Name: real-time detection and capture of invasive cell subpopulations from co-cultures
Uploaded: 2022-03-30T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Real-Time Detection and Capture of Invasive Cell Subpopulations from Co-Cultures at JoVE.com

نود أن نشكر الدكتورة ألانا ويلمز ، معهد هانتسمان للسرطان ، جامعة يوتا ، على تزويدنا ب xenografts المشتقة من المريض (HCI-010). تم دعم هذا العمل من خلال منح المعاهد الوطنية للصحة R01CA205632 و R21CA226542 ، وجزئيا ، بمنحة من Agilent Technologies.

تمت مراجعة الدراسة واعتبارها "معفاة" من قبل مجلس المراجعة المؤسسية بجامعة جورجتاون (IRB # 2002-022). تم جمع أنسجة نخاع العظم التي تم حصادها حديثا من مرشحات جمع نخاع العظم البشرية السليمة المهملة التي تم إلغاء تحديدها.
1. تصميم غرفة جديدة (الشكل 2)
<...

<ol>
	<li>Friedl, P., Gilmour, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collective+cell+migration+in+morphogenesis,+regeneration+and+cancer.">Collective cell migration in morphogenesis, regeneration and cancer.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10 (7), 445-457 (2009).</li><li>Boyden, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chemotactic+effect+of+mixtures+of+antibody+and+antigen+on+polymorphonuclear+leucocytes.">The chemotactic effect of mixtures of antibody and antigen on polymorphonuclear leucocytes.</a> The Journal of Experimental Medicine. 115 (3), 453-466 (1962).</li><li>Xu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+review+of+impedance+measurements+of+whole+cells.">A review of impedance measurements of whole cells.</a> Biosensors &amp; Bioelectronics. 77, 824-836 (2016).</li><li>Stylianou, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+single-chain+antibody+targeting+of+the+ligand-binding+domain+in+the+anaplastic+lymphoma+kinase+receptor.">Effect of single-chain antibody targeting of the ligand-binding domain in the anaplastic lymphoma kinase receptor.</a> Oncogene. 28 (37), 3296-3306 (2009).</li><li>Abassi, Y. A., Wang, X., Xu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real+time+electronic+cell+sensing+system+and+applications+for+cytotoxcity+profiling+and+compound+assays.">Real time electronic cell sensing system and applications for cytotoxcity profiling and compound assays.</a> United States Patent. , 1-88 (2013).</li><li>Abassi, Y. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-free,+real-time+monitoring+of+IgE-mediated+mast+cell+activation+on+microelectronic+cell+sensor+arrays.">Label-free, real-time monitoring of IgE-mediated mast cell activation on microelectronic cell sensor arrays.</a> Journal of Immunological Methods. 292 (1-2), 195-205 (2004).</li><li>Morton, C. L., Houghton, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+human+tumor+xenografts+in+immunodeficient+mice.">Establishment of human tumor xenografts in immunodeficient mice.</a> Nature Protocols. 2 (2), 247-250 (2007).</li><li>DeRose, Y. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+grafts+derived+from+women+with+breast+cancer+authentically+reflect+tumor+pathology,+growth,+metastasis+and+disease+outcomes.">Tumor grafts derived from women with breast cancer authentically reflect tumor pathology, growth, metastasis and disease outcomes.</a> Nature Medicine. 17 (11), 1514-1520 (2011).</li><li>Sharif, G. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+AIB1+isoform+alters+enhancer+access+and+enables+progression+of+early-stage+triple-negative+breast+cancer.">An AIB1 isoform alters enhancer access and enables progression of early-stage triple-negative breast cancer.</a> Cancer Research. 81 (16), 4230-4241 (2021).</li><li>Caileau, R., Olive, M., Cruciger, Q. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+human+breast+carcinoma+cell+lines+of+metastatic+origin:+preliminary+characterization.">Long-term human breast carcinoma cell lines of metastatic origin: preliminary characterization.</a> In Vitro. 14 (11), 911-915 (1978).</li><li>Sharif, G. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+growth+density+modulates+cancer+cell+vascular+invasion+via+Hippo+pathway+activity+and+CXCR2+signaling.">Cell growth density modulates cancer cell vascular invasion via Hippo pathway activity and CXCR2 signaling.</a> Oncogene. 34 (48), 5879-5889 (2015).</li><li>Miller, F. R., Santner, S. J., Tait, L., Dawson, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MCF10DCIS.com+xenograft+model+of+human+comedo+ductal+carcinoma+in+situ.">MCF10DCIS.com xenograft model of human comedo ductal carcinoma in situ.</a> Journal of the National Cancer Institute. 92 (14), 1185-1186 (2000).</li><li>Winkler, J., Abisoye-Ogunniyan, A., Metcalf, K. J., zenaa, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concepts+of+extracellular+matrix+remodelling+in+tumour+progression+and+metastasis.">Concepts of extracellular matrix remodelling in tumour progression and metastasis.</a> Nature Communications. 11 (1), 1-19 (2020).</li><li>Nkosi, D., Sun, L., Duke, L. C., Meckes, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epstein-Barr+virus+LMP1+manipulates+the+content+and+functions+of+extracellular+vesicles+to+enhance+metastatic+potential+of+recipient+cells.">Epstein-Barr virus LMP1 manipulates the content and functions of extracellular vesicles to enhance metastatic potential of recipient cells.</a> PLoS Pathogens. 16 (12), 1009023 (2020).</li><li>Eisenberg, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanistic+modeling+of+the+effects+of+myoferlin+on+tumor+cell+invasion.">Mechanistic modeling of the effects of myoferlin on tumor cell invasion.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (50), 20078-20083 (2011).</li></ol>

لقد قمنا بتعديل تصميم مصفوفة مزدوجة الغرف لتشمل غرفة ثالثة لمراقبة غزو الخلايا في الوقت الفعلي في وجود خلايا لحمية. لقد لاحظنا تأثيرات متميزة للخلايا الليفية المستزرعة بشكل مشترك على الخلايا السرطانية الغازية وغير الغازية مما يشير إلى أنه يمكن استخدام المصفوفة للتمييز بين المجموعات الف...

غزو الخلايا هو عملية مهمة تسمح للخلايا بعبور حواجز الغشاء السفلي استجابة للإشارات البيئية التي توفرها الخلايا اللحمية. إنها خطوة حاسمة خلال عدة مراحل من التطور للاستجابات المناعية ، والتئام الجروح ، وإصلاح الأنسجة ، والأورام الخبيثة التي يمكن أن تتطور من الآفات المحلية إلى السرطانات الغازية والنقيلية1. عادة ما تولد الفحوصات التي تم تطويرها في وقت مبكر لقياس الإمكانات الغازية لمجموعات الخلايا قياسا واحدا لنقطة النهاية أو تتطلب وضع علامات مسبقة على الخلايا الغازية2. تم الآن تطوير تكامل تقنيات الإلكترونيات الدقيقة والموائع الدقيقة للكشف عن الجوانب المختلفة لبيولوجيا الخلية مثل الجدوى والحركة والتعلق باستخدام المعاوقة الكهربائية للخلايا الحية على الأقطاب الكهربائية الدقيقة 3,4. يسمح قياس المعاوقة بإجراء تقييم كمي خال من الملصقات وغير جراحي وكمي لحالة الخلية3. هنا نصف مصفوفة من ثلاث غرف تستند إلى تصميم نظام التحليل الخلوي في الوقت الحقيقي (RTCA) الذي طوره Abassi et al.5. تسمح المجموعة المكونة من ثلاث غرف بتقييم الخلايا المستزرعة بشكل مشترك على الغزو الخلوي واستعادة الخلايا الغازية لإجراء تحليلات إضافية أو توسيع.
في نظام محلل الخلايا ، تغزو الخلايا من خلال مصفوفة خارج الخلية مغلفة بغشاء مسامي وتصل إلى مجموعة أقطاب كهربائية متداخلة الهوية موضوعة على الجانب الآخر من الحاجز. مع استمرار الخلايا الغازية في التعلق واحتلال مجموعة الأقطاب الكهربائية هذه بمرور الوقت ، تتغير المعاوقة الكهربائية بالتوازي. يتكون النظام الحالي من لوحة غزو وهجرة الخلايا (CIM) المكونة من 16 بئرا مع غرفتين. يحتوي جهاز RTCA-DP (الغرض المزدوج) (يسمى محلل الخلايا ثنائي الغرض من الآن فصاعدا) على أجهزة استشعار لقياس المعاوقة وبرامج متكاملة لتحليل ومعالجة بيانات المعاوقة. تعتمد قيم المقاومة عند خط الأساس على القوة الأيونية للوسائط في الآبار ويتم تغييرها عندما تلتصق الخلايا بالأقطاب الكهربائية. تعتمد تغيرات المعاوقة على عدد الخلايا ومورفولوجيتها ومدى ارتباط الخلايا بالأقطاب الكهربائية. يعتبر قياس الآبار باستخدام الوسائط قبل إضافة الخلايا بمثابة إشارة خلفية. يتم طرح الخلفية من قياسات المعاوقة بعد الوصول إلى التوازن مع الخلايا التي تعلق وتنتشر على الأقطاب الكهربائية. يتم حساب معلمة غير موحدة لحالة الخلايا على قطب كهربائي يسمى مؤشر الخلية (CI) على النحو التالي: CI = (المعاوقة بعد التوازن - المعاوقة في حالة عدم وجود خلايا) / قيمة المعاوقة الاسمية6. عند مقارنة معدلات ترحيل خطوط الخلايا المختلفة، يمكن استخدام Delta CI لمقارنة حالة الخلية بغض النظر عن الفرق في المرفق الذي يتم تمثيله في القياسات القليلة الأولى.
تعتمد المصفوفة ثلاثية الغرف المصممة حديثا على التصميم الحالي وتستخدم الغرفة العلوية من نظام محلل الخلايا ثنائي الغرض الذي يحتوي على الأقطاب الكهربائية. يتم تكييف الغرف الوسطى والسفلية المعدلة لتناسب التجميع في محلل الخلايا ثنائي الغرض لقياس وتحليل المعاوقة باستخدام البرنامج المتكامل. التقدمان الرئيسيان اللذان يوفرهما التصميم الجديد على لوحة CIM الحالية ثنائية الغرفة (تسمى لوحة محلل الخلايا من الآن فصاعدا) هما: i) القدرة على التعافي ، ثم تحليل المجموعات الفرعية للخلايا الغازية الموجودة في خلطات الخلايا غير المتجانسة و ii) خيار تقييم تأثير العوامل المفرزة من الخلايا اللحمية أو المناعية المستزرعة على غزو الخلايا (الشكل 1).
يمكن أن تكون هذه التكنولوجيا مفيدة في دراسة المجموعات الفرعية للخلايا ذات القدرات الغازية المختلفة. ويشمل ذلك (أ) الخلايا السرطانية الغازية التي تغزو الأنسجة المحيطة أو الأوعية الدموية واللمفاوية أو تتكاثر في مواقع البذر النقيلي في الأعضاء البعيدة، (ب) الخلايا من الجهاز المناعي التي تغزو الأنسجة لمعالجة مسببات الأمراض أو الخلايا المريضة، (ج) الخلايا البطانية التي تغزو الأنسجة لتشكيل أوعية دموية جديدة أثناء إعادة تنظيم الأنسجة أو التئام الجروح، وكذلك (د) الخلايا اللحمية من البيئة الدقيقة للورم التي تدعم وتغزو جنبا إلى جنب مع الخلايا السرطانية. يسمح هذا النهج بإدراج الحديث المتبادل اللحمي الذي يمكن أن يعدل حركة الخلايا والغزو. تستخدم دراسات الجدوى الموضحة هنا هذه المجموعة المعدلة التي تركز على غزو الخلايا السرطانية والتفاعل مع السدى كنظام نموذجي ، بما في ذلك الغزو البطاني استجابة للإشارات التفاضلية من الخلايا السرطانية. يمكن استقراء هذا النهج لعزل الخلايا السرطانية وأنواع الخلايا الأخرى مثل المجموعات الفرعية للخلايا المناعية أو الخلايا الليفية أو الخلايا البطانية. اختبرنا خطوط خلايا سرطان الثدي الغازية وغير الغازية كدليل على المبدأ. كما استخدمنا خلايا من غزو xenograft (PDX) المشتق من المريض استجابة للخلايا المناعية من نخاع العظم البشري لإظهار جدوى للاستخدام المستقبلي أيضا في إعدادات التشخيص السريري. PDX هي أنسجة ورم المريض التي يتم زرعها في نموذج الفئران التي تعاني من نقص المناعة أو البشرية للسماح بدراسة النمو والتقدم وخيارات العلاج للمريض الأصلي 7,8.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.05% Trypsin-EDTA</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>25300-054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adhesive</td>
			<td>Norland Optical Adhesive</td>
			<td>NOA63</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell lifter</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.1832</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholera Toxin from Vibrio cholerae</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>12585-014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CIM-plate</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5665817001</td>
			<td>Cell analyzer plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase from Clostridium histolyticum</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C0130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase</td>
			<td>StemCell</td>
			<td>7913</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>11995-065</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM-F12</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>11875-093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS), Heat Inactivated</td>
			<td>Omega Scientific</td>
			<td>FB-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>15630106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse serum (HS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>16050-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human EGF</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>AF-100-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human umbilical Vein endothelail cells (HUVEC)</td>
			<td>LONZA (RRID:CVCL_2959)</td>
			<td>C-2517A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HUVEC media</td>
			<td>LONZA</td>
			<td>CC-3162</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrocortisone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H4001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin Transferrin Selenium Ethanolamine (ITSX) (100x)</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>51500056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin, Human Recombinant, Zinc Solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C8052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>J2 Fibroblasts</td>
			<td>Stemcell (RRID:CVCL_W667)</td>
			<td>100-0353</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LymphoPrep</td>
			<td>Stemcell</td>
			<td>7851</td>
			<td>Density gradient medium for the isolation of mononuclear cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354230</td>
			<td>Basement membrane matrix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MCFDCIS.com cells ( DCIS)</td>
			<td>RRID:CVCL_5552</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MDA-MB-231 cells</td>
			<td>RRID:CVCL_0062</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Milling machine</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Bridgeport Series 1 Vertical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline (1x)</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>10010049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethersulfone (PES) membrane</td>
			<td>Sterlitech</td>
			<td>PCTF029030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RBC lysis solution</td>
			<td>Stemcell</td>
			<td>7800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy Micro Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RTCA DP analyzer</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>3X16</td>
			<td>Dual purpose cell analyzer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T4799</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

real-time detection and capture of invasive cell subpopulations from co-cultures

الغزو والانتشار النقيلي للخلايا السرطانية هي السبب الرئيسي للوفاة من السرطان. عادة ما تولد الفحوصات التي تم تطويرها في وقت مبكر لقياس الإمكانات الغازية لمجموعات الخلايا السرطانية قياسا واحدا لنقطة النهاية لا يميز بين المجموعات الفرعية للخلايا السرطانية ذات الإمكانات الغازية المختلفة. أيضا ، تتكون البيئة الدقيقة للورم من خلايا لحمية ومناعية مقيمة مختلفة تتغير وتشارك في السلوك الغازي للخلايا السرطانية. يلعب غزو الأنسجة أيضا دورا في المجموعات الفرعية للخلايا المناعية التي تتصدى للكائنات الحية الدقيقة أو تقضي على الخلايا المريضة من الحمة والخلايا البطانية أثناء إعادة تشكيل الأنسجة وتكوين الأوعية. كان التحليل الخلوي في الوقت الفعلي (RTCA) الذي يستخدم أجهزة الاستشعار الحيوية للمعاوقة لمراقبة غزو الخلايا خطوة كبيرة إلى الأمام تتجاوز قياس نقطة النهاية للغزو: وهذا يوفر قياسات مستمرة بمرور الوقت وبالتالي يمكن أن يكشف عن الاختلافات في معدلات الغزو التي يتم فقدانها في فحص نقطة النهاية. باستخدام تقنية RTCA الحالية ، قمنا بتوسيع صفائف الحجرة المزدوجة عن طريق إضافة غرفة أخرى يمكن أن تحتوي على خلايا لحمية و / أو مناعية وتسمح بقياس معدل الغزو تحت تأثير العوامل المفرزة من الخلايا اللحمية أو المناعية المستزرعة مع مرور الوقت. علاوة على ذلك ، يسمح التصميم الفريد بفصل الغرف في أي وقت وعزل الخلايا السرطانية الأكثر توغلا ، أو المجموعات الفرعية الأخرى من الخلايا الموجودة في مزيج غير متجانس من عزلات الورم التي تم اختبارها. هذه الخلايا السرطانية الأكثر توغلا وغيرها من المجموعات الفرعية للخلايا تدفع التقدم الخبيث إلى مرض النقيلي ، وخصائصها الجزيئية مهمة للدراسات الميكانيكية المتعمقة ، وتطوير تحقيقات تشخيصية للكشف عنها ، وتقييم نقاط الضعف. وبالتالي ، يمكن استخدام تضمين الأدوية ذات الجزيئات الصغيرة أو الكبيرة لاختبار إمكانات العلاجات التي تستهدف السرطان و / أو المجموعات الفرعية للخلايا اللحمية بهدف تثبيط (على سبيل المثال ، الخلايا السرطانية) أو تعزيز (على سبيل المثال ، الخلايا المناعية) السلوك الغازي.

باستخدام المصفوفة ثلاثية الغرف المصممة حديثا ، تم اختبار غزو الخلايا في وجود أو عدم وجود خلايا لحمية مثل الخلايا الليفية. تم تعزيز غزو الخلايا MDA-MB-231 عندما تم زرع الخلايا الليفية السويسرية 3T3 المشععة (سلالة J2) في الغرفة السفلية ، مما يسمح بتبادل العوامل بين خطي الخلية. ومن المثير للاهتمام أ?...

Watch this Scientific Journal Video about Real-Time Detection and Capture of Invasive Cell Subpopulations from Co-Cultures at JoVE.com

Real-Time Detection and Capture of Invasive Cell Subpopulations from Co-Cultures

نحن نصف نهجا للكشف عن المجموعات الفرعية للخلايا الغازية والتقاطها في الوقت الفعلي. يستخدم التصميم التجريبي التحليل الخلوي في الوقت الفعلي من خلال مراقبة التغيرات في المعاوقة الكهربائية للخلايا. يمكن التقاط السرطان الغازي أو الخلايا المناعية أو البطانية أو اللحمية في الأنسجة المعقدة ، ويمكن تقييم تأثير الثقافات المشتركة.

الكشف في الوقت الحقيقي والتقاط المجموعات الفرعية للخلايا الغازية من الثقافات المشتركة

Invasion and metastatic spread of cancer cells are the major cause of death from cancer. Assays developed early on to measure the invasive potential of ...

تمكن هذه التقنية من تحديد الخلايا ذات القدرات الغازية المختلفة تحت تأثير العوامل المفرزة من الخلايا اللحمية المستزرعة. تقوم هذه التقنية بتقييم تأثير العوامل المفرزة من الخلايا اللحمية أو المناعية المستزرعة على غزو الخلايا. كما يسمح باستعادة وتحليل المجموعات الفرعية للخلايا الغازية الموجودة في خلطات الخلايا غير المتجانسة.يمكن لهذه التقنية تحديد الأورام التي تؤوي مجموعات فرعية من الخلايا الغازية التي تؤدي إلى ورم خبيث. قد يؤدي التقاط الخلايا السرطانية الغازية وتحليلها إلى اتخاذ قرارات العلاج. لبدء زراعة الخلايا ، اغسل مزارع الخلايا الالتصاق التي تحتوي على ما يقرب من 70٪ من الالتقاء مع 1X محلول ملحي مخزن بفوسفات.ثم أضف 0.05٪ من التربسين ومحلول EDTA لرفع الخلايا. تحييد محلول التربسين باستخدام وسائط زراعة الخلايا التي تحتوي على مصل وحساب الخلايا باستخدام أليكوت من تعليق الخلية. ضع جميع الغرف المعقمة الثلاث في غطاء محرك السيارة لزراعة الأنسجة.حدد موقع المقبض على الجانب القصير من الغرفة السفلية وقم بتوجيه الغرفة السفلية بحيث يواجه المقبض المجرب. أضف 30،000 إلى 50،000 خلية في 90 ميكرولتر من الوسائط إلى كل بئر من الغرفة السفلية دون تشكيل أي فقاعات. استخدم 5٪ من الوسائط المكملة لمصل البقر الجنيني في غرفتين سفليتين كعنصر تحكم إيجابي في حركة الخلايا ، واستخدم 0٪ وسائط مكملة للمصل كعنصر تحكم سلبي.قم بتدوير الغرفة السفلية عند 90 درجة بعد تركها تستقر لمدة 10 إلى 15 دقيقة في غطاء المحرك. ثم ضع الغرفة الوسطى في الأعلى بحيث ينزلق المقبض الموجود في الغرفة السفلية إلى الشق الموجود في الغرفة الوسطى. ادفع الغرفة عموديا لأسفل حتى تسمع نقرة من كل جانب من الجوانب الطويلة للتجميع.أضف 160 ميكرولتر من الوسائط الخالية من المصل إلى جميع آبار الغرفة الوسطى. تأكد من رؤية الغضروف المفصلي على شكل قبة بعد ملء الآبار ووضع الغرفة العلوية مع أقطاب كهربائية متجهة لأسفل إلى الغرفة الوسطى لمحاذاة النقاط الزرقاء على الحجرتين الوسطى والعليا. ادفع الغرفة عموديا لأسفل حتى يتم سماع صوت نقرة من كل جانب من الجوانب الطويلة للتجميع.أضف 20 إلى 50 ميكرولتر من الوسائط الخالية من المصل إلى الغرفة العلوية. قم بتركيب التجميع على محلل الخلايا ثنائي الغرض في حاضنة زراعة الأنسجة وانتظر 30 دقيقة قبل قياس الخلفية. افتح برنامج محلل الخلايا ، ثم حدد المهد المراد استخدامه ، متبوعا بنقرة واحدة على علامة تبويب الرسالة ، وتأكد من أنه يقول اتصالات بخير "لضمان وضع الصفيف بشكل جيد في المهد وأن الأقطاب الكهربائية محاذاة بشكل جيد مع أجهزة الاستشعار.انقر على علامة التبويب ملاحظات التجربة واملأ جميع المعلومات الممكنة حول التجربة. ثم انقر فوق علامة التبويب تخطيط واملأ وصف تخطيط الصفيف. ثم انقر فوق علامة التبويب الجدول الزمني وأضف خطوتين من قائمة الخطوات ، وخطوة خلفية مع مسح واحد ، وخطوة اختبار مع 100 عملية مسح.بمجرد أن تكون المصفوفة في حاضنة تحليل الخلايا ثنائية الغرض لمدة 30 دقيقة ، انقر فوق زر التشغيل لبدء قياس الخلفية. بعد الانتهاء من قياس الخلفية ، قم بإزالة الصفيف من المهد وضعه مرة أخرى في غطاء مزرعة الخلية. ثم أضف 30،000 إلى 50،000 خلية في 100 ميكرولتر من الوسائط الخالية من المصل إلى كل بئر من الغرفة العلوية.هذه هي الخلايا التي سيكتشفها القطب الكهربائي بمجرد أن تهاجر بنجاح عبر الغشاء. دع التجميع يقف في غطاء المحرك لمدة 30 دقيقة قبل تركيبه على محلل الخلايا ثنائي الغرض لقياس المعاوقة. ضع الصفيف مرة أخرى في محلل الخلايا ثنائي الغرض وتحقق من علامة تبويب الرسالة الخاصة برسالة "اتصالات موافق".انقر فوق زر التشغيل لبدء قياس المعاوقة ثم انقر فوق علامة التبويب المؤامرة لمراقبة تقدم الإشارة. إذا تم الوصول إلى نقطة النهاية قبل 25 ساعة ، فانقر فوق خطوة الإجهاض من القائمة المنسدلة تنفيذ. لتصدير البيانات، انقر بزر الماوس الأيمن فوق الرسم البياني، واختر نسخ بتنسيق القائمة، ثم الصق البيانات في جدول بيانات.راقب معدل الترحيل في الوقت الفعلي على محلل الخلايا ثنائي الغرض لتحديد نقطة التوقف المثيرة للاهتمام. بمجرد تحقيقه ، قم بفك التجميع من محلل الخلايا ثنائي الغرض وضعه في غطاء محرك الأنسجة. إعداد عدد مناسب من 1.5 ملليلتر من أنابيب الطرد المركزي الدقيقة لجمع الخلايا من الآبار ذات الاهتمام.ضع التجميع في طبق طوله 10 سنتيمترات لاحتواء السوائل عند انفصال الغرف. ادفع أطراف الانجذاب المرنة على الجانب الطويل من الغرفة الوسطى إلى الداخل حتى يتم سماع صوت نقرة ، يليه تفكيك الغرفة العلوية وقلبها إلى طبق جديد بطول 10 سم. استخدم رافع خلايا بشفرة 13 ملم لجمع الخلايا من جميع الآبار التي تؤوي نفس الحالة التجريبية.شطف أو غمس الشفرة في 1X الفوسفات المخزنة المالحة لجمع الخلايا في أنابيب الطرد المركزي الدقيق 1.5 ملليلتر. ثم قم بتدوير الخلايا بسرعة 500 مرة G لمدة خمس دقائق ونشر هذه الخلايا التي تم جمعها أو إجراء تحليل نقطة النهاية مثل تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية. أظهر تقييم غزو الخلايا في وجود أو عدم وجود خلايا لحمية أن غزو خلايا MDA-MB-231 قد تعزز عندما كانت سلالة الخلايا الليفية السويسرية 3T3 J2 المشععة جالسة في الغرفة السفلية لتبادل العوامل بين خطي الخلية.ومن المثير للاهتمام ، زاد غزو MDA-MB-231 عندما تضاعف عدد خلايا 3T3 J2. من ناحية أخرى ، يبدو أن معدل غزو استنساخ غازي لخلايا MCFDCIS ، DCIS-Delta Four ، قد تم تثبيطه بواسطة التداخل مع خلايا 3T3 J2 ، مما يشير إلى التطبيق القيم لمصفوفة الغرف الثلاث لقياس التأثيرات المختلفة للسدى. في هذه الحالة ، الخلايا الليفية على غزو الخلايا.كانت الخلايا البطانية للوريد السري البشري أكثر توغلا استجابة للعوامل التي تفرزها خلايا MDA-MB-231 ، على عكس تلك التي تفرزها خلايا DCIS ، والتي تتوافق مع قدرة الأورام الغازية على تجنيد الخلايا البطانية لتشكيل الأوعية الدموية ونشرها لاحقا في الدورة الدموية. زاد غزو خلايا xenograft المشتقة من المريض من الغرفة العلوية استجابة للخلايا المناعية لنخاع العظم البشري المستزرع. ومن المثير للاهتمام ، أن وجود مصل 2٪ في الغرفة السفلية مع الخلايا المناعية لنخاع العظم البشري كان ضروريا لغزو xenografts المشتق من المريض.يمكن طلاء الآبار بمصفوفة خارج الخلية لتقليد حاجز الغشاء السفلي. يمكن إضافة عوامل علاجية إلى وسائل الإعلام في الآبار لمراقبة تأثيرها على الغزو.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Capture and Release of Viable Circulating Tumor Cells from Blood

القبض على وإطلاق قابلة للحياة تعميم الخلايا السرطانية من الدم

We demonstrate a method for size based capture of viable circulating tumor cell (CTC) from whole blood, along with the release of these cells from chip ...

Invasive Behavior of Human Breast Cancer Cells in Embryonic Zebrafish

السلوك الغازية من خلايا سرطان الثدي البشرية في الجنينية الزرد

In many cases, cancer patients do not die of a primary tumor, but rather because of metastasis. Although numerous rodent models are available for studying ...

Four-color Fluorescence Immunohistochemistry of T-cell Subpopulations in Archival Formalin-fixed, Paraffin-embedded Human Oropharyngeal Squamous Cell Carcinoma Samples

أربعة ألوان مضان المناعية من الخلايا السكانية الفرعية T- خلية في الأرشيفية الفورمالين ثابتة، جزءا لا يتجزأ من البارافين الإنسان البلعوم الخلايا الحرشفية سرطان الخلايا العينات

The four-color fluorescence immunohistochemistry (IHC) technique is a method to quantify cell populations of interest while taking into account their ...

Preparation and Metabolic Assay of 3-dimensional Spheroid Co-cultures of Pancreatic Cancer Cells and Fibroblasts

الإعداد والتحليل الأيضي الثقافات المشارك كروي ثلاثي الأبعاد لخلايا سرطان البنكرياس والخلايا الليفية

Many cancer types, including pancreatic cancer, have a dense fibrotic stroma that plays an important role in tumor progression and invasion. Activated ...

Serum and Plasma Copy Number Detection Using Real-time PCR

مصل وبلازما نسخة الكشف رقم PCR الوقت الحقيقي باستخدام

Serum and plasma cell free DNA (cfDNA) has been shown as an informative, non-invasive source of biomarkers for cancer diagnosis, prognosis, monitoring, ...

Real Time Detection of In Vitro Tumor Cell Apoptosis Induced by CD8+ T Cells to Study Immune Suppressive Functions of Tumor-infiltrating Myeloid Cells

Real Time Detection of In Vitro Tumor Cell Apoptosis Induced by CD8+ T Cells to Study Immune Suppressive Functions of Tumor-infiltrating Myeloid Cells

الكشف عن الوقت الحقيقي في المختبر ورم الخلايا المبرمج الناجمة عن CD8+ تي الخلايا لدراسة وظائف المناعة القمعية من التسلل إلى ورم الخلايا النقوي

Potentiation of the tumor-killing ability of CD8+ T cells in tumors, along with their efficient tumor infiltration, is a key element of successful ...

Real-Time Monitoring of Human Glioma Cell Migration on Dorsal Root Ganglion Axon-Oligodendrocyte Co-Cultures

في الوقت الحقيقي رصد الهجرة الخلية البشرية الورم علي العقدة الجذر الظهرية اكسون-اوليغوداندورونسيتي الثقافات المشتركة

Glioblastoma is one of the most aggressive human cancers due to extensive cellular heterogeneity and the migration properties of hGCs. In order to better ...

Time-Lapse 2D Imaging of Phagocytic Activity in M1 Macrophage-4T1 Mouse Mammary Carcinoma Cells in Co-cultures

الوقت الفاصل بين التصوير 2D من النشاط Phagocytic في M1 الضامة-4T1 الفئران سرطان الثدي خلايا في الثقافات المشتركة

Tumor-associated macrophages (TAMs) have been identified as an important component for tumor growth, invasion, metastasis, and resistance to cancer ...

Combined Use of Tail Vein Metastasis Assays and Real-Time In Vivo Imaging to Quantify Breast Cancer Metastatic Colonization and Burden in the Lungs

الجمع بين استخدام الذيل الوريد الانبثاث الاختبارات والوقت الحقيقي في التصوير فيفو لقياس سرطان الثدي الاستعمار المنتشر والعبء في الرئتين

Metastasis is the main cause of cancer-related deaths and there are limited therapeutic options for patients with metastatic disease. The identification ...

Impedance-based Real-time Measurement of Cancer Cell Migration and Invasion

المعاوقة القائمة على قياس في الوقت الحقيقي من هجرة الخلايا السرطانية والغزو

Cancer arises due to uncontrolled proliferation of cells initiated by genetic instability, mutations, and environmental and other stress factors. These ...