Name: real-time detection and capture of invasive cell subpopulations from co-cultures
Uploaded: 2022-03-30T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Real-Time Detection and Capture of Invasive Cell Subpopulations from Co-Cultures at JoVE.com

Vi vil gerne takke Dr. Alana Welms, Huntsman Cancer Institute, University of Utah, for at give os de patientafledte xenografts (HCI-010). Dette arbejde blev støttet af NIH-tilskud R01CA205632, R21CA226542 og delvist af en bevilling fra Agilent Technologies.

Undersøgelsen blev gennemgået og betragtet som "fritaget" af Institutional Review Board of Georgetown University (IRB # 2002-022). Friskhøstet knoglemarvsvæv blev indsamlet fra kasserede sunde humane knoglemarvsopsamlingsfiltre, der var blevet afidentificeret.
1. Nyt kammerdesign (figur 2)
<ol><li>Åbn en ny dobbeltkammercelleanalysatorplade. Sæt det øverste kammer til side med elektroder.</li>
	<li>Brug en fræsemaskine t...

<ol>
	<li>Friedl, P., Gilmour, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collective+cell+migration+in+morphogenesis,+regeneration+and+cancer.">Collective cell migration in morphogenesis, regeneration and cancer.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10 (7), 445-457 (2009).</li><li>Boyden, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chemotactic+effect+of+mixtures+of+antibody+and+antigen+on+polymorphonuclear+leucocytes.">The chemotactic effect of mixtures of antibody and antigen on polymorphonuclear leucocytes.</a> The Journal of Experimental Medicine. 115 (3), 453-466 (1962).</li><li>Xu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+review+of+impedance+measurements+of+whole+cells.">A review of impedance measurements of whole cells.</a> Biosensors &amp; Bioelectronics. 77, 824-836 (2016).</li><li>Stylianou, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+single-chain+antibody+targeting+of+the+ligand-binding+domain+in+the+anaplastic+lymphoma+kinase+receptor.">Effect of single-chain antibody targeting of the ligand-binding domain in the anaplastic lymphoma kinase receptor.</a> Oncogene. 28 (37), 3296-3306 (2009).</li><li>Abassi, Y. A., Wang, X., Xu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real+time+electronic+cell+sensing+system+and+applications+for+cytotoxcity+profiling+and+compound+assays.">Real time electronic cell sensing system and applications for cytotoxcity profiling and compound assays.</a> United States Patent. , 1-88 (2013).</li><li>Abassi, Y. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-free,+real-time+monitoring+of+IgE-mediated+mast+cell+activation+on+microelectronic+cell+sensor+arrays.">Label-free, real-time monitoring of IgE-mediated mast cell activation on microelectronic cell sensor arrays.</a> Journal of Immunological Methods. 292 (1-2), 195-205 (2004).</li><li>Morton, C. L., Houghton, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+human+tumor+xenografts+in+immunodeficient+mice.">Establishment of human tumor xenografts in immunodeficient mice.</a> Nature Protocols. 2 (2), 247-250 (2007).</li><li>DeRose, Y. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+grafts+derived+from+women+with+breast+cancer+authentically+reflect+tumor+pathology,+growth,+metastasis+and+disease+outcomes.">Tumor grafts derived from women with breast cancer authentically reflect tumor pathology, growth, metastasis and disease outcomes.</a> Nature Medicine. 17 (11), 1514-1520 (2011).</li><li>Sharif, G. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+AIB1+isoform+alters+enhancer+access+and+enables+progression+of+early-stage+triple-negative+breast+cancer.">An AIB1 isoform alters enhancer access and enables progression of early-stage triple-negative breast cancer.</a> Cancer Research. 81 (16), 4230-4241 (2021).</li><li>Caileau, R., Olive, M., Cruciger, Q. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+human+breast+carcinoma+cell+lines+of+metastatic+origin:+preliminary+characterization.">Long-term human breast carcinoma cell lines of metastatic origin: preliminary characterization.</a> In Vitro. 14 (11), 911-915 (1978).</li><li>Sharif, G. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+growth+density+modulates+cancer+cell+vascular+invasion+via+Hippo+pathway+activity+and+CXCR2+signaling.">Cell growth density modulates cancer cell vascular invasion via Hippo pathway activity and CXCR2 signaling.</a> Oncogene. 34 (48), 5879-5889 (2015).</li><li>Miller, F. R., Santner, S. J., Tait, L., Dawson, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MCF10DCIS.com+xenograft+model+of+human+comedo+ductal+carcinoma+in+situ.">MCF10DCIS.com xenograft model of human comedo ductal carcinoma in situ.</a> Journal of the National Cancer Institute. 92 (14), 1185-1186 (2000).</li><li>Winkler, J., Abisoye-Ogunniyan, A., Metcalf, K. J., zenaa, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concepts+of+extracellular+matrix+remodelling+in+tumour+progression+and+metastasis.">Concepts of extracellular matrix remodelling in tumour progression and metastasis.</a> Nature Communications. 11 (1), 1-19 (2020).</li><li>Nkosi, D., Sun, L., Duke, L. C., Meckes, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epstein-Barr+virus+LMP1+manipulates+the+content+and+functions+of+extracellular+vesicles+to+enhance+metastatic+potential+of+recipient+cells.">Epstein-Barr virus LMP1 manipulates the content and functions of extracellular vesicles to enhance metastatic potential of recipient cells.</a> PLoS Pathogens. 16 (12), 1009023 (2020).</li><li>Eisenberg, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanistic+modeling+of+the+effects+of+myoferlin+on+tumor+cell+invasion.">Mechanistic modeling of the effects of myoferlin on tumor cell invasion.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (50), 20078-20083 (2011).</li></ol>

Vi har ændret designet af et dobbeltkammeret array til at omfatte et tredje kammer til overvågning af celleinvasion i realtid i nærværelse af stromalceller. Vi har observeret forskellige virkninger af co-dyrkede fibroblaster på invasive og ikke-invasive kræftceller, hvilket indikerer, at arrayet kan bruges til at skelne mellem kræftcellesubpopulationer, der reagerer forskelligt på faktorer produceret af samkulturerede stromale celler. Arrayet blev også brugt til at overvåge endotelcelleinvasion i stromalvæv, e...

Celleinvasion er en vigtig proces, der gør det muligt for celler at krydse kældermembranbarrierer som reaktion på miljømæssige signaler fra stromalceller. Det er et afgørende skridt i flere udviklingsstadier for immunresponser, sårheling, vævsreparation og maligniteter, der kan udvikle sig fra lokale læsioner til invasive og metastatiske kræftformer1. Assays udviklet tidligt for at måle det invasive potentiale i cellepopulationer genererer typisk en enkelt endepunktsmåling eller kræver formærkning af invasive celler2. Integrationen af mikroelektronik og mikrofluidik teknikker er nu udviklet til at detektere forskellige aspekter af cellebiologi såsom levedygtighed, bevægelse og fastgørelse ved hjælp af den elektriske impedans af levende celler på mikroelektroder 3,4. Impedansmåling giver mulighed for en etiketfri, ikke-invasiv og kvantitativ vurdering af cellestatus3. Her beskriver vi et tre-kammer array baseret på designet af Real-Time Cellular Analysis (RTCA) -systemet, der blev udviklet af Abassi et al.5. Det tre-kammerede array giver mulighed for vurdering af samkulturerede celler på cellulær invasion og genopretning af invasive celler til yderligere analyser eller ekspansion.
I celleanalysatorsystemet invaderer celler gennem en ekstracellulær matrix belagt på en porøs membran og når et interdigiteret elektrodearray placeret på den modsatte side af barrieren. Da de invasive celler fortsætter med at fastgøre og optage dette elektrodearray over tid, ændres den elektriske impedans parallelt. Det nuværende system består af en celleinvasion og migration (CIM) 16-brønds plade med to kamre. Instrumentet RTCA-DP (dual purpose) (kaldet dual purpose cell analyzer fremover) indeholder sensorer til impedansmåling og integreret software til analyse og behandling af impedansdata. Impedansværdier ved baseline afhænger af ionisk styrke af medier i brøndene og ændres, når celler fastgøres til elektroderne. Impedansændringerne afhænger af antallet af celler, deres morfologi og i hvilket omfang celler fastgøres til elektroderne. En måling af brøndene med medier, før cellerne tilføjes, betragtes som baggrundssignalet. Baggrunden trækkes fra impedansmålinger efter at have nået ligevægt med celler, der fastgøres og spredes på elektroderne. En enhedsløs parameter for cellernes status på en elektrode betegnet celleindeks (CI) beregnes som følger: CI = (impedans efter ligevægt - impedans i fravær af celler) / nominel impedansværdi6. Når migreringshastigheder for forskellige cellelinjer sammenlignes, kan Delta CI bruges til at sammenligne cellestatus uanset forskellen i vedhæftning, der er repræsenteret i de første par målinger.
Det nydesignede trekammerarray bygger på det eksisterende design og bruger det øverste kammer fra dobbeltcelleanalysatorsystemet, der indeholder elektroderne. De modificerede mellem- og bundkamre er tilpasset til at passe samlingen ind i celleanalysatoren med dobbelt formål til impedansmåling og analyse ved hjælp af den integrerede software. De to store fremskridt, som det nye design giver i forhold til den eksisterende cim-plade med dobbelt kammer (kaldet celleanalysatorplade fremover) er: i) evnen til at komme sig og derefter analysere invasive celleunderpopulationer, der er til stede i heterogene celleblandinger og ii) muligheden for at vurdere virkningen af udskillede faktorer fra samkultiverede stromal- eller immunceller på celleinvasion (figur 1).
Denne teknologi kan være nyttig til at studere delpopulationer af celler med forskellige invasive kapaciteter. Dette omfatter a) invasive kræftceller, der invaderer omgivende væv eller blod og lymfekar eller ekstravaserer på metastatiske såningssteder i fjerne organer, b) celler fra immunsystemet, der invaderer væv for at tackle patogener eller syge celler, c) endotelceller, der invaderer væv for at danne nye blodkar under vævsomorganisering eller sårheling, samt (d) stromalceller fra tumormikromiljøet, der understøtter og invaderer sammen med kræftceller. Tilgangen tillader inkludering af stromal cross-talk, der kan modulere cellemotilitet og invasion. De gennemførlighedsundersøgelser, der er vist her, bruger dette modificerede array med fokus på kræftcelleinvasion og interaktionen med stroma som et modelsystem, herunder endotelinvasion som reaktion på differentielle signaler fra kræftceller. Fremgangsmåden kan ekstrapoleres for at isolere kræftceller og andre celletyper såsom subpopulationer af immunceller, fibroblaster eller endotelceller. Vi testede invasive og ikke-invasive etablerede brystkræftcellelinjer som et bevis på princippet. Vi brugte også celler fra patientafledt xenograft (PDX) invasion som reaktion på immunceller fra human knoglemarv for at vise gennemførlighed til fremtidig brug også i kliniske diagnostiske indstillinger. PDX er patienttumorvæv, der implanteres i immunkompromitteret eller humaniseret musemodel for at muliggøre undersøgelse af vækst, progression og behandlingsmuligheder for den oprindelige patient 7,8.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.05% Trypsin-EDTA</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>25300-054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adhesive</td>
			<td>Norland Optical Adhesive</td>
			<td>NOA63</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell lifter</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.1832</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholera Toxin from Vibrio cholerae</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>12585-014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CIM-plate</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5665817001</td>
			<td>Cell analyzer plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase from Clostridium histolyticum</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C0130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase</td>
			<td>StemCell</td>
			<td>7913</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>11995-065</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM-F12</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>11875-093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS), Heat Inactivated</td>
			<td>Omega Scientific</td>
			<td>FB-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>15630106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse serum (HS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>16050-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human EGF</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>AF-100-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human umbilical Vein endothelail cells (HUVEC)</td>
			<td>LONZA (RRID:CVCL_2959)</td>
			<td>C-2517A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HUVEC media</td>
			<td>LONZA</td>
			<td>CC-3162</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrocortisone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H4001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin Transferrin Selenium Ethanolamine (ITSX) (100x)</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>51500056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin, Human Recombinant, Zinc Solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C8052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>J2 Fibroblasts</td>
			<td>Stemcell (RRID:CVCL_W667)</td>
			<td>100-0353</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LymphoPrep</td>
			<td>Stemcell</td>
			<td>7851</td>
			<td>Density gradient medium for the isolation of mononuclear cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354230</td>
			<td>Basement membrane matrix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MCFDCIS.com cells ( DCIS)</td>
			<td>RRID:CVCL_5552</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MDA-MB-231 cells</td>
			<td>RRID:CVCL_0062</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Milling machine</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Bridgeport Series 1 Vertical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline (1x)</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>10010049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethersulfone (PES) membrane</td>
			<td>Sterlitech</td>
			<td>PCTF029030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RBC lysis solution</td>
			<td>Stemcell</td>
			<td>7800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy Micro Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RTCA DP analyzer</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>3X16</td>
			<td>Dual purpose cell analyzer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T4799</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

real-time detection and capture of invasive cell subpopulations from co-cultures

Invasion og metastatisk spredning af kræftceller er den største dødsårsag fra kræft. Assays udviklet tidligt for at måle det invasive potentiale i kræftcellepopulationer genererer typisk en enkelt endepunktsmåling, der ikke skelner mellem kræftcelleunderpopulationer med forskelligt invasivt potentiale. Tumormikromiljøet består også af forskellige bosiddende stromal- og immunceller, der ændrer og deltager i kræftcellernes invasive opførsel. Invasion i væv spiller også en rolle i immuncellesubpopulationer, der afværger mikroorganismer eller eliminerer syge celler fra parenchymen og endotelcellerne under vævsombygning og angiogenese. Real-Time Cellular Analysis (RTCA), der bruger impedansbiosensorer til at overvåge celleinvasion, var et stort skridt fremad ud over endepunktsmåling af invasion: dette giver kontinuerlige målinger over tid og kan således afsløre forskelle i invasionshastigheder, der går tabt i slutpunktsanalysen. Ved hjælp af den nuværende RTCA-teknologi udvidede vi dobbeltkammerarrays ved at tilføje et yderligere kammer, der kan indeholde stromal- og / eller immunceller og gør det muligt at måle invasionshastigheden under påvirkning af udskillede faktorer fra co-dyrkede stromal- eller immunceller over tid. Ud over dette giver det unikke design mulighed for at løsne kamre til enhver tid og isolere den mest invasive kræftcelle eller andre celleunderpopulationer, der er til stede i heterogene blandinger af tumorisolater, der testes. Disse mest invasive kræftceller og andre celleunderpopulationer driver ondartet progression til metastatisk sygdom, og deres molekylære egenskaber er vigtige for dybtgående mekanistiske undersøgelser, udvikling af diagnostiske sonder til påvisning af dem og vurdering af sårbarheder. Således kan inkluderingen af lægemidler med små eller store molekyler bruges til at teste potentialet i terapier, der er målrettet mod kræft og / eller stromalcelleunderpopulationer med det formål at hæmme (f.eks. Kræftceller) eller forbedre (f.eks. Immunceller) invasiv adfærd.

Ved hjælp af det nydesignede trekammerarray blev invasion af cellerne testet i nærvær eller fravær af stromalceller såsom fibroblaster. MDA-MB-231 celleinvasion blev forbedret, når bestrålede schweiziske 3T3 fibroblaster (J2-stamme) blev podet i bundkammeret, hvilket muliggør udveksling af faktorer mellem de to cellelinjer. Interessant nok steg MDA-MB-231 invasionen, da 3T3-J2-celler blev fordoblet i antal (figur 3A). På den anden side synes invasionshastigheden af en invasiv klon a...

Watch this Scientific Journal Video about Real-Time Detection and Capture of Invasive Cell Subpopulations from Co-Cultures at JoVE.com

Real-Time Detection and Capture of Invasive Cell Subpopulations from Co-Cultures

Vi beskriver en tilgang til at opdage og fange invasive celleunderpopulationer i realtid. Det eksperimentelle design bruger Real-Time Cellular Analysis ved at overvåge ændringer i cellernes elektriske impedans. Invasive kræft-, immun-, endotel- eller stromale celler i komplekse væv kan fanges, og virkningen af co-kulturer kan vurderes.

Detektion og indfangning i realtid af invasive cellesubpopulationer fra co-kulturer

Invasion and metastatic spread of cancer cells are the major cause of death from cancer. Assays developed early on to measure the invasive potential of ...

Denne teknik gør det muligt at identificere cellerne med forskellige invasive kapaciteter under påvirkning af udskillede faktorer fra samkulturerede stromalceller. Teknikken vurderer virkningen af udskillede faktorer fra samkulturerede stromal- eller immunceller på celleinvasion. Det tillader også genopretning og analyse af invasive cellesubpopulationer, der er til stede i heterogene celleblandinger.Teknikken kan bestemme, hvilke tumorer der har invasive celleunderpopulationer, der fører til metastase. Indfangning og analyse af invasive kræftceller kan informere terapibeslutninger. For at starte cellekulturen skal du vaske adhærenscellekulturerne med ca. 70% sammenflydende med 1X fosfatbufret saltvand.Tilsæt derefter 0,05% trypsin og EDTA-opløsning for at løfte cellerne. Neutraliser trypsinopløsningen med cellekulturmedier indeholdende serum og tæl cellerne ved hjælp af en alikvot af cellesuspensionen. Placer alle tre sterile kamre i vævskulturhætten.Find knappen på den korte side af det nederste kammer, og orienter det nederste kammer, så knappen vender mod eksperimentatoren. Tilsæt 30.000 til 50.000 celler i 90 mikroliter medier til hver brønd fra det nederste kammer uden at danne bobler. Brug 5% af føtalt kvægserum suppleret med medier i to nedre kamre som en positiv kontrol for cellemotilitet, og brug 0% serumstænkt medie som en negativ kontrol.Drej det nederste kammer ved 90 grader efter at have ladet det sætte sig i 10 til 15 minutter i emhætten. Placer derefter det midterste kammer ovenpå, så knappen på det nederste kammer glider ind i hakket på det midterste kammer. Skub kammeret lodret nedad, indtil der høres et klik fra hver af samlingens langsider.Tilsæt 160 mikroliter serumfrie medier til alle brøndene i det midterste kammer. Sørg for, at en kuppelformet menisk er synlig, når brøndene er fyldt, og placer det øverste kammer med elektroder, der vender nedad mod det midterste kammer for at justere de blå prikker på de midterste og øverste kamre. Skub kammeret lodret ned, indtil der høres en kliklyd fra hver af samlingens langsider.Tilsæt 20 til 50 mikroliter serumfrie medier til det øverste kammer. Monter enheden på dobbeltcelleanalysatoren i vævskulturinkubatoren, og vent 30 minutter, før du måler baggrunden. Åbn celleanalysatorsoftwaren, vælg derefter den holder, der skal bruges, efterfulgt af et klik på meddelelsesfanen, og sørg for, at der står Forbindelser okay "for at sikre, at arrayet er godt placeret i holderen, og elektroderne er godt justeret med sensorerne.Klik på fanen eksperimentnoter, og udfyld alle mulige oplysninger om eksperimentet. Klik derefter på fanen Layout og udfyld beskrivelsen af arraylayoutet. Klik derefter på fanen Tidsplan, og tilføj to trin fra trinmenuen, et baggrundstrin med et feje og et testtrin med 100 fejninger.Når arrayet har været i inkubatoren med dobbelt formål i 30 minutter, skal du klikke på afspilningsknappen for at starte baggrundsmåling. Når baggrundsmålingen er udført, skal du fjerne arrayet fra holderen og placere det tilbage i cellekulturhætten. Derefter tilsættes 30.000 til 50.000 celler i 100 mikroliter serumfrie medier til hver brønd i det øverste kammer.Dette er de celler, som elektroden vil opdage, når de med succes migrerer gennem membranen. Lad samlingen stå i emhætten i 30 minutter, før den monteres på celleanalysatoren til dobbelt formål til impedansmåling. Placer arrayet tilbage i celleanalysatoren med to formål, og kontroller meddelelsesfanen for meddelelsen Forbindelser okay".Klik på afspilningsknappen for at starte impedansmåling, og klik derefter på fanen Plot for at overvåge signalets fremskridt. Hvis slutpunktet nås inden 25 timer, skal du klikke på afbrydelsestrinnet i rullemenuen Udfør. Hvis du vil eksportere data, skal du højreklikke på grafen, vælge Kopiér i listeformatet og derefter indsætte dataene i et regneark.Overvåg migrationshastigheden i realtid på celleanalysatoren med dobbelt formål for at bestemme det stoppepunkt, der er af interesse. Når det er opnået, skal du afmontere samlingen fra celleanalysatoren med dobbelt formål og placere den i vævskulturhætten. Forbered et passende antal 1,5 ml mikrocentrifugerør for at opsamle cellerne fra de brønde, der er af interesse.Anbring samlingen i en 10 centimeter skål for at indeholde væsker, når kamrene løsnes. Skub de fleksible snappende ender på langsiden af det midterste kammer indad, indtil der høres en kliklyd, efterfulgt af demontering af det øverste kammer og omvendt det til en ny 10 centimeter skål. Brug en celleløfter med et 13 millimeter blad til at opsamle cellerne fra alle brønde, der har den samme eksperimentelle tilstand.Skyl eller dypp bladet i 1X fosfatbufret saltvand for at opsamle cellerne i 1,5 ml mikrocentrifugerør. Derefter spinder cellerne ned ved 500 gange G i fem minutter og formerer disse indsamlede celler eller udfører endepunktsanalyse såsom enkeltcellet RNA-sekventering. Vurdering af invasion af cellerne i nærvær eller fravær af stromale celler viste, at MDA-MB-231 celleinvasion blev forbedret, når bestrålet Swiss-3T3 fibroblaster J2 stamme sad i det nederste kammer til udveksling af faktorer mellem de to cellelinjer.Interessant nok steg MDA-MB-231 invasionen, da 3T3 J2-celler blev fordoblet i antal. På den anden side synes invasionshastigheden af en invasiv klon af MCFDCIS-celler, DCIS-Delta Four, at blive hæmmet af krydstale med 3T3 J2-celler, hvilket tyder på den værdifulde anvendelse af trekammerarrayet til måling af stromaens varierende virkninger. I dette tilfælde fibroblaster på celleinvasion.Humane navlestrengselendeotelceller var mere invasive som reaktion på faktorer udskilt af MDA-MB-231-celler, i modsætning til dem, der udskilles af DCIS-celler, hvilket er i overensstemmelse med invasive tumorers evne til at rekruttere endotelceller til dannelse af blodkar og senere spredning i cirkulationen. Patientafledte xenograftceller invasion fra det øverste kammer steg som reaktion på co-dyrkede humane knoglemarvsimmunceller. Interessant nok var tilstedeværelsen af 2% serum i bundkammeret med de humane knoglemarvsimmunceller afgørende for patientafledte xenografts invasion.Brønde kan belægges med en ekstracellulær matrix for at efterligne kældermembranbarrieren. Terapeutiske midler kan tilsættes medierne i brøndene for at overvåge deres virkning på invasion.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Capture and Release of Viable Circulating Tumor Cells from Blood

Capture og Frigivelse af levedygtige Cirkulerende tumorceller fra Blood

We demonstrate a method for size based capture of viable circulating tumor cell (CTC) from whole blood, along with the release of these cells from chip ...

Invasive Behavior of Human Breast Cancer Cells in Embryonic Zebrafish

Invasiv Opførsel af humane brystcancerceller i embryonale zebrafisk

In many cases, cancer patients do not die of a primary tumor, but rather because of metastasis. Although numerous rodent models are available for studying ...

Four-color Fluorescence Immunohistochemistry of T-cell Subpopulations in Archival Formalin-fixed, Paraffin-embedded Human Oropharyngeal Squamous Cell Carcinoma Samples

Four-Color Fluorescence Immunohistochemistry af T-Cell Subpopulations i Archival Formalin-Fixed, Paraffin-Embedded Human Oropharyngeal Squamous Cell Carcinoma Samples

The four-color fluorescence immunohistochemistry (IHC) technique is a method to quantify cell populations of interest while taking into account their ...

Preparation and Metabolic Assay of 3-dimensional Spheroid Co-cultures of Pancreatic Cancer Cells and Fibroblasts

Forberedelse og metaboliske analyse af 3-dimensionelle klumpformet Co kulturer af kræft i bugspytkirtlen celler og fibroblaster

Many cancer types, including pancreatic cancer, have a dense fibrotic stroma that plays an important role in tumor progression and invasion. Activated ...

Serum and Plasma Copy Number Detection Using Real-time PCR

Serum og Plasma kopi nummer påvisning ved hjælp af Real-time PCR

Serum and plasma cell free DNA (cfDNA) has been shown as an informative, non-invasive source of biomarkers for cancer diagnosis, prognosis, monitoring, ...

Real Time Detection of In Vitro Tumor Cell Apoptosis Induced by CD8+ T Cells to Study Immune Suppressive Functions of Tumor-infiltrating Myeloid Cells

Real Time Detection of In Vitro Tumor Cell Apoptosis Induced by CD8+ T Cells to Study Immune Suppressive Functions of Tumor-infiltrating Myeloid Cells

Realtid påvisning af i Vitro Tumor celle apoptose induceret af CD8+ T-celler til at studere immun suppressiv funktioner af Tumor infiltrerer myeloide celler

Potentiation of the tumor-killing ability of CD8+ T cells in tumors, along with their efficient tumor infiltration, is a key element of successful ...

Real-Time Monitoring of Human Glioma Cell Migration on Dorsal Root Ganglion Axon-Oligodendrocyte Co-Cultures

Realtidsovervågning af menneskelige Glioma celle migration på dorsale root ganglion Axon-Oligodendrocyte Co-kulturer

Glioblastoma is one of the most aggressive human cancers due to extensive cellular heterogeneity and the migration properties of hGCs. In order to better ...

Time-Lapse 2D Imaging of Phagocytic Activity in M1 Macrophage-4T1 Mouse Mammary Carcinoma Cells in Co-cultures

Time-lapse 2D billeddannelse af Fagocytisk aktivitet i M1 Macrophage-4T1 mus mammary karcinom celler i co-kulturer

Tumor-associated macrophages (TAMs) have been identified as an important component for tumor growth, invasion, metastasis, and resistance to cancer ...

Combined Use of Tail Vein Metastasis Assays and Real-Time In Vivo Imaging to Quantify Breast Cancer Metastatic Colonization and Burden in the Lungs

Kombineret brug af hale vene metastase assays og Real-Time in vivo billeddannelse at kvantificere brystkræft metastatisk kolonisering og byrde i lungerne

Metastasis is the main cause of cancer-related deaths and there are limited therapeutic options for patients with metastatic disease. The identification ...

Impedance-based Real-time Measurement of Cancer Cell Migration and Invasion

Impedans-baseret Real-time Måling af Kræft Cell Migration og Invasion

Cancer arises due to uncontrolled proliferation of cells initiated by genetic instability, mutations, and environmental and other stress factors. These ...