Name: real-time detection and capture of invasive cell subpopulations from co-cultures
Uploaded: 2022-03-30T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Real-Time Detection and Capture of Invasive Cell Subpopulations from Co-Cultures at JoVE.com

We willen Dr. Alana Welms, Huntsman Cancer Institute, University of Utah, bedanken voor het verstrekken van de patiënt-afgeleide xenografts (HCI-010). Dit werk werd ondersteund door NIH-subsidies R01CA205632, R21CA226542 en gedeeltelijk door een subsidie van Agilent Technologies.

De studie werd beoordeeld en beschouwd als "vrijgesteld" door de Institutional Review Board van Georgetown University (IRB # 2002-022). Vers geoogste beenmergweefsels werden verzameld uit afgedankte gezonde menselijke beenmergverzamelingsfilters die waren gedeïdentificeerd.
1. Nieuw kamerontwerp (figuur 2)
<ol><li>Open een nieuwe tweekamercelanalysatorplaat. Zet de bovenste kamer opzij met elektroden.</li>
	<li>Scheer met behul...

<ol>
	<li>Friedl, P., Gilmour, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collective+cell+migration+in+morphogenesis,+regeneration+and+cancer.">Collective cell migration in morphogenesis, regeneration and cancer.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10 (7), 445-457 (2009).</li><li>Boyden, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chemotactic+effect+of+mixtures+of+antibody+and+antigen+on+polymorphonuclear+leucocytes.">The chemotactic effect of mixtures of antibody and antigen on polymorphonuclear leucocytes.</a> The Journal of Experimental Medicine. 115 (3), 453-466 (1962).</li><li>Xu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+review+of+impedance+measurements+of+whole+cells.">A review of impedance measurements of whole cells.</a> Biosensors &amp; Bioelectronics. 77, 824-836 (2016).</li><li>Stylianou, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+single-chain+antibody+targeting+of+the+ligand-binding+domain+in+the+anaplastic+lymphoma+kinase+receptor.">Effect of single-chain antibody targeting of the ligand-binding domain in the anaplastic lymphoma kinase receptor.</a> Oncogene. 28 (37), 3296-3306 (2009).</li><li>Abassi, Y. A., Wang, X., Xu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real+time+electronic+cell+sensing+system+and+applications+for+cytotoxcity+profiling+and+compound+assays.">Real time electronic cell sensing system and applications for cytotoxcity profiling and compound assays.</a> United States Patent. , 1-88 (2013).</li><li>Abassi, Y. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-free,+real-time+monitoring+of+IgE-mediated+mast+cell+activation+on+microelectronic+cell+sensor+arrays.">Label-free, real-time monitoring of IgE-mediated mast cell activation on microelectronic cell sensor arrays.</a> Journal of Immunological Methods. 292 (1-2), 195-205 (2004).</li><li>Morton, C. L., Houghton, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+human+tumor+xenografts+in+immunodeficient+mice.">Establishment of human tumor xenografts in immunodeficient mice.</a> Nature Protocols. 2 (2), 247-250 (2007).</li><li>DeRose, Y. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+grafts+derived+from+women+with+breast+cancer+authentically+reflect+tumor+pathology,+growth,+metastasis+and+disease+outcomes.">Tumor grafts derived from women with breast cancer authentically reflect tumor pathology, growth, metastasis and disease outcomes.</a> Nature Medicine. 17 (11), 1514-1520 (2011).</li><li>Sharif, G. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+AIB1+isoform+alters+enhancer+access+and+enables+progression+of+early-stage+triple-negative+breast+cancer.">An AIB1 isoform alters enhancer access and enables progression of early-stage triple-negative breast cancer.</a> Cancer Research. 81 (16), 4230-4241 (2021).</li><li>Caileau, R., Olive, M., Cruciger, Q. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+human+breast+carcinoma+cell+lines+of+metastatic+origin:+preliminary+characterization.">Long-term human breast carcinoma cell lines of metastatic origin: preliminary characterization.</a> In Vitro. 14 (11), 911-915 (1978).</li><li>Sharif, G. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+growth+density+modulates+cancer+cell+vascular+invasion+via+Hippo+pathway+activity+and+CXCR2+signaling.">Cell growth density modulates cancer cell vascular invasion via Hippo pathway activity and CXCR2 signaling.</a> Oncogene. 34 (48), 5879-5889 (2015).</li><li>Miller, F. R., Santner, S. J., Tait, L., Dawson, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MCF10DCIS.com+xenograft+model+of+human+comedo+ductal+carcinoma+in+situ.">MCF10DCIS.com xenograft model of human comedo ductal carcinoma in situ.</a> Journal of the National Cancer Institute. 92 (14), 1185-1186 (2000).</li><li>Winkler, J., Abisoye-Ogunniyan, A., Metcalf, K. J., zenaa, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concepts+of+extracellular+matrix+remodelling+in+tumour+progression+and+metastasis.">Concepts of extracellular matrix remodelling in tumour progression and metastasis.</a> Nature Communications. 11 (1), 1-19 (2020).</li><li>Nkosi, D., Sun, L., Duke, L. C., Meckes, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epstein-Barr+virus+LMP1+manipulates+the+content+and+functions+of+extracellular+vesicles+to+enhance+metastatic+potential+of+recipient+cells.">Epstein-Barr virus LMP1 manipulates the content and functions of extracellular vesicles to enhance metastatic potential of recipient cells.</a> PLoS Pathogens. 16 (12), 1009023 (2020).</li><li>Eisenberg, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanistic+modeling+of+the+effects+of+myoferlin+on+tumor+cell+invasion.">Mechanistic modeling of the effects of myoferlin on tumor cell invasion.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (50), 20078-20083 (2011).</li></ol>

We hebben het ontwerp van een array met twee kamers aangepast om een derde kamer op te nemen voor het monitoren van celinvasie in realtime in aanwezigheid van stromale cellen. We hebben verschillende effecten van co-gekweekte fibroblasten op invasieve en niet-invasieve kankercellen waargenomen, wat aangeeft dat de array kan worden gebruikt om onderscheid te maken tussen subpopulaties van kankercellen die anders reageren op factoren die worden geproduceerd door co-gekweekte stromale cellen. De array werd ook gebruikt om d...

Celinvasie is een belangrijk proces waarmee cellen keldermembraanbarrières kunnen passeren als reactie op omgevingssignalen van stromale cellen. Het is een cruciale stap in verschillende stadia van ontwikkeling voor immuunresponsen, wondgenezing, weefselherstel en maligniteiten die kunnen evolueren van lokale laesies tot invasieve en gemetastaseerde kankers1. Assays die al vroeg zijn ontwikkeld om het invasieve potentieel van celpopulaties te meten, genereren meestal een enkele eindpuntmeting of vereisen pre-labeling van invasieve cellen2. De integratie van micro-elektronica en microfluïdica-technieken is nu ontwikkeld om verschillende aspecten van celbiologie te detecteren, zoals levensvatbaarheid, beweging en hechting met behulp van de elektrische impedantie van levende cellen op micro-elektroden 3,4. Impedantiemeting maakt een labelvrije, niet-invasieve en kwantitatieve beoordeling van de celstatusmogelijk 3. Hier beschrijven we een array met drie kamers op basis van het ontwerp van het Real-Time Cellular Analysis (RTCA) -systeem dat werd ontwikkeld door Abassi et al.5. De driekamerige array maakt het mogelijk om co-gekweekte cellen te beoordelen op cellulaire invasie en herstel van invasieve cellen voor aanvullende analyses of uitbreiding.
In het celanalysatorsysteem dringen cellen binnen door een extracellulaire matrix die is gecoat op een poreus membraan en bereiken een interdigitated elektrode-array aan de andere kant van de barrière. Naarmate de invasieve cellen zich in de loop van de tijd blijven hechten en deze elektrode-array bezetten, verandert de elektrische impedantie parallel. Het huidige systeem bestaat uit een celinvasie en migratie (CIM) 16-well plaat met twee kamers. Het RTCA-DP (dual purpose) (voortaan dual purpose cell analyzer genoemd) instrument bevat sensoren voor impedantiemeting en geïntegreerde software om de impedantiegegevens te analyseren en te verwerken. Impedantiewaarden bij baseline zijn afhankelijk van de ionische sterkte van media in de putten en worden veranderd als cellen zich aan de elektroden hechten. De impedantieveranderingen zijn afhankelijk van het aantal cellen, hun morfologie en de mate waarin cellen zich aan de elektroden hechten. Een meting van de putten met media voordat de cellen worden toegevoegd, wordt beschouwd als het achtergrondsignaal. De achtergrond wordt afgetrokken van impedantiemetingen na het bereiken van evenwicht met cellen die zich hechten en verspreiden op de elektroden. Een eenheidsloze parameter van de status van de cellen op een elektrode genaamd Cell Index (CI) wordt als volgt berekend: CI = (impedantie na evenwicht - impedantie bij afwezigheid van cellen) / nominale impedantiewaarde6. Wanneer migratiesnelheden van verschillende cellijnen worden vergeleken, kan de Delta CI worden gebruikt om de celstatus te vergelijken, ongeacht het verschil in hechting dat wordt weergegeven in de eerste paar metingen.
De nieuw ontworpen array met drie kamers bouwt voort op het bestaande ontwerp en maakt gebruik van de bovenste kamer van het dual purpose cell analyzer-systeem dat de elektroden bevat. De gemodificeerde midden- en onderkamers zijn aangepast om de assemblage in de dual purpose celanalysator te passen voor impedantiemeting en -analyse met behulp van de geïntegreerde software. De twee belangrijkste verbeteringen die het nieuwe ontwerp biedt ten opzichte van de bestaande CIM-plaat met twee kamers (voortaan celanalysatorplaat genoemd) zijn: i) het vermogen om invasieve celsubpopulaties die aanwezig zijn in heterogene celmengsels te herstellen en vervolgens te analyseren en ii) de optie om de impact van uitgescheiden factoren van co-gekweekte stromale of immuuncellen op celinvasie te beoordelen (figuur 1).
Deze technologie kan nuttig zijn bij het bestuderen van de subpopulaties van cellen met verschillende invasieve capaciteiten. Dat omvat (a) invasieve kankercellen die omliggende weefsels of bloed- en lymfevaten binnendringen of extravaseren op gemetastaseerde zaaiplaatsen in verre organen, (b) cellen van het immuunsysteem die weefsels binnendringen om ziekteverwekkers of zieke cellen aan te pakken, (c) endotheelcellen die weefsels binnendringen om nieuwe bloedvaten te vormen tijdens weefselreorganisatie of wondgenezing, evenals (d) stromale cellen uit de tumormicro-omgeving die samen met kankercellen ondersteunen en binnendringen. De aanpak maakt de opname van stromale cross-talk mogelijk die de celmotiliteit en invasie kan moduleren. De hier getoonde haalbaarheidsstudies gebruiken deze gemodificeerde array gericht op kankercelinvasie en de interactie met het stroma als een modelsysteem, inclusief endotheelinvasie als reactie op differentiële signalen van kankercellen. De aanpak kan worden geëxtrapoleerd om kankercellen en andere celtypen zoals subpopulaties van immuuncellen, fibroblasten of endotheelcellen te isoleren. We hebben invasieve en niet-invasieve gevestigde borstkankercellijnen getest als een proof of principle. We gebruikten ook cellen van patiënt-afgeleide xenograft (PDX) invasie in reactie op immuuncellen uit menselijk beenmerg om haalbaarheid aan te tonen voor toekomstig gebruik, ook in klinische diagnostische omgevingen. PDX zijn tumorweefsels van patiënten die worden geïmplanteerd in immuungecompromitteerde of gehumaniseerde muizenmodellen om studie van groei, progressie en behandelingsopties voor de oorspronkelijke patiënt mogelijk te maken 7,8.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.05% Trypsin-EDTA</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>25300-054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adhesive</td>
			<td>Norland Optical Adhesive</td>
			<td>NOA63</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell lifter</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.1832</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholera Toxin from Vibrio cholerae</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>12585-014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CIM-plate</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5665817001</td>
			<td>Cell analyzer plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase from Clostridium histolyticum</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C0130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase</td>
			<td>StemCell</td>
			<td>7913</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>11995-065</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM-F12</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>11875-093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS), Heat Inactivated</td>
			<td>Omega Scientific</td>
			<td>FB-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>15630106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse serum (HS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>16050-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human EGF</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>AF-100-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human umbilical Vein endothelail cells (HUVEC)</td>
			<td>LONZA (RRID:CVCL_2959)</td>
			<td>C-2517A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HUVEC media</td>
			<td>LONZA</td>
			<td>CC-3162</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrocortisone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H4001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin Transferrin Selenium Ethanolamine (ITSX) (100x)</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>51500056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin, Human Recombinant, Zinc Solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C8052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>J2 Fibroblasts</td>
			<td>Stemcell (RRID:CVCL_W667)</td>
			<td>100-0353</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LymphoPrep</td>
			<td>Stemcell</td>
			<td>7851</td>
			<td>Density gradient medium for the isolation of mononuclear cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354230</td>
			<td>Basement membrane matrix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MCFDCIS.com cells ( DCIS)</td>
			<td>RRID:CVCL_5552</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MDA-MB-231 cells</td>
			<td>RRID:CVCL_0062</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Milling machine</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Bridgeport Series 1 Vertical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline (1x)</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>10010049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethersulfone (PES) membrane</td>
			<td>Sterlitech</td>
			<td>PCTF029030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RBC lysis solution</td>
			<td>Stemcell</td>
			<td>7800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy Micro Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RTCA DP analyzer</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>3X16</td>
			<td>Dual purpose cell analyzer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T4799</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

real-time detection and capture of invasive cell subpopulations from co-cultures

Invasie en gemetastaseerde verspreiding van kankercellen zijn de belangrijkste doodsoorzaak van kanker. Assays die al vroeg zijn ontwikkeld om het invasieve potentieel van kankercelpopulaties te meten, genereren meestal een enkele eindpuntmeting die geen onderscheid maakt tussen subpopulaties van kankercellen met verschillende invasieve mogelijkheden. Ook bestaat de tumormicro-omgeving uit verschillende residente stromale en immuuncellen die veranderen en deelnemen aan het invasieve gedrag van kankercellen. Invasie in weefsels speelt ook een rol bij subpopulaties van immuuncellen die micro-organismen afweren of zieke cellen uit het parenchym en endotheelcellen elimineren tijdens weefselremodellering en angiogenese. Real-Time Cellular Analysis (RTCA) die impedantiebiosensoren gebruikt om celinvasie te monitoren, was een grote stap voorwaarts dan eindpuntmeting van invasie: dit biedt continue metingen in de loop van de tijd en kan dus verschillen in invasiesnelheden onthullen die verloren gaan in de eindpunttest. Met behulp van de huidige RTCA-technologie hebben we arrays met twee kamers uitgebreid door een extra kamer toe te voegen die stromale en / of immuuncellen kan bevatten en waarmee de invasiesnelheid onder invloed van uitgescheiden factoren van co-gekweekte stromale of immuuncellen in de loop van de tijd kan worden gemeten. Daarnaast maakt het unieke ontwerp het mogelijk om kamers op elk moment los te maken en de meest invasieve kankercel of andere celsubpopulaties die aanwezig zijn in heterogene mixen van geteste tumorisolaten te isoleren. Deze meest invasieve kankercellen en andere celsubpopulaties stimuleren kwaadaardige progressie naar gemetastaseerde ziekte, en hun moleculaire kenmerken zijn belangrijk voor diepgaande mechanistische studies, de ontwikkeling van diagnostische sondes voor hun detectie en de beoordeling van kwetsbaarheden. De opname van geneesmiddelen met kleine of grote moleculen kan dus worden gebruikt om het potentieel te testen van therapieën die zich richten op kanker en / of subpopulaties van stromale cellen met als doel het remmen (bijv. Kankercellen) of het verbeteren (bijv. Immuuncellen) invasief gedrag.

Met behulp van de nieuw ontworpen driekamerige array werd invasie van de cellen getest in de aan- of afwezigheid van stromale cellen zoals fibroblasten. MDA-MB-231 celinvasie werd versterkt wanneer bestraalde Zwitserse 3T3 fibroblasten (J2-stam) in de onderste kamer werden gezaaid, waardoor de uitwisseling van factoren tussen de twee cellijnen mogelijk werd. Interessant is dat de MDA-MB-231-invasie toenam wanneer 3T3-J2-cellen in aantal werden verdubbeld (figuur 3A). Aan de andere kant lijkt...

Watch this Scientific Journal Video about Real-Time Detection and Capture of Invasive Cell Subpopulations from Co-Cultures at JoVE.com

Real-Time Detection and Capture of Invasive Cell Subpopulations from Co-Cultures

We beschrijven een aanpak om invasieve celsubpopulaties in realtime te detecteren en vast te leggen. Het experimentele ontwerp maakt gebruik van Real-Time Cellular Analysis door veranderingen in de elektrische impedantie van cellen te monitoren. Invasieve kanker, immuun-, endotheel- of stromale cellen in complexe weefsels kunnen worden vastgelegd en de impact van coculturen kan worden beoordeeld.

Real-time detectie en vastlegging van invasieve celsubpopulaties uit coculturen

Invasion and metastatic spread of cancer cells are the major cause of death from cancer. Assays developed early on to measure the invasive potential of ...

Deze techniek maakt de identificatie van de cellen met verschillende invasieve capaciteiten mogelijk onder invloed van uitgescheiden factoren uit co-gekweekte stromale cellen. De techniek beoordeelt de impact van uitgescheiden factoren van co-gekweekte stromale of immuuncellen op celinvasie. Het maakt ook het herstel en de analyse van invasieve celsubpopulaties mogelijk die aanwezig zijn in heterogene celmengsels.De techniek kan bepalen welke tumoren invasieve celsubpopulaties herbergen die leiden tot metastase. Het vangen en analyseren van invasieve kankercellen kan therapiebeslissingen informeren. Om de celkweek te beginnen, wast u de hechtingscelculturen met ongeveer 70% confluentie met 1X fosfaat gebufferde zoutoplossing.Voeg vervolgens 0,05% trypsine en EDTA-oplossing toe om de cellen op te tillen. Neutraliseer de trypsineoplossing met celkweekmedia die serum bevatten en tel de cellen met behulp van een aliquot van de celsuspensie. Plaats alle drie de steriele kamers in de weefselkweekkap.Plaats de knop aan de korte kant van de onderste kamer en oriënteer de onderste kamer zo dat de knop naar de experimentator is gericht. Voeg 30.000 tot 50.000 cellen in 90 microliter media toe aan elke put vanuit de onderste kamer zonder bubbels te vormen. Gebruik 5% van foetale runderserum aangevulde media in twee onderste kamers als een positieve controle voor celmotiliteit, en gebruik 0% serum aangevulde media als een negatieve controle.Draai de onderste kamer op 90 graden nadat je deze 10 tot 15 minuten in de kap hebt laten bezinken. Plaats vervolgens de middelste kamer bovenop zodat de knop op de onderste kamer in de inkeping op de middelste kamer schuift. Duw de kamer verticaal naar beneden totdat er een klik te horen is van elk van de lange zijden van de assemblage.Voeg 160 microliter serumvrije media toe aan alle putjes van de middelste kamer. Zorg ervoor dat een koepelvormige meniscus zichtbaar is nadat de putjes zijn gevuld en plaats de bovenste kamer met elektroden naar beneden gericht op de middelste kamer om de blauwe stippen op de middelste en bovenste kamers uit te lijnen. Duw de kamer verticaal naar beneden totdat er een klikgeluid klinkt van elk van de lange zijden van de assemblage.Voeg 20 tot 50 microliter serumvrije media toe aan de bovenste kamer. Monteer de assemblage op de dual-purpose celanalysator in de weefselkweekincubator en wacht 30 minuten voordat u de achtergrond meet. Open de celanalysatorsoftware, selecteer vervolgens de houder die moet worden gebruikt, gevolgd door een klik op het berichttabblad en zorg ervoor dat er verbindingen in orde staan om ervoor te zorgen dat de array goed in de houder is geplaatst en de elektroden goed zijn uitgelijnd met de sensoren.Klik op het tabblad experimentnotities en vul alle mogelijke informatie over het experiment in. Klik vervolgens op het tabblad Lay-out en vul de beschrijving van de array-indeling in. Klik vervolgens op het tabblad Planning en voeg twee stappen toe uit het stappenmenu, een achtergrondstap met één veeg en een teststap met 100 sweeps.Zodra de array 30 minuten in de incubator voor tweevoudige celanalysator heeft gestaan, klikt u op de afspeelknop om de achtergrondmeting te starten. Nadat de achtergrondmeting is uitgevoerd, verwijdert u de array uit de houder en plaatst u deze terug in de celkweekkap. Voeg vervolgens 30.000 tot 50.000 cellen in 100 microliter serumvrije media toe aan elke put van de bovenste kamer.Dit zijn de cellen die de elektrode zal detecteren zodra ze met succes door het membraan migreren. Laat de assemblage 30 minuten in de motorkap staan voordat u deze op de dual-purpose celanalysator monteert voor impedantiemeting. Plaats de array terug in de dual-purpose cell analyzer en controleer op het berichttabblad voor het bericht Connections okay"-bericht.Klik op de afspeelknop om de impedantiemeting te starten en klik vervolgens op het tabblad Plot om de voortgang van het signaal te volgen. Als het eindpunt vóór 25 uur is bereikt, klikt u op de stap afbreken in het vervolgkeuzemenu Uitvoeren. Als u gegevens wilt exporteren, klikt u met de rechtermuisknop op de grafiek, kiest u Kopiëren in de lijstindeling en plakt u de gegevens in een spreadsheet.Bewaak de migratiesnelheid in realtime op de dual-purpose celanalysator om het stoppunt van belang te bepalen. Eenmaal bereikt, ontkoppelt u de assemblage van de dual-purpose celanalysator en plaatst u deze in de weefselkweekkap. Bereid een passend aantal van 1,5 milliliter microcentrifugebuizen voor om de cellen uit de betreffende putten te verzamelen.Plaats de assemblage in een schaal van 10 centimeter om vloeistoffen te bevatten wanneer de kamers loskomen. Duw de flexibele knapeinden aan de lange kant van de middelste kamer naar binnen totdat een klikgeluid wordt gehoord, gevolgd door het demonteren van de bovenste kamer en het omkeren in een nieuwe schaal van 10 centimeter. Gebruik een cellifter met een mes van 13 millimeter om de cellen te verzamelen uit alle putten met dezelfde experimentele toestand.Spoel of dompel het mes in 1X fosfaat gebufferde zoutoplossing om de cellen te verzamelen in microcentrifugebuizen van 1,5 milliliter. Draai vervolgens de cellen gedurende vijf minuten op 500 keer G en verspreid deze verzamelde cellen of voer eindpuntanalyses uit, zoals eencellige RNA-sequencing. Beoordeling van invasie van de cellen in de aan- of afwezigheid van stromale cellen toonde aan dat MDA-MB-231 celinvasie werd versterkt wanneer bestraalde Swiss-3T3 fibroblasten J2-stam in de onderste kamer zaten voor de uitwisseling van factoren tussen de twee cellijnen.Interessant is dat de MDA-MB-231-invasie toenam wanneer 3T3 J2-cellen in aantal werden verdubbeld. Aan de andere kant lijkt de invasiesnelheid van een invasieve kloon van MCFDCIS-cellen, DCIS-Delta Four, te worden geremd door de overspraak met 3T3 J2-cellen, wat de waardevolle toepassing van de driekamerarray suggereert om verschillende effecten van het stroma te meten. In dit geval fibroblasten op celinvasie.Menselijke navelstrengas endotheelcellen waren invasiever als reactie op factoren die werden uitgescheiden door MDA-MB-231-cellen, in tegenstelling tot die uitgescheiden door DCIS-cellen, wat consistent is met het vermogen van invasieve tumoren om endotheelcellen te rekruteren voor bloedvatvorming en latere verspreiding in de bloedsomloop. Patiënt-afgeleide xenograft cellen invasie van de bovenste kamer nam toe als reactie op co-gekweekte menselijke beenmerg immuuncellen. Interessant is dat de aanwezigheid van 2% serum in de onderste kamer met de menselijke beenmergimmuuncellen essentieel was voor de invasie van van de patiënt afgeleide xenografts.Putten kunnen worden gecoat met een extracellulaire matrix om de keldermembraanbarrière na te bootsen. Therapeutische middelen kunnen worden toegevoegd aan de media in de putten om hun effect op de invasie te volgen.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Capture and Release of Viable Circulating Tumor Cells from Blood

Capture and Release van levensvatbare circulerende tumorcellen van Blood

We demonstrate a method for size based capture of viable circulating tumor cell (CTC) from whole blood, along with the release of these cells from chip ...

Invasive Behavior of Human Breast Cancer Cells in Embryonic Zebrafish

Invasief gedrag van menselijke borstkankercellen in embryonale zebravis

In many cases, cancer patients do not die of a primary tumor, but rather because of metastasis. Although numerous rodent models are available for studying ...

Four-color Fluorescence Immunohistochemistry of T-cell Subpopulations in Archival Formalin-fixed, Paraffin-embedded Human Oropharyngeal Squamous Cell Carcinoma Samples

Vier-kleur Fluorescentie Immunohistochemie van T-cel Subpopulations in Archival Formalin-Fixed, Paraffine-Embedded Human Oropharyngeal Squamous Cell Carcinoma Monsters

The four-color fluorescence immunohistochemistry (IHC) technique is a method to quantify cell populations of interest while taking into account their ...

Preparation and Metabolic Assay of 3-dimensional Spheroid Co-cultures of Pancreatic Cancer Cells and Fibroblasts

Voorbereiding en metabole kwantitatieve analyse van 3-dimensionale sferoïde co culturen van Pancreatic kankercellen en fibroblasten

Many cancer types, including pancreatic cancer, have a dense fibrotic stroma that plays an important role in tumor progression and invasion. Activated ...

Serum and Plasma Copy Number Detection Using Real-time PCR

Serum en Plasma kopiëren nummer detectie met behulp van PCR in real time

Serum and plasma cell free DNA (cfDNA) has been shown as an informative, non-invasive source of biomarkers for cancer diagnosis, prognosis, monitoring, ...

Real Time Detection of In Vitro Tumor Cell Apoptosis Induced by CD8+ T Cells to Study Immune Suppressive Functions of Tumor-infiltrating Myeloid Cells

Real Time Detection of In Vitro Tumor Cell Apoptosis Induced by CD8+ T Cells to Study Immune Suppressive Functions of Tumor-infiltrating Myeloid Cells

Real-time detectie van In Vitro Tumor cel Apoptosis geïnduceerd door CD8+ T cellen te bestuderen immuun onderdrukkende functies van Tumor-infiltreren myeloïde cellen

Potentiation of the tumor-killing ability of CD8+ T cells in tumors, along with their efficient tumor infiltration, is a key element of successful ...

Real-Time Monitoring of Human Glioma Cell Migration on Dorsal Root Ganglion Axon-Oligodendrocyte Co-Cultures

Real-time monitoring van menselijke Glioom Celmigratie op Rugwortel ganglion axon-oligodendrocyte co-culturen

Glioblastoma is one of the most aggressive human cancers due to extensive cellular heterogeneity and the migration properties of hGCs. In order to better ...

Time-Lapse 2D Imaging of Phagocytic Activity in M1 Macrophage-4T1 Mouse Mammary Carcinoma Cells in Co-cultures

Time-lapse 2D-beeldvorming van fagocytische activiteit in M1 macrophage-4T1 muis borstkanker cellen in co-culturen

Tumor-associated macrophages (TAMs) have been identified as an important component for tumor growth, invasion, metastasis, and resistance to cancer ...

Combined Use of Tail Vein Metastasis Assays and Real-Time In Vivo Imaging to Quantify Breast Cancer Metastatic Colonization and Burden in the Lungs

Gecombineerd gebruik van staart ader metastase assays en real-time in vivo beeldvorming om borstkanker te kwantificeren gemetastaseerde kolonisatie en last in de longen

Metastasis is the main cause of cancer-related deaths and there are limited therapeutic options for patients with metastatic disease. The identification ...

Impedance-based Real-time Measurement of Cancer Cell Migration and Invasion

Impedantie-gebaseerde Real-time meting van kanker cel migratie en invasie

Cancer arises due to uncontrolled proliferation of cells initiated by genetic instability, mutations, and environmental and other stress factors. These ...