Name: real-time detection and capture of invasive cell subpopulations from co-cultures
Uploaded: 2022-03-30T14:00:00
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Wir danken Dr. Alana Welms, Huntsman Cancer Institute, University of Utah, für die Bereitstellung der patientenabgeleiteten Xenotransplantate (HCI-010). Diese Arbeit wurde durch NIH-Zuschüsse R01CA205632, R21CA226542 und teilweise durch einen Zuschuss von Agilent Technologies unterstützt.

Die Studie wurde vom Institutional Review Board der Georgetown University (IRB # 2002-022) überprüft und als "befreit" betrachtet. Frisch geerntetes Knochenmarkgewebe wurde aus entsorgten gesunden menschlichen Knochenmarksammelfiltern entnommen, die de-identifiziert worden waren.
1. Neues Kammerdesign (Abbildung 2)
<ol><li>Öffnen Sie eine neue Zweikammer-Zellanalysatorplatte. Stellen Sie die obere Kammer mit Elektroden beisei...

<ol>
	<li>Friedl, P., Gilmour, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collective+cell+migration+in+morphogenesis,+regeneration+and+cancer.">Collective cell migration in morphogenesis, regeneration and cancer.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10 (7), 445-457 (2009).</li><li>Boyden, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chemotactic+effect+of+mixtures+of+antibody+and+antigen+on+polymorphonuclear+leucocytes.">The chemotactic effect of mixtures of antibody and antigen on polymorphonuclear leucocytes.</a> The Journal of Experimental Medicine. 115 (3), 453-466 (1962).</li><li>Xu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+review+of+impedance+measurements+of+whole+cells.">A review of impedance measurements of whole cells.</a> Biosensors &amp; Bioelectronics. 77, 824-836 (2016).</li><li>Stylianou, D. 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A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-free,+real-time+monitoring+of+IgE-mediated+mast+cell+activation+on+microelectronic+cell+sensor+arrays.">Label-free, real-time monitoring of IgE-mediated mast cell activation on microelectronic cell sensor arrays.</a> Journal of Immunological Methods. 292 (1-2), 195-205 (2004).</li><li>Morton, C. L., Houghton, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+human+tumor+xenografts+in+immunodeficient+mice.">Establishment of human tumor xenografts in immunodeficient mice.</a> Nature Protocols. 2 (2), 247-250 (2007).</li><li>DeRose, Y. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+grafts+derived+from+women+with+breast+cancer+authentically+reflect+tumor+pathology,+growth,+metastasis+and+disease+outcomes.">Tumor grafts derived from women with breast cancer authentically reflect tumor pathology, growth, metastasis and disease outcomes.</a> Nature Medicine. 17 (11), 1514-1520 (2011).</li><li>Sharif, G. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+AIB1+isoform+alters+enhancer+access+and+enables+progression+of+early-stage+triple-negative+breast+cancer.">An AIB1 isoform alters enhancer access and enables progression of early-stage triple-negative breast cancer.</a> Cancer Research. 81 (16), 4230-4241 (2021).</li><li>Caileau, R., Olive, M., Cruciger, Q. 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G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epstein-Barr+virus+LMP1+manipulates+the+content+and+functions+of+extracellular+vesicles+to+enhance+metastatic+potential+of+recipient+cells.">Epstein-Barr virus LMP1 manipulates the content and functions of extracellular vesicles to enhance metastatic potential of recipient cells.</a> PLoS Pathogens. 16 (12), 1009023 (2020).</li><li>Eisenberg, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanistic+modeling+of+the+effects+of+myoferlin+on+tumor+cell+invasion.">Mechanistic modeling of the effects of myoferlin on tumor cell invasion.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (50), 20078-20083 (2011).</li></ol>

Wir haben das Design eines Zweikammer-Arrays modifiziert, um eine dritte Kammer zur Überwachung der Zellinvasion in Echtzeit in Gegenwart von Stromazellen aufzunehmen. Wir haben deutliche Auswirkungen von kokultivierten Fibroblasten auf invasive und nicht-invasive Krebszellen beobachtet, was darauf hindeutet, dass das Array verwendet werden kann, um zwischen Krebszellsubpopulationen zu unterscheiden, die unterschiedlich auf Faktoren reagieren, die von kokultivierten Stromazellen produziert werden. Das Array wurde auch v...

Die Zellinvasion ist ein wichtiger Prozess, der es Zellen ermöglicht, Basalmembranbarrieren als Reaktion auf Umwelthinweise von Stromazellen zu überwinden. Es ist ein entscheidender Schritt in mehreren Entwicklungsstadien für Immunantworten, Wundheilung, Gewebereparatur und Malignome, die von lokalen Läsionen zu invasiven und metastasierenden Krebsarten übergehen können1. Assays, die früh entwickelt wurden, um das invasive Potenzial von Zellpopulationen zu messen, erzeugen typischerweise eine Einzelendpunktmessung oder erfordern eine Vormarkierung invasiver Zellen2. Die Integration von Mikroelektronik- und Mikrofluidik-Techniken wird nun entwickelt, um verschiedene Aspekte der Zellbiologie wie Lebensfähigkeit, Bewegung und Befestigung unter Verwendung der elektrischen Impedanz lebender Zellen auf Mikroelektroden 3,4 zu erkennen. Die Impedanzmessung ermöglicht eine markierungsfreie, nicht-invasive und quantitative Beurteilung des Zellstatus3. Hier beschreiben wir ein dreikammeriges Array, das auf dem Design des Real-Time Cellular Analysis (RTCA) -Systems basiert, das von Abassi et al.5 entwickelt wurde. Das dreikammerige Array ermöglicht die Beurteilung von kokultivierten Zellen auf zelluläre Invasion und die Erholung invasiver Zellen für zusätzliche Analysen oder Expansion.
Im Zellanalysatorsystem dringen Zellen durch eine extrazelluläre Matrix ein, die auf eine poröse Membran aufgetragen ist, und erreichen ein interdigitalisiertes Elektrodenarray, das auf der gegenüberliegenden Seite der Barriere positioniert ist. Da die invasiven Zellen dieses Elektrodenarray im Laufe der Zeit weiter anheften und besetzen, ändert sich die elektrische Impedanz parallel. Das aktuelle System besteht aus einer CIM-Platte (Cell Invasion and Migration) mit zwei Kammern. Das RTCA-DP (Dual Purpose) (fortan Dual Purpose Cell Analyzer genannt) Gerät enthält Sensoren zur Impedanzmessung und integrierte Software zur Analyse und Verarbeitung der Impedanzdaten. Die Impedanzwerte zu Studienbeginn hängen von der Ionenstärke der Medien in den Vertiefungen ab und werden geändert, wenn sich die Zellen an die Elektroden anlagern. Die Impedanzänderungen hängen von der Anzahl der Zellen, ihrer Morphologie und dem Ausmaß ab, in dem sich die Zellen an die Elektroden anheften. Eine Messung der Vertiefungen mit Medien vor der Zugabe der Zellen wird als Hintergrundsignal betrachtet. Der Hintergrund wird von den Impedanzmessungen abgezogen, nachdem das Gleichgewicht erreicht wurde, wobei sich die Zellen an die Elektroden anheften und sich auf sie ausbreiten. Ein einheitsloser Parameter des Status der Zellen auf einer Elektrode namens Cell Index (CI) wird wie folgt berechnet: CI = (Impedanz nach Gleichgewicht - Impedanz in Abwesenheit von Zellen) / Nennimpedanzwert6. Wenn Migrationsraten verschiedener Zelllinien verglichen werden, kann der Delta CI verwendet werden, um den Zellstatus unabhängig von dem Unterschied in der Befestigung zu vergleichen, der in den ersten Messungen dargestellt wird.
Das neu entwickelte dreikammerige Array baut auf dem bestehenden Design auf und verwendet die obere Kammer des Zweizweck-Zellanalysatorsystems, das die Elektroden enthält. Die modifizierten mittleren und unteren Kammern sind so angepasst, dass sie mit der integrierten Software in den Zweizweck-Zellanalysator zur Impedanzmessung und -analyse passen. Die beiden wichtigsten Fortschritte, die das neue Design gegenüber der bestehenden Zweikammer-CIM-Platte (von nun an Zellanalysatorplatte genannt) bietet, sind: i) die Fähigkeit, sich zu erholen und dann invasive Zellsubpopulationen zu analysieren, die in heterogenen Zellmischungen vorhanden sind, und ii) die Option, den Einfluss von sezernierten Faktoren aus kokultivierten Stroma- oder Immunzellen auf die Zellinvasion zu bewerten (Abbildung 1).
Diese Technologie kann bei der Untersuchung der Subpopulationen von Zellen mit unterschiedlichen invasiven Fähigkeiten nützlich sein. Dazu gehören (a) invasive Krebszellen, die in umliegende Gewebe oder Blut- und Lymphgefäße eindringen oder an metastasierten Aussaatstellen in entfernten Organen extravasieren, (b) Zellen des Immunsystems, die in Gewebe eindringen, um Krankheitserreger oder erkrankte Zellen zu bekämpfen, (c) Endothelzellen, die während der Gewebereorganisation oder Wundheilung in Gewebe eindringen, um neue Blutgefäße zu bilden, sowie (d) Stromazellen aus der Tumormikroumgebung, die zusammen mit Krebszellen unterstützen und eindringen. Der Ansatz ermöglicht die Einbeziehung von stromalem Cross-Talk, das die Zellmotilität und -invasion modulieren kann. Die hier gezeigten Machbarkeitsstudien verwenden dieses modifizierte Array, das sich auf die Invasion von Krebszellen und die Interaktion mit dem Stroma als Modellsystem konzentriert, einschließlich der endothelialen Invasion als Reaktion auf differentielle Signale von Krebszellen. Der Ansatz kann extrapoliert werden, um Krebszellen und andere Zelltypen wie Subpopulationen von Immunzellen, Fibroblasten oder Endothelzellen zu isolieren. Wir haben invasive und nicht-invasive etablierte Brustkrebszelllinien als Proof of Principle getestet. Wir verwendeten auch Zellen aus der Invasion von Patienten-abgeleiteten Xenotransplantaten (PDX) als Reaktion auf Immunzellen aus menschlichem Knochenmark, um die Machbarkeit für den zukünftigen Einsatz auch in klinischen Diagnoseumgebungen zu zeigen. PDX sind Patiententumorgewebe, die in ein immungeschwächtes oder humanisiertes Mäusemodell implantiert werden, um die Untersuchung von Wachstum, Progression und Behandlungsmöglichkeiten für den ursprünglichen Patientenzu ermöglichen 7,8.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.05% Trypsin-EDTA</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>25300-054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adhesive</td>
			<td>Norland Optical Adhesive</td>
			<td>NOA63</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell lifter</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.1832</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholera Toxin from Vibrio cholerae</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>12585-014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CIM-plate</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5665817001</td>
			<td>Cell analyzer plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase from Clostridium histolyticum</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C0130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase</td>
			<td>StemCell</td>
			<td>7913</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>11995-065</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM-F12</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>11875-093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS), Heat Inactivated</td>
			<td>Omega Scientific</td>
			<td>FB-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>15630106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse serum (HS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>16050-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human EGF</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>AF-100-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human umbilical Vein endothelail cells (HUVEC)</td>
			<td>LONZA (RRID:CVCL_2959)</td>
			<td>C-2517A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HUVEC media</td>
			<td>LONZA</td>
			<td>CC-3162</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrocortisone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H4001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin Transferrin Selenium Ethanolamine (ITSX) (100x)</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>51500056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin, Human Recombinant, Zinc Solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C8052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>J2 Fibroblasts</td>
			<td>Stemcell (RRID:CVCL_W667)</td>
			<td>100-0353</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LymphoPrep</td>
			<td>Stemcell</td>
			<td>7851</td>
			<td>Density gradient medium for the isolation of mononuclear cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354230</td>
			<td>Basement membrane matrix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MCFDCIS.com cells ( DCIS)</td>
			<td>RRID:CVCL_5552</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MDA-MB-231 cells</td>
			<td>RRID:CVCL_0062</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Milling machine</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Bridgeport Series 1 Vertical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline (1x)</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>10010049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethersulfone (PES) membrane</td>
			<td>Sterlitech</td>
			<td>PCTF029030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RBC lysis solution</td>
			<td>Stemcell</td>
			<td>7800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy Micro Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RTCA DP analyzer</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>3X16</td>
			<td>Dual purpose cell analyzer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T4799</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

real-time detection and capture of invasive cell subpopulations from co-cultures

Invasion und metastasierende Ausbreitung von Krebszellen sind die Haupttodesursache durch Krebs. Assays, die früh entwickelt wurden, um das invasive Potenzial von Krebszellpopulationen zu messen, erzeugen typischerweise eine Einzelendpunktmessung, die nicht zwischen Krebszellsubpopulationen mit unterschiedlichem invasivem Potenzial unterscheidet. Außerdem besteht die Tumormikroumgebung aus verschiedenen residenten Stroma- und Immunzellen, die das invasive Verhalten von Krebszellen verändern und daran teilnehmen. Das Eindringen in Gewebe spielt auch eine Rolle bei Immunzellsubpopulationen, die Mikroorganismen abwehren oder erkrankte Zellen aus dem Parenchym und den Endothelzellen während des Gewebeumbaus und der Angiogenese eliminieren. Die Echtzeit-Zellanalyse (Real-Time Cellular Analysis, RTCA), die Impedanz-Biosensoren zur Überwachung der Zellinvasion verwendet, war ein wichtiger Schritt über die Endpunktmessung der Invasion hinaus: Sie ermöglicht kontinuierliche Messungen im Laufe der Zeit und kann somit Unterschiede in den Invasionsraten aufdecken, die im Endpunktassay verloren gehen. Mit der aktuellen RTCA-Technologie haben wir Zweikammer-Arrays erweitert, indem wir eine weitere Kammer hinzugefügt haben, die Stroma- und / oder Immunzellen enthalten kann und es ermöglicht, die Invasionsrate unter dem Einfluss von sezernierten Faktoren aus kokultivierten Stroma- oder Immunzellen im Laufe der Zeit zu messen. Darüber hinaus ermöglicht das einzigartige Design jederzeit das Ablösen von Kammern und die Isolierung der invasivsten Krebszelle oder anderer Zellsubpopulationen, die in heterogenen Mischungen von getesteten Tumorisolaten vorhanden sind. Diese invasivsten Krebszellen und andere Zellsubpopulationen treiben das maligne Fortschreiten zu metastasierenden Erkrankungen voran, und ihre molekularen Eigenschaften sind wichtig für eingehende mechanistische Studien, die Entwicklung diagnostischer Sonden für ihre Erkennung und die Bewertung von Schwachstellen. So kann die Einbeziehung von nieder- oder großmolekularen Medikamenten genutzt werden, um das Potenzial von Therapien zu testen, die auf Krebs und/oder Stromazellsubpopulationen abzielen, mit dem Ziel, invasives Verhalten zu hemmen (z. B. Krebszellen) oder zu verstärken (z. B. Immunzellen).

Unter Verwendung des neu entwickelten Dreikammer-Arrays wurde die Invasion der Zellen in Gegenwart oder Abwesenheit von Stromazellen wie Fibroblasten getestet. Die MDA-MB-231-Zellinvasion wurde verstärkt, als bestrahlte Schweizer 3T3-Fibroblasten (J2-Stamm) in der Bodenkammer ausgesät wurden, was den Austausch von Faktoren zwischen den beiden Zelllinien ermöglichte. Interessanterweise nahm die MDA-MB-231-Invasion zu, wenn die Anzahl der 3T3-J2-Zellen verdoppelt wurde (Abbildung 3A). Auf d...

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Real-Time Detection and Capture of Invasive Cell Subpopulations from Co-Cultures

Wir beschreiben einen Ansatz zum Nachweis und zur Erfassung invasiver Zellsubpopulationen in Echtzeit. Das experimentelle Design verwendet die Echtzeit-Zellanalyse, indem Änderungen in der elektrischen Impedanz von Zellen überwacht werden. Invasive Krebs-, Immun-, Endothel- oder Stromazellen in komplexen Geweben können eingefangen und die Auswirkungen von Kokulturen beurteilt werden.

Echtzeit-Detektion und Erfassung invasiver Zellsubpopulationen aus Co-Kulturen

Invasion and metastatic spread of cancer cells are the major cause of death from cancer. Assays developed early on to measure the invasive potential of ...

Diese Technik ermöglicht die Identifizierung von Zellen mit unterschiedlichen invasiven Fähigkeiten unter dem Einfluss von sezernierten Faktoren aus kokultivierten Stromazellen. Die Technik bewertet den Einfluss von sezernierten Faktoren aus kokultivierten Stroma- oder Immunzellen auf die Zellinvasion. Es ermöglicht auch die Wiederherstellung und Analyse invasiver Zellsubpopulationen, die in heterogenen Zellmischungen vorhanden sind.Die Technik kann bestimmen, welche Tumoren invasive Zellsubpopulationen beherbergen, die zu Metastasen führen. Die Erfassung und Analyse invasiver Krebszellen kann Therapieentscheidungen beeinflussen. Um die Zellkultur zu beginnen, waschen Sie die Adhärenzzellkulturen mit einer Konfluenz von etwa 70% mit 1X phosphatgepufferter Kochsalzlösung.Dann fügen Sie 0,05% Trypsin und EDTA-Lösung hinzu, um die Zellen abzuheben. Neutralisieren Sie die Trypsinlösung mit serumhaltigen Zellkulturmedien und zählen Sie die Zellen mit einem Aliquot der Zellsuspension. Legen Sie alle drei sterilen Kammern in die Gewebekulturhaube.Suchen Sie den Knopf auf der kurzen Seite der unteren Kammer und richten Sie die untere Kammer so aus, dass der Knopf dem Experimentator zugewandt ist. Fügen Sie 30.000 bis 50.000 Zellen in 90 Mikrolitern Medien aus der unteren Kammer zu jeder Vertiefung hinzu, ohne Blasen zu bilden. Verwenden Sie 5% der mit fetalem Rinderserum ergänzten Medien in zwei unteren Kammern als Positivkontrolle für die Zellmotilität und verwenden Sie 0% serumergänzte Medien als Negativkontrolle.Drehen Sie die untere Kammer um 90 Grad, nachdem Sie sie für 10 bis 15 Minuten in der Haube eingewöhnt haben. Platzieren Sie dann die mittlere Kammer oben, so dass der Knopf an der unteren Kammer in die Kerbe der mittleren Kammer gleitet. Drücken Sie die Kammer vertikal nach unten, bis von jeder der Längsseiten der Baugruppe ein Klicken zu hören ist.Fügen Sie 160 Mikroliter serumfreie Medien zu allen Vertiefungen der mittleren Kammer hinzu. Stellen Sie sicher, dass ein kuppelförmiger Meniskus sichtbar ist, nachdem die Vertiefungen gefüllt wurden, und platzieren Sie die obere Kammer mit Elektroden nach unten auf der mittleren Kammer, um die blauen Punkte auf der mittleren und oberen Kammer auszurichten. Drücken Sie die Kammer vertikal nach unten, bis von jeder der Längsseiten der Baugruppe ein Klickgeräusch zu hören ist.Geben Sie 20 bis 50 Mikroliter serumfreies Medium in die obere Kammer. Montieren Sie die Baugruppe auf dem Zweizweck-Zellanalysator im Gewebekultur-Inkubator und warten Sie 30 Minuten, bevor Sie den Hintergrund messen. Öffnen Sie die Zellanalysator-Software, wählen Sie dann die zu verwendende Dockingstation aus, gefolgt von einem Klick auf die Nachrichtenregisterkarte, und stellen Sie sicher, dass Verbindungen in Ordnung angezeigt werden, um sicherzustellen, dass das Array gut in der Dockingstation platziert ist und die Elektroden gut auf die Sensoren ausgerichtet sind.Klicken Sie auf die Registerkarte Testnotizen und geben Sie alle möglichen Informationen zum Experiment ein. Klicken Sie dann auf die Registerkarte Layout und geben Sie die Beschreibung des Array-Layouts ein. Klicken Sie dann auf die Registerkarte Zeitplan und fügen Sie zwei Schritte aus dem Menü Schritte hinzu, einen Hintergrundschritt mit einem Sweep und einen Testschritt mit 100 Sweeps.Sobald sich das Array 30 Minuten lang im Inkubator des Zweizweck-Zellanalysators befunden hat, klicken Sie auf die Wiedergabeschaltfläche, um die Hintergrundmessung zu starten. Nachdem die Hintergrundmessung abgeschlossen ist, entfernen Sie das Array aus der Halterung und legen Sie es wieder in die Zellkulturhaube. Dann fügen Sie 30.000 bis 50.000 Zellen in 100 Mikrolitern serumfreier Medien zu jeder Vertiefung der oberen Kammer hinzu.Dies sind die Zellen, die die Elektrode erkennt, sobald sie erfolgreich durch die Membran wandern. Lassen Sie die Baugruppe 30 Minuten in der Haube stehen, bevor Sie sie zur Impedanzmessung auf dem Zweizweck-Zellanalysator montieren. Platzieren Sie das Array wieder im Zweizweckzellenanalysator und überprüfen Sie die Nachrichtenregisterkarte auf die Meldung "Verbindungen in Ordnung".Klicken Sie auf die Wiedergabeschaltfläche, um die Impedanzmessung zu starten, und klicken Sie dann auf die Registerkarte Plot, um den Fortschritt des Signals zu überwachen. Wenn der Endpunkt vor 25 Stunden erreicht wird, klicken Sie im Dropdown-Menü Ausführen auf den Abbruchschritt. Um Daten zu exportieren, klicken Sie mit der rechten Maustaste auf das Diagramm, wählen Sie Im Listenformat kopieren aus, und fügen Sie die Daten dann in eine Kalkulationstabelle ein.Überwachen Sie die Migrationsrate in Echtzeit auf dem Zweizweck-Zellanalysator, um den interessierenden Haltepunkt zu bestimmen. Sobald dies erreicht ist, demontieren Sie die Baugruppe aus dem Zweizweck-Zellanalysator und legen Sie sie in die Gewebekulturhaube. Bereiten Sie eine angemessene Anzahl von 1,5 Millilitern Mikrozentrifugenröhrchen vor, um die Zellen aus den interessierenden Vertiefungen zu sammeln.Legen Sie die Baugruppe in eine 10 Zentimeter große Schale, um Flüssigkeiten aufzunehmen, wenn sich die Kammern lösen. Drücken Sie die flexiblen Schnappenden auf der Längsseite der mittleren Kammer nach innen, bis ein Klickgeräusch zu hören ist, anschließend demontieren Sie die obere Kammer und kehren Sie sie in eine neue 10-Zentimeter-Schüssel um. Verwenden Sie einen Zellheber mit einem 13-Millimeter-Blatt, um die Zellen aus allen Vertiefungen zu sammeln, die den gleichen experimentellen Zustand aufweisen.Spülen oder tauchen Sie die Klinge in 1X phosphatgepufferte Kochsalzlösung, um die Zellen in 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen zu sammeln. Dann drehen Sie die Zellen bei 500 mal G für fünf Minuten herunter und vermehren Sie diese gesammelten Zellen oder führen Sie Endpunktanalysen wie Einzelzell-RNA-Sequenzierung durch. Die Beurteilung der Invasion der Zellen in Gegenwart oder Abwesenheit von Stromazellen zeigte, dass die MDA-MB-231-Zellinvasion verstärkt wurde, wenn bestrahlte Swiss-3T3-Fibroblasten J2-Stamm in der unteren Kammer für den Austausch von Faktoren zwischen den beiden Zelllinien saßen.Interessanterweise nahm die MDA-MB-231-Invasion zu, als die Anzahl der 3T3 J2-Zellen verdoppelt wurde. Auf der anderen Seite scheint die Invasionsrate eines invasiven Klons von MCFDCIS-Zellen, DCIS-Delta Four, durch das Übersprechen mit 3T3 J2-Zellen gehemmt zu werden, was auf die wertvolle Anwendung des Dreikammer-Arrays zur Messung unterschiedlicher Effekte des Stromas hindeutet. In diesem Fall Fibroblasten auf Zellinvasion.Menschliche Nabelvenen-Endothelzellen waren invasiver als Reaktion auf Faktoren, die von MDA-MB-231-Zellen abgesondert wurden, im Gegensatz zu denen, die von DCIS-Zellen sezerniert wurden, was mit der Fähigkeit invasiver Tumore übereinstimmt, Endothelzellen für die Blutgefäßbildung und spätere Verbreitung in den Kreislauf zu rekrutieren. Die Invasion von Patienten-abgeleiteten Xenotransplantatzellen aus der obersten Kammer nahm als Reaktion auf kokultivierte menschliche Knochenmark-Immunzellen zu. Interessanterweise war das Vorhandensein von 2% Serum in der unteren Kammer mit den Immunzellen des menschlichen Knochenmarks für die Invasion von Xenotransplantaten aus dem Patienten unerlässlich.Wells können mit einer extrazellulären Matrix beschichtet werden, um die Basalmembranbarriere nachzuahmen. Therapeutika können den Medien in den Brunnen hinzugefügt werden, um ihre Wirkung auf die Invasion zu überwachen.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Capture and Release of Viable Circulating Tumor Cells from Blood

Erfassung und Veröffentlichung durchführbare zirkulierender Tumorzellen aus Blut

We demonstrate a method for size based capture of viable circulating tumor cell (CTC) from whole blood, along with the release of these cells from chip ...

Forschung

Krebsforschung

Invasive Behavior of Human Breast Cancer Cells in Embryonic Zebrafish

Invasive Verhalten von menschlichen Brustkrebszellen in embryonalem Zebrabärbling

In many cases, cancer patients do not die of a primary tumor, but rather because of metastasis. Although numerous rodent models are available for studying ...

Four-color Fluorescence Immunohistochemistry of T-cell Subpopulations in Archival Formalin-fixed, Paraffin-embedded Human Oropharyngeal Squamous Cell Carcinoma Samples

Vier-Farb-Fluoreszenz-Immunhistochemie von T-Zell-Subpopulationen im Archiv Formalin-fixierte, Paraffin-eingebettete menschliche Oropharynx-Plattenepithelkarzinom-Proben

The four-color fluorescence immunohistochemistry (IHC) technique is a method to quantify cell populations of interest while taking into account their ...

Preparation and Metabolic Assay of 3-dimensional Spheroid Co-cultures of Pancreatic Cancer Cells and Fibroblasts

Vorbereitung und metabolische Assay von 3-dimensionalen Sphäroid Ko-Kulturen von Pankreaskarzinom-Zellen und Fibroblasten

Many cancer types, including pancreatic cancer, have a dense fibrotic stroma that plays an important role in tumor progression and invasion. Activated ...

Serum and Plasma Copy Number Detection Using Real-time PCR

Serum und Plasma Kopie Nummer Erkennung mittels Real-Time PCR

Serum and plasma cell free DNA (cfDNA) has been shown as an informative, non-invasive source of biomarkers for cancer diagnosis, prognosis, monitoring, ...

Real Time Detection of In Vitro Tumor Cell Apoptosis Induced by CD8+ T Cells to Study Immune Suppressive Functions of Tumor-infiltrating Myeloid Cells

Real Time Detection of In Vitro Tumor Cell Apoptosis Induced by CD8+ T Cells to Study Immune Suppressive Functions of Tumor-infiltrating Myeloid Cells

Echtzeit-Erkennung von In Vitro Tumor Zelle Apoptose induziert durch CD8+ T-Zellen, unterdrückende Immunfunktionen Tumor infiltrieren myeloische Zellen zu studieren

Potentiation of the tumor-killing ability of CD8+ T cells in tumors, along with their efficient tumor infiltration, is a key element of successful ...

Real-Time Monitoring of Human Glioma Cell Migration on Dorsal Root Ganglion Axon-Oligodendrocyte Co-Cultures

Echtzeit-Überwachung der Migration menschlicher Gliom-Zell auf Dorsalwurzel Ganglion Axon-Oligodendrozyten-Ko-Kulturen

Glioblastoma is one of the most aggressive human cancers due to extensive cellular heterogeneity and the migration properties of hGCs. In order to better ...

Time-Lapse 2D Imaging of Phagocytic Activity in M1 Macrophage-4T1 Mouse Mammary Carcinoma Cells in Co-cultures

Time-Lapse 2D Imaging der phagozytischen Aktivität in M1 Macrophage-4T1 Maus-Mammary Karzinom-Zellen in Kokulturen

Tumor-associated macrophages (TAMs) have been identified as an important component for tumor growth, invasion, metastasis, and resistance to cancer ...

Combined Use of Tail Vein Metastasis Assays and Real-Time In Vivo Imaging to Quantify Breast Cancer Metastatic Colonization and Burden in the Lungs

Kombinierte Verwendung von Tail Vein Metastasis Assays und Real-Time In Vivo Imaging zur Quantifizierung der metastasierenden Kolonisation und Belastung von Brustkrebs in der Lunge

Metastasis is the main cause of cancer-related deaths and there are limited therapeutic options for patients with metastatic disease. The identification ...

Impedance-based Real-time Measurement of Cancer Cell Migration and Invasion

Impedanzbasierte Echtzeitmessung der Krebszellmigration und -invasion

Cancer arises due to uncontrolled proliferation of cells initiated by genetic instability, mutations, and environmental and other stress factors. These ...