Name: real-time detection and capture of invasive cell subpopulations from co-cultures
Uploaded: 2022-03-30T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Real-Time Detection and Capture of Invasive Cell Subpopulations from Co-Cultures at JoVE.com

ברצוננו להודות לד"ר אלנה וולמס, מכון האנטסמן לסרטן, אוניברסיטת יוטה, על שסיפקה לנו את הקסנוגרפטים שמקורם בחולה (HCI-010). עבודה זו נתמכה על ידי מענקי NIH R01CA205632, R21CA226542, ובחלקה, על ידי מענק מאג'ילנט טכנולוגיות.

המחקר נסקר ונחשב "פטור" על ידי מועצת הביקורת המוסדית של אוניברסיטת ג'ורג'טאון (IRB # 2002-022). רקמות מח עצם שנקטפו זה עתה נאספו ממסנני איסוף מח עצם אנושיים בריאים שהושלכו וזוהו.
1. עיצוב תא חדש (איור 2)
<ol><li>פתח לוחית מנתח תאים דו-תאית חדשה. הניחו בצד...

<ol>
	<li>Friedl, P., Gilmour, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collective+cell+migration+in+morphogenesis,+regeneration+and+cancer.">Collective cell migration in morphogenesis, regeneration and cancer.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10 (7), 445-457 (2009).</li><li>Boyden, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chemotactic+effect+of+mixtures+of+antibody+and+antigen+on+polymorphonuclear+leucocytes.">The chemotactic effect of mixtures of antibody and antigen on polymorphonuclear leucocytes.</a> The Journal of Experimental Medicine. 115 (3), 453-466 (1962).</li><li>Xu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+review+of+impedance+measurements+of+whole+cells.">A review of impedance measurements of whole cells.</a> Biosensors &amp; Bioelectronics. 77, 824-836 (2016).</li><li>Stylianou, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+single-chain+antibody+targeting+of+the+ligand-binding+domain+in+the+anaplastic+lymphoma+kinase+receptor.">Effect of single-chain antibody targeting of the ligand-binding domain in the anaplastic lymphoma kinase receptor.</a> Oncogene. 28 (37), 3296-3306 (2009).</li><li>Abassi, Y. A., Wang, X., Xu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real+time+electronic+cell+sensing+system+and+applications+for+cytotoxcity+profiling+and+compound+assays.">Real time electronic cell sensing system and applications for cytotoxcity profiling and compound assays.</a> United States Patent. , 1-88 (2013).</li><li>Abassi, Y. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-free,+real-time+monitoring+of+IgE-mediated+mast+cell+activation+on+microelectronic+cell+sensor+arrays.">Label-free, real-time monitoring of IgE-mediated mast cell activation on microelectronic cell sensor arrays.</a> Journal of Immunological Methods. 292 (1-2), 195-205 (2004).</li><li>Morton, C. L., Houghton, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+human+tumor+xenografts+in+immunodeficient+mice.">Establishment of human tumor xenografts in immunodeficient mice.</a> Nature Protocols. 2 (2), 247-250 (2007).</li><li>DeRose, Y. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+grafts+derived+from+women+with+breast+cancer+authentically+reflect+tumor+pathology,+growth,+metastasis+and+disease+outcomes.">Tumor grafts derived from women with breast cancer authentically reflect tumor pathology, growth, metastasis and disease outcomes.</a> Nature Medicine. 17 (11), 1514-1520 (2011).</li><li>Sharif, G. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+AIB1+isoform+alters+enhancer+access+and+enables+progression+of+early-stage+triple-negative+breast+cancer.">An AIB1 isoform alters enhancer access and enables progression of early-stage triple-negative breast cancer.</a> Cancer Research. 81 (16), 4230-4241 (2021).</li><li>Caileau, R., Olive, M., Cruciger, Q. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+human+breast+carcinoma+cell+lines+of+metastatic+origin:+preliminary+characterization.">Long-term human breast carcinoma cell lines of metastatic origin: preliminary characterization.</a> In Vitro. 14 (11), 911-915 (1978).</li><li>Sharif, G. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+growth+density+modulates+cancer+cell+vascular+invasion+via+Hippo+pathway+activity+and+CXCR2+signaling.">Cell growth density modulates cancer cell vascular invasion via Hippo pathway activity and CXCR2 signaling.</a> Oncogene. 34 (48), 5879-5889 (2015).</li><li>Miller, F. R., Santner, S. J., Tait, L., Dawson, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MCF10DCIS.com+xenograft+model+of+human+comedo+ductal+carcinoma+in+situ.">MCF10DCIS.com xenograft model of human comedo ductal carcinoma in situ.</a> Journal of the National Cancer Institute. 92 (14), 1185-1186 (2000).</li><li>Winkler, J., Abisoye-Ogunniyan, A., Metcalf, K. J., zenaa, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concepts+of+extracellular+matrix+remodelling+in+tumour+progression+and+metastasis.">Concepts of extracellular matrix remodelling in tumour progression and metastasis.</a> Nature Communications. 11 (1), 1-19 (2020).</li><li>Nkosi, D., Sun, L., Duke, L. C., Meckes, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epstein-Barr+virus+LMP1+manipulates+the+content+and+functions+of+extracellular+vesicles+to+enhance+metastatic+potential+of+recipient+cells.">Epstein-Barr virus LMP1 manipulates the content and functions of extracellular vesicles to enhance metastatic potential of recipient cells.</a> PLoS Pathogens. 16 (12), 1009023 (2020).</li><li>Eisenberg, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanistic+modeling+of+the+effects+of+myoferlin+on+tumor+cell+invasion.">Mechanistic modeling of the effects of myoferlin on tumor cell invasion.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (50), 20078-20083 (2011).</li></ol>

שינינו את העיצוב של מערך דו-תאי כך שיכלול תא שלישי לניטור פלישת תאים בזמן אמת בנוכחות תאים סטרומליים. ראינו השפעות ברורות של פיברובלסטים בתרבית משותפת על תאים סרטניים פולשניים ולא פולשניים, מה שמצביע על כך שניתן להשתמש במערך כדי להבחין בין תת-אוכלוסיות של תאים סרטניים המגיבים באופן שונה ל...

פלישת תאים היא תהליך חשוב המאפשר לתאים לחצות מחסומים של קרום מרתף בתגובה לרמזים סביבתיים המסופקים על ידי תאים סטרומליים. זהו שלב מכריע במהלך מספר שלבים של התפתחות לתגובות חיסוניות, ריפוי פצעים, תיקון רקמות וממאירויות שיכולות להתקדם מנגעים מקומיים לסרטן פולשני וגרורות1. מבחנים שפותחו בשלב מוקדם כדי למדוד את הפוטנציאל הפולשני של אוכלוסיות תאים מייצרים בדרך כלל מדידה של נקודת קצה אחת או דורשים תיוג מראש של תאים פולשים2. השילוב של מיקרו-אלקטרוניקה וטכניקות של מיקרופלואידיקה פותח כעת כדי לזהות היבטים שונים של הביולוגיה של התא, כגון כדאיות, תנועה והתקשרות באמצעות העכבה החשמלית של תאים חיים על מיקרו-אלקטרוניקה 3,4. מדידת עכבה מאפשרת הערכה נטולת תוויות, לא פולשנית וכמותית של מצב התא3. כאן אנו מתארים מערך בעל שלושה תאים המבוסס על תכנון מערכת האנליזה התאית בזמן אמת (RTCA) שפותחה על ידי Abassi et al.5. המערך בעל שלושת התאים מאפשר הערכה של תאים בתרבית משותפת על פלישה תאית והתאוששות של תאים פולשים לצורך ניתוחים או התפשטות נוספים.
במערכת מנתחי התאים, תאים פולשים דרך מטריצה חוץ-תאית המצופה על ממברנה נקבובית ומגיעים למערך אלקטרודות משולב הממוקם בצד הנגדי של המחסום. כאשר התאים הפולשים ממשיכים להתחבר ולתפוס את מערך האלקטרודות הזה לאורך זמן, העכבה החשמלית משתנה במקביל. המערכת הנוכחית כוללת צלחת 16 בארות פלישה והגירה של תאים (CIM) עם שני תאים. מכשיר RTCA-DP (דו-תכליתי) (הנקרא מנתח תאים דו-תכליתי) מכיל חיישנים למדידת עכבה ותוכנה משולבת לניתוח ועיבוד נתוני העכבה. ערכי העכבה בנקודת ההתחלה תלויים בחוזק היוני של המדיה בבארות ומשתנים כאשר התאים נצמדים לאלקטרודות. שינויי העכבה תלויים במספר התאים, במורפולוגיה שלהם ובמידה שבה התאים מתחברים לאלקטרודות. מדידה של הבארות עם המדיה לפני הוספת התאים נחשבת לאות הרקע. הרקע מופחת ממדידות עכבה לאחר שהגיע לשיווי משקל כאשר תאים מתחברים ומתפשטים על האלקטרודות. פרמטר ללא יחידה של מצב התאים על אלקטרודה המכונה אינדקס תאים (CI) מחושב כדלקמן: CI = (עכבה לאחר שיווי משקל - עכבה בהיעדר תאים) / ערך עכבהנומינלית 6. כאשר משווים את שיעורי ההעברה של קווי תאים שונים, ניתן להשתמש ב- Delta CI כדי להשוות את מצב התא ללא קשר להבדל בהיצמדות המיוצג במדידות הראשונות.
המערך התלת-תאי החדש שתוכנן מתבסס על העיצוב הקיים ומשתמש בתא העליון ממערכת מנתח התאים הדו-תכליתית המכילה את האלקטרודות. התאים האמצעיים והתחתונים שהשתנו מותאמים כדי להתאים את ההרכבה למנתח התאים הדו-תכליתי למדידת עכבה וניתוח באמצעות התוכנה המשולבת. שתי ההתפתחויות העיקריות שהתכנון החדש מספק על פני לוחית ה-CIM הדו-תאית הקיימת (הנקראת מעתה צלחת מנתחת תאים) הן: 1) היכולת להתאושש, ולאחר מכן לנתח תת-אוכלוסיות של תאים פולשניים הנמצאים בתערובות תאים הטרוגניות, ו-ב) האפשרות להעריך את ההשפעה של גורמים מופרשים מתאים סטרומליים או חיסוניים בתרבית משותפת על פלישת תאים (איור 1).
טכנולוגיה זו יכולה להיות שימושית בחקר תת-האוכלוסיות של תאים בעלי יכולות פולשניות שונות. זה כולל (א) תאים סרטניים פולשים הפולשים לרקמות הסובבות או לדם ולכלי הלימפה או מתרבים באתרי זריעה גרורתיים באיברים מרוחקים, (ב) תאים ממערכת החיסון הפולשים לרקמות כדי להתמודד עם פתוגנים או תאים חולים, (ג) תאי אנדותל הפולשים לרקמות ויוצרים כלי דם חדשים במהלך ארגון מחדש של רקמות או ריפוי פצעים, כמו גם (ד) תאים סטרומליים מהמיקרו-סביבה של הגידול התומכים ופולשים יחד עם תאים סרטניים. הגישה מאפשרת הכללה של דיבורים צולבים סטרומליים שיכולים לווסת את תנועתיות התא ואת הפלישה. מחקרי ההיתכנות המוצגים כאן משתמשים במערך שונה זה המתמקד בפלישה לתאים סרטניים ובאינטראקציה עם הסטרומה כמערכת מודל, כולל פלישת אנדותל בתגובה לאותות דיפרנציאליים מתאי הסרטן. ניתן לבצע אקסטרפולציה של הגישה כדי לבודד תאים סרטניים וסוגי תאים אחרים כגון תת-אוכלוסיות של תאי מערכת החיסון, פיברובלסטים או תאי אנדותל. בדקנו קווי תאי סרטן שד פולשניים ולא פולשניים מבוססים כהוכחה עקרונית. השתמשנו גם בתאים מפלישה של קסנוגרפט (PDX) שמקורו בחולה בתגובה לתאי מערכת החיסון ממח העצם האנושי כדי להראות היתכנות לשימוש עתידי גם במסגרות אבחון קליניות. PDX הן רקמות גידול של מטופלים המושתלות במודל עכברים מדוכאי חיסון או הומניזציה כדי לאפשר לימוד של אפשרויות גדילה, התקדמות וטיפול בחולה המקורי 7,8.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.05% Trypsin-EDTA</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>25300-054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adhesive</td>
			<td>Norland Optical Adhesive</td>
			<td>NOA63</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell lifter</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.1832</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholera Toxin from Vibrio cholerae</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>12585-014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CIM-plate</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5665817001</td>
			<td>Cell analyzer plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase from Clostridium histolyticum</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C0130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase</td>
			<td>StemCell</td>
			<td>7913</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>11995-065</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM-F12</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>11875-093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS), Heat Inactivated</td>
			<td>Omega Scientific</td>
			<td>FB-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>15630106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse serum (HS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>16050-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human EGF</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>AF-100-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human umbilical Vein endothelail cells (HUVEC)</td>
			<td>LONZA (RRID:CVCL_2959)</td>
			<td>C-2517A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HUVEC media</td>
			<td>LONZA</td>
			<td>CC-3162</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrocortisone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H4001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin Transferrin Selenium Ethanolamine (ITSX) (100x)</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>51500056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin, Human Recombinant, Zinc Solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C8052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>J2 Fibroblasts</td>
			<td>Stemcell (RRID:CVCL_W667)</td>
			<td>100-0353</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LymphoPrep</td>
			<td>Stemcell</td>
			<td>7851</td>
			<td>Density gradient medium for the isolation of mononuclear cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354230</td>
			<td>Basement membrane matrix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MCFDCIS.com cells ( DCIS)</td>
			<td>RRID:CVCL_5552</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MDA-MB-231 cells</td>
			<td>RRID:CVCL_0062</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Milling machine</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Bridgeport Series 1 Vertical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline (1x)</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>10010049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethersulfone (PES) membrane</td>
			<td>Sterlitech</td>
			<td>PCTF029030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RBC lysis solution</td>
			<td>Stemcell</td>
			<td>7800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy Micro Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RTCA DP analyzer</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>3X16</td>
			<td>Dual purpose cell analyzer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T4799</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

real-time detection and capture of invasive cell subpopulations from co-cultures

פלישה והתפשטות גרורתית של תאים סרטניים הם הגורם העיקרי למוות מסרטן. מבחנים שפותחו בשלב מוקדם כדי למדוד את הפוטנציאל הפולשני של אוכלוסיות תאים סרטניים מייצרים בדרך כלל מדידה של נקודת קצה אחת שאינה מבחינה בין תת-אוכלוסיות של תאים סרטניים עם פוטנציאל פולשני שונה. כמו כן, המיקרו-סביבה של הגידול מורכבת מתאים סטרומליים וחיסון שונים, המשנים את ההתנהגות הפולשנית של תאים סרטניים ומשתתפים בהם. פלישה לרקמות ממלאת גם תפקיד בתת-אוכלוסיות של תאי מערכת החיסון הנלחמות במיקרואורגניזמים או בסילוק תאים חולים מתאי הפרנכימה והאנדותל במהלך שיפוץ רקמות ואנגיוגנזה. אנליזה תאית בזמן אמת (RTCA) המשתמשת בביו-סנסורים של עכבה כדי לנטר את פלישת התאים הייתה צעד גדול קדימה מעבר למדידת נקודת הקצה של הפלישה: זו מספקת מדידות רציפות לאורך זמן ובכך יכולה לחשוף הבדלים בשיעורי הפלישה שאבדו במבחן נקודות הקצה. באמצעות טכנולוגיית RTCA הנוכחית, הרחבנו מערכים דו-תאיים על ידי הוספת תא נוסף שיכול להכיל תאים סטרומליים ו/או חיסוניים ומאפשר למדוד את קצב הפלישה בהשפעת גורמים מופרשים מתאי סטרומל או מערכת החיסון בתרבית משותפת לאורך זמן. מעבר לכך, העיצוב הייחודי מאפשר ניתוק תאים בכל עת ובידוד של התא הסרטני הפולשני ביותר, או תת-אוכלוסיות תאים אחרות הנמצאות בתערובות הטרוגניות של מבודדי גידול שנבדקו. תאים סרטניים פולשניים אלה ותת-אוכלוסיות תאים אחרות מניעים התקדמות ממאירה למחלות גרורתיות, ומאפייניהן המולקולריים חשובים למחקרים מכניסטיים מעמיקים, לפיתוח בדיקות אבחון לגילוין ולהערכת פגיעויות. לפיכך, ניתן להשתמש בהכללה של תרופות בעלות מולקולות קטנות או גדולות כדי לבחון את הפוטנציאל של טיפולים המכוונים לסרטן ו/או לתת-אוכלוסיות של תאים סטרומליים במטרה לעכב (למשל, תאים סרטניים) או לשפר (למשל, תאי מערכת החיסון) התנהגות פולשנית.

באמצעות מערך שלושת התאים שתוכנן לאחרונה, פלישה של התאים נבדקה בנוכחות או בהיעדר תאים סטרומליים כגון פיברובלסטים. פלישת תאי MDA-MB-231 שופרה כאשר פיברובלסטים שוויצריים מוקרנים 3T3 (זן J2) נזרעו בתא התחתון, מה שאפשר חילופי גורמים בין שני קווי התאים. באופן מעניין, הפלישה ל-MDA-MB-231 גדלה כאשר מספרם של תא...

Watch this Scientific Journal Video about Real-Time Detection and Capture of Invasive Cell Subpopulations from Co-Cultures at JoVE.com

Real-Time Detection and Capture of Invasive Cell Subpopulations from Co-Cultures

אנו מתארים גישה לאיתור ולכידת תת-אוכלוסיות של תאים פולשניים בזמן אמת. התכנון הניסויי משתמש באנליזה תאית בזמן אמת על ידי ניטור שינויים בעכבה החשמלית של תאים. סרטן פולשני, תאי חיסון, אנדותל או סטרומל ברקמות מורכבות יכולים להיתפס, וניתן להעריך את ההשפעה של תרביות משותפות.

זיהוי ולכידה בזמן אמת של תת-אוכלוסיות תאים פולשניות מתרביות משותפות

Invasion and metastatic spread of cancer cells are the major cause of death from cancer. Assays developed early on to measure the invasive potential of ...

טכניקה זו מאפשרת זיהוי של התאים בעלי יכולות פולשניות שונות בהשפעת גורמים מופרשים מתאים סטרומליים בתרבית משותפת. הטכניקה מעריכה את ההשפעה של גורמים מופרשים מתאים סטרומליים או חיסוניים בתרבית משותפת על פלישת התאים. זה גם מאפשר התאוששות וניתוח של תת-אוכלוסיות תאים פולשניות הנמצאות בתערובות תאים הטרוגניות.הטכניקה יכולה לקבוע אילו גידולים מכילים תת-אוכלוסיות של תאים פולשניים שמובילים לגרורות. לכידה וניתוח של תאים סרטניים פולשניים עשויים לקבל החלטות טיפוליות מושכלות. כדי להתחיל את תרבית התאים, שטפו את תרביות תאי ההדבקה במפגש של כ-70% עם מלח 1X חסום פוספט.לאחר מכן הוסף תמיסת 0.05% טריפסין ו- EDTA כדי להרים את התאים. נטרלו את תמיסת הטריפסין בעזרת מדיה של תרביות תאים המכילה סרום וספרו את התאים באמצעות אליקווט של תרחיף התא. הניחו את כל שלושת התאים הסטריליים במכסה המנוע של תרבית הרקמה.אתרו את הידית בצד הקצר של החדר התחתון וכיוונו את התא התחתון כך שהידית תפנה אל הנסיין. הוסף 30, 000 עד 50, 000 תאים ב-90 מיקרוליטרים של מדיה לכל באר מהתא התחתון מבלי ליצור בועות. השתמשו ב-5% מהתוספים של סרום בקר עוברי בשני תאים תחתונים כבקרה חיובית לתנועתיות התאים, והשתמשו ב-0% במדיה של תוספי סרום כבקרה שלילית.סובבו את התא התחתון ב-90 מעלות לאחר שנתנו לו להסתפק במשך 10 עד 15 דקות במכסה המנוע. לאחר מכן הניחו את החדר האמצעי למעלה כך שהידית בתא התחתון תחליק לתוך החריץ שבחדר האמצעי. דחפו את התא אנכית כלפי מטה עד שנשמע קליק מכל אחד מהצדדים הארוכים של ההרכבה.הוסיפו 160 מיקרוליטרים של מדיה ללא סרום לכל הבארות של החדר האמצעי. ודאו שמניסקוס בצורת כיפה נראה לעין לאחר מילוי בארות והניחו את התא העליון עם אלקטרודות הפונות כלפי מטה אל החדר האמצעי כדי ליישר את הנקודות הכחולות בתאים האמצעיים והעליונים. דחפו את התא אנכית כלפי מטה עד שנשמע צליל לחיצה מכל אחד מהצדדים הארוכים של ההרכבה.הוסיפו 20 עד 50 מיקרוליטרים של מדיה ללא סרום לתא העליון. הרכיבו את ההרכבה על מנתח התאים הדו-תכליתי באינקובטור תרביות הרקמה והמתינו 30 דקות לפני מדידת הרקע. פתח את תוכנת מנתח התאים, לאחר מכן בחר את העריסה לשימוש, ולאחר מכן לחץ על לשונית ההודעה, וודא שכתוב עליה חיבורים בסדר "כדי להבטיח שהמערך ממוקם היטב בעריסה והאלקטרודות מיושרות היטב עם החיישנים.לחץ על לשונית הערות הניסוי ומלא את כל המידע האפשרי על הניסוי. לאחר מכן לחץ על כרטיסיית הפריסה ומלא את התיאור של פריסת המערך. לאחר מכן לחץ על הכרטיסייה לוח זמנים והוסף שני שלבים מתפריט השלבים, שלב רקע עם טאטוא אחד ושלב בדיקה עם 100 טאטואים.לאחר שהמערך נמצא באינקובטור מנתח התאים הדו-תכליתי במשך 30 דקות, לחץ על כפתור ההפעלה כדי להתחיל במדידת הרקע. לאחר סיום מדידת הרקע, הסר את המערך מהעריסה והנח אותו בחזרה במכסה המנוע של תרבית התאים. לאחר מכן הוסיפו 30, 000 עד 50, 000 תאים ב-100 מיקרוליטרים של מדיה ללא סרום לכל באר של החדר העליון.אלה הם התאים שהאלקטרודה תזהה ברגע שהם יעברו בהצלחה דרך הממברנה. תנו למכלול לעמוד במכסה המנוע במשך 30 דקות לפני ההרכבה על מנתח התאים הדו-תכליתי למדידת עכבה. מקם את המערך בחזרה למנתח התאים הדו-תכליתי ובדוק את לשונית ההודעה עבור ההודעה 'חיבורים בסדר'.לחץ על כפתור ההפעלה כדי להתחיל מדידת עכבה ולאחר מכן לחץ על כרטיסיית העלילה כדי לעקוב אחר התקדמות האות. אם נקודת הקצה מגיעה לפני 25 שעות, לחץ על שלב הביטול מהתפריט הנפתח 'הפעל'. כדי לייצא נתונים, לחץ באמצעות לחצן העכבר הימני על הגרף, בחר העתק בתבנית הרשימה ולאחר מכן הדבק את הנתונים בגיליון אלקטרוני.עקוב אחר קצב ההעברה בזמן אמת על מנתח התאים הדו-תכליתי כדי לקבוע את נקודת העצירה של העניין. לאחר שהושגו, שחררו את ההרכבה ממנתח התאים הדו-תכליתי והניחו אותו במכסה המנוע של תרבית הרקמה. הכן מספר מתאים של 1.5 מיליליטרים של צינורות microcentrifuge כדי לאסוף את התאים מבארות העניין.מניחים את המכלול בצלחת של 10 ס"מ כדי להכיל נוזלים כאשר התאים מתנתקים. דוחפים את קצוות ההצמדה הגמישים בצד הארוך של החדר האמצעי פנימה עד שנשמע צליל לחיצה, ולאחר מכן מפרקים את התא העליון והופכים אותו לתבשיל חדש של 10 סנטימטרים. השתמשו במרים תאים עם להב של 13 מילימטר כדי לאסוף את התאים מכל הבארות עם אותו מצב ניסיוני.יש לשטוף או לטבול את הלהב בתמיסת מלח 1X דחוסה בפוספט כדי לאסוף את התאים בצינורות מיקרו-צנטריפוגה של 1.5 מיליליטר. לאחר מכן סובבו את התאים ב-500 פעמים G למשך חמש דקות והפיצו את התאים שנאספו או בצעו ניתוח נקודות קצה כגון ריצוף RNA חד-תאי. הערכה של פלישה לתאים בנוכחותם או בהיעדרם של תאים סטרומליים הראתה כי פלישת תאי MDA-MB-231 שופרה כאשר זן הפיברובלסטים של Swiss-3T3 המוקרן J2 ישב בתא התחתון לצורך החלפת גורמים בין שני קווי התאים.באופן מעניין, הפלישה ל-MDA-MB-231 גדלה כאשר מספרם של תאי 3T3 J2 הוכפל. מצד שני, נראה כי קצב הפלישה של שיבוט פולשני של תאי MCFDCIS, DCIS-Delta Four, מעוכב על ידי הצלבה עם תאי 3T3 J2, מה שמרמז על יישום רב ערך של מערך שלושת התאים למדידת השפעות משתנות של הסטרומה. במקרה זה, פיברובלסטים על פלישת תאים.תאי האנדותל של וריד הטבור האנושי היו פולשניים יותר בתגובה לגורמים המופרשים על ידי תאי MDA-MB-231, בניגוד לאלה שהופרשו על ידי תאי DCIS, מה שעולה בקנה אחד עם יכולתם של גידולים פולשניים לגייס תאי אנדותל להיווצרות כלי דם ולהפצה מאוחרת יותר למחזור הדם. פלישת תאי קסנוגרפט שמקורם בחולה מהתא העליון גדלה בתגובה לתאי חיסון של מח עצם אנושי בתרבית משותפת. באופן מעניין, נוכחות של 2% סרום בתא התחתון עם תאי החיסון של מח העצם האנושי הייתה חיונית לפלישה של קסנוגרפטים שמקורם בחולים.ניתן לצפות את הבארות במטריצה חוץ-תאית כדי לחקות את מחסום קרום המרתף. ניתן להוסיף סוכנים טיפוליים לתקשורת בבארות כדי לעקוב אחר השפעתם על הפלישה.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Capture and Release of Viable Circulating Tumor Cells from Blood

לכידת שחרור בתאי גידול במחזור קיימא מן הדם

We demonstrate a method for size based capture of viable circulating tumor cell (CTC) from whole blood, along with the release of these cells from chip ...

Invasive Behavior of Human Breast Cancer Cells in Embryonic Zebrafish

התנהגות פולשנית של תאים סרטניים בשד אדם עוברי הזברה

In many cases, cancer patients do not die of a primary tumor, but rather because of metastasis. Although numerous rodent models are available for studying ...

Four-color Fluorescence Immunohistochemistry of T-cell Subpopulations in Archival Formalin-fixed, Paraffin-embedded Human Oropharyngeal Squamous Cell Carcinoma Samples

ארבע צבע הקרינה אימונוהיסטוכימיה של T- תאים subpopulations ב פורמולה קבוע פורמאלית, פרפין, מוטבע האדם דגימות שלפוחית ​​השתן דגימות קרצינומה של תאי קשקש

The four-color fluorescence immunohistochemistry (IHC) technique is a method to quantify cell populations of interest while taking into account their ...

Preparation and Metabolic Assay of 3-dimensional Spheroid Co-cultures of Pancreatic Cancer Cells and Fibroblasts

הכנה ואת וזמינותו מטבולית של תרבויות המשנה ספרואיד תלת-ממדי של תאי סרטן הלבלב ו Fibroblasts

Many cancer types, including pancreatic cancer, have a dense fibrotic stroma that plays an important role in tumor progression and invasion. Activated ...

Serum and Plasma Copy Number Detection Using Real-time PCR

סרום ו פלזמה עותק מספר זיהוי באמצעות PCR בזמן אמת

Serum and plasma cell free DNA (cfDNA) has been shown as an informative, non-invasive source of biomarkers for cancer diagnosis, prognosis, monitoring, ...

Real Time Detection of In Vitro Tumor Cell Apoptosis Induced by CD8+ T Cells to Study Immune Suppressive Functions of Tumor-infiltrating Myeloid Cells

Real Time Detection of In Vitro Tumor Cell Apoptosis Induced by CD8+ T Cells to Study Immune Suppressive Functions of Tumor-infiltrating Myeloid Cells

זיהוי בזמן אמת של הגידול Vitro תאים אפופטוזיס שנגזרות CD8+ T תאים ללמוד פונקציות החיסונית מדכא גידולים הסתננות התאים מיאלואידית

Potentiation of the tumor-killing ability of CD8+ T cells in tumors, along with their efficient tumor infiltration, is a key element of successful ...

Real-Time Monitoring of Human Glioma Cell Migration on Dorsal Root Ganglion Axon-Oligodendrocyte Co-Cultures

ניטור בזמן אמת של הגירה של תא האדם Glioma על גבי גנגליון שורש-אוליגודנדרוציטים שיתוף תרבויות

Glioblastoma is one of the most aggressive human cancers due to extensive cellular heterogeneity and the migration properties of hGCs. In order to better ...

Time-Lapse 2D Imaging of Phagocytic Activity in M1 Macrophage-4T1 Mouse Mammary Carcinoma Cells in Co-cultures

הדמיה הזמן 2D דימות של פעילות Phagocytic ב-M1 מקרופאג-4T1 עכבר קרצינומה של החלב תאים במשותף תרבויות

Tumor-associated macrophages (TAMs) have been identified as an important component for tumor growth, invasion, metastasis, and resistance to cancer ...

Combined Use of Tail Vein Metastasis Assays and Real-Time In Vivo Imaging to Quantify Breast Cancer Metastatic Colonization and Burden in the Lungs

שימוש משולב של הזנב וריד גרורה Assays ובזמן אמת ב Vivo הדמיה כדי לכמת מושבת סרטן השד ונטל בריאות

Metastasis is the main cause of cancer-related deaths and there are limited therapeutic options for patients with metastatic disease. The identification ...

Impedance-based Real-time Measurement of Cancer Cell Migration and Invasion

עכבה מבוססי מדידה בזמן אמת של סרטן הגירה תאים ופלישה

Cancer arises due to uncontrolled proliferation of cells initiated by genetic instability, mutations, and environmental and other stress factors. These ...