Name: real-time detection and capture of invasive cell subpopulations from co-cultures
Uploaded: 2022-03-30T14:00:00
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ユタ大学ハンツマンがん研究所のアラナ・ウェルムズ博士に、患者由来の異種移植片(HCI-010)を提供してくださったことに感謝します。この研究は、NIHの助成金R01CA205632、R21CA226542、および部分的にはAgilent Technologiesからの助成金によって支援されました。

この研究は、ジョージタウン大学の治験審査委員会(IRB # 2002-022)によって審査され、「免除」とみなされました。新たに採取された骨髄組織は、脱同定されていた廃棄された健康なヒト骨髄採取フィルターから採取した。
1. 新しいチャンバー設計(図2)
<ol><li>新しいデュアルチャンバーセルアナライザープレートを開きます?...

<ol>
	<li>Friedl, P., Gilmour, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collective+cell+migration+in+morphogenesis,+regeneration+and+cancer.">Collective cell migration in morphogenesis, regeneration and cancer.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10 (7), 445-457 (2009).</li><li>Boyden, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chemotactic+effect+of+mixtures+of+antibody+and+antigen+on+polymorphonuclear+leucocytes.">The chemotactic effect of mixtures of antibody and antigen on polymorphonuclear leucocytes.</a> The Journal of Experimental Medicine. 115 (3), 453-466 (1962).</li><li>Xu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+review+of+impedance+measurements+of+whole+cells.">A review of impedance measurements of whole cells.</a> Biosensors &amp; Bioelectronics. 77, 824-836 (2016).</li><li>Stylianou, D. 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デュアルチャンバーアレイの設計を変更し、間質細胞の存在下で細胞侵入をリアルタイムで監視するための第3チャンバーを含めました。我々は、共培養線維芽細胞が浸潤性および非浸潤性癌細胞に対して有する明確な効果を観察し、このアレイを使用して、共培養間質細胞によって産生される因子に対して異なる応答を示す癌細胞亜集団を区別することができることを示している。このアレ...

細胞浸潤は、間質細胞によって提供される環境的手がかりに応答して、細胞が基底膜障壁を通過することを可能にする重要なプロセスである。これは、免疫応答、創傷治癒、組織修復、および局所病変から浸潤性および転移性癌に進行する可能性のある悪性腫瘍の発達のいくつかの段階における重要なステップである1。細胞集団の侵襲的可能性を測定するために早期に開発されたアッセイは、典型的には、単一のエンドポイント測定を生成するか、または侵襲的細胞の事前標識を必要とする2。マイクロエレクトロニクスとマイクロフルイディクス技術の統合は、微小電極3,4上の生細胞の電気インピーダンスを使用して、生存率、動き、および付着などの細胞生物学のさまざまな側面を検出するために開発されています。インピーダンス測定により、ラベルフリー、非侵襲的、定量的な細胞状態の評価が可能になります3。ここでは、Abassiらによって開発されたリアルタイム細胞解析(RTCA)システムの設計に基づく3チャンバーアレイについて説明します。3チャンバーアレイは、細胞侵入に関する共培養細胞の評価および追加の分析または拡張のための侵襲性細胞の回収を可能にする。
細胞分析システムでは、細胞は多孔性膜上にコーティングされた細胞外マトリックスを介して侵入し、障壁の反対側に位置するデジタル化された電極アレイに到達する。侵襲的なセルが時間の経過とともにこの電極アレイを取り付けて占有し続けると、電気インピーダンスは並列に変化します。現在のシステムは、2つのチャンバーを有する細胞浸潤および遊走(CIM)16ウェルプレートを含む。RTCA-DP(デュアルパーパス)(以下、デュアルパーパスセルアナライザと呼ぶ)機器には、インピーダンス測定用のセンサと、インピーダンスデータを分析および処理するための統合ソフトウェアが含まれています。ベースラインでのインピーダンス値は、ウェル内の培地のイオン強度に依存し、細胞が電極に付着するにつれて変化します。インピーダンスの変化は、細胞の数、その形態、および細胞が電極に付着する程度に依存する。細胞が添加される前の培地を含むウェルの測定は、バックグラウンドシグナルとみなされます。バックグラウンドは、セルが電極に付着および拡散して平衡に達した後のインピーダンス測定から差し引かれます。セルインデックス(CI)と呼ばれる電極上のセルの状態の単位のないパラメータは、CI =(平衡後のインピーダンス - セルの非存在下でのインピーダンス)/公称インピーダンス値6のように計算されます。異なる細胞株の遊走速度を比較する場合、デルタCIを使用して、最初の数回の測定で表された付着の違いに関係なく、細胞の状態を比較することができます。
新しく設計された3チャンバーアレイは、既存の設計に基づいて構築され、電極を含むデュアルパーパスセルアナライザシステムのトップチャンバを使用します。修正された中央チャンバとボトムチャンバは、統合されたソフトウェアを使用してインピーダンス測定と解析を行うために、アセンブリをデュアルパーパスセルアナライザに適合させるように適合されています。新しい設計が既存のデュアルチャンバーCIMプレート(以下、セルアナライザープレートと呼ぶ)に対して提供する2つの大きな進歩は、i)異種細胞ミックスに存在する侵襲性細胞亜集団を回収し、分析する能力と、ii)共培養間質または免疫細胞からの分泌因子が細胞浸潤に及ぼす影響を評価するオプションです(図1)。
この技術は、異なる侵襲能力を有する細胞の亜集団を研究するのに有用であり得る。すなわち、(a)周囲の組織または血液およびリンパ管に侵入する浸潤性癌細胞、または遠隔臓器の転移性播種部位で溢出する浸潤性癌細胞、(b)病原体または罹患細胞に対処するために組織に侵入する免疫系からの細胞、(c)組織再編成または創傷治癒中に組織に侵入して新しい血管を形成する内皮細胞、 (d)腫瘍微小環境からの間質細胞が癌細胞と共に支持および浸潤する。このアプローチは、細胞の運動性および浸潤を調節することができる間質クロストークの包含を可能にする。ここに示した実現可能性研究は、癌細胞からの差異シグナルに応答した内皮浸潤を含むモデル系として、癌細胞浸潤および間質との相互作用に焦点を当てたこの改変アレイを使用する。このアプローチは、癌細胞および免疫細胞、線維芽細胞、または内皮細胞の亜集団などの他の細胞型を単離するために外挿され得る。我々は、原理の証明として浸潤性および非浸潤性の確立された乳癌細胞株を試験した。また、ヒト骨髄由来の免疫細胞に応答した患者由来の異種移植片(PDX)浸潤由来の細胞を用いて、臨床診断の現場においても将来の使用の可能性を示した。PDXは、元の患者に対する成長、進行、および治療選択肢の研究を可能にするために免疫不全またはヒト化マウスモデルに移植された患者腫瘍組織7、8である。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.05% Trypsin-EDTA</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>25300-054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adhesive</td>
			<td>Norland Optical Adhesive</td>
			<td>NOA63</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell lifter</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.1832</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholera Toxin from Vibrio cholerae</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>12585-014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CIM-plate</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5665817001</td>
			<td>Cell analyzer plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase from Clostridium histolyticum</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C0130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase</td>
			<td>StemCell</td>
			<td>7913</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>11995-065</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM-F12</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>11875-093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS), Heat Inactivated</td>
			<td>Omega Scientific</td>
			<td>FB-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>15630106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse serum (HS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>16050-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human EGF</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>AF-100-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human umbilical Vein endothelail cells (HUVEC)</td>
			<td>LONZA (RRID:CVCL_2959)</td>
			<td>C-2517A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HUVEC media</td>
			<td>LONZA</td>
			<td>CC-3162</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrocortisone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H4001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin Transferrin Selenium Ethanolamine (ITSX) (100x)</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>51500056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin, Human Recombinant, Zinc Solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C8052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>J2 Fibroblasts</td>
			<td>Stemcell (RRID:CVCL_W667)</td>
			<td>100-0353</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LymphoPrep</td>
			<td>Stemcell</td>
			<td>7851</td>
			<td>Density gradient medium for the isolation of mononuclear cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354230</td>
			<td>Basement membrane matrix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MCFDCIS.com cells ( DCIS)</td>
			<td>RRID:CVCL_5552</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MDA-MB-231 cells</td>
			<td>RRID:CVCL_0062</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Milling machine</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Bridgeport Series 1 Vertical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline (1x)</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>10010049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethersulfone (PES) membrane</td>
			<td>Sterlitech</td>
			<td>PCTF029030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RBC lysis solution</td>
			<td>Stemcell</td>
			<td>7800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy Micro Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RTCA DP analyzer</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>3X16</td>
			<td>Dual purpose cell analyzer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T4799</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

real-time detection and capture of invasive cell subpopulations from co-cultures

癌細胞の浸潤および転移性拡散は、癌による死の主な原因である。癌細胞集団の浸潤性ポテンシャルを測定するために早期に開発されたアッセイは、典型的には、異なる浸潤ポテンシャルを有するがん細胞サブポピュレーションを区別しない単一のエンドポイント測定を生成する。また、腫瘍微小環境は、癌細胞の浸潤挙動を変化させ、関与する異なる常在間質および免疫細胞からなる。組織への侵入はまた、組織リモデリングおよび血管新生の間に微生物をかわすか、または実質および内皮細胞から罹患細胞を排除する免疫細胞亜集団において役割を果たす。インピーダンスバイオセンサーを利用して細胞浸潤を監視するリアルタイム細胞解析(RTCA)は、エンドポイントの浸潤測定を超えた大きな前進でした:これは、時間の経過とともに継続的な測定を提供し、エンドポイントアッセイで失われる浸潤率の違いを明らかにすることができます。現在のRTCA技術を使用して、間質および/または免疫細胞を含むことができ、共培養間質または免疫細胞からの分泌因子の影響下での浸潤速度を経時的に測定できるさらなるチャンバーを追加することによって、デュアルチャンバーアレイを拡張した。これを超えて、このユニークな設計により、いつでもチャンバーを剥離し、最も浸潤性の高いがん細胞、または試験した腫瘍分離株の不均一な混合物中に存在する他の細胞亜集団を単離することができます。これらの最も浸潤性の高いがん細胞および他の細胞亜集団は、転移性疾患への悪性進行を駆動し、それらの分子特性は、詳細な機構的研究、それらの検出のための診断プローブの開発、および脆弱性の評価にとって重要である。したがって、小分子または大分子の薬物の包含は、(例えば、癌細胞)浸潤行動を阻害または増強する(例えば、免疫細胞)ことを目的として、癌および/または間質細胞亜集団を標的とする治療法の可能性を試験するために使用することができる。

新たに設計された3チャンバーアレイを用いて、細胞の浸潤を、線維芽細胞などの間質細胞の存在下または非存在下で試験した。照射されたスイス3T3線維芽細胞(J2株)を底部チャンバーに播種するとMDA-MB-231細胞浸潤が増強され、2つの細胞株間での因子の交換が可能になった。興味深いことに、MDA-MB-231の浸潤は、3T3-J2細胞の数が2倍になったときに増加した(図3A)。一方、MCF...

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Real-Time Detection and Capture of Invasive Cell Subpopulations from Co-Cultures

侵襲的な細胞亜集団をリアルタイムで検出して捕捉するアプローチについて説明します。実験計画では、セルの電気インピーダンスの変化を監視することによってリアルタイムセルラー解析を使用しています。浸潤性癌、免疫、内皮または間質細胞を複雑な組織に捕捉することができ、共培養の影響を評価することができる。

共培養からの侵襲的細胞亜集団のリアルタイム検出と捕捉

Invasion and metastatic spread of cancer cells are the major cause of death from cancer. Assays developed early on to measure the invasive potential of ...

この技術は、共培養間質細胞から分泌された因子の影響下で異なる侵襲能力を有する細胞の同定を可能にする。この技術は、共培養間質または免疫細胞からの分泌因子が細胞浸潤に及ぼす影響を評価する。それはまた、不均一な細胞混合物中に存在する侵襲性細胞亜集団の回収および分析を可能にする。この技術は、どの腫瘍が転移につながる浸潤性細胞亜集団を保有しているかを決定することができる。浸潤性癌細胞の捕捉および分析は、治療の決定に情報を与える可能性がある。細胞培養を開始するために、約70%のコンフルエント性を有する付着細胞培養物を1倍リン酸緩衝生理食塩水で洗浄する。次に、0.05%トリプシンおよびEDTA溶液を加えて細胞を持ち上げる。血清を含む細胞培養培地でトリプシン溶液を中和し、細胞懸濁液のアリコートを用いて細胞を計数する。3つの滅菌チャンバーすべてを組織培養フードに入れます。下のチャンバーの短辺にあるノブの位置を確認し、ノブが実験者の方を向くように下のチャンバーを向けます。気泡を形成せずに、90マイクロリットルの培地中の30,000〜50,000個の細胞を下部チャンバから各ウェルに加える。細胞運動性の陽性対照として2つの下部チャンバーで5%のウシ胎児血清補充培地を使用し、陰性対照として0%血清補充培地を使用する。ボンネットに10~15分間沈ませた後、下部チャンバーを90度回転させます。次に、下部チャンバのノブが中央チャンバの切り込みにスライドするように、中央のチャンバを上に置きます。アセンブリの長辺のそれぞれからカチッという音がするまで、チャンバーを垂直に下方に押します。160マイクロリットルの無血清培地を中央チャンバーのすべてのウェルに加える。井戸が満たされた後、ドーム型のメニスカスが見えることを確認し、中央のチャンバに下を向いた電極で上部チャンバを配置し、中央チャンバとトップチャンバの青い点を揃えます。アセンブリの長辺のそれぞれからカチッという音が聞こえるまで、チャンバーを垂直に押し下げます。20~50マイクロリットルの無血清培地を上部チャンバーに加える。組織培養インキュベーター内のデュアルパーパス細胞分析装置にアセンブリを取り付け、30分待ってからバックグラウンドを測定します。セルアナライザソフトウェアを開き、使用するクレードルを選択し、メッセージタブをクリックして、「接続は大丈夫です」と表示されていることを確認し、アレイがクレードルに正しく配置され、電極がセンサーと適切に整列していることを確認します。[実験メモ] タブをクリックし、実験に関するすべての可能な情報を入力します。次に、レイアウトタブをクリックし、配列レイアウトの説明を入力します。次に、[スケジュール] タブをクリックし、[ステップ] メニューから 2 つのステップ、1 つのスイープを含むバックグラウンド ステップ、および 100 回のスイープを含むテスト ステップを追加します。アレイがデュアルパーパス細胞分析器インキュベーターに30分間入れられたら、再生ボタンをクリックしてバックグラウンド測定を開始します。バックグラウンド測定が完了したら、アレイをクレードルから取り出し、細胞培養フードに戻します。次いで、100マイクロリットルの無血清培地中の30,000〜50,000個の細胞をトップチャンバーの各ウェルに加える。これらは、電極が膜を通って正常に移動した後に検出するセルです。アセンブリをフード内に30分間放置してから、インピーダンス測定用のデュアルパーパスセルアナライザに取り付けます。アレイをデュアルパーパス・セル・アナライザーに戻し、「メッセージ」タブで「接続は大丈夫です」というメッセージを確認します。再生ボタンをクリックしてインピーダンス測定を開始し、プロットタブをクリックして信号の進行状況を監視します。エンドポイントが 25 時間前に達した場合は、[実行] ドロップダウン メニューから [中止] ステップをクリックします。データをエクスポートするには、グラフを右クリックし、[リスト形式でコピー] を選択してから、データをスプレッドシートに貼り付けます。デュアルパーパスセルアナライザーで移行速度をリアルタイムで監視し、目的の停止点を決定します。完了したら、アセンブリをデュアルパーパス細胞分析装置から取り外し、組織培養フードに入れます。適切な数の1.5ミリリットルの微量遠心チューブを準備して、目的のウェルから細胞を回収する。アセンブリを10センチメートルの皿に入れて、チャンバーが外れたときに液体を入れます。中央のチャンバーの長辺にある柔軟なスナップ端を、カチッという音が聞こえるまで内側に押し込み、次に上部チャンバーを解体して新しい10センチメートルの皿に反転させます。13ミリメートルブレードを備えたセルリフターを使用して、同じ実験条件を保持するすべてのウェルから細胞を収集します。ブレードを1Xリン酸緩衝生理食塩水ですすいまたは浸し、1.5ミリリットルの微量遠心チューブで細胞を回収する。その後、細胞を500倍のGで5分間スピンダウンし、これらの収集された細胞を増殖させるか、単一細胞RNAシーケンシングなどのエンドポイント分析を実行します。間質細胞の存在下または非存在下での細胞の浸潤の評価は、2つの細胞株間の因子の交換のために底部チャンバーに座ったSwiss−3T3線維芽細胞J2株を照射したときにMDA−MB−231細胞浸潤が増強されたことを示した。興味深いことに、MDA-MB-231の侵入は、3T3 J2細胞の数が2倍になったときに増加した。一方、MCFDCIS細胞の侵襲性クローンDCIS-Delta Fourの浸潤速度は、3T3 J2細胞とのクロストークによって阻害されるようであり、間質の様々な効果を測定するための3チャンバーアレイの貴重な適用を示唆している。この場合、線維芽細胞は細胞浸潤する。ヒト臍帯静脈内皮細胞は、DCIS細胞によって分泌されるものとは異なり、MDA-MB-231細胞によって分泌される因子に応答してより侵襲的であり、これは血管形成および後の循環への播種のために内皮細胞を動員する浸潤性腫瘍の能力と一致する。患者由来異種移植細胞は、共培養ヒト骨髄免疫細胞に応答してトップチャンバーからの浸潤が増加した。興味深いことに、ヒト骨髄免疫細胞を有する底チャンバーにおける2%血清の存在は、患者由来の異種移植片浸潤に不可欠であった。ウェルは、基底膜障壁を模倣するために細胞外マトリックスでコーティングすることができる。治療薬をウェル内の培地に添加して、浸潤に対するそれらの効果を監視することができる。

Research

JoVE Journal

Cancer Research

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We demonstrate a method for size based capture of viable circulating tumor cell (CTC) from whole blood, along with the release of these cells from chip ...

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Time-Lapse 2D Imaging of Phagocytic Activity in M1 Macrophage-4T1 Mouse Mammary Carcinoma Cells in Co-cultures

M1マクロファージ-4T1マウス乳腺癌細胞における食細胞活性のタイムラプス2Dイメージング

Tumor-associated macrophages (TAMs) have been identified as an important component for tumor growth, invasion, metastasis, and resistance to cancer ...

Combined Use of Tail Vein Metastasis Assays and Real-Time In Vivo Imaging to Quantify Breast Cancer Metastatic Colonization and Burden in the Lungs

尾静脈転移アッセイとリアルタイムインビボイメージングの併用による乳癌転移性コロニー形成と肺の負担の定量化

Metastasis is the main cause of cancer-related deaths and there are limited therapeutic options for patients with metastatic disease. The identification ...

Impedance-based Real-time Measurement of Cancer Cell Migration and Invasion

がん細胞の移動と浸潤のインピーダンスベースリアルタイム測定

Cancer arises due to uncontrolled proliferation of cells initiated by genetic instability, mutations, and environmental and other stress factors. These ...