Name: real-time detection and capture of invasive cell subpopulations from co-cultures
Uploaded: 2022-03-30T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Real-Time Detection and Capture of Invasive Cell Subpopulations from Co-Cultures at JoVE.com

유타 대학교 헌츠만 암 연구소의 알라나 웰름스 박사에게 환자 유래 이종이식편(HCI-010)을 제공해주신 것에 대해 감사드립니다. 이 작업은 NIH 보조금 R01CA205632, R21CA226542 및 부분적으로 애질런트 테크놀로지스의 보조금으로 지원되었습니다.

이 연구는 조지 타운 대학의 기관 검토위원회 (IRB # 2002-022)에 의해 검토되고 "면제"로 간주되었습니다. 갓 수확한 골수 조직은 폐기된 건강한 인간 골수 수집 필터로부터 수집되었으며, 이는 비확인되었다.
1. 새로운 약실 디자인 (그림 2)
<ol><li>새로운 이중 챔버 셀 분석기 플레이트를 엽니다. 전극이있는 상단 챔버를 따로 두십?...

<ol>
	<li>Friedl, P., Gilmour, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collective+cell+migration+in+morphogenesis,+regeneration+and+cancer.">Collective cell migration in morphogenesis, regeneration and cancer.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10 (7), 445-457 (2009).</li><li>Boyden, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chemotactic+effect+of+mixtures+of+antibody+and+antigen+on+polymorphonuclear+leucocytes.">The chemotactic effect of mixtures of antibody and antigen on polymorphonuclear leucocytes.</a> The Journal of Experimental Medicine. 115 (3), 453-466 (1962).</li><li>Xu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+review+of+impedance+measurements+of+whole+cells.">A review of impedance measurements of whole cells.</a> Biosensors &amp; Bioelectronics. 77, 824-836 (2016).</li><li>Stylianou, D. 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A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-free,+real-time+monitoring+of+IgE-mediated+mast+cell+activation+on+microelectronic+cell+sensor+arrays.">Label-free, real-time monitoring of IgE-mediated mast cell activation on microelectronic cell sensor arrays.</a> Journal of Immunological Methods. 292 (1-2), 195-205 (2004).</li><li>Morton, C. L., Houghton, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+human+tumor+xenografts+in+immunodeficient+mice.">Establishment of human tumor xenografts in immunodeficient mice.</a> Nature Protocols. 2 (2), 247-250 (2007).</li><li>DeRose, Y. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+grafts+derived+from+women+with+breast+cancer+authentically+reflect+tumor+pathology,+growth,+metastasis+and+disease+outcomes.">Tumor grafts derived from women with breast cancer authentically reflect tumor pathology, growth, metastasis and disease outcomes.</a> Nature Medicine. 17 (11), 1514-1520 (2011).</li><li>Sharif, G. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+AIB1+isoform+alters+enhancer+access+and+enables+progression+of+early-stage+triple-negative+breast+cancer.">An AIB1 isoform alters enhancer access and enables progression of early-stage triple-negative breast cancer.</a> Cancer Research. 81 (16), 4230-4241 (2021).</li><li>Caileau, R., Olive, M., Cruciger, Q. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+human+breast+carcinoma+cell+lines+of+metastatic+origin:+preliminary+characterization.">Long-term human breast carcinoma cell lines of metastatic origin: preliminary characterization.</a> In Vitro. 14 (11), 911-915 (1978).</li><li>Sharif, G. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+growth+density+modulates+cancer+cell+vascular+invasion+via+Hippo+pathway+activity+and+CXCR2+signaling.">Cell growth density modulates cancer cell vascular invasion via Hippo pathway activity and CXCR2 signaling.</a> Oncogene. 34 (48), 5879-5889 (2015).</li><li>Miller, F. R., Santner, S. J., Tait, L., Dawson, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MCF10DCIS.com+xenograft+model+of+human+comedo+ductal+carcinoma+in+situ.">MCF10DCIS.com xenograft model of human comedo ductal carcinoma in situ.</a> Journal of the National Cancer Institute. 92 (14), 1185-1186 (2000).</li><li>Winkler, J., Abisoye-Ogunniyan, A., Metcalf, K. J., zenaa, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concepts+of+extracellular+matrix+remodelling+in+tumour+progression+and+metastasis.">Concepts of extracellular matrix remodelling in tumour progression and metastasis.</a> Nature Communications. 11 (1), 1-19 (2020).</li><li>Nkosi, D., Sun, L., Duke, L. C., Meckes, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epstein-Barr+virus+LMP1+manipulates+the+content+and+functions+of+extracellular+vesicles+to+enhance+metastatic+potential+of+recipient+cells.">Epstein-Barr virus LMP1 manipulates the content and functions of extracellular vesicles to enhance metastatic potential of recipient cells.</a> PLoS Pathogens. 16 (12), 1009023 (2020).</li><li>Eisenberg, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanistic+modeling+of+the+effects+of+myoferlin+on+tumor+cell+invasion.">Mechanistic modeling of the effects of myoferlin on tumor cell invasion.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (50), 20078-20083 (2011).</li></ol>

우리는 기질 세포의 존재하에 실시간으로 세포 침윤을 모니터링하기위한 세 번째 챔버를 포함하도록 이중 챔버 어레이의 설계를 수정했습니다. 우리는 침습성 및 비침습적 암 세포에 대한 공동 배양된 섬유아세포의 뚜렷한 효과를 관찰하였는데, 이는 어레이가 공동 배양된 기질 세포에 의해 생성된 인자에 다르게 반응하는 암 세포 하위집단을 구별하는데 사용될 수 있음을 나타낸다. 이 어레이?...

세포 침윤은 세포가 기질 세포에 의해 제공되는 환경 단서에 반응하여 기저막 장벽을 통과 할 수있게 해주는 중요한 과정입니다. 면역 반응, 상처 치유, 조직 복구 및 국소 병변에서 침습성 및 전이성 암으로 진행될 수있는 악성 종양을위한 개발의 여러 단계에서 중요한 단계입니다1. 세포 집단의 침습적 잠재력을 측정하기 위해 초기에 개발된 어세이는 전형적으로 단일 종점 측정을 생성하거나 침습성 세포의 사전 표지를 필요로한다2. 마이크로 일렉트로닉스 및 미세 유체 공학 기술의 통합은 이제 마이크로 전극 3,4에서 살아있는 세포의 전기 임피던스를 사용하여 생존력, 이동 및 부착과 같은 세포 생물학의 다양한 측면을 감지하기 위해 개발되었습니다. 임피던스 측정은 세포 상태에 대한 라벨 프리, 비침습적 및 정량적 평가를 가능하게한다3. 여기에서는 Abassi et al.5에 의해 개발 된 RTCA(Real-Time Cellular Analysis) 시스템의 설계를 기반으로 한 3개의 챔버 어레이에 대해 설명합니다. 세 개의 챔버형 어레이는 추가적인 분석 또는 확장을 위해 침습적 세포의 세포 침윤 및 회복에 대한 공동 배양된 세포의 평가를 가능하게 한다.
세포 분석기 시스템에서, 세포는 다공성 막 상에 코팅된 세포외 매트릭스를 통해 침범하여 장벽의 반대편에 위치하는 인터디지타이징된 전극 어레이에 도달한다. 침습 셀이 시간이 지남에 따라 이 전극 어레이를 계속 부착하고 점유함에 따라 전기 임피던스가 병렬로 변합니다. 현재 시스템은 두 개의 챔버를 갖는 세포 침윤 및 이동(CIM) 16-웰 플레이트를 포함한다. RTCA-DP(이중 목적)(이중 목적 셀 분석기라고 함) 계측기에는 임피던스 측정용 센서와 임피던스 데이터를 분석하고 처리하기 위한 통합 소프트웨어가 포함되어 있습니다. 기준선에서의 임피던스 값은 웰 내의 매체의 이온 강도에 의존하며, 전지가 전극에 부착될 때 변화된다. 임피던스 변화는 셀의 수, 그 형태 및 셀이 전극에 부착되는 정도에 따라 달라집니다. 세포가 추가되기 전에 배지를 가진 웰의 측정은 배경 신호로 간주됩니다. 배경은 전극에 부착되고 확산되는 셀과 평형에 도달 한 후 임피던스 측정에서 뺍니다. 전극 상의 셀 상태에 대한 무단위 파라미터는 셀 인덱스(CI)로 명명된다: CI = (평형 후 임피던스 - 셀의 부재 하에서의 임피던스)/공칭 임피던스 값6. 상이한 세포주의 이동 속도가 비교될 때, 델타 CI는 처음 몇 번의 측정에서 표현되는 부착의 차이에 관계없이 세포 상태를 비교하는데 사용될 수 있다.
새로 설계된 세 개의 챔버 어레이는 기존 설계를 기반으로 하며 전극이 포함된 이중 용도 셀 분석기 시스템의 상단 챔버를 사용합니다. 수정된 중간 및 하단 챔버는 통합 소프트웨어를 사용하여 임피던스 측정 및 분석을 위해 조립품을 이중 용도 셀 분석기에 적합하도록 조정됩니다. 새로운 설계가 기존의 이중 챔버 CIM-플레이트 (이후 세포 분석기 플레이트라고 함)를 통해 제공하는 두 가지 주요 진보는 i) 이종 세포 혼합물에 존재하는 침습적 세포 하위 집단을 회수 한 다음 분석 할 수있는 능력 및 ii) 공동 배양 된 기질 또는 면역 세포로부터 분비 된 인자가 세포 침윤에 미치는 영향을 평가하는 옵션 (그림 1).
이 기술은 다른 침습적 능력을 가진 세포의 하위 집단을 연구하는 데 유용 할 수 있습니다. 여기에는 (a) 주변 조직이나 혈액 및 림프관을 침범하거나 먼 장기의 전이성 시딩 부위에서 혈관을 침범하는 침습성 암세포, (b) 병원균 또는 병든 세포를 다루기 위해 조직을 침범하는 면역계로부터의 세포, (c) 조직 재구성 또는 상처 치유 중에 새로운 혈관을 형성하기 위해 조직을 침범하는 내피 세포, 뿐만 아니라 (d) 종양 미세환경으로부터의 기질 세포는 암 세포와 함께 지지하고 침범한다. 이 접근법은 세포 운동성과 침윤을 조절할 수있는 기질 교차 대화의 포함을 허용합니다. 여기에 제시된 타당성 연구는 암 세포로부터의 차등 신호에 반응하여 내피 침윤을 포함하는 모델 시스템으로서 암 세포 침윤 및 스트로마와의 상호작용에 초점을 맞춘 이 변형된 어레이를 사용한다. 상기 접근법은 암 세포 및 다른 세포 유형, 예컨대 면역 세포, 섬유아세포, 또는 내피 세포의 하위집단을 분리하기 위해 외삽될 수 있다. 우리는 원칙의 증거로 침습적이고 비 침습적 인 확립 된 유방암 세포주를 테스트했습니다. 우리는 또한 인간 골수의 면역 세포에 반응하여 환자 유래 이종이식편 (PDX) 침윤의 세포를 사용하여 임상 진단 설정에서도 향후 사용에 대한 타당성을 보여주었습니다. PDX는 원래 환자(7,8)에 대한 성장, 진행 및 치료 옵션의 연구를 허용하기 위해 면역저하 또는 인간화 마우스 모델에 이식되는 환자 종양 조직이다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.05% Trypsin-EDTA</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>25300-054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adhesive</td>
			<td>Norland Optical Adhesive</td>
			<td>NOA63</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell lifter</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.1832</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholera Toxin from Vibrio cholerae</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>12585-014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CIM-plate</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5665817001</td>
			<td>Cell analyzer plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase from Clostridium histolyticum</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C0130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase</td>
			<td>StemCell</td>
			<td>7913</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>11995-065</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM-F12</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>11875-093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS), Heat Inactivated</td>
			<td>Omega Scientific</td>
			<td>FB-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>15630106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse serum (HS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>16050-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human EGF</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>AF-100-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human umbilical Vein endothelail cells (HUVEC)</td>
			<td>LONZA (RRID:CVCL_2959)</td>
			<td>C-2517A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HUVEC media</td>
			<td>LONZA</td>
			<td>CC-3162</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrocortisone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H4001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin Transferrin Selenium Ethanolamine (ITSX) (100x)</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>51500056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin, Human Recombinant, Zinc Solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C8052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>J2 Fibroblasts</td>
			<td>Stemcell (RRID:CVCL_W667)</td>
			<td>100-0353</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LymphoPrep</td>
			<td>Stemcell</td>
			<td>7851</td>
			<td>Density gradient medium for the isolation of mononuclear cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354230</td>
			<td>Basement membrane matrix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MCFDCIS.com cells ( DCIS)</td>
			<td>RRID:CVCL_5552</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MDA-MB-231 cells</td>
			<td>RRID:CVCL_0062</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Milling machine</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Bridgeport Series 1 Vertical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline (1x)</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>10010049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethersulfone (PES) membrane</td>
			<td>Sterlitech</td>
			<td>PCTF029030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RBC lysis solution</td>
			<td>Stemcell</td>
			<td>7800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy Micro Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RTCA DP analyzer</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>3X16</td>
			<td>Dual purpose cell analyzer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T4799</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

real-time detection and capture of invasive cell subpopulations from co-cultures

암세포의 침윤 및 전이성 확산은 암으로 인한 사망의 주요 원인입니다. 암 세포 집단의 침습적 잠재력을 측정하기 위해 초기에 개발된 어세이는 전형적으로 상이한 침습적 잠재력을 갖는 암 세포 하위집단을 구별하지 않는 단일 종점 측정을 생성한다. 또한, 종양 미세환경은 암세포의 침습적 거동을 변화시키고 참여하는 상이한 상주 기질 및 면역 세포로 구성된다. 조직으로의 침윤은 또한 조직 리모델링 및 혈관형성 동안 미생물을 방어하거나 실질 및 내피 세포로부터 병든 세포를 제거하는 면역 세포 하위 집단에서 중요한 역할을 한다. 임피던스 바이오센서를 활용하여 세포 침윤을 모니터링하는 실시간 세포 분석(RTCA)은 침윤의 종점 측정을 넘어 중요한 진전이었습니다: 이는 시간이 지남에 따라 지속적인 측정을 제공하므로 종점 분석에서 손실되는 침윤율의 차이를 나타낼 수 있습니다. 현재의 RTCA 기술을 사용하여, 우리는 기질 및 / 또는 면역 세포를 포함 할 수있는 챔버를 추가로 추가하여 이중 챔버 어레이를 확장했으며 시간이 지남에 따라 공동 배양 된 기질 또는 면역 세포에서 분비 된 인자의 영향으로 침윤 속도를 측정 할 수 있습니다. 이 외에도, 독특한 디자인은 언제든지 챔버를 분리하고 가장 침습적 인 암 세포 또는 테스트 된 종양 분리 물의 이종 혼합물에 존재하는 다른 세포 하위 집단을 분리 할 수있게합니다. 이러한 가장 침습적 인 암세포 및 기타 세포 하위 집단은 전이성 질환으로의 악성 진행을 유도하며, 분자 특성은 심층적 인 기계론 연구, 탐지를위한 진단 프로브 개발 및 취약성 평가에 중요합니다. 따라서, 소분자 또는 거대 분자 약물의 포함은 침습적 행동을 억제(예를 들어, 암 세포) 또는 증강(예를 들어, 면역 세포)하는 것을 목표로 암 및/또는 기질 세포 하위집단을 표적으로 하는 치료법의 잠재력을 시험하는데 사용될 수 있다.

새로 설계된 삼챔버형 어레이를 사용하여, 섬유아세포와 같은 기질 세포의 존재 또는 부재 하에 세포의 침윤을 시험하였다. MDA-MB-231 세포 침윤은 조사된 스위스 3T3 섬유아세포(J2 균주)를 하부 챔버에 시딩할 때 강화되었고, 두 세포주 사이의 인자 교환을 허용하였다. 흥미롭게도, MDA-MB-231 침윤은 3T3-J2 세포 수가 두 배로 증가했을 때 증가하였다(도 3A). 한편, MCFDCIS 세포(DCIS-Δ4...

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Real-Time Detection and Capture of Invasive Cell Subpopulations from Co-Cultures

우리는 침습적 세포 하위집단을 실시간으로 검출하고 포획하는 접근법을 기술한다. 실험 설계는 세포의 전기 임피던스의 변화를 모니터링하여 실시간 세포 분석을 사용합니다. 복잡한 조직에서 침습성 암, 면역, 내피 또는 기질 세포를 포획 할 수 있으며 공동 배양의 영향을 평가할 수 있습니다.

공동 배양물로부터의 침습적 세포 하위집단의 실시간 검출 및 포획

Invasion and metastatic spread of cancer cells are the major cause of death from cancer. Assays developed early on to measure the invasive potential of ...

이 기술은 공동 배양된 기질 세포로부터 분비된 인자의 영향 하에 상이한 침습적 능력을 갖는 세포의 동정을 가능하게 한다. 이 기술은 공동 배양된 기질 또는 면역 세포로부터 분비된 인자가 세포 침윤에 미치는 영향을 평가한다. 또한 이종 세포 혼합물에 존재하는 침습성 세포 하위집단의 회복 및 분석을 허용한다.이 기술은 어떤 종양이 전이로 이어지는 침습적 세포 하위집단을 보유하는지 결정할 수 있다. 침습성 암세포의 포획 및 분석은 치료 결정을 알릴 수 있다. 세포 배양을 시작하기 위해, 대략 70%컨플루언시를 갖는 부착성 세포 배양물을 1X 포스페이트 완충 식염수로 세척한다.그런 다음 0.05 % 트립신과 EDTA 용액을 첨가하여 세포를 들어 올립니다. 트립신 용액을 혈청을 함유하는 세포 배양 배지로 중화시키고, 세포 현탁액의 분취량을 사용하여 세포를 계수한다. 세 개의 멸균 챔버를 모두 조직 배양 후드에 놓습니다.아래쪽 챔버의 짧은 쪽에 있는 손잡이를 찾고 노브가 실험자를 향하도록 아래쪽 챔버의 방향을 지정합니다. 기포를 형성하지 않고 하부 챔버로부터 각 웰에 90 마이크로리터의 배지에 30, 000 내지 50, 000 세포를 첨가한다. 세포 운동성에 대한 양성 대조군으로 두 개의 하부 챔버에서 태아 소 혈청 보충 배지의 5 %를 사용하고 음성 대조군으로 0 % 혈청 보충 배지를 사용하십시오.후드에서 10 ~ 15 분 동안 정착시킨 후 하부 챔버를 90도에서 회전시킵니다. 그런 다음 중간 챔버를 상단에 배치하여 하단 챔버의 노브가 중간 챔버의 노치로 미끄러지도록하십시오. 어셈블리의 긴 측면 각각에서 딸깍 소리가 들릴 때까지 챔버를 수직으로 아래로 밀어 넣습니다.중간 챔버의 모든 웰에 160 마이크로 리터의 혈청이없는 배지를 추가하십시오. 우물을 채운 후에 돔 모양의 메니스커스가 보이는지 확인하고 전극이 중간 챔버에 아래쪽을 향하도록 상단 챔버를 배치하여 중간 및 상단 챔버에 파란색 점을 정렬하십시오. 어셈블리의 긴 측면 각각에서 클릭 소리가 들릴 때까지 챔버를 수직으로 누릅니다.20 ~ 50 마이크로 리터의 무혈청 배지를 상단 챔버에 첨가하십시오. 조립체를 조직 배양 인큐베이터의 이중 용도 세포 분석기에 장착하고 배경을 측정하기 전에 30분 동안 기다렸다. 셀 분석기 소프트웨어를 연 다음 사용할 크래들을 선택한 다음 메시지 탭을 클릭하고 어레이가 크래들에 잘 배치되고 전극이 센서와 잘 정렬되어 있는지 확인하기 위해 연결 확인"이라고 표시되는지 확인하십시오.실험 노트 탭을 클릭하고 실험에 대한 가능한 모든 정보를 입력합니다. 그런 다음 레이아웃 탭을 클릭하고 배열 레이아웃에 대한 설명을 입력하십시오. 그런 다음 일정 탭을 클릭하고 단계 메뉴에서 두 단계, 한 번의 스윕이있는 배경 단계 및 100 번의 스윕이있는 테스트 단계를 추가하십시오.어레이가 이중 용도 세포 분석기 인큐베이터에 30 분 동안 있으면 재생 버튼을 클릭하여 배경 측정을 시작하십시오. 배경 측정이 완료되면 크래들에서 어레이를 제거하고 세포 배양 후드에 다시 놓습니다. 그런 다음 100 마이크로리터의 무혈청 배지에 30, 000 내지 50, 000 세포를 상부 챔버의 각 웰에 첨가한다.이들은 전극이 멤브레인을 통해 성공적으로 이동하면 감지 할 세포입니다. 임피던스 측정을 위해 이중 용도 셀 분석기에 장착하기 전에 조립품을 후드에 30분 동안 방치하십시오. 어레이를 이중 용도 셀 분석기에 다시 배치하고 메시지 탭에서 연결 정상"메시지를 확인합니다.재생 버튼을 클릭하여 임피던스 측정을 시작한 다음 플롯 탭을 클릭하여 신호의 진행률을 모니터링합니다. 끝점이 25시간 전에 도달하면 실행 드롭다운 메뉴에서 중단 단계를 클릭합니다. 데이터를 내보내려면 그래프를 마우스 오른쪽 단추로 클릭하고 목록 형식으로 복사를 선택한 다음 데이터를 스프레드시트에 붙여 넣습니다.이중 목적 셀 분석기에서 실시간으로 이동 속도를 모니터링하여 관심 지점의 정지 지점을 결정합니다. 일단 달성되면, 조립체를 이중 목적 세포 분석기로부터 마운트 해제하고 조직 배양 후드에 놓는다. 관심있는 웰에서 세포를 수집하기 위해 적절한 수의 1.5 밀리리터의 마이크로 원심분리 튜브를 준비하십시오.챔버가 분리 될 때 액체를 담기 위해 어셈블리를 10 센티미터 접시에 넣으십시오. 딸깍 소리가 들릴 때까지 중간 챔버의 긴 쪽에있는 유연한 스냅 끝을 안쪽으로 밀어 넣은 다음 상단 챔버를 해체하고 새로운 10 센티미터 접시로 뒤집습니다. 13mm 블레이드가 있는 셀 리프터를 사용하여 동일한 실험 조건을 수용하는 모든 웰에서 세포를 수집합니다.블레이드를 헹구거나 1X 인산염 완충 식염수에 담그고 세포를 1.5 밀리리터 마이크로 원심분리 튜브에 모으십시오. 그런 다음 세포를 5분 동안 500배 G에서 스핀다운하고 수집된 세포를 전파하거나 단일 세포 RNA 시퀀싱과 같은 종점 분석을 수행한다. 기질 세포의 존재 또는 부재 하에서의 세포의 침윤의 평가는 MDA-MB-231 세포 침윤이 조사된 Swiss-3T3 섬유아세포 J2 균주가 두 세포주 사이의 인자 교환을 위해 바닥 챔버에 앉았을 때 강화되었다는 것을 보여주었다.흥미롭게도, MDA-MB-231 침윤은 3T3 J2 세포의 수가 두 배로 증가했을 때 증가하였다. 한편, MCFDCIS 세포의 침습성 클론인 DCIS-Delta Four의 침윤 속도는 3T3 J2 세포와의 누화에 의해 억제되는 것으로 보이며, 이는 스트로마의 다양한 효과를 측정하기 위한 3개의 챔버 어레이의 유용한 적용을 시사한다. 이 경우, 세포 침윤에 섬유 아세포.인간 탯줄 정맥 내피 세포는 DCIS 세포에 의해 분비되는 것과 달리 MDA-MB-231 세포에 의해 분비되는 인자에 반응하여 더 침습적이었으며, 이는 혈관 형성을 위해 내피 세포를 모집하고 나중에 순환 내로 보급하는 침습성 종양의 능력과 일치한다. 환자 유래 이종이식편 세포는 상부 챔버로부터 침윤되어 공동 배양된 인간 골수 면역 세포에 반응하여 증가하였다. 흥미롭게도, 인간 골수 면역 세포와 함께 바닥 챔버 내의 2%혈청의 존재는 환자 유래 이종이식편 침윤에 필수적이었다.웰은 기저막 장벽을 모방하기 위해 세포외 매트릭스로 코팅될 수 있다. 치료제는 침윤에 대한 그들의 효과를 모니터링하기 위해 웰 내의 매체에 첨가될 수 있다.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Capture and Release of Viable Circulating Tumor Cells from Blood

캡처 및 혈액에서 실행 가능한 순환 종양 세포의 릴리스

We demonstrate a method for size based capture of viable circulating tumor cell (CTC) from whole blood, along with the release of these cells from chip ...

연구

암 연구학

Invasive Behavior of Human Breast Cancer Cells in Embryonic Zebrafish

배아 Zebrafish의 인간 유방암 세포의 침략 행동

In many cases, cancer patients do not die of a primary tumor, but rather because of metastasis. Although numerous rodent models are available for studying ...

Four-color Fluorescence Immunohistochemistry of T-cell Subpopulations in Archival Formalin-fixed, Paraffin-embedded Human Oropharyngeal Squamous Cell Carcinoma Samples

포르말린 - 고정, 파라핀 - 임베디드 인간 구강 성 편평 세포 암종 샘플에서의 T 세포 아군의 4 색 형광 면역 조직 화학

The four-color fluorescence immunohistochemistry (IHC) technique is a method to quantify cell populations of interest while taking into account their ...

Preparation and Metabolic Assay of 3-dimensional Spheroid Co-cultures of Pancreatic Cancer Cells and Fibroblasts

준비 및 췌장암 세포 및 섬유 아 세포의 3 차원 회전 타원 체 공동 문화의 변화 분석 결과

Many cancer types, including pancreatic cancer, have a dense fibrotic stroma that plays an important role in tumor progression and invasion. Activated ...

Serum and Plasma Copy Number Detection Using Real-time PCR

혈 청 및 혈장 복사 번호 검출 실시간 PCR를 사용 하 여

Serum and plasma cell free DNA (cfDNA) has been shown as an informative, non-invasive source of biomarkers for cancer diagnosis, prognosis, monitoring, ...

Real Time Detection of In Vitro Tumor Cell Apoptosis Induced by CD8+ T Cells to Study Immune Suppressive Functions of Tumor-infiltrating Myeloid Cells

Real Time Detection of In Vitro Tumor Cell Apoptosis Induced by CD8+ T Cells to Study Immune Suppressive Functions of Tumor-infiltrating Myeloid Cells

실시간 탐지의 체 외 종양 세포 Apoptosis에 CD8에 의해 유도 된+ T 세포 종양 침투 골수성 세포의 면역 진압 기능 연구

Potentiation of the tumor-killing ability of CD8+ T cells in tumors, along with their efficient tumor infiltration, is a key element of successful ...

Real-Time Monitoring of Human Glioma Cell Migration on Dorsal Root Ganglion Axon-Oligodendrocyte Co-Cultures

등쪽 뿌리 신경절 축삭-올리고젠드로시트 공동 배양에 대한 인간 신경교종 세포 이동의 실시간 모니터링

Glioblastoma is one of the most aggressive human cancers due to extensive cellular heterogeneity and the migration properties of hGCs. In order to better ...

Time-Lapse 2D Imaging of Phagocytic Activity in M1 Macrophage-4T1 Mouse Mammary Carcinoma Cells in Co-cultures

M1 대식세포-4T1 마우스 유방 암암 세포에서 식세포 활동의 타임랩스 2D 이미징

Tumor-associated macrophages (TAMs) have been identified as an important component for tumor growth, invasion, metastasis, and resistance to cancer ...

Combined Use of Tail Vein Metastasis Assays and Real-Time In Vivo Imaging to Quantify Breast Cancer Metastatic Colonization and Burden in the Lungs

꼬리 정맥 전이 검사의 결합된 사용 및 생체 내 실시간 생체 내 이미징을 결합하여 폐암 전이성 식민지화 및 폐의 부담을 정량화

Metastasis is the main cause of cancer-related deaths and there are limited therapeutic options for patients with metastatic disease. The identification ...

Impedance-based Real-time Measurement of Cancer Cell Migration and Invasion

암세포 이동 및 침입에 대한 임피던스 기반 실시간 측정

Cancer arises due to uncontrolled proliferation of cells initiated by genetic instability, mutations, and environmental and other stress factors. These ...