Name: real-time detection and capture of invasive cell subpopulations from co-cultures
Uploaded: 2022-03-30T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Real-Time Detection and Capture of Invasive Cell Subpopulations from Co-Cultures at JoVE.com

Vi vil gjerne takke Dr. Alana Welms, Huntsman Cancer Institute, University of Utah, for å gi oss de pasientavledede xenograftene (HCI-010). Dette arbeidet ble støttet av NIH-tilskudd R01CA205632, R21CA226542, og delvis av et stipend fra Agilent Technologies.

Studien ble gjennomgått og vurdert som "unntatt" av Institutional Review Board ved Georgetown University (IRB # 2002-022). Fersk høstet benmargsvev ble samlet inn fra kasserte sunne humane benmargsoppsamlingsfiltre som hadde blitt av identifisert.
1. Nytt kammerdesign (figur 2)
<ol><li>Åpne en ny dobbeltkammercelleanalysatorplate. Sett til side toppkammeret med elektroder.</li>
	<li>Bruk en fresemaskin til å barbere av 2 mm ...

<ol>
	<li>Friedl, P., Gilmour, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collective+cell+migration+in+morphogenesis,+regeneration+and+cancer.">Collective cell migration in morphogenesis, regeneration and cancer.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10 (7), 445-457 (2009).</li><li>Boyden, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chemotactic+effect+of+mixtures+of+antibody+and+antigen+on+polymorphonuclear+leucocytes.">The chemotactic effect of mixtures of antibody and antigen on polymorphonuclear leucocytes.</a> The Journal of Experimental Medicine. 115 (3), 453-466 (1962).</li><li>Xu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+review+of+impedance+measurements+of+whole+cells.">A review of impedance measurements of whole cells.</a> Biosensors &amp; Bioelectronics. 77, 824-836 (2016).</li><li>Stylianou, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+single-chain+antibody+targeting+of+the+ligand-binding+domain+in+the+anaplastic+lymphoma+kinase+receptor.">Effect of single-chain antibody targeting of the ligand-binding domain in the anaplastic lymphoma kinase receptor.</a> Oncogene. 28 (37), 3296-3306 (2009).</li><li>Abassi, Y. A., Wang, X., Xu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real+time+electronic+cell+sensing+system+and+applications+for+cytotoxcity+profiling+and+compound+assays.">Real time electronic cell sensing system and applications for cytotoxcity profiling and compound assays.</a> United States Patent. , 1-88 (2013).</li><li>Abassi, Y. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-free,+real-time+monitoring+of+IgE-mediated+mast+cell+activation+on+microelectronic+cell+sensor+arrays.">Label-free, real-time monitoring of IgE-mediated mast cell activation on microelectronic cell sensor arrays.</a> Journal of Immunological Methods. 292 (1-2), 195-205 (2004).</li><li>Morton, C. L., Houghton, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+human+tumor+xenografts+in+immunodeficient+mice.">Establishment of human tumor xenografts in immunodeficient mice.</a> Nature Protocols. 2 (2), 247-250 (2007).</li><li>DeRose, Y. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+grafts+derived+from+women+with+breast+cancer+authentically+reflect+tumor+pathology,+growth,+metastasis+and+disease+outcomes.">Tumor grafts derived from women with breast cancer authentically reflect tumor pathology, growth, metastasis and disease outcomes.</a> Nature Medicine. 17 (11), 1514-1520 (2011).</li><li>Sharif, G. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+AIB1+isoform+alters+enhancer+access+and+enables+progression+of+early-stage+triple-negative+breast+cancer.">An AIB1 isoform alters enhancer access and enables progression of early-stage triple-negative breast cancer.</a> Cancer Research. 81 (16), 4230-4241 (2021).</li><li>Caileau, R., Olive, M., Cruciger, Q. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+human+breast+carcinoma+cell+lines+of+metastatic+origin:+preliminary+characterization.">Long-term human breast carcinoma cell lines of metastatic origin: preliminary characterization.</a> In Vitro. 14 (11), 911-915 (1978).</li><li>Sharif, G. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+growth+density+modulates+cancer+cell+vascular+invasion+via+Hippo+pathway+activity+and+CXCR2+signaling.">Cell growth density modulates cancer cell vascular invasion via Hippo pathway activity and CXCR2 signaling.</a> Oncogene. 34 (48), 5879-5889 (2015).</li><li>Miller, F. R., Santner, S. J., Tait, L., Dawson, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MCF10DCIS.com+xenograft+model+of+human+comedo+ductal+carcinoma+in+situ.">MCF10DCIS.com xenograft model of human comedo ductal carcinoma in situ.</a> Journal of the National Cancer Institute. 92 (14), 1185-1186 (2000).</li><li>Winkler, J., Abisoye-Ogunniyan, A., Metcalf, K. J., zenaa, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concepts+of+extracellular+matrix+remodelling+in+tumour+progression+and+metastasis.">Concepts of extracellular matrix remodelling in tumour progression and metastasis.</a> Nature Communications. 11 (1), 1-19 (2020).</li><li>Nkosi, D., Sun, L., Duke, L. C., Meckes, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epstein-Barr+virus+LMP1+manipulates+the+content+and+functions+of+extracellular+vesicles+to+enhance+metastatic+potential+of+recipient+cells.">Epstein-Barr virus LMP1 manipulates the content and functions of extracellular vesicles to enhance metastatic potential of recipient cells.</a> PLoS Pathogens. 16 (12), 1009023 (2020).</li><li>Eisenberg, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanistic+modeling+of+the+effects+of+myoferlin+on+tumor+cell+invasion.">Mechanistic modeling of the effects of myoferlin on tumor cell invasion.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (50), 20078-20083 (2011).</li></ol>

Vi har modifisert utformingen av en tokammeret matrise for å inkludere et tredje kammer for overvåking av celleinvasjon i sanntid i nærvær av stromale celler. Vi har observert tydelige effekter av samkulturerte fibroblaster på invasive og ikke-invasive kreftceller som indikerer at matrisen kan brukes til å skille mellom kreftcelle subpopulasjoner som reagerer forskjellig på faktorer produsert av kokulturerte stromalceller. Matrisen ble også brukt til å overvåke endotelcelleinvasjon i stromalt vev, et kritisk sk...

Celleinvasjon er en viktig prosess som gjør det mulig for celler å krysse kjellermembranbarrierer som svar på miljøsignaler levert av stromale celler. Det er et avgjørende skritt i flere stadier av utvikling for immunresponser, sårheling, vevsreparasjon og maligniteter som kan utvikle seg fra lokale lesjoner til invasive og metastatiske kreftformer1. Analyser utviklet seg tidlig for å måle det invasive potensialet til cellepopulasjoner genererer vanligvis en enkelt endepunktmåling eller krever forhåndsmerking av invasive celler2. Integreringen av mikroelektronikk og mikrofluidikkteknikker er nå utviklet for å oppdage ulike aspekter ved cellebiologi som levedyktighet, bevegelse og vedlegg ved hjelp av elektrisk impedans av levende celler på mikroelektroder 3,4. Impedansmåling gir mulighet for en etikettfri, ikke-invasiv og kvantitativ vurdering av cellestatus3. Her beskriver vi en trekammeret matrise basert på utformingen av RTCA-systemet (Real-Time Cellular Analysis) som ble utviklet av Abassi et al.5. Den trekammerede matrisen gjør det mulig å vurdere samkulturerte celler på cellulær invasjon og gjenvinning av invasive celler for ytterligere analyser eller ekspansjon.
I celleanalysatorsystemet invaderer celler gjennom en ekstracellulær matrise belagt på en porøs membran og når en interdigitert elektrodematrise plassert på motsatt side av barrieren. Etter hvert som de invasive cellene fortsetter å feste og okkupere denne elektrodematrisen over tid, endres den elektriske impedansen parallelt. Det nåværende systemet består av en celleinvasjon og migrasjonsplate (CIM) 16-brønnsplate med to kamre. RTCA-DP -instrumentet (dual purpose) (kalt dual purpose cell analyzer heretter) inneholder sensorer for impedansmåling og integrert programvare for å analysere og behandle impedansdataene. Impedansverdier ved baseline avhenger av mediets ioniske styrke i brønnene og endres etter hvert som cellene festes til elektrodene. Impedansendringene avhenger av antall celler, deres morfologi og i hvilken grad celler festes til elektrodene. En måling av brønnene med medier før cellene tilsetts betraktes som bakgrunnssignalet. Bakgrunnen trekkes fra impedansmålinger etter å ha nådd likevekt med celler som fester og sprer seg på elektrodene. En enhetsløs parameter for cellenes status på en elektrode kalt Cell Index (CI) beregnes som følger: CI = (impedans etter likevekt - impedans i fravær av celler) / nominell impedansverdi6. Når overføringshastigheten for ulike cellelinjer sammenlignes, kan Delta CI brukes til å sammenligne cellestatus uavhengig av forskjellen i vedlegg som er representert i de første målingene.
Den nydesignede trekammerde matrisen bygger på den eksisterende designen og bruker toppkammeret fra dobbeltbrukscelleanalysatorsystemet som inneholder elektrodene. De modifiserte midt- og bunnkamrene er tilpasset monteringen i dobbeltbrukscelleanalysatoren for impedansmåling og analyse ved hjelp av den integrerte programvaren. De to viktigste fremskrittene som den nye designen gir over den eksisterende dual-chamber CIM-platen (kalt celleanalysatorplate heretter) er: i) evnen til å gjenopprette, og deretter analysere invasive celle subpopulations som er til stede i heterogene celleblandinger og ii) muligheten til å vurdere virkningen av utskilte faktorer fra kokulturerte stromale eller immunceller på celleinvasjon (figur 1).
Denne teknologien kan være nyttig for å studere subpopulasjonene av celler med forskjellig invasiv kapasitet. Det inkluderer (a) invasive kreftceller som invaderer omkringliggende vev eller blod- og lymfatiske kar eller ekstravasat på metastatiske såddsteder i fjerne organer, (b) celler fra immunsystemet som invaderer vev for å takle patogener eller syke celler, (c) endotelceller som invaderer vev for å danne nye blodkar under vevsreorganisering eller sårheling, så vel som (d) stromale celler fra tumormikromiljøet som støtter og invaderer sammen med kreftceller. Tilnærmingen tillater inkludering av stromal kryssprat som kan modulere cellemotilitet og invasjon. Mulighetsstudiene vist her bruker denne modifiserte matrisen fokusert på kreftcelleinvasjon og samspillet med stroma som modellsystem, inkludert endotelinvasjon som svar på differensialsignaler fra kreftceller. Tilnærmingen kan ekstrapoleres for å isolere kreftceller og andre celletyper som subpopulasjoner av immunceller, fibroblaster eller endotelceller. Vi testet invasive og ikke-invasive etablerte brystkreftcellelinjer som et prinsippbevis. Vi brukte også celler fra pasient-avledet xenograft (PDX) invasjon som svar på immunceller fra menneskelig benmarg for å vise gjennomførbarhet for fremtidig bruk også i kliniske diagnostiske omgivelser. PDX er pasientsvulstvev som er implantert i immunkompromittert eller humanisert musmodell for å tillate studier av vekst, progresjon og behandlingsalternativer for den opprinnelige pasienten 7,8.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.05% Trypsin-EDTA</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>25300-054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adhesive</td>
			<td>Norland Optical Adhesive</td>
			<td>NOA63</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell lifter</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.1832</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholera Toxin from Vibrio cholerae</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>12585-014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CIM-plate</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5665817001</td>
			<td>Cell analyzer plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase from Clostridium histolyticum</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C0130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase</td>
			<td>StemCell</td>
			<td>7913</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>11995-065</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM-F12</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>11875-093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS), Heat Inactivated</td>
			<td>Omega Scientific</td>
			<td>FB-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>15630106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse serum (HS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>16050-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human EGF</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>AF-100-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human umbilical Vein endothelail cells (HUVEC)</td>
			<td>LONZA (RRID:CVCL_2959)</td>
			<td>C-2517A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HUVEC media</td>
			<td>LONZA</td>
			<td>CC-3162</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrocortisone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H4001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin Transferrin Selenium Ethanolamine (ITSX) (100x)</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>51500056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin, Human Recombinant, Zinc Solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C8052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>J2 Fibroblasts</td>
			<td>Stemcell (RRID:CVCL_W667)</td>
			<td>100-0353</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LymphoPrep</td>
			<td>Stemcell</td>
			<td>7851</td>
			<td>Density gradient medium for the isolation of mononuclear cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354230</td>
			<td>Basement membrane matrix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MCFDCIS.com cells ( DCIS)</td>
			<td>RRID:CVCL_5552</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MDA-MB-231 cells</td>
			<td>RRID:CVCL_0062</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Milling machine</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Bridgeport Series 1 Vertical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline (1x)</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>10010049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethersulfone (PES) membrane</td>
			<td>Sterlitech</td>
			<td>PCTF029030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RBC lysis solution</td>
			<td>Stemcell</td>
			<td>7800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy Micro Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RTCA DP analyzer</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>3X16</td>
			<td>Dual purpose cell analyzer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T4799</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

real-time detection and capture of invasive cell subpopulations from co-cultures

Invasjon og metastatisk spredning av kreftceller er den viktigste dødsårsaken til kreft. Analyser utviklet seg tidlig for å måle det invasive potensialet til kreftcellepopulasjoner genererer vanligvis en enkelt endepunktmåling som ikke skiller mellom kreftcelle subpopulasjoner med forskjellig invasivt potensial. Også tumormikromiljøet består av forskjellige bosatte stromale og immunceller som endrer og deltar i den invasive oppførselen til kreftceller. Invasjon i vev spiller også en rolle i immuncelle-subpopulasjoner som avverger mikroorganismer eller eliminerer syke celler fra parenchyma og endotelceller under vevsoppussing og angiogenese. Sanntids cellulær analyse (RTCA) som benytter impedansbiosensorer for å overvåke celleinvasjon, var et stort skritt fremover utover endepunktmåling av invasjon: Dette gir kontinuerlige målinger over tid og kan dermed avsløre forskjeller i invasjonshastigheter som går tapt i endepunktanalysen. Ved hjelp av dagens RTCA-teknologi utvidet vi tokammermatriser ved å legge til et ytterligere kammer som kan inneholde stromale og / eller immunceller og gjør det mulig å måle invasjonshastigheten under påvirkning av utskilte faktorer fra kokulturerte stromale eller immunceller over tid. Utover dette tillater den unike designen å løsne kamre når som helst og isolere den mest invasive kreftcellen, eller andre celle subpopulations som er til stede i heterogene blandinger av tumorisolasjoner testet. Disse mest invasive kreftcellene og andre celle subpopulasjoner driver ondartet progresjon til metastatisk sykdom, og deres molekylære egenskaper er viktige for dyptgående mekanistiske studier, utvikling av diagnostiske sonder for deteksjon og vurdering av sårbarheter. Dermed kan inkludering av små- eller store molekylmedisiner brukes til å teste potensialet i terapier som retter seg mot kreft og / eller stromale celleunderbefolkninger med sikte på å hemme (f.eks. kreftceller) eller forbedre (f.eks. immunceller) invasiv oppførsel.

Ved hjelp av den nydesignede trekammerde matrisen ble invasjonen av cellene testet i nærvær eller fravær av stromale celler som fibroblaster. MDA-MB-231 celleinvasjon ble forbedret da bestrålede sveitsiske 3T3 fibroblaster (J2-stamme) ble sådd i bunnkammeret, noe som muliggjør utveksling av faktorer mellom de to cellelinjene. Interessant nok økte MDA-MB-231 invasjonen da 3T3-J2 celler ble doblet i antall (figur 3A). På den annen side ser invasjonsraten for en invasiv klone av MCFDCIS...

Watch this Scientific Journal Video about Real-Time Detection and Capture of Invasive Cell Subpopulations from Co-Cultures at JoVE.com

Real-Time Detection and Capture of Invasive Cell Subpopulations from Co-Cultures

Vi beskriver en tilnærming for å oppdage og fange invasive celle subpopulations i sanntid. Den eksperimentelle designen bruker sanntids cellulær analyse ved å overvåke endringer i den elektriske impedansen av celler. Invasiv kreft, immun- eller endotelceller eller stromale celler i komplekse vev kan fanges opp, og effekten av samkulturer kan vurderes.

Sanntidsdeteksjon og fangst av invasive celledelpopulasjoner fra samkulturer

Invasion and metastatic spread of cancer cells are the major cause of death from cancer. Assays developed early on to measure the invasive potential of ...

Denne teknikken gjør det mulig å identifisere cellene med forskjellige invasive kapasiteter under påvirkning av utskilte faktorer fra kokulturerte stromale celler. Teknikken vurderer effekten av utskilte faktorer fra samkulturerte stromale eller immunceller på celleinvasjon. Det tillater også gjenoppretting og analyse av invasive celle subpopulations tilstede i heterogene celleblandinger.Teknikken kan bestemme hvilke svulster som har invasive celle subpopulations som fører til metastase. Fangst og analyse av invasive kreftceller kan informere behandlingsbeslutninger. For å starte cellekulturen, vask tilslutningscellekulturene med omtrent 70% samløp med 1X fosfatbufret saltvann.Tilsett deretter 0,05% trypsin og EDTA-løsning for å løfte av cellene. Nøytraliser trypsinløsningen med cellekulturmedier som inneholder serum og tell cellene ved hjelp av en aliquot av cellesuspensjonen. Plasser alle tre sterile kamrene i vevskulturhetten.Plasser knotten på kortsiden av det nedre kammeret og orienter det nedre kammeret slik at knotten vender mot eksperimentet. Tilsett 30 000 til 50 000 celler i 90 mikroliter medier i hver brønn fra det nedre kammeret uten å danne noen bobler. Bruk 5% av føtal bovint serum supplert media i to nedre kamre som en positiv kontroll for cellemotilitet, og bruk 0% serum supplert media som en negativ kontroll.Roter det nedre kammeret ved 90 grader etter å ha latt det slå seg ned i 10 til 15 minutter i hetten. Plasser deretter midtkammeret på toppen slik at knotten på det nedre kammeret glir inn i hakket på midtkammeret. Skyv kammeret vertikalt nedover til du hører et klikk fra hver av de lange sidene av forsamlingen.Tilsett 160 mikroliter serumfrie medier til alle brønnene i midtkammeret. Pass på at en kuppelformet menisk er synlig etter at brønnene er fylt og plasser toppkammeret med elektroder vendt ned på midtkammeret for å justere de blå prikkene på midtre og øverste kamre. Skyv kammeret vertikalt ned til du hører en klikklyd fra hver av de lange sidene av enheten.Tilsett 20 til 50 mikroliter serumfrie medier i toppkammeret. Monter monteringen på den doble celleanalysatoren i vevskulturinkubatoren og vent i 30 minutter før du måler bakgrunnen. Åpne celleanalysatorprogramvaren, velg deretter vuggen som skal brukes, etterfulgt av et klikk på meldingsfanen, og sørg for at det står Tilkoblinger ok"For å sikre at matrisen er godt plassert i holderen og elektrodene er godt tilpasset sensorene.Klikk på fanen for eksperimentnotater og fyll ut all mulig informasjon om eksperimentet. Klikk deretter på oppsettfanen og fyll ut beskrivelsen av matriseoppsettet. Klikk deretter på tidsplanfanen og legg til to trinn fra trinnmenyen, et bakgrunnstrinn med en feie og et testtrinn med 100 sveip.Når matrisen har vært i dual-purpose cell analyzer inkubator i 30 minutter, klikker du på avspillingsknappen for å starte bakgrunnsmåling. Når bakgrunnsmålingen er fullført, fjerner du matrisen fra holderen og plasserer den tilbake i cellekulturhetten. Tilsett deretter 30 000 til 50 000 celler i 100 mikroliter serumfrie medier til hver brønn i toppkammeret.Dette er cellene som elektroden vil oppdage når de lykkes med å migrere gjennom membranen. La enheten stå i hetten i 30 minutter før montering på den doble celleanalysatoren for impedansmåling. Plasser matrisen tilbake i dual-purpose celleanalysatoren og sjekk meldingsfanen for Connections okay"-meldingen.Klikk på avspillingsknappen for å starte impedansmåling og klikk deretter på tegnefanen for å overvåke fremdriften til signalet. Hvis endepunktet nås før 25 timer, klikker du på avbruddstrinnet fra rullegardinmenyen Utfør. Hvis du vil eksportere data, høyreklikker du diagrammet, velger kopier i listeformatet og limer deretter inn dataene i et regneark.Overvåk migreringshastigheten i sanntid på dual-purpose celleanalysatoren for å bestemme stopppunktet for interessen. Når den er oppnådd, demonterer du monteringen fra den doble celleanalysatoren og plasserer den i vevskulturhetten. Forbered et passende antall 1,5 milliliter mikrocentrifuge rør for å samle cellene fra brønnene av interesse.Legg monteringen i en 10 centimeter tallerken for å inneholde væsker når kamrene løsner. Skyv de fleksible snappingendene på langsiden av midtkammeret innover til du hører en klikklyd, etterfulgt av å demontere toppkammeret og invertere det til en ny 10 centimeter tallerken. Bruk en celleløfter med et blad på 13 millimeter for å samle cellene fra alle brønnene som har samme eksperimentelle tilstand.Skyll eller dypp bladet i 1X fosfatbufret saltvann for å samle cellene i 1,5 milliliter mikrocentrifugerør. Deretter snurrer du ned cellene ved 500 ganger G i fem minutter og forplanter disse innsamlede cellene eller utfører endepunktanalyser som enkeltcellet RNA-sekvensering. Vurdering av invasjon av cellene i nærvær eller fravær av stromale celler viste at MDA-MB-231 celleinvasjon ble forbedret da bestrålet Swiss-3T3 fibroblaster J2-stammen ble sittende i bunnkammeret for utveksling av faktorer mellom de to cellelinjene.Interessant nok økte MDA-MB-231 invasjonen da 3T3 J2-celler ble doblet i antall. På den annen side ser invasjonshastigheten til en invasiv klone av MCFDCIS-celler, DCIS-Delta Four, ut til å være hemmet av krysstale med 3T3 J2-celler, noe som tyder på verdifull anvendelse av trekammermatrisen for å måle varierende effekter av stromaen. I dette tilfellet fibroblaster på celleinvasjon.Humane navlestrengs endothelialceller var mer invasive som svar på faktorer utskilt av MDA-MB-231 celler, i motsetning til de som utskilles av DCIS-celler, som er i samsvar med evnen til invasive svulster til å rekruttere endotelceller for blodkardannelse og senere spredning i sirkulasjonen. Pasientavledede xenograftceller invasjon fra toppkammeret økte som svar på samkulturerte humane benmargsimmunceller. Interessant nok var tilstedeværelsen av 2% serum i bunnkammeret med de menneskelige benmargsimmuncellene avgjørende for pasientavledede xenografts invasjon.Brønner kan belegges med en ekstracellulær matrise for å etterligne kjellermembranbarrieren. Terapeutiske midler kan legges til media i brønnene for å overvåke deres effekt på invasjon.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Capture and Release of Viable Circulating Tumor Cells from Blood

Capture and Release av Levedyktige Sirkulasjonstumorceller fra Blood

We demonstrate a method for size based capture of viable circulating tumor cell (CTC) from whole blood, along with the release of these cells from chip ...

Invasive Behavior of Human Breast Cancer Cells in Embryonic Zebrafish

Invasiv Opptreden av humane brystcancerceller i Embryonic Sebrafisk

In many cases, cancer patients do not die of a primary tumor, but rather because of metastasis. Although numerous rodent models are available for studying ...

Four-color Fluorescence Immunohistochemistry of T-cell Subpopulations in Archival Formalin-fixed, Paraffin-embedded Human Oropharyngeal Squamous Cell Carcinoma Samples

Fargelysfluorescensimmunohistokjemi av T-celle-subpopulasjoner i Archival Formalin-fikserte, paraffin-innebygde humane Orofaryngeale Squamous Cell Karsinomeksempler

The four-color fluorescence immunohistochemistry (IHC) technique is a method to quantify cell populations of interest while taking into account their ...

Preparation and Metabolic Assay of 3-dimensional Spheroid Co-cultures of Pancreatic Cancer Cells and Fibroblasts

Forberedelse og metabolske analysen av 3-dimensjonale Spheroid co kulturer av kreft i bukspyttkjertelen celler og fibroblaster

Many cancer types, including pancreatic cancer, have a dense fibrotic stroma that plays an important role in tumor progression and invasion. Activated ...

Serum and Plasma Copy Number Detection Using Real-time PCR

Plasmaprøver kopiere nummer Detection bruke sanntid PCR

Serum and plasma cell free DNA (cfDNA) has been shown as an informative, non-invasive source of biomarkers for cancer diagnosis, prognosis, monitoring, ...

Real Time Detection of In Vitro Tumor Cell Apoptosis Induced by CD8+ T Cells to Study Immune Suppressive Functions of Tumor-infiltrating Myeloid Cells

Real Time Detection of In Vitro Tumor Cell Apoptosis Induced by CD8+ T Cells to Study Immune Suppressive Functions of Tumor-infiltrating Myeloid Cells

Sanntid påvisning av i Vitro svulst celle apoptose indusert av CD8+ T celler å studere immun undertrykkende funksjoner av svulst-infiltrere myeloide celler

Potentiation of the tumor-killing ability of CD8+ T cells in tumors, along with their efficient tumor infiltration, is a key element of successful ...

Real-Time Monitoring of Human Glioma Cell Migration on Dorsal Root Ganglion Axon-Oligodendrocyte Co-Cultures

Real-Time overvåking av Human glioma Cell migrasjon på rygg rot Ganglion axon-Oligodendrocyte co-kulturer

Glioblastoma is one of the most aggressive human cancers due to extensive cellular heterogeneity and the migration properties of hGCs. In order to better ...

Time-Lapse 2D Imaging of Phagocytic Activity in M1 Macrophage-4T1 Mouse Mammary Carcinoma Cells in Co-cultures

Time-lapse 2D Imaging av phagocytic aktivitet i M1 macrophage-4T1 Mouse Brystkreftceller i co-kulturer

Tumor-associated macrophages (TAMs) have been identified as an important component for tumor growth, invasion, metastasis, and resistance to cancer ...

Combined Use of Tail Vein Metastasis Assays and Real-Time In Vivo Imaging to Quantify Breast Cancer Metastatic Colonization and Burden in the Lungs

Kombinert bruk av hale vene metastasering analyser og Real-Time in vivo Imaging å kvantifisere brystkreft metastatisk kolonisering og byrde i lungene

Metastasis is the main cause of cancer-related deaths and there are limited therapeutic options for patients with metastatic disease. The identification ...

Impedance-based Real-time Measurement of Cancer Cell Migration and Invasion

Impedansbasert sanntidsmåling av kreftcellemigrasjon og invasjon

Cancer arises due to uncontrolled proliferation of cells initiated by genetic instability, mutations, and environmental and other stress factors. These ...