Name: real-time detection and capture of invasive cell subpopulations from co-cultures
Uploaded: 2022-03-30T14:00:00
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Gostaríamos de agradecer à Dra. Este trabalho foi apoiado pelas bolsas NIH R01CA205632, R21CA226542 e, em parte, por subvenção da Agilent Technologies.

O estudo foi revisado e considerado como "isento" pelo Conselho de Revisão Institucional da Universidade de Georgetown (IRB # 2002-022). Os tecidos de medula óssea recém-colhidos foram coletados a partir de filtros descartados de coleta de medula óssea humana saudável que haviam sido desidentificulados.
1. Novo desenho de câmara (Figura 2)
<ol><li>Abra uma nova placa de analisador de células de câmara dupla. Reserve a c?...

<ol>
	<li>Friedl, P., Gilmour, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collective+cell+migration+in+morphogenesis,+regeneration+and+cancer.">Collective cell migration in morphogenesis, regeneration and cancer.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10 (7), 445-457 (2009).</li><li>Boyden, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chemotactic+effect+of+mixtures+of+antibody+and+antigen+on+polymorphonuclear+leucocytes.">The chemotactic effect of mixtures of antibody and antigen on polymorphonuclear leucocytes.</a> The Journal of Experimental Medicine. 115 (3), 453-466 (1962).</li><li>Xu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+review+of+impedance+measurements+of+whole+cells.">A review of impedance measurements of whole cells.</a> Biosensors &amp; Bioelectronics. 77, 824-836 (2016).</li><li>Stylianou, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+single-chain+antibody+targeting+of+the+ligand-binding+domain+in+the+anaplastic+lymphoma+kinase+receptor.">Effect of single-chain antibody targeting of the ligand-binding domain in the anaplastic lymphoma kinase receptor.</a> Oncogene. 28 (37), 3296-3306 (2009).</li><li>Abassi, Y. A., Wang, X., Xu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real+time+electronic+cell+sensing+system+and+applications+for+cytotoxcity+profiling+and+compound+assays.">Real time electronic cell sensing system and applications for cytotoxcity profiling and compound assays.</a> United States Patent. , 1-88 (2013).</li><li>Abassi, Y. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-free,+real-time+monitoring+of+IgE-mediated+mast+cell+activation+on+microelectronic+cell+sensor+arrays.">Label-free, real-time monitoring of IgE-mediated mast cell activation on microelectronic cell sensor arrays.</a> Journal of Immunological Methods. 292 (1-2), 195-205 (2004).</li><li>Morton, C. L., Houghton, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+human+tumor+xenografts+in+immunodeficient+mice.">Establishment of human tumor xenografts in immunodeficient mice.</a> Nature Protocols. 2 (2), 247-250 (2007).</li><li>DeRose, Y. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+grafts+derived+from+women+with+breast+cancer+authentically+reflect+tumor+pathology,+growth,+metastasis+and+disease+outcomes.">Tumor grafts derived from women with breast cancer authentically reflect tumor pathology, growth, metastasis and disease outcomes.</a> Nature Medicine. 17 (11), 1514-1520 (2011).</li><li>Sharif, G. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+AIB1+isoform+alters+enhancer+access+and+enables+progression+of+early-stage+triple-negative+breast+cancer.">An AIB1 isoform alters enhancer access and enables progression of early-stage triple-negative breast cancer.</a> Cancer Research. 81 (16), 4230-4241 (2021).</li><li>Caileau, R., Olive, M., Cruciger, Q. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+human+breast+carcinoma+cell+lines+of+metastatic+origin:+preliminary+characterization.">Long-term human breast carcinoma cell lines of metastatic origin: preliminary characterization.</a> In Vitro. 14 (11), 911-915 (1978).</li><li>Sharif, G. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+growth+density+modulates+cancer+cell+vascular+invasion+via+Hippo+pathway+activity+and+CXCR2+signaling.">Cell growth density modulates cancer cell vascular invasion via Hippo pathway activity and CXCR2 signaling.</a> Oncogene. 34 (48), 5879-5889 (2015).</li><li>Miller, F. R., Santner, S. J., Tait, L., Dawson, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MCF10DCIS.com+xenograft+model+of+human+comedo+ductal+carcinoma+in+situ.">MCF10DCIS.com xenograft model of human comedo ductal carcinoma in situ.</a> Journal of the National Cancer Institute. 92 (14), 1185-1186 (2000).</li><li>Winkler, J., Abisoye-Ogunniyan, A., Metcalf, K. J., zenaa, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concepts+of+extracellular+matrix+remodelling+in+tumour+progression+and+metastasis.">Concepts of extracellular matrix remodelling in tumour progression and metastasis.</a> Nature Communications. 11 (1), 1-19 (2020).</li><li>Nkosi, D., Sun, L., Duke, L. C., Meckes, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epstein-Barr+virus+LMP1+manipulates+the+content+and+functions+of+extracellular+vesicles+to+enhance+metastatic+potential+of+recipient+cells.">Epstein-Barr virus LMP1 manipulates the content and functions of extracellular vesicles to enhance metastatic potential of recipient cells.</a> PLoS Pathogens. 16 (12), 1009023 (2020).</li><li>Eisenberg, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanistic+modeling+of+the+effects+of+myoferlin+on+tumor+cell+invasion.">Mechanistic modeling of the effects of myoferlin on tumor cell invasion.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (50), 20078-20083 (2011).</li></ol>

Modificamos o projeto de uma matriz de câmara dupla para incluir uma terceira câmara para monitorar a invasão celular em tempo real na presença de células estromicas. Observamos efeitos distintos de fibroblastos co-cultivados em células cancerígenas invasivas e não invasivas indicando que a matriz pode ser usada para distinguir entre subpopulações de células cancerosas que respondem de forma diferente aos fatores produzidos por células estrogonais co-cultivadas. A matriz também foi usada para monitorar a inv...

A invasão celular é um processo importante que permite que as células cruzem barreiras de membrana de porão em resposta a pistas ambientais fornecidas por células estromas. É um passo crucial durante vários estágios de desenvolvimento para respostas imunes, cicatrização de feridas, reparação de tecidos e malignidades que podem progredir de lesões locais para cânceres invasivos e metastáticos1. Ensaios desenvolvidos desde cedo para medir o potencial invasivo das populações celulares normalmente geram uma única medição de ponto final ou requerem pré-rotulagem de células invasoras2. A integração das técnicas de microeletrônica e microfluido é agora desenvolvida para detectar diferentes aspectos da biologia celular, como viabilidade, movimento e apego usando a impedância elétrica de células vivas em microeletrodos 3,4. A medição de impedância permite uma avaliação não invasiva e quantitativa do statuscelular 3. Aqui descrevemos uma matriz de três câmaras baseada no design do sistema RTCA (Real-Time Cellular Analysis, análise celular em tempo real) que foi desenvolvido pela Abassi et al.5. O conjunto de três câmaras permite a avaliação de células co-cultivadas sobre invasão celular e recuperação de células invasoras para análises adicionais ou expansão.
No sistema de analisador celular, as células invadem através de uma matriz extracelular revestida em uma membrana porosa e atingem uma matriz de eletrodos interdigitadas posicionada no lado oposto da barreira. À medida que as células invasoras continuam a prender e ocupar esta matriz de eletrodos ao longo do tempo, a impedância elétrica muda em paralelo. O sistema atual compreende uma placa de invasão e migração celular (CIM) de 16 poços com duas câmaras. O instrumento RTCA-DP (dual purpose cell analyzer a partir de agora) contém sensores para medição de impedância e software integrado para analisar e processar os dados de impedância. Os valores de impedância na linha de base dependem da força iônica da mídia nos poços e são alterados à medida que as células se ligam aos eletrodos. As mudanças de impedância dependem do número de células, sua morfologia, e até que ponto as células se ligam aos eletrodos. Uma medição dos poços com mídia antes que as células sejam adicionadas é considerada como o sinal de fundo. O fundo é subtraído de medidas de impedância depois de atingir o equilíbrio com células anexando e se espalhando para os eletrodos. Um parâmetro sem unidade do status das células em um índice celular denominado eletrodo (IC) é calculado da seguinte forma: IC = (impedância após equilíbrio - impedância na ausência de células) / valor de impedância nominal6. Quando as taxas de migração de diferentes linhas celulares são comparadas, o CI Delta pode ser usado para comparar o status da célula, independentemente da diferença de apego representada nas primeiras medições.
O recém-projetado array de três câmaras se baseia no design existente e usa a câmara superior do sistema de analisador de células de dupla finalidade que contém os eletrodos. As câmaras média e inferior modificadas são adaptadas para encaixar o conjunto no analisador de células de dupla finalidade para medição e análise de impedância usando o software integrado. Os dois principais avanços que o novo projeto proporciona sobre a placa CIM de duas câmaras existente (chamada placa analisador de células a partir de agora) são: i) a capacidade de recuperação e, em seguida, analisar subpopulações celulares invasivas que estão presentes em misturas de células heterogêneas e ii) a opção de avaliar o impacto de fatores secretados de células estromes ou imunes co-cultivadas na invasão celular (Figura 1).
Essa tecnologia pode ser útil no estudo das subpopulações de células com diferentes capacidades invasivas. Isso inclui (a) células cancerígenas invasivas que invadem tecidos ou sangue ao redor e vasos linfáticos ou extravasados em locais de semeadura metastática em órgãos distantes, (b) células do sistema imunológico que invadem tecidos para combater patógenos ou células doentes, (c) células endoteliais que invadem tecidos para formar novos vasos sanguíneos durante a reorganização tecidual ou cicatrização de feridas, assim como (d) células estromas do microambiente tumoral que suportam e invadem junto com células cancerígenas. A abordagem permite a inclusão de conversas cruzadas estromicas que podem modular a motilidade celular e a invasão. Os estudos de viabilidade aqui mostrados utilizam este conjunto modificado focado na invasão de células cancerosas e na interação com o estroma como um sistema modelo, incluindo a invasão endotelial em resposta a sinais diferenciais de células cancerosas. A abordagem pode ser extrapolada para isolar células cancerígenas e outros tipos de células, como subpopulações de células imunes, fibroblastos ou células endoteliais. Testamos linhas invasivas e não invasivas estabelecidas células cancerígenas de mama como prova de princípio. Também usamos células da invasão de xenoenxerto derivado do paciente (PDX) em resposta às células imunes da medula óssea humana para mostrar viabilidade para uso futuro também em ambientes de diagnóstico clínico. PDX são tecidos tumorais do paciente que são implantados em camundongos imunocomprometidos ou humanizados para permitir o estudo do crescimento, progressão e opções de tratamento para o paciente original 7,8.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.05% Trypsin-EDTA</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>25300-054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adhesive</td>
			<td>Norland Optical Adhesive</td>
			<td>NOA63</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell lifter</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.1832</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholera Toxin from Vibrio cholerae</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>12585-014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CIM-plate</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5665817001</td>
			<td>Cell analyzer plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase from Clostridium histolyticum</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C0130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase</td>
			<td>StemCell</td>
			<td>7913</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>11995-065</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM-F12</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>11875-093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS), Heat Inactivated</td>
			<td>Omega Scientific</td>
			<td>FB-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>15630106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse serum (HS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>16050-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human EGF</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>AF-100-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human umbilical Vein endothelail cells (HUVEC)</td>
			<td>LONZA (RRID:CVCL_2959)</td>
			<td>C-2517A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HUVEC media</td>
			<td>LONZA</td>
			<td>CC-3162</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrocortisone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H4001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin Transferrin Selenium Ethanolamine (ITSX) (100x)</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>51500056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin, Human Recombinant, Zinc Solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C8052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>J2 Fibroblasts</td>
			<td>Stemcell (RRID:CVCL_W667)</td>
			<td>100-0353</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LymphoPrep</td>
			<td>Stemcell</td>
			<td>7851</td>
			<td>Density gradient medium for the isolation of mononuclear cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354230</td>
			<td>Basement membrane matrix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MCFDCIS.com cells ( DCIS)</td>
			<td>RRID:CVCL_5552</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MDA-MB-231 cells</td>
			<td>RRID:CVCL_0062</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Milling machine</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Bridgeport Series 1 Vertical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline (1x)</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>10010049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethersulfone (PES) membrane</td>
			<td>Sterlitech</td>
			<td>PCTF029030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RBC lysis solution</td>
			<td>Stemcell</td>
			<td>7800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy Micro Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RTCA DP analyzer</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>3X16</td>
			<td>Dual purpose cell analyzer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T4799</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

real-time detection and capture of invasive cell subpopulations from co-cultures

Invasão e propagação metastática de células cancerígenas são a principal causa de morte por câncer. Ensaios desenvolvidos desde cedo para medir o potencial invasivo das populações de células cancerosas normalmente geram uma única medição de ponto final que não distingue entre subpopulações de células cancerosas com diferentes potenciais invasivos. Além disso, o microambiente tumoral consiste em diferentes células estrômicas residentes e imunes que alteram e participam do comportamento invasivo das células cancerosas. A invasão aos tecidos também desempenha um papel nas subpopulações de células imunes que se defendem de microrganismos ou eliminam células doentes das células parenchyma e endotelial durante a remodelação tecidual e angiogênese. A Análise Celular em Tempo Real (RTCA) que utiliza biosensores de impedância para monitorar a invasão celular foi um grande passo em frente além da medição do ponto final da invasão: isso fornece medições contínuas ao longo do tempo e, portanto, pode revelar diferenças nas taxas de invasão que são perdidas no ensaio de ponto final. Usando a tecnologia RTCA atual, expandimos matrizes de câmara dupla adicionando uma câmara adicional que pode conter células estrômicas e/ou imunes e permite medir a taxa de invasão sob a influência de fatores secretados de células estromais ou imunes co-cultivadas ao longo do tempo. Além disso, o design único permite desprender câmaras a qualquer momento e isolar a célula cancerígena mais invasiva, ou outras subpopulações celulares que estão presentes em misturas heterogêneas de isolados tumorais testados. Essas células cancerígenas mais invasivas e outras subpopulações celulares impulsionam a progressão maligna para doenças metastáticas, e suas características moleculares são importantes para estudos mecanicistas aprofundados, o desenvolvimento de sondas diagnósticas para sua detecção e a avaliação de vulnerabilidades. Assim, a inclusão de drogas de pequenas ou grandes moléculas pode ser usada para testar o potencial de terapias que visam o câncer e/ou subpopulações de células estromicas com o objetivo de inibir (por exemplo, células cancerosas) ou melhorar (por exemplo, células imunes) comportamento invasivo.

Usando a matriz recém-projetada de três câmaras, a invasão das células foi testada na presença ou ausência de células estromas, como os fibroblastos. A invasão celular MDA-MB-231 foi reforçada quando os fibroblastos 3T3 suíços irradiados (cepa J2) foram semeados na câmara inferior, permitindo a troca de fatores entre as duas linhas celulares. Curiosamente, a invasão MDA-MB-231 aumentou quando as células 3T3-J2 foram duplicadas em número (Figura 3A). Por outro lado, a taxa de ...

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Real-Time Detection and Capture of Invasive Cell Subpopulations from Co-Cultures

Descrevemos uma abordagem para detectar e capturar subpopulações celulares invasivas em tempo real. O projeto experimental utiliza a Análise Celular em Tempo Real monitorando mudanças na impedância elétrica das células. Podem ser capturados câncer invasivo, células endoteliais ou estromais em tecidos complexos, e o impacto das co-culturas pode ser avaliado.

Detecção e Captura em Tempo Real de Subpopulações celulares invasoras de co-culturas

Invasion and metastatic spread of cancer cells are the major cause of death from cancer. Assays developed early on to measure the invasive potential of ...

Esta técnica permite a identificação das células com diferentes capacidades invasivas sob a influência de fatores secretados a partir de células estromas co-cultivadas. A técnica avalia o impacto de fatores secretados de células estromais ou imunes co-cultivadas na invasão celular. Também permite a recuperação e análise de subpopulações celulares invasivas presentes em misturas de células heterogêneas.A técnica pode determinar quais tumores abrigam subpopulações celulares invasoras que levam à metástase. A captura e análise de células cancerígenas invasivas pode informar as decisões terapêuticas. Para começar a cultura celular, lave as culturas celulares de adesão com aproximadamente 70% de confluência com soro fisiológico tamponado 1X.Em seguida, adicione 0,05% de trippsina e solução EDTA para decolar das células. Neutralizar a solução de trippsina com meios de cultura celular contendo soro e contar as células usando uma alíquota da suspensão celular. Coloque as três câmaras estéreis na capa da cultura tecidual.Localize o botão no lado curto da câmara inferior e oriente a câmara inferior para que o botão esteja voltado para o experimentador. Adicione 30.000 a 50.000 células em 90 microliters de mídia para cada poço da câmara inferior sem formar bolhas. Use 5% da mídia bovina bovina suplementada em duas câmaras inferiores como controle positivo para motilidade celular, e use mídia suplementada 0%soro como controle negativo.Gire a câmara inferior a 90 graus depois de deixá-la se contentar por 10 a 15 minutos no capô. Em seguida, coloque a câmara do meio em cima para que o botão na câmara inferior deslize para o entalhe na câmara do meio. Empurre a câmara verticalmente para baixo até que um clique seja ouvido de cada um dos lados longos da montagem.Adicione 160 microliters de mídia sem soro a todos os poços da câmara do meio. Certifique-se de que um menisco em forma de cúpula seja visível depois que os poços forem preenchidos e coloque a câmara superior com eletrodos voltados para a câmara do meio para alinhar os pontos azuis nas câmaras média e superior. Empurre a câmara verticalmente para baixo até que um som de clique seja ouvido de cada um dos lados longos da montagem.Adicione 20 a 50 microliters de mídia sem soro à câmara superior. Monte o conjunto no analisador de células de dupla finalidade na incubadora de cultura tecidual e espere 30 minutos antes de medir o fundo. Abra o software do analisador de células e selecione o berço a ser usado, seguido de um clique na guia da mensagem e certifique-se de que diz conexões bem"para garantir que a matriz esteja bem colocada no berço e os eletrodos estejam bem alinhados com os sensores.Clique na guia de notas do experimento e preencha todas as informações possíveis sobre o experimento. Em seguida, clique na guia layout e preencha a descrição do layout do array. Em seguida, clique na guia de programação e adicione dois passos do menu passos, um passo de fundo com uma varredura e uma etapa de teste com 100 varreduras.Uma vez que a matriz tenha estado na incubadora de analisadores de células de uso duplo por 30 minutos, clique no botão de reprodução para iniciar a medição de fundo. Depois que a medição de fundo for feita, remova a matriz do berço e coloque-a de volta na capa de cultura celular. Em seguida, adicione 30.000 a 50.000 células em 100 microliters de mídia livre de soro para cada poço da câmara superior.Estas são as células que o eletrodo detectará assim que migrarem com sucesso através da membrana. Deixe a montagem ficar no capô por 30 minutos antes de montar no analisador de células de dupla finalidade para medição de impedância. Coloque a matriz de volta no analisador de células de uso duplo e verifique a guia de mensagens para a mensagem Conexões ok".Clique no botão reproduzir para iniciar a medição de impedância e, em seguida, clique na guia plot para monitorar o progresso do sinal. Se o ponto final for atingido antes de 25 horas, clique na etapa de abortagem do menu suspenso executar. Para exportar dados, clique com o botão direito do mouse no gráfico, escolha copiar no formato da lista e, em seguida, cole os dados em uma planilha.Monitore a taxa de migração em tempo real no analisador de células de dupla finalidade para determinar o ponto de parada de juros. Uma vez alcançado, desmonte o conjunto do analisador celular de dupla finalidade e coloque-o na capa da cultura tecidual. Prepare um número apropriado de 1,5 mililitros de tubos de microcentrífuga para coletar as células dos poços de interesse.Coloque o conjunto em uma antena de 10 centímetros para conter líquidos quando as câmaras se soltarem. Empurre as extremidades flexíveis de estalo no lado longo da câmara média para dentro até que um som de clique seja ouvido, seguido por desmontar a câmara superior e inverti-la em um novo prato de 10 centímetros. Use um levantador de células com uma lâmina de 13 milímetros para coletar as células de todos os poços que abrigam a mesma condição experimental.Enxágüe ou mergulhe a lâmina em salina tamponada de fosfato 1X para coletar as células em tubos de microcentrífuga de 1,5 mililitro. Em seguida, gire as células a 500 vezes G por cinco minutos e propague essas células coletadas ou realize análises de ponto final, como sequenciamento de RNA unicelular. A avaliação da invasão das células na presença ou ausência de células estromais mostrou que a invasão celular MDA-MB-231 foi reforçada quando os fibroblastos Irracões Suíço-3T3 J2 estavam sentados na câmara inferior para a troca de fatores entre as duas linhas celulares.Curiosamente, a invasão MDA-MB-231 aumentou quando as células 3T3 J2 foram dobradas em número. Por outro lado, a taxa de invasão de um clone invasivo de células MCFDCIS, DCIS-Delta Four, parece ser inibida pelo crosstalk com células 3T3 J2, sugerindo a aplicação valiosa da matriz de três câmaras para medir efeitos variados do estroma. Neste caso, fibroblastos na invasão celular.As células endoteliais da veia umbilical humana foram mais invasivas em resposta a fatores secretados pelas células MDA-MB-231, ao contrário daquelas secretadas pelas células DCIS, o que é consistente com a capacidade de tumores invasivos de recrutar células endoteliais para formação de vasos sanguíneos e posterior disseminação na circulação. A invasão de células de xenoenxerto derivada do paciente da câmara superior aumentou em resposta às células imunes da medula óssea humana co-cultivadas. Curiosamente, a presença de 2% de soro na câmara inferior com as células imunes da medula óssea humana foi essencial para a invasão de xenoenxertos derivados pelo paciente.Poços podem ser revestidos com uma matriz extracelular para imitar a barreira da membrana do porão. Agentes terapêuticos podem ser adicionados à mídia nos poços para monitorar seu efeito na invasão.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Capture and Release of Viable Circulating Tumor Cells from Blood

Captura e libertação de viáveis ​​circulantes células tumorais do sangue

We demonstrate a method for size based capture of viable circulating tumor cell (CTC) from whole blood, along with the release of these cells from chip ...

Pesquisa do câncer

Invasive Behavior of Human Breast Cancer Cells in Embryonic Zebrafish

Comportamento invasiva de células de cancro da mama humano em Embryonic Zebrafish

In many cases, cancer patients do not die of a primary tumor, but rather because of metastasis. Although numerous rodent models are available for studying ...

Four-color Fluorescence Immunohistochemistry of T-cell Subpopulations in Archival Formalin-fixed, Paraffin-embedded Human Oropharyngeal Squamous Cell Carcinoma Samples

Imuno-histoquímica de fluorescência de quatro cores das subpopulações de células T em amostras de carcinoma de células escamosas humano oftaríngeas fixadas em formalina, arquivadas, formadas por formalina

The four-color fluorescence immunohistochemistry (IHC) technique is a method to quantify cell populations of interest while taking into account their ...

Preparation and Metabolic Assay of 3-dimensional Spheroid Co-cultures of Pancreatic Cancer Cells and Fibroblasts

Preparação e ensaio metabólico de 3-dimensional Spheroid co culturas de células de câncer no pâncreas e fibroblastos

Many cancer types, including pancreatic cancer, have a dense fibrotic stroma that plays an important role in tumor progression and invasion. Activated ...

Serum and Plasma Copy Number Detection Using Real-time PCR

Soro e Plasma cópia número deteção usando PCR em tempo real

Serum and plasma cell free DNA (cfDNA) has been shown as an informative, non-invasive source of biomarkers for cancer diagnosis, prognosis, monitoring, ...

Real Time Detection of In Vitro Tumor Cell Apoptosis Induced by CD8+ T Cells to Study Immune Suppressive Functions of Tumor-infiltrating Myeloid Cells

Real Time Detection of In Vitro Tumor Cell Apoptosis Induced by CD8+ T Cells to Study Immune Suppressive Functions of Tumor-infiltrating Myeloid Cells

Detecção de tempo real em Vitro Tumor celular apoptose induzida por CD8+ T células para estudar as funções imunológicas supressora de Tumor infiltrando células mieloides

Potentiation of the tumor-killing ability of CD8+ T cells in tumors, along with their efficient tumor infiltration, is a key element of successful ...

Real-Time Monitoring of Human Glioma Cell Migration on Dorsal Root Ganglion Axon-Oligodendrocyte Co-Cultures

Monitoramento em tempo real da migração humana de células glioma em co-culturas de raiz dorsal Ganglion Axon-Oligodendrocyte

Glioblastoma is one of the most aggressive human cancers due to extensive cellular heterogeneity and the migration properties of hGCs. In order to better ...

Time-Lapse 2D Imaging of Phagocytic Activity in M1 Macrophage-4T1 Mouse Mammary Carcinoma Cells in Co-cultures

Tumor-associated macrophages (TAMs) have been identified as an important component for tumor growth, invasion, metastasis, and resistance to cancer ...

Combined Use of Tail Vein Metastasis Assays and Real-Time In Vivo Imaging to Quantify Breast Cancer Metastatic Colonization and Burden in the Lungs

Uso combinado de ensaios de metástase de veia de cauda e imagens in vivo em tempo real para quantificar a colonização metastática do câncer de mama e carga nos pulmões

Metastasis is the main cause of cancer-related deaths and there are limited therapeutic options for patients with metastatic disease. The identification ...

Impedance-based Real-time Measurement of Cancer Cell Migration and Invasion

Medição em tempo real da migração e invasão de células cancerígenas

Cancer arises due to uncontrolled proliferation of cells initiated by genetic instability, mutations, and environmental and other stress factors. These ...