Name: real-time detection and capture of invasive cell subpopulations from co-cultures
Uploaded: 2022-03-30T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Real-Time Detection and Capture of Invasive Cell Subpopulations from Co-Cultures at JoVE.com

Мы хотели бы поблагодарить доктора Алану Уэлмс, Институт рака Хантсмана, Университет штата Юта, за предоставление нам ксенотрансплантатов, полученных от пациента (HCI-010). Эта работа была поддержана грантами NIH R01CA205632, R21CA226542 и частично грантом от Agilent Technologies.

Исследование было рассмотрено и рассмотрено как «освобожденное» Советом по институциональному обзору Джорджтаунского университета (IRB # 2002-022). Свежесобранные ткани костного мозга были собраны из выброшенных здоровых фильтров сбора костного мозга человека, которые были деидентифицир...

<ol>
	<li>Friedl, P., Gilmour, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collective+cell+migration+in+morphogenesis,+regeneration+and+cancer.">Collective cell migration in morphogenesis, regeneration and cancer.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10 (7), 445-457 (2009).</li><li>Boyden, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chemotactic+effect+of+mixtures+of+antibody+and+antigen+on+polymorphonuclear+leucocytes.">The chemotactic effect of mixtures of antibody and antigen on polymorphonuclear leucocytes.</a> The Journal of Experimental Medicine. 115 (3), 453-466 (1962).</li><li>Xu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+review+of+impedance+measurements+of+whole+cells.">A review of impedance measurements of whole cells.</a> Biosensors &amp; Bioelectronics. 77, 824-836 (2016).</li><li>Stylianou, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+single-chain+antibody+targeting+of+the+ligand-binding+domain+in+the+anaplastic+lymphoma+kinase+receptor.">Effect of single-chain antibody targeting of the ligand-binding domain in the anaplastic lymphoma kinase receptor.</a> Oncogene. 28 (37), 3296-3306 (2009).</li><li>Abassi, Y. A., Wang, X., Xu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real+time+electronic+cell+sensing+system+and+applications+for+cytotoxcity+profiling+and+compound+assays.">Real time electronic cell sensing system and applications for cytotoxcity profiling and compound assays.</a> United States Patent. , 1-88 (2013).</li><li>Abassi, Y. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-free,+real-time+monitoring+of+IgE-mediated+mast+cell+activation+on+microelectronic+cell+sensor+arrays.">Label-free, real-time monitoring of IgE-mediated mast cell activation on microelectronic cell sensor arrays.</a> Journal of Immunological Methods. 292 (1-2), 195-205 (2004).</li><li>Morton, C. L., Houghton, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+human+tumor+xenografts+in+immunodeficient+mice.">Establishment of human tumor xenografts in immunodeficient mice.</a> Nature Protocols. 2 (2), 247-250 (2007).</li><li>DeRose, Y. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+grafts+derived+from+women+with+breast+cancer+authentically+reflect+tumor+pathology,+growth,+metastasis+and+disease+outcomes.">Tumor grafts derived from women with breast cancer authentically reflect tumor pathology, growth, metastasis and disease outcomes.</a> Nature Medicine. 17 (11), 1514-1520 (2011).</li><li>Sharif, G. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+AIB1+isoform+alters+enhancer+access+and+enables+progression+of+early-stage+triple-negative+breast+cancer.">An AIB1 isoform alters enhancer access and enables progression of early-stage triple-negative breast cancer.</a> Cancer Research. 81 (16), 4230-4241 (2021).</li><li>Caileau, R., Olive, M., Cruciger, Q. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+human+breast+carcinoma+cell+lines+of+metastatic+origin:+preliminary+characterization.">Long-term human breast carcinoma cell lines of metastatic origin: preliminary characterization.</a> In Vitro. 14 (11), 911-915 (1978).</li><li>Sharif, G. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+growth+density+modulates+cancer+cell+vascular+invasion+via+Hippo+pathway+activity+and+CXCR2+signaling.">Cell growth density modulates cancer cell vascular invasion via Hippo pathway activity and CXCR2 signaling.</a> Oncogene. 34 (48), 5879-5889 (2015).</li><li>Miller, F. R., Santner, S. J., Tait, L., Dawson, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MCF10DCIS.com+xenograft+model+of+human+comedo+ductal+carcinoma+in+situ.">MCF10DCIS.com xenograft model of human comedo ductal carcinoma in situ.</a> Journal of the National Cancer Institute. 92 (14), 1185-1186 (2000).</li><li>Winkler, J., Abisoye-Ogunniyan, A., Metcalf, K. J., zenaa, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concepts+of+extracellular+matrix+remodelling+in+tumour+progression+and+metastasis.">Concepts of extracellular matrix remodelling in tumour progression and metastasis.</a> Nature Communications. 11 (1), 1-19 (2020).</li><li>Nkosi, D., Sun, L., Duke, L. C., Meckes, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epstein-Barr+virus+LMP1+manipulates+the+content+and+functions+of+extracellular+vesicles+to+enhance+metastatic+potential+of+recipient+cells.">Epstein-Barr virus LMP1 manipulates the content and functions of extracellular vesicles to enhance metastatic potential of recipient cells.</a> PLoS Pathogens. 16 (12), 1009023 (2020).</li><li>Eisenberg, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanistic+modeling+of+the+effects+of+myoferlin+on+tumor+cell+invasion.">Mechanistic modeling of the effects of myoferlin on tumor cell invasion.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (50), 20078-20083 (2011).</li></ol>

Мы модифицировали конструкцию двухкамерного массива, включив в него третью камеру для мониторинга инвазии клеток в режиме реального времени в присутствии стромальных клеток. Мы наблюдали различные эффекты совместно культивируемых фибробластов на инвазивные и неинвазивные раковые к...

Клеточная инвазия является важным процессом, который позволяет клеткам пересекать барьеры базальной мембраны в ответ на сигналы окружающей среды, предоставляемые стромальными клетками. Это важный шаг на нескольких этапах развития иммунных реакций, заживления ран, восстановления тканей и злокачественных новообразований, которые могут прогрессировать от локальных поражений до инвазивного и метастатического рака1. Анализы, разработанные на ранней стадии для измерения инвазивного потенциала клеточных популяций, обычно генерируют измерение одной конечной точки или требуют предварительной маркировки инвазивных клеток2. Интеграция методов микроэлектроники и микрофлюидики в настоящее время разрабатывается для обнаружения различных аспектов клеточной биологии, таких как жизнеспособность, движение и прикрепление, с использованием электрического импеданса живых клеток на микроэлектродах 3,4. Измерение импеданса позволяет проводить безметочную, неинвазивную и количественную оценку состояния клеток3. Здесь мы описываем трехкамерный массив, основанный на конструкции системы анализа клеток реального времени (RTCA), которая была разработана Abassi et al.5. Трехкамерный массив позволяет оценивать совместно культивируемые клетки при клеточной инвазии и восстановлении инвазивных клеток для дополнительного анализа или расширения.
В системе клеточного анализатора клетки проникают через внеклеточный матрикс, покрытый пористой мембраной, и достигают междигитированного электродного массива, расположенного на противоположной стороне барьера. Поскольку инвазивные клетки продолжают присоединяться и занимать этот электродный массив с течением времени, электрическое сопротивление изменяется параллельно. Нынешняя система содержит инвазию и миграцию ячеек (CIM) из 16-луночной пластины с двумя камерами. Прибор RTCA-DP (двойного назначения) (далее называемый анализатором ячеек двойного назначения) содержит датчики для измерения импеданса и интегрированное программное обеспечение для анализа и обработки данных об импедансе. Значения импеданса на исходном уровне зависят от ионной прочности среды в скважинах и изменяются по мере присоединения ячеек к электродам. Изменения импеданса зависят от количества ячеек, их морфологии и степени, в которой ячейки прикрепляются к электродам. Измерение скважин средой до добавления ячеек рассматривается как фоновый сигнал. Фон вычитается из измерений импеданса после достижения равновесия с прикреплением и распространением ячеек на электроды. Безудельный параметр состояния ячеек на электроде, называемый Cell Index (CI), рассчитывается следующим образом: CI = (импеданс после равновесия - импеданс при отсутствии ячеек) / номинальное значение импеданса6. При сравнении скоростей миграции различных клеточных линий Delta CI можно использовать для сравнения состояния клеток независимо от разницы в прикреплении, представленной в первых нескольких измерениях.
Недавно разработанный трехкамерный массив основан на существующей конструкции и использует верхнюю камеру от системы анализатора ячеек двойного назначения, которая содержит электроды. Модифицированные средняя и нижняя камеры адаптированы для установки сборки в анализатор ячеек двойного назначения для измерения и анализа импеданса с использованием интегрированного программного обеспечения. Двумя основными достижениями, которые новая конструкция обеспечивает по сравнению с существующей двухкамерной CIM-пластиной (впредь называемой пластиной клеточного анализатора), являются: i) способность восстанавливаться, а затем анализировать инвазивные клеточные субпопуляции, которые присутствуют в гетерогенных клеточных смесях, и ii) возможность оценки влияния секретируемых факторов из совместно культивируемых стромальных или иммунных клеток на инвазию клеток (рисунок 1).
Эта технология может быть полезна при изучении субпопуляций клеток с различной инвазивной способностью. Это включает в себя (a) инвазивные раковые клетки, которые вторгаются в окружающие ткани или кровеносные и лимфатические сосуды или экстравазируются в местах метастатического посева в отдаленных органах, (b) клетки иммунной системы, которые вторгаются в ткани для борьбы с патогенами или больными клетками, (c) эндотелиальные клетки, которые вторгаются в ткани с образованием новых кровеносных сосудов во время реорганизации тканей или заживления ран, а также (d) стромальные клетки из микроокружения опухоли, которые поддерживают и вторгаются вместе с раковыми клетками. Этот подход позволяет включить стромальные перекрестные помехи, которые могут модулировать подвижность и инвазию клеток. Технико-экономические обоснования, показанные здесь, используют этот модифицированный массив, ориентированный на инвазию раковых клеток и взаимодействие со стромой в качестве модельной системы, включая эндотелиальную инвазию в ответ на дифференциальные сигналы от раковых клеток. Этот подход может быть экстраполирован для выделения раковых клеток и других типов клеток, таких как субпопуляции иммунных клеток, фибробластов или эндотелиальных клеток. Мы протестировали инвазивные и неинвазивные установленные клеточные линии рака молочной железы в качестве доказательства принципа. Мы также использовали клетки из инвазии ксенотрансплантата (PDX), полученные от пациента, в ответ на иммунные клетки из костного мозга человека, чтобы показать возможность будущего использования также в клинических диагностических условиях. PDX - это опухолевые ткани пациента, которые имплантируются в модель мышей с ослабленным иммунитетом или гуманизированным иммунитетом, чтобы обеспечить изучение роста, прогрессирования и вариантов лечения для исходного пациента 7,8.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.05% Trypsin-EDTA</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>25300-054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adhesive</td>
			<td>Norland Optical Adhesive</td>
			<td>NOA63</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell lifter</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.1832</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholera Toxin from Vibrio cholerae</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>12585-014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CIM-plate</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5665817001</td>
			<td>Cell analyzer plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase from Clostridium histolyticum</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C0130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase</td>
			<td>StemCell</td>
			<td>7913</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>11995-065</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM-F12</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>11875-093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS), Heat Inactivated</td>
			<td>Omega Scientific</td>
			<td>FB-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>15630106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse serum (HS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>16050-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human EGF</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>AF-100-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human umbilical Vein endothelail cells (HUVEC)</td>
			<td>LONZA (RRID:CVCL_2959)</td>
			<td>C-2517A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HUVEC media</td>
			<td>LONZA</td>
			<td>CC-3162</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrocortisone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H4001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin Transferrin Selenium Ethanolamine (ITSX) (100x)</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>51500056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin, Human Recombinant, Zinc Solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C8052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>J2 Fibroblasts</td>
			<td>Stemcell (RRID:CVCL_W667)</td>
			<td>100-0353</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LymphoPrep</td>
			<td>Stemcell</td>
			<td>7851</td>
			<td>Density gradient medium for the isolation of mononuclear cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354230</td>
			<td>Basement membrane matrix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MCFDCIS.com cells ( DCIS)</td>
			<td>RRID:CVCL_5552</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MDA-MB-231 cells</td>
			<td>RRID:CVCL_0062</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Milling machine</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Bridgeport Series 1 Vertical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline (1x)</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>10010049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethersulfone (PES) membrane</td>
			<td>Sterlitech</td>
			<td>PCTF029030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RBC lysis solution</td>
			<td>Stemcell</td>
			<td>7800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy Micro Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RTCA DP analyzer</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>3X16</td>
			<td>Dual purpose cell analyzer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T4799</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

real-time detection and capture of invasive cell subpopulations from co-cultures

Инвазия и метастатическое распространение раковых клеток являются основной причиной смерти от рака. Анализы, разработанные на ранней стадии для измерения инвазивного потенциала популяций раковых клеток, обычно генерируют одно измерение конечной точки, которое не различает субпопуляции раковых клеток с различным инвазивным потенциалом. Кроме того, микроокружение опухоли состоит из различных резидентных стромальных и иммунных клеток, которые изменяют и участвуют в инвазивном поведении раковых клеток. Инвазия в ткани также играет роль в субпопуляциях иммунных клеток, отбивающихся от микроорганизмов или устраняющих больные клетки из паренхимы и эндотелиальных клеток во время ремоделирования тканей и ангиогенеза. Клеточный анализ в реальном времени (RTCA), который использует импедансные биосенсоры для мониторинга клеточной инвазии, был важным шагом вперед после измерения инвазии в конечной точке: это обеспечивает непрерывные измерения с течением времени и, таким образом, может выявить различия в скорости инвазии, которые теряются в анализе конечной точки. Используя современную технологию RTCA, мы расширили двухкамерные массивы, добавив дополнительную камеру, которая может содержать стромальные и / или иммунные клетки и позволяет измерять скорость инвазии под воздействием секретируемых факторов из совместно культивируемых стромальных или иммунных клеток с течением времени. Помимо этого, уникальная конструкция позволяет в любое время отсоединять камеры и выделять наиболее инвазивные раковые клетки или другие клеточные субпопуляции, которые присутствуют в гетерогенных смесях тестируемых изолятов опухолей. Эти наиболее инвазивные раковые клетки и другие клеточные субпопуляции приводят к злокачественному прогрессированию до метастатического заболевания, и их молекулярные характеристики важны для углубленных механистических исследований, разработки диагностических зондов для их обнаружения и оценки уязвимостей. Таким образом, включение низкомолекулярных или крупномолекулярных препаратов может быть использовано для проверки потенциала методов лечения, нацеленных на рак и/или субпопуляции стромальных клеток, с целью ингибирования (например, раковых клеток) или усиления (например, иммунных клеток) инвазивного поведения.

Используя недавно разработанный трехкамерный массив, инвазия клеток была проверена в присутствии или отсутствии стромальных клеток, таких как фибробласты. Клеточная инвазия MDA-MB-231 усиливалась, когда облученные швейцарские фибробласты 3T3 (штамм J2) были посеяны в нижнюю камеру, что позв?...

Watch this Scientific Journal Video about Real-Time Detection and Capture of Invasive Cell Subpopulations from Co-Cultures at JoVE.com

Real-Time Detection and Capture of Invasive Cell Subpopulations from Co-Cultures

Описан подход к обнаружению и захвату инвазивных клеточных субпопуляций в режиме реального времени. Экспериментальный проект использует клеточный анализ в реальном времени путем мониторинга изменений электрического импеданса клеток. Инвазивные раковые, иммунные, эндотелиальные или стромальные клетки в сложных тканях могут быть захвачены, и влияние кокультур может быть оценено.

Обнаружение и захват инвазивных клеточных субпопуляций из кокультур в режиме реального времени

Invasion and metastatic spread of cancer cells are the major cause of death from cancer. Assays developed early on to measure the invasive potential of ...

Этот метод позволяет идентифицировать клетки с различными инвазивными возможностями под воздействием секретируемых факторов из совместно культивируемых стромальных клеток. Методика оценивает влияние секретируемых факторов из совместно культивируемых стромальных или иммунных клеток на клеточную инвазию. Это также позволяет восстанавливать и анализировать инвазивные клеточные субпопуляции, присутствующие в гетерогенных клеточных смесях.Метод может определить, какие опухоли содержат инвазивные клеточные субпопуляции, которые приводят к метастазированию. Захват и анализ инвазивных раковых клеток может информировать о решениях о терапии. Чтобы начать клеточную культуру, промывайте клеточные культуры, имеющие примерно 70% слияние с 1X фосфатным буферным физиологическим раствором.Затем добавляют 0,05% трипсина и раствор ЭДТА для удаления клеток. Нейтрализуют раствор трипсина клеточными культуральными средами, содержащими сыворотку, и подсчитывают клетки с помощью аликвоты клеточной суспензии. Поместите все три стерильные камеры в вытяжку для культивирования тканей.Расположите ручку на короткой стороне нижней камеры и сориентируйте нижнюю камеру так, чтобы ручка была обращена к экспериментатору. Добавьте от 30 000 до 50 000 клеток в 90 микролитров среды в каждую лунку из нижней камеры без образования пузырьков. Используйте 5% добавляемых среды с сывороткой крупного рогатого скота плода в двух нижних камерах в качестве положительного контроля подвижности клеток и используйте 0% сывороточных добавляемых сред в качестве отрицательного контроля.Поверните нижнюю камеру на 90 градусов, дав ей отстояться в течение 10-15 минут в капоте. Затем поместите среднюю камеру сверху так, чтобы ручка на нижней камере скользила в выемку на средней камере. Толкайте камеру вертикально вниз, пока не раздастся щелчок с каждой из длинных сторон узла.Добавьте 160 микролитров бессывороточной среды во все лунки средней камеры. Убедитесь, что куполообразный мениск виден после заполнения колодцев, и поместите верхнюю камеру с электродами, обращенными вниз к средней камере, чтобы выровнять синие точки на средней и верхней камерах. Толкайте камеру вертикально вниз, пока с каждой из длинных сторон узла не раздастся звук щелчка.Добавьте от 20 до 50 микролитров среды без сыворотки в верхнюю камеру. Установите сборку на анализатор клеток двойного назначения в инкубаторе культуры тканей и подождите 30 минут, прежде чем измерять фон. Откройте программное обеспечение анализатора ячеек, затем выберите подставку для использования, а затем нажмите на вкладку сообщения и убедитесь, что на ней написано «Соединения в порядке», чтобы убедиться, что массив хорошо расположен в подставке, а электроды хорошо выровнены с датчиками.Перейдите на вкладку «Заметки об эксперименте» и заполните всю возможную информацию об эксперименте. Затем нажмите на вкладку макета и заполните описание макета массива. Затем нажмите на вкладку расписания и добавьте два шага из меню шагов, фоновый шаг с одной разверткой и шаг теста со 100 развертками.После того, как массив находился в инкубаторе клеточного анализатора двойного назначения в течение 30 минут, нажмите кнопку воспроизведения, чтобы начать фоновое измерение. После того, как фоновое измерение будет сделано, извлеките массив из колыбели и поместите его обратно в вытяжку для культивирования клеток. Затем добавьте от 30 000 до 50 000 клеток в 100 микролитрах свободной от сыворотки среды к каждой лунке верхней камеры.Это клетки, которые электрод обнаружит, как только они успешно мигрируют через мембрану. Дайте сборке постоять в капоте в течение 30 минут перед установкой на анализатор ячеек двойного назначения для измерения импеданса. Поместите массив обратно в анализатор ячеек двойного назначения и проверьте вкладку сообщения Подключение в порядке".Нажмите кнопку воспроизведения, чтобы начать измерение импеданса, а затем нажмите на вкладку графика, чтобы отслеживать ход сигнала. Если конечная точка достигнута до 25 часов, щелкните шаг прерывания в раскрывающемся меню выполнения. Чтобы экспортировать данные, щелкните диаграмму правой кнопкой мыши, выберите «Копировать» в формате списка, а затем вставьте данные в электронную таблицу.Отслеживайте скорость миграции в режиме реального времени на анализаторе ячеек двойного назначения, чтобы определить интересующую точку остановки. После этого отсоедините узел от анализатора клеток двойного назначения и поместите его в вытяжку для культивирования тканей. Подготовьте соответствующее количество 1,5 миллилитров микроцентрифужных трубок для сбора клеток из интересующих лунок.Поместите узел в 10-сантиметровую посуду, чтобы она содержала жидкости, когда камеры отсоединяются. Отодвигайте гибкие защелкивающиеся концы на длинной стороне средней камеры внутрь, пока не раздастся звук щелчка, после чего разберите верхнюю камеру и переверните ее в новую 10-сантиметровую тарелку. Используйте подъемник клеток с 13-миллиметровым лезвием, чтобы собрать клетки из всех скважин, имеющих одинаковое экспериментальное состояние.Промыть или окунуть лезвие в 1X фосфатный буферизованный физиологический раствор, чтобы собрать клетки в 1,5-миллилитровые микроцентрифужные трубки. Затем вращайте клетки в 500 раз G в течение пяти минут и распространяйте эти собранные клетки или выполняйте анализ конечных точек, такой как секвенирование одноклеточной РНК. Оценка инвазии клеток при наличии или отсутствии стромальных клеток показала, что клеточная инвазия MDA-MB-231 усиливалась, когда облученные swiss-3T3 фибробласты штамма J2 сидели в нижней камере для обмена факторами между двумя клеточными линиями.Интересно, что инвазия MDA-MB-231 увеличилась, когда число ячеек 3T3 J2 удвоилось. С другой стороны, скорость инвазии инвазивного клона клеток MCFDCIS, DCIS-Delta Four, по-видимому, ингибируется перекрестными помехами с клетками 3T3 J2, что предполагает ценное применение трехкамерного массива для измерения различных эффектов стромы. В этом случае фибробласты на клеточную инвазию.Эндотелиальные клетки пупочных вен человека были более инвазивными в ответ на факторы, секретируемые клетками MDA-MB-231, в отличие от тех, которые секретируются клетками DCIS, что согласуется со способностью инвазивных опухолей рекрутировать эндотелиальные клетки для формирования кровеносных сосудов и последующей диссеминации в кровообращение. Инвазия клеток ксенотрансплантата пациента из верхней камеры увеличивалась в ответ на совместно культивируемые иммунные клетки костного мозга человека. Интересно, что наличие 2% сыворотки в нижней камере с иммунными клетками костного мозга человека было необходимо для инвазии ксенотрансплантатов, полученных пациентом.Колодцы могут быть покрыты внеклеточным матриксом, чтобы имитировать барьер базальной мембраны. Лечебные средства могут быть добавлены в среды в колодцах для мониторинга их влияния на инвазию.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Capture and Release of Viable Circulating Tumor Cells from Blood

Захват и Выпуск Жизнеспособных циркулирующих опухолевых клеток из крови

We demonstrate a method for size based capture of viable circulating tumor cell (CTC) from whole blood, along with the release of these cells from chip ...

Invasive Behavior of Human Breast Cancer Cells in Embryonic Zebrafish

Инвазивные поведение клеток рака молочной железы человека в эмбриональном данио рерио

In many cases, cancer patients do not die of a primary tumor, but rather because of metastasis. Although numerous rodent models are available for studying ...

Four-color Fluorescence Immunohistochemistry of T-cell Subpopulations in Archival Formalin-fixed, Paraffin-embedded Human Oropharyngeal Squamous Cell Carcinoma Samples

Четырехцветная флуоресценция Иммуногистохимия субпопуляций Т-клеток в архивных формалиновых фиксированных, парафиновых встраиваемых образцах проксимальной клеточной карциномы человека

The four-color fluorescence immunohistochemistry (IHC) technique is a method to quantify cell populations of interest while taking into account their ...

Preparation and Metabolic Assay of 3-dimensional Spheroid Co-cultures of Pancreatic Cancer Cells and Fibroblasts

Подготовка и метаболических Assay 3-мерной сфероида Сопредседатель культур клеток поджелудочной железы и фибробластов

Many cancer types, including pancreatic cancer, have a dense fibrotic stroma that plays an important role in tumor progression and invasion. Activated ...

Serum and Plasma Copy Number Detection Using Real-time PCR

Сыворотки и плазмы скопировать номер обнаружения с помощью ПЦР в реальном времени

Serum and plasma cell free DNA (cfDNA) has been shown as an informative, non-invasive source of biomarkers for cancer diagnosis, prognosis, monitoring, ...

Real Time Detection of In Vitro Tumor Cell Apoptosis Induced by CD8+ T Cells to Study Immune Suppressive Functions of Tumor-infiltrating Myeloid Cells

Real Time Detection of In Vitro Tumor Cell Apoptosis Induced by CD8+ T Cells to Study Immune Suppressive Functions of Tumor-infiltrating Myeloid Cells

Режиме реального времени обнаружения в апоптоз клеток in Vitro опухоли индуцированные CD8 клетки+ T для изучения подавляющей иммунные функции проникновения опухоли миелоидных клеток

Potentiation of the tumor-killing ability of CD8+ T cells in tumors, along with their efficient tumor infiltration, is a key element of successful ...

Real-Time Monitoring of Human Glioma Cell Migration on Dorsal Root Ganglion Axon-Oligodendrocyte Co-Cultures

Мониторинг в режиме реального времени миграции клеток глиомы человека на dorsal Root Ganglion Axon-Oligodendrocyte Co-Cultures

Glioblastoma is one of the most aggressive human cancers due to extensive cellular heterogeneity and the migration properties of hGCs. In order to better ...

Time-Lapse 2D Imaging of Phagocytic Activity in M1 Macrophage-4T1 Mouse Mammary Carcinoma Cells in Co-cultures

Time-Lapse 2D Изображение фагоцитарной активности в M1 Макрофаг-4T1 Мышь Mammary Карцином Клетки в ко-культур

Tumor-associated macrophages (TAMs) have been identified as an important component for tumor growth, invasion, metastasis, and resistance to cancer ...

Combined Use of Tail Vein Metastasis Assays and Real-Time In Vivo Imaging to Quantify Breast Cancer Metastatic Colonization and Burden in the Lungs

Комбинированное использование хвоста вен ы метастазы анализы и в режиме реального времени в Vivo Imaging для количественной диагностики рака молочной железы метастатическая колонизация и бремя в легких

Metastasis is the main cause of cancer-related deaths and there are limited therapeutic options for patients with metastatic disease. The identification ...

Impedance-based Real-time Measurement of Cancer Cell Migration and Invasion

Impedance основе в режиме реального времени Измерения миграции раковых клеток и вторжения

Cancer arises due to uncontrolled proliferation of cells initiated by genetic instability, mutations, and environmental and other stress factors. These ...