Name: real-time detection and capture of invasive cell subpopulations from co-cultures
Uploaded: 2022-03-30T14:00:00
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Alana Welms, Huntsman Cancer Institute, Universidad de Utah, por proporcionarnos los xenoinjertos derivados del paciente (HCI-010). Este trabajo fue apoyado por las subvenciones de los NIH R01CA205632, R21CA226542 y, en parte, por una subvención de Agilent Technologies.

El estudio fue revisado y considerado como "exento" por la Junta de Revisión Institucional de la Universidad de Georgetown (IRB # 2002-022). Los tejidos de médula ósea recién cosechados se recolectaron de filtros de recolección de médula ósea humana sanos desechados que habían sido desidentificados.
1. Nuevo diseño de cámara (Figura 2)
<ol><li>Abra una nueva placa analizadora de celdas de doble cámara. Aparta la cáma...

<ol>
	<li>Friedl, P., Gilmour, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collective+cell+migration+in+morphogenesis,+regeneration+and+cancer.">Collective cell migration in morphogenesis, regeneration and cancer.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10 (7), 445-457 (2009).</li><li>Boyden, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chemotactic+effect+of+mixtures+of+antibody+and+antigen+on+polymorphonuclear+leucocytes.">The chemotactic effect of mixtures of antibody and antigen on polymorphonuclear leucocytes.</a> The Journal of Experimental Medicine. 115 (3), 453-466 (1962).</li><li>Xu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+review+of+impedance+measurements+of+whole+cells.">A review of impedance measurements of whole cells.</a> Biosensors &amp; Bioelectronics. 77, 824-836 (2016).</li><li>Stylianou, D. 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A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-free,+real-time+monitoring+of+IgE-mediated+mast+cell+activation+on+microelectronic+cell+sensor+arrays.">Label-free, real-time monitoring of IgE-mediated mast cell activation on microelectronic cell sensor arrays.</a> Journal of Immunological Methods. 292 (1-2), 195-205 (2004).</li><li>Morton, C. L., Houghton, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+human+tumor+xenografts+in+immunodeficient+mice.">Establishment of human tumor xenografts in immunodeficient mice.</a> Nature Protocols. 2 (2), 247-250 (2007).</li><li>DeRose, Y. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+grafts+derived+from+women+with+breast+cancer+authentically+reflect+tumor+pathology,+growth,+metastasis+and+disease+outcomes.">Tumor grafts derived from women with breast cancer authentically reflect tumor pathology, growth, metastasis and disease outcomes.</a> Nature Medicine. 17 (11), 1514-1520 (2011).</li><li>Sharif, G. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+AIB1+isoform+alters+enhancer+access+and+enables+progression+of+early-stage+triple-negative+breast+cancer.">An AIB1 isoform alters enhancer access and enables progression of early-stage triple-negative breast cancer.</a> Cancer Research. 81 (16), 4230-4241 (2021).</li><li>Caileau, R., Olive, M., Cruciger, Q. 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J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MCF10DCIS.com+xenograft+model+of+human+comedo+ductal+carcinoma+in+situ.">MCF10DCIS.com xenograft model of human comedo ductal carcinoma in situ.</a> Journal of the National Cancer Institute. 92 (14), 1185-1186 (2000).</li><li>Winkler, J., Abisoye-Ogunniyan, A., Metcalf, K. J., zenaa, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concepts+of+extracellular+matrix+remodelling+in+tumour+progression+and+metastasis.">Concepts of extracellular matrix remodelling in tumour progression and metastasis.</a> Nature Communications. 11 (1), 1-19 (2020).</li><li>Nkosi, D., Sun, L., Duke, L. C., Meckes, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epstein-Barr+virus+LMP1+manipulates+the+content+and+functions+of+extracellular+vesicles+to+enhance+metastatic+potential+of+recipient+cells.">Epstein-Barr virus LMP1 manipulates the content and functions of extracellular vesicles to enhance metastatic potential of recipient cells.</a> PLoS Pathogens. 16 (12), 1009023 (2020).</li><li>Eisenberg, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanistic+modeling+of+the+effects+of+myoferlin+on+tumor+cell+invasion.">Mechanistic modeling of the effects of myoferlin on tumor cell invasion.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (50), 20078-20083 (2011).</li></ol>

Hemos modificado el diseño de una matriz de doble cámara para incluir una tercera cámara para monitorear la invasión celular en tiempo real en presencia de células estromales. Hemos observado distintos efectos de los fibroblastos cocultivados en células cancerosas invasivas y no invasivas, lo que indica que la matriz se puede utilizar para distinguir entre subpoblaciones de células cancerosas que responden de manera diferente a los factores producidos por las células estromales cocultivadas. La matriz también se...

La invasión celular es un proceso importante que permite a las células cruzar las barreras de la membrana basal en respuesta a las señales ambientales proporcionadas por las células estromales. Es un paso crucial durante varias etapas de desarrollo para las respuestas inmunes, la cicatrización de heridas, la reparación de tejidos y las neoplasias malignas que pueden progresar de lesiones locales a cánceres invasivos y metastásicos1. Los ensayos desarrollados desde el principio para medir el potencial invasivo de las poblaciones celulares generalmente generan una medición de punto final único o requieren un etiquetado previo de las células invasivas2. La integración de técnicas de microelectrónica y microfluídica se desarrolla ahora para detectar diferentes aspectos de la biología celular como la viabilidad, el movimiento y la fijación utilizando la impedancia eléctrica de células vivas en microelectrodos 3,4. La medición de la impedancia permite una evaluación cuantitativa, no invasiva y sin etiquetas del estado celular3. Aquí describimos una matriz de tres cámaras basada en el diseño del sistema de Análisis Celular en Tiempo Real (RTCA) que fue desarrollado por Abassi et al.5. La matriz de tres cámaras permite la evaluación de células cocultivadas en la invasión celular y la recuperación de células invasivas para análisis o expansión adicionales.
En el sistema analizador celular, las células invaden a través de una matriz extracelular recubierta sobre una membrana porosa y alcanzan una matriz de electrodos interdigitados colocada en el lado opuesto de la barrera. A medida que las células invasivas continúan uniéndose y ocupando esta matriz de electrodos con el tiempo, la impedancia eléctrica cambia en paralelo. El sistema actual comprende una placa de invasión y migración celular (CIM) de 16 pocillos con dos cámaras. El instrumento RTCA-DP (dual purpose) (llamado analizador de células de doble propósito en adelante) contiene sensores para la medición de impedancia y software integrado para analizar y procesar los datos de impedancia. Los valores de impedancia al inicio dependen de la fuerza iónica de los medios en los pocillos y se cambian a medida que las células se unen a los electrodos. Los cambios de impedancia dependen del número de células, su morfología y la medida en que las células se adhieren a los electrodos. Una medición de los pozos con medios antes de que se agreguen las células se considera como la señal de fondo. El fondo se resta de las mediciones de impedancia después de alcanzar el equilibrio con las celdas que se unen y se extienden sobre los electrodos. Un parámetro sin unidad del estado de las celdas en un electrodo denominado Índice de Celda (IC) se calcula de la siguiente manera: IC = (impedancia después del equilibrio - impedancia en ausencia de celdas) / valor de impedancia nominal6. Cuando se comparan las tasas de migración de diferentes líneas celulares, el Delta CI se puede utilizar para comparar el estado de la célula independientemente de la diferencia en la conexión que se representa en las primeras mediciones.
La matriz de tres cámaras de nuevo diseño se basa en el diseño existente y utiliza la cámara superior del sistema de analizador de celdas de doble propósito que contiene los electrodos. Las cámaras intermedia e inferior modificadas se adaptan para adaptar el conjunto al analizador de celdas de doble propósito para la medición y el análisis de impedancia utilizando el software integrado. Los dos principales avances que el nuevo diseño proporciona sobre la placa CIM de doble cámara existente (llamada placa analizadora celular en adelante) son: i) la capacidad de recuperarse y luego analizar las subpoblaciones celulares invasivas que están presentes en mezclas celulares heterogéneas y ii) la opción de evaluar el impacto de los factores secretados de células estromales o inmunes cocultivadas en la invasión celular (Figura 1).
Esta tecnología puede ser útil en el estudio de las subpoblaciones de células con diferentes capacidades invasivas. Eso incluye (a) células cancerosas invasivas que invaden los tejidos circundantes o vasos sanguíneos y linfáticos o extravasan en sitios de siembra metastásicos en órganos distantes, (b) células del sistema inmunitario que invaden tejidos para hacer frente a patógenos o células enfermas, (c) células endoteliales que invaden tejidos para formar nuevos vasos sanguíneos durante la reorganización de tejidos o la cicatrización de heridas, así como (d) células estromales del microambiente tumoral que soportan e invaden junto con las células cancerosas. El enfoque permite la inclusión de diafonías estromales que pueden modular la motilidad celular y la invasión. Los estudios de viabilidad que se muestran aquí utilizan esta matriz modificada centrada en la invasión de células cancerosas y la interacción con el estroma como sistema modelo, incluida la invasión endotelial en respuesta a las señales diferenciales de las células cancerosas. El enfoque se puede extrapolar para aislar células cancerosas y otros tipos de células, como subpoblaciones de células inmunes, fibroblastos o células endoteliales. Probamos líneas celulares de cáncer de mama establecidas invasivas y no invasivas como prueba de principio. También utilizamos células de invasión de xenoinjerto derivado del paciente (PDX) en respuesta a células inmunes de la médula ósea humana para mostrar la viabilidad para su uso futuro también en entornos de diagnóstico clínico. Las PDX son tejidos tumorales de pacientes que se implantan en ratones modelo inmunocomprometidos o humanizados para permitir el estudio del crecimiento, la progresión y las opciones de tratamiento para el paciente original 7,8.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.05% Trypsin-EDTA</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>25300-054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adhesive</td>
			<td>Norland Optical Adhesive</td>
			<td>NOA63</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell lifter</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.1832</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholera Toxin from Vibrio cholerae</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>12585-014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CIM-plate</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5665817001</td>
			<td>Cell analyzer plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase from Clostridium histolyticum</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C0130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase</td>
			<td>StemCell</td>
			<td>7913</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>11995-065</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM-F12</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>11875-093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS), Heat Inactivated</td>
			<td>Omega Scientific</td>
			<td>FB-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>15630106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse serum (HS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>16050-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human EGF</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>AF-100-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human umbilical Vein endothelail cells (HUVEC)</td>
			<td>LONZA (RRID:CVCL_2959)</td>
			<td>C-2517A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HUVEC media</td>
			<td>LONZA</td>
			<td>CC-3162</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrocortisone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H4001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin Transferrin Selenium Ethanolamine (ITSX) (100x)</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>51500056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin, Human Recombinant, Zinc Solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C8052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>J2 Fibroblasts</td>
			<td>Stemcell (RRID:CVCL_W667)</td>
			<td>100-0353</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LymphoPrep</td>
			<td>Stemcell</td>
			<td>7851</td>
			<td>Density gradient medium for the isolation of mononuclear cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354230</td>
			<td>Basement membrane matrix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MCFDCIS.com cells ( DCIS)</td>
			<td>RRID:CVCL_5552</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MDA-MB-231 cells</td>
			<td>RRID:CVCL_0062</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Milling machine</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Bridgeport Series 1 Vertical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline (1x)</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>10010049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethersulfone (PES) membrane</td>
			<td>Sterlitech</td>
			<td>PCTF029030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RBC lysis solution</td>
			<td>Stemcell</td>
			<td>7800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy Micro Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RTCA DP analyzer</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>3X16</td>
			<td>Dual purpose cell analyzer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T4799</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

real-time detection and capture of invasive cell subpopulations from co-cultures

La invasión y la diseminación metastásica de las células cancerosas son la principal causa de muerte por cáncer. Los ensayos desarrollados desde el principio para medir el potencial invasivo de las poblaciones de células cancerosas generalmente generan una medición de punto final único que no distingue entre las subpoblaciones de células cancerosas con diferente potencial invasivo. Además, el microambiente tumoral consiste en diferentes células e inmunitarias y del estroma residentes que alteran y participan en el comportamiento invasivo de las células cancerosas. La invasión en los tejidos también juega un papel en las subpoblaciones de células inmunes que se defienden de los microorganismos o eliminan las células enfermas del parénquima y las células endoteliales durante la remodelación del tejido y la angiogénesis. El análisis celular en tiempo real (RTCA) que utiliza biosensores de impedancia para monitorear la invasión celular fue un gran paso adelante más allá de la medición de la invasión en el punto final: esto proporciona mediciones continuas a lo largo del tiempo y, por lo tanto, puede revelar diferencias en las tasas de invasión que se pierden en el ensayo de punto final. Utilizando la tecnología RTCA actual, ampliamos las matrices de doble cámara agregando una cámara adicional que puede contener células estromales y / o inmunes y permite medir la tasa de invasión bajo la influencia de factores secretados de células estromales o inmunes cocultivadas a lo largo del tiempo. Más allá de esto, el diseño único permite separar cámaras en cualquier momento y aislar la célula cancerosa más invasiva u otras subpoblaciones celulares que están presentes en mezclas heterogéneas de aislados tumorales probados. Estas células cancerosas más invasivas y otras subpoblaciones celulares impulsan la progresión maligna a la enfermedad metastásica, y sus características moleculares son importantes para estudios mecanicistas en profundidad, el desarrollo de sondas de diagnóstico para su detección y la evaluación de vulnerabilidades. Por lo tanto, la inclusión de medicamentos de moléculas pequeñas o grandes se puede utilizar para probar el potencial de las terapias que se dirigen al cáncer y / o subpoblaciones de células estromales con el objetivo de inhibir (por ejemplo, células cancerosas) o mejorar (por ejemplo, células inmunes) el comportamiento invasivo.

Utilizando la matriz de tres cámaras de nuevo diseño, la invasión de las células se probó en presencia o ausencia de células estromales como los fibroblastos. La invasión celular MDA-MB-231 se mejoró cuando se sembraron fibroblastos suizos 3T3 irradiados (cepa J2) en la cámara inferior, lo que permitió el intercambio de factores entre las dos líneas celulares. Curiosamente, la invasión de MDA-MB-231 aumentó cuando las células 3T3-J2 se duplicaron en número (Figura 3A). Por otr...

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Real-Time Detection and Capture of Invasive Cell Subpopulations from Co-Cultures

Describimos un enfoque para detectar y capturar subpoblaciones celulares invasivas en tiempo real. El diseño experimental utiliza el análisis celular en tiempo real mediante el monitoreo de los cambios en la impedancia eléctrica de las células. Se pueden capturar células invasivas de cáncer, inmunes, endoteliales o estromales en tejidos complejos y se puede evaluar el impacto de los cocultivos.

Detección y captura en tiempo real de subpoblaciones celulares invasivas a partir de cocultivos

Invasion and metastatic spread of cancer cells are the major cause of death from cancer. Assays developed early on to measure the invasive potential of ...

Esta técnica permite la identificación de las células con diferentes capacidades invasivas bajo la influencia de factores secretados de células estromales cocultivadas. La técnica evalúa el impacto de los factores secretados de las células estromales o inmunes cocultivadas en la invasión celular. También permite la recuperación y análisis de subpoblaciones celulares invasivas presentes en mezclas celulares heterogéneas.La técnica puede determinar qué tumores albergan subpoblaciones celulares invasivas que conducen a la metástasis. La captura y el análisis de células cancerosas invasivas pueden informar las decisiones terapéuticas. Para comenzar el cultivo celular, lave los cultivos celulares de adherencia que tengan aproximadamente un 70% de confluencia con solución salina tamponada con fosfato 1X.Luego agregue 0.05% de tripsina y solución de EDTA para levantar las células. Neutralizar la solución de tripsina con medios de cultivo celular que contengan suero y contar las células utilizando una alícuota de la suspensión celular. Coloque las tres cámaras estériles en la campana de cultivo de tejidos.Ubique la perilla en el lado corto de la cámara inferior y oriente la cámara inferior de modo que la perilla esté orientada hacia el experimentador. Agregue de 30, 000 a 50, 000 células en 90 microlitros de medios a cada pozo desde la cámara inferior sin formar burbujas. Utilice el 5% de los medios suplementados con suero fetal bovino en dos cámaras inferiores como control positivo de la motilidad celular, y use el medio suplementado con suero al 0% como control negativo.Gire la cámara inferior a 90 grados después de dejarla reposar durante 10 a 15 minutos en la capucha. Luego coloque la cámara central en la parte superior para que la perilla de la cámara inferior se deslice hacia la muesca en la cámara central. Empuje la cámara verticalmente hacia abajo hasta que se escuche un clic desde cada uno de los lados largos del conjunto.Agregue 160 microlitros de medios sin suero a todos los pozos de la cámara central. Asegúrese de que un menisco en forma de cúpula sea visible después de llenar los pozos y coloque la cámara superior con electrodos mirando hacia abajo en la cámara central para alinear los puntos azules en las cámaras media y superior. Empuje la cámara verticalmente hacia abajo hasta que se escuche un sonido de clic desde cada uno de los lados largos del conjunto.Agregue de 20 a 50 microlitros de medios sin suero a la cámara superior. Monte el conjunto en el analizador celular de doble propósito en la incubadora de cultivo de tejidos y espere 30 minutos antes de medir el fondo. Abra el software del analizador de celdas, luego seleccione la base que se utilizará, seguida de un clic en la pestaña de mensajes, y asegúrese de que diga Conexiones bien"para asegurarse de que la matriz esté bien colocada en la base y que los electrodos estén bien alineados con los sensores.Haga clic en la pestaña de notas del experimento y complete toda la información posible sobre el experimento. Luego haga clic en la pestaña de diseño y complete la descripción del diseño de la matriz. Luego haga clic en la pestaña de programación y agregue dos pasos del menú de pasos, un paso de fondo con un barrido y un paso de prueba con 100 barridos.Una vez que la matriz haya estado en la incubadora del analizador de células de doble propósito durante 30 minutos, haga clic en el botón de reproducción para iniciar la medición de fondo. Una vez realizada la medición de fondo, retire la matriz de la base y colóquela de nuevo en la campana de cultivo celular. Luego agregue de 30, 000 a 50, 000 células en 100 microlitros de medios sin suero a cada pozo de la cámara superior.Estas son las células que el electrodo detectará una vez que migren con éxito a través de la membrana. Deje reposar el conjunto en la campana durante 30 minutos antes de montarlo en el analizador de celdas de doble propósito para la medición de impedancia. Vuelva a colocar la matriz en el analizador de celdas de doble propósito y compruebe la pestaña de mensajes para el mensaje Conexiones correctas.Haga clic en el botón de reproducción para iniciar la medición de impedancia y luego haga clic en la pestaña de gráfico para monitorear el progreso de la señal. Si se alcanza el punto final antes de 25 horas, haga clic en el paso de anulación del menú desplegable Ejecutar. Para exportar datos, haga clic con el botón secundario en el gráfico, elija copiar en el formato de lista y, a continuación, pegue los datos en una hoja de cálculo.Monitoree la tasa de migración en tiempo real en el analizador de celdas de doble propósito para determinar el punto de parada de interés. Una vez logrado, desmonte el conjunto del analizador celular de doble propósito y colóquelo en la campana de cultivo de tejidos. Prepare un número apropiado de 1,5 mililitros de tubos de microcentrífuga para recoger las células de los pocillos de interés.Coloque el conjunto en un plato de 10 centímetros para contener líquidos cuando las cámaras se desprendan. Empuje los extremos flexibles de ajuste en el lado largo de la cámara central hacia adentro hasta que se escuche un sonido de clic, seguido de desmontar la cámara superior e invertirla en un nuevo plato de 10 centímetros. Use un elevador de células con una cuchilla de 13 milímetros para recolectar las células de todos los pozos que albergan la misma condición experimental.Enjuague o sumerja la cuchilla en solución salina tamponada con fosfato 1X para recoger las células en tubos de microcentrífuga de 1,5 mililitros. Luego, gire las células a 500 veces G durante cinco minutos y propague estas células recolectadas o realice análisis de punto final, como la secuenciación de ARN de una sola célula. La evaluación de la invasión de las células en presencia o ausencia de células estromales mostró que la invasión celular MDA-MB-231 mejoró cuando la cepa J2 de fibroblastos Swiss-3T3 irradiada se asentó en la cámara inferior para el intercambio de factores entre las dos líneas celulares.Curiosamente, la invasión de MDA-MB-231 aumentó cuando las células 3T3 J2 se duplicaron en número. Por otro lado, la tasa de invasión de un clon invasivo de células MCFDCIS, DCIS-Delta Four, parece estar inhibida por la diafonía con células 3T3 J2, lo que sugiere la valiosa aplicación de la matriz de tres cámaras para medir los efectos variables del estroma. En este caso, fibroblastos en invasión celular.Las células endoteliales de la vena umbilical humana fueron más invasivas en respuesta a los factores secretados por las células MDA-MB-231, a diferencia de las secretadas por las células DCIS, lo que es consistente con la capacidad de los tumores invasivos para reclutar células endoteliales para la formación de vasos sanguíneos y su posterior diseminación a la circulación. La invasión de células de xenoinjerto derivadas del paciente desde la cámara superior aumentó en respuesta a las células inmunes de la médula ósea humana cocultivadas. Curiosamente, la presencia de suero del 2% en la cámara inferior con las células inmunes de la médula ósea humana fue esencial para la invasión de xenoinjertos derivados del paciente.Los pozos se pueden recubrir con una matriz extracelular para imitar la barrera de la membrana basal. Los agentes terapéuticos se pueden agregar a los medios en los pozos para controlar su efecto sobre la invasión.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Capture and Release of Viable Circulating Tumor Cells from Blood

Captura y Liberación de viables células tumorales circulantes de la sangre

We demonstrate a method for size based capture of viable circulating tumor cell (CTC) from whole blood, along with the release of these cells from chip ...

Investigación

Investigación sobre el cáncer

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El comportamiento invasivo de las células del cáncer de mama humano en embriones de pez cebra

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Inmunohistoquímica de fluorescencia de cuatro colores de las subpoblaciones de células T en muestras de carcinoma de células escamosas humanas orofaríngeas fijadas con formol fijadas en parafina

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Serum and Plasma Copy Number Detection Using Real-time PCR

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Serum and plasma cell free DNA (cfDNA) has been shown as an informative, non-invasive source of biomarkers for cancer diagnosis, prognosis, monitoring, ...

Real Time Detection of In Vitro Tumor Cell Apoptosis Induced by CD8+ T Cells to Study Immune Suppressive Functions of Tumor-infiltrating Myeloid Cells

Real Time Detection of In Vitro Tumor Cell Apoptosis Induced by CD8+ T Cells to Study Immune Suppressive Functions of Tumor-infiltrating Myeloid Cells

Tiempo real detección de Vitro Tumor de la célula apoptosis inducida por CD8+ T las células para el estudio de las funciones inmunológicas de supresores de Tumor infiltrante de células mieloides

Potentiation of the tumor-killing ability of CD8+ T cells in tumors, along with their efficient tumor infiltration, is a key element of successful ...

Real-Time Monitoring of Human Glioma Cell Migration on Dorsal Root Ganglion Axon-Oligodendrocyte Co-Cultures

Monitoreo en tiempo real de la migración de células de glioma humano en cocultivos de axón-oligodendrocitos de ganglios de raíz dorsal

Glioblastoma is one of the most aggressive human cancers due to extensive cellular heterogeneity and the migration properties of hGCs. In order to better ...

Time-Lapse 2D Imaging of Phagocytic Activity in M1 Macrophage-4T1 Mouse Mammary Carcinoma Cells in Co-cultures

Tumor-associated macrophages (TAMs) have been identified as an important component for tumor growth, invasion, metastasis, and resistance to cancer ...

Combined Use of Tail Vein Metastasis Assays and Real-Time In Vivo Imaging to Quantify Breast Cancer Metastatic Colonization and Burden in the Lungs

Uso combinado de ensayos de metástasis de vena de cola e imágenes en tiempo real en vivo en vivo para cuantificar la colonización metastásica del cáncer de mama y la carga en los pulmones

Metastasis is the main cause of cancer-related deaths and there are limited therapeutic options for patients with metastatic disease. The identification ...

Impedance-based Real-time Measurement of Cancer Cell Migration and Invasion

Medición en tiempo real basada en impedancia de la migración e invasión de células cancerosas

Cancer arises due to uncontrolled proliferation of cells initiated by genetic instability, mutations, and environmental and other stress factors. These ...