Name: real-time detection and capture of invasive cell subpopulations from co-cultures
Uploaded: 2022-03-30T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Real-Time Detection and Capture of Invasive Cell Subpopulations from Co-Cultures at JoVE.com

Vi vill tacka Dr. Alana Welms, Huntsman Cancer Institute, University of Utah, för att förse oss med patienthärledda xenotransplantat (HCI-010). Detta arbete stöddes av NIH-anslag R01CA205632, R21CA226542, och delvis av ett bidrag från Agilent Technologies.

Studien granskades och betraktades som "undantagen" av Institutional Review Board of Georgetown University (IRB # 2002-022). Nyskördade benmärgsvävnader samlades in från kasserade friska humana benmärgsuppsamlingsfilter som hade avidentifierats.
1. Ny kammardesign (figur 2)
<ol><li>Öppna en ny cellanalysatorplatta med dubbla kammare. Lägg åt sidan den övre kammaren med elektroder.</li>
	<li>Raka av 2 mm av de U-formade ...

<ol>
	<li>Friedl, P., Gilmour, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collective+cell+migration+in+morphogenesis,+regeneration+and+cancer.">Collective cell migration in morphogenesis, regeneration and cancer.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10 (7), 445-457 (2009).</li><li>Boyden, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chemotactic+effect+of+mixtures+of+antibody+and+antigen+on+polymorphonuclear+leucocytes.">The chemotactic effect of mixtures of antibody and antigen on polymorphonuclear leucocytes.</a> The Journal of Experimental Medicine. 115 (3), 453-466 (1962).</li><li>Xu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+review+of+impedance+measurements+of+whole+cells.">A review of impedance measurements of whole cells.</a> Biosensors &amp; Bioelectronics. 77, 824-836 (2016).</li><li>Stylianou, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+single-chain+antibody+targeting+of+the+ligand-binding+domain+in+the+anaplastic+lymphoma+kinase+receptor.">Effect of single-chain antibody targeting of the ligand-binding domain in the anaplastic lymphoma kinase receptor.</a> Oncogene. 28 (37), 3296-3306 (2009).</li><li>Abassi, Y. A., Wang, X., Xu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real+time+electronic+cell+sensing+system+and+applications+for+cytotoxcity+profiling+and+compound+assays.">Real time electronic cell sensing system and applications for cytotoxcity profiling and compound assays.</a> United States Patent. , 1-88 (2013).</li><li>Abassi, Y. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-free,+real-time+monitoring+of+IgE-mediated+mast+cell+activation+on+microelectronic+cell+sensor+arrays.">Label-free, real-time monitoring of IgE-mediated mast cell activation on microelectronic cell sensor arrays.</a> Journal of Immunological Methods. 292 (1-2), 195-205 (2004).</li><li>Morton, C. L., Houghton, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+human+tumor+xenografts+in+immunodeficient+mice.">Establishment of human tumor xenografts in immunodeficient mice.</a> Nature Protocols. 2 (2), 247-250 (2007).</li><li>DeRose, Y. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+grafts+derived+from+women+with+breast+cancer+authentically+reflect+tumor+pathology,+growth,+metastasis+and+disease+outcomes.">Tumor grafts derived from women with breast cancer authentically reflect tumor pathology, growth, metastasis and disease outcomes.</a> Nature Medicine. 17 (11), 1514-1520 (2011).</li><li>Sharif, G. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+AIB1+isoform+alters+enhancer+access+and+enables+progression+of+early-stage+triple-negative+breast+cancer.">An AIB1 isoform alters enhancer access and enables progression of early-stage triple-negative breast cancer.</a> Cancer Research. 81 (16), 4230-4241 (2021).</li><li>Caileau, R., Olive, M., Cruciger, Q. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+human+breast+carcinoma+cell+lines+of+metastatic+origin:+preliminary+characterization.">Long-term human breast carcinoma cell lines of metastatic origin: preliminary characterization.</a> In Vitro. 14 (11), 911-915 (1978).</li><li>Sharif, G. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+growth+density+modulates+cancer+cell+vascular+invasion+via+Hippo+pathway+activity+and+CXCR2+signaling.">Cell growth density modulates cancer cell vascular invasion via Hippo pathway activity and CXCR2 signaling.</a> Oncogene. 34 (48), 5879-5889 (2015).</li><li>Miller, F. R., Santner, S. J., Tait, L., Dawson, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MCF10DCIS.com+xenograft+model+of+human+comedo+ductal+carcinoma+in+situ.">MCF10DCIS.com xenograft model of human comedo ductal carcinoma in situ.</a> Journal of the National Cancer Institute. 92 (14), 1185-1186 (2000).</li><li>Winkler, J., Abisoye-Ogunniyan, A., Metcalf, K. J., zenaa, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concepts+of+extracellular+matrix+remodelling+in+tumour+progression+and+metastasis.">Concepts of extracellular matrix remodelling in tumour progression and metastasis.</a> Nature Communications. 11 (1), 1-19 (2020).</li><li>Nkosi, D., Sun, L., Duke, L. C., Meckes, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epstein-Barr+virus+LMP1+manipulates+the+content+and+functions+of+extracellular+vesicles+to+enhance+metastatic+potential+of+recipient+cells.">Epstein-Barr virus LMP1 manipulates the content and functions of extracellular vesicles to enhance metastatic potential of recipient cells.</a> PLoS Pathogens. 16 (12), 1009023 (2020).</li><li>Eisenberg, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanistic+modeling+of+the+effects+of+myoferlin+on+tumor+cell+invasion.">Mechanistic modeling of the effects of myoferlin on tumor cell invasion.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (50), 20078-20083 (2011).</li></ol>

Vi har modifierat utformningen av en dubbelkammare för att inkludera en tredje kammare för övervakning av cellinvasion i realtid i närvaro av stromaceller. Vi har observerat tydliga effekter av samodlingade fibroblaster på invasiva och icke-invasiva cancerceller som indikerar att matrisen kan användas för att skilja mellan cancercellsubpopulationer som svarar annorlunda på faktorer som produceras av samkulturerade stromaceller. Arrayen användes också för att övervaka endotelcellsinvasion i stromala vävnader,...

Cellinvasion är en viktig process som gör det möjligt för celler att korsa basalmembranbarriärer som svar på miljösignaler som tillhandahålls av stromaceller. Det är ett avgörande steg under flera utvecklingsstadier för immunsvar, sårläkning, vävnadsreparation och maligniteter som kan utvecklas från lokala lesioner till invasiva och metastatiska cancerformer1. Analyser som utvecklades tidigt för att mäta den invasiva potentialen hos cellpopulationer genererar vanligtvis en enda slutpunktsmätning eller kräver förmärkning av invasiva celler2. Integrationen av mikroelektronik och mikrofluidiktekniker är nu utvecklad för att detektera olika aspekter av cellbiologi såsom livskraft, rörelse och fastsättning med hjälp av den elektriska impedansen hos levande celler på mikroelektroder 3,4. Impedansmätning möjliggör en etikettfri, icke-invasiv och kvantitativ bedömning av cellstatus3. Här beskriver vi en trekammarmatris baserad på utformningen av Real-Time Cellular Analysis (RTCA) -systemet som utvecklades av Abassi et al.5. Den trekammare matrisen möjliggör bedömning av samodlingade celler på cellulär invasion och återhämtning av invasiva celler för ytterligare analyser eller expansion.
I cellanalysatorsystemet invaderar celler genom en extracellulär matris belagd på ett poröst membran och når en interdigiterad elektrodmatris placerad på motsatt sida av barriären. Eftersom de invasiva cellerna fortsätter att fästa och ockupera denna elektrodmatris över tiden förändras den elektriska impedansen parallellt. Det nuvarande systemet består av en cellinvasion och migration (CIM) 16-brunnsplatta med två kamrar. RTCA-DP-instrumentet (dual purpose) (kallat dual purpose cell analyzer hädanefter) innehåller sensorer för impedansmätning och integrerad programvara för att analysera och bearbeta impedansdata. Impedansvärden vid baslinjen beror på jonstyrkan hos media i brunnarna och ändras när celler fäster vid elektroderna. Impedansförändringarna beror på antalet celler, deras morfologi och i vilken utsträckning celler fäster vid elektroderna. En mätning av brunnarna med media innan cellerna tillsätts betraktas som bakgrundssignal. Bakgrunden subtraheras från impedansmätningar efter att ha nått jämvikt med celler som fäster och sprider sig på elektroderna. En enhetslös parameter för cellernas status på en elektrod benämnt Cell Index (CI) beräknas enligt följande: CI = (impedans efter jämviktsimpedans i frånvaro av celler) / nominellt impedansvärde6. När migrationshastigheter för olika cellinjer jämförs kan Delta CI användas för att jämföra cellstatus oavsett skillnaden i fastsättning som representeras i de första mätningarna.
Den nydesignade trekammarmatrisen bygger på den befintliga designen och använder toppkammaren från det dubbla cellanalysatorsystemet som innehåller elektroderna. De modifierade mellan- och bottenkamrarna är anpassade för att passa in i cellanalysatorn med dubbla syften för impedansmätning och analys med hjälp av den integrerade programvaran. De två stora framstegen som den nya designen ger över den befintliga CIM-plattan med dubbla kammare (kallad cellanalysatorplatta hädanefter) är: i) förmågan att återhämta sig och sedan analysera invasiva cellsubpopulationer som finns i heterogena cellblandningar och ii) möjligheten att bedöma effekterna av utsöndrade faktorer från samkulturerade stromala eller immunceller på cellinvasion (Figur 1).
Denna teknik kan vara användbar för att studera delpopulationerna av celler med olika invasiv kapacitet. Detta inbegriper (a) invasiva cancerceller som invaderar omgivande vävnader eller blod och lymfkärl eller extravaserar vid metastaserande såddplatser i avlägsna organ, (b) celler från immunsystemet som invaderar vävnader för att ta itu med patogener eller sjuka celler, (c) endotelceller som invaderar vävnader för att bilda nya blodkärl under vävnadsomorganisation eller sårläkning, samt (d) stromaceller från tumörmikromiljön som stöder och invaderar tillsammans med cancerceller. Tillvägagångssättet möjliggör inkludering av stromal cross-talk som kan modulera cellmotilitet och invasion. Genomförbarhetsstudierna som visas här använder denna modifierade matris fokuserad på cancercellinvasion och interaktionen med stroma som ett modellsystem, inklusive endotelinvasion som svar på differentiella signaler från cancerceller. Tillvägagångssättet kan extrapoleras för att isolera cancerceller och andra celltyper såsom subpopulationer av immunceller, fibroblaster eller endotelceller. Vi testade invasiva och icke-invasiva etablerade bröstcancercellinjer som ett principbevis. Vi använde också celler från patient-härledd xenograft (PDX) invasion som svar på immunceller från mänsklig benmärg för att visa genomförbarhet för framtida användning även i kliniska diagnostiska inställningar. PDX är patienttumörvävnader som implanteras i immunkompromitterade eller humaniserade mössmodeller för att möjliggöra studier av tillväxt, progression och behandlingsalternativ för den ursprungliga patienten 7,8.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.05% Trypsin-EDTA</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>25300-054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adhesive</td>
			<td>Norland Optical Adhesive</td>
			<td>NOA63</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell lifter</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.1832</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholera Toxin from Vibrio cholerae</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>12585-014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CIM-plate</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5665817001</td>
			<td>Cell analyzer plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase from Clostridium histolyticum</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C0130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase</td>
			<td>StemCell</td>
			<td>7913</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>11995-065</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM-F12</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>11875-093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS), Heat Inactivated</td>
			<td>Omega Scientific</td>
			<td>FB-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>15630106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse serum (HS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>16050-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human EGF</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>AF-100-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human umbilical Vein endothelail cells (HUVEC)</td>
			<td>LONZA (RRID:CVCL_2959)</td>
			<td>C-2517A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HUVEC media</td>
			<td>LONZA</td>
			<td>CC-3162</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrocortisone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H4001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin Transferrin Selenium Ethanolamine (ITSX) (100x)</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>51500056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin, Human Recombinant, Zinc Solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C8052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>J2 Fibroblasts</td>
			<td>Stemcell (RRID:CVCL_W667)</td>
			<td>100-0353</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LymphoPrep</td>
			<td>Stemcell</td>
			<td>7851</td>
			<td>Density gradient medium for the isolation of mononuclear cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354230</td>
			<td>Basement membrane matrix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MCFDCIS.com cells ( DCIS)</td>
			<td>RRID:CVCL_5552</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MDA-MB-231 cells</td>
			<td>RRID:CVCL_0062</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Milling machine</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Bridgeport Series 1 Vertical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline (1x)</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>10010049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethersulfone (PES) membrane</td>
			<td>Sterlitech</td>
			<td>PCTF029030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RBC lysis solution</td>
			<td>Stemcell</td>
			<td>7800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy Micro Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RTCA DP analyzer</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>3X16</td>
			<td>Dual purpose cell analyzer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T4799</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

real-time detection and capture of invasive cell subpopulations from co-cultures

Invasion och metastatisk spridning av cancerceller är den främsta dödsorsaken från cancer. Analyser som utvecklades tidigt för att mäta den invasiva potentialen hos cancercellpopulationer genererar vanligtvis en enda slutpunktsmätning som inte skiljer mellan cancercellssubpopulationer med olika invasiv potential. Tumörmikromiljön består också av olika bosatta stroma- och immunceller som förändrar och deltar i cancercellernas invasiva beteende. Invasion i vävnader spelar också en roll i immuncellssubpopulationer som avvärjer mikroorganismer eller eliminerar sjuka celler från parenkym och endotelceller under vävnadsombyggnad och angiogenes. Real-Time Cellular Analysis (RTCA) som använder impedansbiosensorer för att övervaka cellinvasion var ett stort steg framåt bortom slutpunktsmätning av invasion: detta ger kontinuerliga mätningar över tid och kan därmed avslöja skillnader i invasionshastigheter som går förlorade i slutpunktsanalysen. Med hjälp av nuvarande RTCA-teknik utvidgade vi dubbelkammarmatriser genom att lägga till ytterligare en kammare som kan innehålla stromala och / eller immunceller och gör det möjligt att mäta invasionshastigheten under påverkan av utsöndrade faktorer från samodlingade stromala eller immunceller över tiden. Utöver detta möjliggör den unika designen att lossa kamrar när som helst och isolera den mest invasiva cancercellen eller andra cellsubpopulationer som finns i heterogena blandningar av testade tumörisolat. Dessa mest invasiva cancerceller och andra cellsubpopulationer driver malign progression till metastatisk sjukdom, och deras molekylära egenskaper är viktiga för djupgående mekanistiska studier, utveckling av diagnostiska sonder för deras upptäckt och bedömning av sårbarheter. Således kan införandet av små eller stora molekylära läkemedel användas för att testa potentialen hos terapier som riktar sig mot cancer och / eller stromacellsubpopulationer med målet att hämma (t.ex. cancerceller) eller förbättra (t.ex. immunceller) invasivt beteende.

Med hjälp av den nydesignade trekammarmatrisen testades invasion av cellerna i närvaro eller frånvaro av stromaceller såsom fibroblaster. MDA-MB-231-cellinvasionen förbättrades när bestrålade schweiziska 3T3-fibroblaster (J2-stam) såddes i bottenkammaren, vilket möjliggjorde utbyte av faktorer mellan de två cellinjerna. Intressant nog ökade MDA-MB-231-invasionen när 3T3-J2-celler fördubblades i antal (Figur 3A). Å andra sidan verkar invasionshastigheten för en invasiv klon av...

Watch this Scientific Journal Video about Real-Time Detection and Capture of Invasive Cell Subpopulations from Co-Cultures at JoVE.com

Real-Time Detection and Capture of Invasive Cell Subpopulations from Co-Cultures

Vi beskriver ett tillvägagångssätt för att upptäcka och fånga invasiva cellsubpopulationer i realtid. Den experimentella designen använder real-time cellular analysis genom att övervaka förändringar i cellernas elektriska impedans. Invasiv cancer, immun-, endotel- eller stromaceller i komplexa vävnader kan fångas upp och effekterna av samkulturer kan bedömas.

Realtidsdetektering och fångst av invasiva cellsubpopulationer från samkulturer

Invasion and metastatic spread of cancer cells are the major cause of death from cancer. Assays developed early on to measure the invasive potential of ...

Denna teknik möjliggör identifiering av cellerna med olika invasiva kapaciteter under påverkan av utsöndrade faktorer från samodlingade stromaceller. Tekniken bedömer effekten av utsöndrade faktorer från samodlingade stromala- eller immunceller på cellinvasion. Det möjliggör också återhämtning och analys av invasiva cellsubpopulationer som finns i heterogena cellblandningar.Tekniken kan avgöra vilka tumörer som har invasiva cellsubpopulationer som leder till metastasering. Fångst och analys av invasiva cancerceller kan informera behandlingsbeslut. För att börja cellodlingen, tvätta vidhäftningscellkulturerna med cirka 70% sammanflöde med 1X fosfatbuffrad saltlösning.Tillsätt sedan 0,05% trypsin och EDTA-lösning för att lyfta av cellerna. Neutralisera trypsinlösningen med cellodlingsmedier innehållande serum och räkna cellerna med hjälp av en alikvot av cellsuspensionen. Placera alla tre sterila kamrarna i vävnadsodlingshuven.Leta reda på ratten på kortsidan av den nedre kammaren och orientera den nedre kammaren så att ratten är vänd mot experimenteraren. Tillsätt 30 000 till 50 000 celler i 90 mikroliter media till varje brunn från den nedre kammaren utan att bilda några bubblor. Använd 5% av fostrets bovina serum kompletterade media i två nedre kamrar som en positiv kontroll för cellmotilitet, och använd 0% serum kompletterat media som en negativ kontroll.Vrid den nedre kammaren vid 90 grader efter att ha låtit den sätta sig i 10 till 15 minuter i huven. Placera sedan mittkammaren ovanpå så att ratten på den nedre kammaren glider in i skåran på mittkammaren. Tryck kammaren vertikalt nedåt tills ett klick hörs från var och en av enhetens långsidor.Tillsätt 160 mikroliter serumfritt medium till alla brunnar i mittkammaren. Se till att en kupolformad menisk är synlig efter att brunnarna är fyllda och placera den övre kammaren med elektroder vända ner på mittkammaren för att rikta in de blå prickarna på mitten och övre kamrarna. Tryck kammaren vertikalt nedåt tills ett klickljud hörs från var och en av enhetens långsidor.Tillsätt 20 till 50 mikroliter serumfritt medium till den övre kammaren. Montera enheten på cellanalysatorn med dubbla syften i vävnadsodlingsinkubatorn och vänta 30 minuter innan du mäter bakgrunden. Öppna cellanalysatorprogramvaran, välj sedan vaggan som ska användas, följt av ett klick på meddelandefliken och se till att det står Anslutningar okej "för att säkerställa att matrisen är väl placerad i vaggan och elektroderna är väl anpassade till sensorerna.Klicka på fliken experimentanteckningar och fyll i all möjlig information om experimentet. Klicka sedan på layoutfliken och fyll i beskrivningen av arraylayouten. Klicka sedan på fliken Schema och lägg till två steg från stegmenyn, ett bakgrundssteg med ett svep och ett teststeg med 100 svep.När matrisen har varit i inkubatorn för cellanalysatorer med dubbla syften i 30 minuter klickar du på uppspelningsknappen för att starta bakgrundsmätningen. När bakgrundsmätningen är klar, ta bort matrisen från vaggan och placera den tillbaka i cellodlingshuven. Tillsätt sedan 30 000 till 50 000 celler i 100 mikroliter serumfritt media till varje brunn i toppkammaren.Dessa är de celler som elektroden kommer att upptäcka när de framgångsrikt migrerar genom membranet. Låt aggregatet stå i huven i 30 minuter innan du monterar på den dubbla cellanalysatorn för impedansmätning. Placera matrisen tillbaka i cellanalysatorn med dubbla syften och kontrollera meddelandefliken för meddelandet Anslutningar okej".Klicka på uppspelningsknappen för att starta impedansmätningen och klicka sedan på fliken Plot för att övervaka signalens framsteg. Om slutpunkten nås före 25 timmar klickar du på avbryt-steget i listrutan Kör. Om du vill exportera data högerklickar du på diagrammet, väljer kopiera i listformat och klistrar sedan in data i ett kalkylblad.Övervaka migreringshastigheten i realtid på cellanalysatorn med dubbla syften för att bestämma stopppunkten för intresse. När det har uppnåtts, demontera enheten från den dubbla cellanalysatorn och placera den i vävnadsodlingshuven. Förbered ett lämpligt antal 1,5 ml mikrocentrifugrör för att samla cellerna från brunnarna av intresse.Placera enheten i en 10 centimeter skål för att innehålla vätskor när kamrarna lossnar. Tryck de flexibla knäppningsändarna på långsidan av mittkammaren inåt tills ett klickljud hörs, följt av att demontera den övre kammaren och invertera den till en ny 10 centimeter skål. Använd en celllyftare med ett 13 millimeter blad för att samla cellerna från alla brunnar som har samma experimentella tillstånd.Skölj eller doppa bladet i 1X fosfatbuffrad saltlösning för att samla cellerna i 1,5 ml mikrocentrifugrör. Snurra sedan ner cellerna vid 500 gånger G i fem minuter och föröka dessa insamlade celler eller utför slutpunktsanalys såsom encellig RNA-sekvensering. Bedömning av invasion av cellerna i närvaro eller frånvaro av stromaceller visade att MDA-MB-231-cellinvasion förbättrades när bestrålade swiss-3T3 fibroblaster J2-stam satt i bottenkammaren för utbyte av faktorer mellan de två cellinjerna.Intressant nog ökade MDA-MB-231 invasionen när 3T3 J2-celler fördubblades i antal. Å andra sidan verkar invasionshastigheten för en invasiv klon av MCFDCIS-celler, DCIS-Delta Four, hämmas av överhörningen med 3T3 J2-celler, vilket tyder på den värdefulla tillämpningen av trekammarmatrisen för att mäta varierande effekter av stroma. I detta fall fibroblaster på cellinvasion.Humana navelvenendotelceller var mer invasiva som svar på faktorer som utsöndrades av MDA-MB-231-celler, till skillnad från de som utsöndras av DCIS-celler, vilket överensstämmer med invasiva tumörers förmåga att rekrytera endotelceller för blodkärlsbildning och senare spridning i cirkulationen. Patient-härledda xenograftceller invasion från den övre kammaren ökade som svar på samodlade humana benmärgs immunceller. Intressant nog var närvaron av 2% serum i bottenkammaren med de humana benmärgs immuncellerna avgörande för patienthärledd xenotransplantatinvasion.Brunnar kan beläggas med en extracellulär matris för att efterlikna basalmembranbarriären. Terapeutiska medel kan tillsättas till media i brunnarna för att övervaka deras effekt på invasionen.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Capture and Release of Viable Circulating Tumor Cells from Blood

Fånga och Release av livsdugliga cirkulerande tumörceller från blod

We demonstrate a method for size based capture of viable circulating tumor cell (CTC) from whole blood, along with the release of these cells from chip ...

Invasive Behavior of Human Breast Cancer Cells in Embryonic Zebrafish

Invasiv Beteende av humana bröstcancerceller i embryonal zebrafisk

In many cases, cancer patients do not die of a primary tumor, but rather because of metastasis. Although numerous rodent models are available for studying ...

Four-color Fluorescence Immunohistochemistry of T-cell Subpopulations in Archival Formalin-fixed, Paraffin-embedded Human Oropharyngeal Squamous Cell Carcinoma Samples

Fyra färgfluorescensimmunohistokemi av T-cell-subpopuleringar i Archival Formalin-fixade, paraffin-inbäddade humana orofaryngeala Squamous Cell Carcinomprover

The four-color fluorescence immunohistochemistry (IHC) technique is a method to quantify cell populations of interest while taking into account their ...

Preparation and Metabolic Assay of 3-dimensional Spheroid Co-cultures of Pancreatic Cancer Cells and Fibroblasts

Förberedelse och metabola haltbestämning av 3-dimensionell sfäroid samtidig kulturer av pankreascancer celler och fibroblaster

Many cancer types, including pancreatic cancer, have a dense fibrotic stroma that plays an important role in tumor progression and invasion. Activated ...

Serum and Plasma Copy Number Detection Using Real-time PCR

Serum och Plasma kopia nummer detektering med realtids-PCR

Serum and plasma cell free DNA (cfDNA) has been shown as an informative, non-invasive source of biomarkers for cancer diagnosis, prognosis, monitoring, ...

Real Time Detection of In Vitro Tumor Cell Apoptosis Induced by CD8+ T Cells to Study Immune Suppressive Functions of Tumor-infiltrating Myeloid Cells

Real Time Detection of In Vitro Tumor Cell Apoptosis Induced by CD8+ T Cells to Study Immune Suppressive Functions of Tumor-infiltrating Myeloid Cells

Realtid upptäcka i Vitro tumör Cell apoptos induceras av CD8+ T celler att studera suppressiv immunförsvaret av tumör-infiltrera myeloida celler

Potentiation of the tumor-killing ability of CD8+ T cells in tumors, along with their efficient tumor infiltration, is a key element of successful ...

Real-Time Monitoring of Human Glioma Cell Migration on Dorsal Root Ganglion Axon-Oligodendrocyte Co-Cultures

Real tidsövervakning av humana Glioma cell migration på dorsala root ganglion Axon-Oligodendrocyte Co-kulturer

Glioblastoma is one of the most aggressive human cancers due to extensive cellular heterogeneity and the migration properties of hGCs. In order to better ...

Time-Lapse 2D Imaging of Phagocytic Activity in M1 Macrophage-4T1 Mouse Mammary Carcinoma Cells in Co-cultures

Time-lapse 2D-avbildning av fagocytos aktivitet i M1 Makrofage-4T1 mus bröstcancerceller i Co-kulturer

Tumor-associated macrophages (TAMs) have been identified as an important component for tumor growth, invasion, metastasis, and resistance to cancer ...

Combined Use of Tail Vein Metastasis Assays and Real-Time In Vivo Imaging to Quantify Breast Cancer Metastatic Colonization and Burden in the Lungs

Kombinerad användning av Stjärtvenmetastaser-analyser och real tids in vivo-avbildning för att kvantifiera bröst cancer metastaserande kolonisering och börda i lungorna

Metastasis is the main cause of cancer-related deaths and there are limited therapeutic options for patients with metastatic disease. The identification ...

Impedance-based Real-time Measurement of Cancer Cell Migration and Invasion

Impedansbaserad realtidsmätning av cancercellmigration och invasion

Cancer arises due to uncontrolled proliferation of cells initiated by genetic instability, mutations, and environmental and other stress factors. These ...