Name: real-time detection and capture of invasive cell subpopulations from co-cultures
Uploaded: 2022-03-30T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Real-Time Detection and Capture of Invasive Cell Subpopulations from Co-Cultures at JoVE.com

Utah Üniversitesi Huntsman Kanser Enstitüsü'nden Dr. Alana Welms'e hasta kaynaklı ksenogreftleri (HCI-010) bize sağladığı için teşekkür ederiz. Bu çalışma, NIH hibeleri R01CA205632, R21CA226542 ve kısmen Agilent Technologies'den bir hibe ile desteklenmiştir.

Çalışma, Georgetown Üniversitesi Kurumsal İnceleme Kurulu tarafından gözden geçirilmiş ve "muaf" olarak kabul edilmiştir (IRB # 2002-022). Taze hasat edilmiş kemik iliği dokuları, tanımlanmamış olan atılmış sağlıklı insan kemik iliği toplama filtrelerinden toplandı.
1. Yeni oda tasarımı (Şekil 2)
<ol><li>Yeni bir çift odacıklı hücre analizörü plakası açın. Üst odayı elektrotlarla bir kenara ...

<ol>
	<li>Friedl, P., Gilmour, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collective+cell+migration+in+morphogenesis,+regeneration+and+cancer.">Collective cell migration in morphogenesis, regeneration and cancer.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10 (7), 445-457 (2009).</li><li>Boyden, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chemotactic+effect+of+mixtures+of+antibody+and+antigen+on+polymorphonuclear+leucocytes.">The chemotactic effect of mixtures of antibody and antigen on polymorphonuclear leucocytes.</a> The Journal of Experimental Medicine. 115 (3), 453-466 (1962).</li><li>Xu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+review+of+impedance+measurements+of+whole+cells.">A review of impedance measurements of whole cells.</a> Biosensors &amp; Bioelectronics. 77, 824-836 (2016).</li><li>Stylianou, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+single-chain+antibody+targeting+of+the+ligand-binding+domain+in+the+anaplastic+lymphoma+kinase+receptor.">Effect of single-chain antibody targeting of the ligand-binding domain in the anaplastic lymphoma kinase receptor.</a> Oncogene. 28 (37), 3296-3306 (2009).</li><li>Abassi, Y. A., Wang, X., Xu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real+time+electronic+cell+sensing+system+and+applications+for+cytotoxcity+profiling+and+compound+assays.">Real time electronic cell sensing system and applications for cytotoxcity profiling and compound assays.</a> United States Patent. , 1-88 (2013).</li><li>Abassi, Y. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-free,+real-time+monitoring+of+IgE-mediated+mast+cell+activation+on+microelectronic+cell+sensor+arrays.">Label-free, real-time monitoring of IgE-mediated mast cell activation on microelectronic cell sensor arrays.</a> Journal of Immunological Methods. 292 (1-2), 195-205 (2004).</li><li>Morton, C. L., Houghton, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+human+tumor+xenografts+in+immunodeficient+mice.">Establishment of human tumor xenografts in immunodeficient mice.</a> Nature Protocols. 2 (2), 247-250 (2007).</li><li>DeRose, Y. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+grafts+derived+from+women+with+breast+cancer+authentically+reflect+tumor+pathology,+growth,+metastasis+and+disease+outcomes.">Tumor grafts derived from women with breast cancer authentically reflect tumor pathology, growth, metastasis and disease outcomes.</a> Nature Medicine. 17 (11), 1514-1520 (2011).</li><li>Sharif, G. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+AIB1+isoform+alters+enhancer+access+and+enables+progression+of+early-stage+triple-negative+breast+cancer.">An AIB1 isoform alters enhancer access and enables progression of early-stage triple-negative breast cancer.</a> Cancer Research. 81 (16), 4230-4241 (2021).</li><li>Caileau, R., Olive, M., Cruciger, Q. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+human+breast+carcinoma+cell+lines+of+metastatic+origin:+preliminary+characterization.">Long-term human breast carcinoma cell lines of metastatic origin: preliminary characterization.</a> In Vitro. 14 (11), 911-915 (1978).</li><li>Sharif, G. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+growth+density+modulates+cancer+cell+vascular+invasion+via+Hippo+pathway+activity+and+CXCR2+signaling.">Cell growth density modulates cancer cell vascular invasion via Hippo pathway activity and CXCR2 signaling.</a> Oncogene. 34 (48), 5879-5889 (2015).</li><li>Miller, F. R., Santner, S. J., Tait, L., Dawson, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MCF10DCIS.com+xenograft+model+of+human+comedo+ductal+carcinoma+in+situ.">MCF10DCIS.com xenograft model of human comedo ductal carcinoma in situ.</a> Journal of the National Cancer Institute. 92 (14), 1185-1186 (2000).</li><li>Winkler, J., Abisoye-Ogunniyan, A., Metcalf, K. J., zenaa, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concepts+of+extracellular+matrix+remodelling+in+tumour+progression+and+metastasis.">Concepts of extracellular matrix remodelling in tumour progression and metastasis.</a> Nature Communications. 11 (1), 1-19 (2020).</li><li>Nkosi, D., Sun, L., Duke, L. C., Meckes, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epstein-Barr+virus+LMP1+manipulates+the+content+and+functions+of+extracellular+vesicles+to+enhance+metastatic+potential+of+recipient+cells.">Epstein-Barr virus LMP1 manipulates the content and functions of extracellular vesicles to enhance metastatic potential of recipient cells.</a> PLoS Pathogens. 16 (12), 1009023 (2020).</li><li>Eisenberg, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanistic+modeling+of+the+effects+of+myoferlin+on+tumor+cell+invasion.">Mechanistic modeling of the effects of myoferlin on tumor cell invasion.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (50), 20078-20083 (2011).</li></ol>

Çift odacıklı bir dizinin tasarımını, stromal hücrelerin varlığında hücre invazyonunu gerçek zamanlı olarak izlemek için üçüncü bir oda içerecek şekilde değiştirdik. Ko-kültürlü fibroblastların invaziv ve non-invaziv kanser hücreleri üzerindeki farklı etkilerini gözlemledik, bu da dizinin ko-kültürlü stromal hücreler tarafından üretilen faktörlere farklı yanıt veren kanser hücresi alt popülasyonları arasında ayrım yapmak için kullanılabileceğini gösteriyor. Dizi ayrıca, de...

Hücre invazyonu, stromal hücreler tarafından sağlanan çevresel ipuçlarına yanıt olarak hücrelerin bazal membran bariyerlerini geçmesini sağlayan önemli bir süreçtir. Lokal lezyonlardan invaziv ve metastatik kanserlere ilerleyebilen immün yanıtlar, yara iyileşmesi, doku onarımı ve maligniteler için gelişimin çeşitli aşamalarında çok önemli bir adımdır1. Hücre popülasyonlarının invaziv potansiyelini ölçmek için erken geliştirilen tahliller tipik olarak tek bir son nokta ölçümü oluşturur veya invaziv hücrelerin önceden etiketlenmesini gerektirir2. Mikroelektronik ve mikroakışkan tekniklerinin entegrasyonu, mikroelektrotlar üzerindeki canlı hücrelerin elektrik empedansını kullanarak hücre biyolojisinin canlılık, hareket ve bağlanma gibi farklı yönlerini tespit etmek için geliştirilmiştir 3,4. Empedans ölçümü, hücre durumunun etiketsiz, invaziv olmayan ve kantitatif bir değerlendirmesine izin verir3. Burada, Abassi ve ark.5 tarafından geliştirilen Gerçek Zamanlı Hücresel Analiz (RTCA) sisteminin tasarımına dayanan üç odacıklı bir dizgeyi tanımlıyoruz. Üç odacıklı dizi, ek analizler veya genişleme için hücresel invazyon ve invaziv hücrelerin geri kazanımı üzerine ko-kültürlü hücrelerin değerlendirilmesine izin verir.
Hücre analizörü sisteminde, hücreler gözenekli bir zar üzerine kaplanmış hücre dışı bir matristen istila eder ve bariyerin karşı tarafına yerleştirilmiş interdijitasyonlu bir elektrot dizisine ulaşır. İnvaziv hücreler zamanla bu elektrot dizisini bağlamaya ve işgal etmeye devam ettikçe, elektriksel empedans paralel olarak değişir. Mevcut sistem, iki odacıklı bir hücre invazyonu ve göçü (CIM) 16 kuyucuklu plakadan oluşmaktadır. RTCA-DP (çift amaçlı) (bundan böyle çift amaçlı hücre analizörü olarak adlandırılacaktır) cihazı, empedans ölçümü için sensörler ve empedans verilerini analiz etmek ve işlemek için entegre yazılım içerir. Başlangıçtaki empedans değerleri, kuyucuklardaki ortamın iyonik gücüne bağlıdır ve hücreler elektrotlara bağlandıkça değişir. Empedans değişiklikleri, hücre sayısına, morfolojilerine ve hücrelerin elektrotlara ne ölçüde bağlandığına bağlıdır. Hücreler eklenmeden önce kuyucukların medya ile ölçülmesi, arka plan sinyali olarak kabul edilir. Arka plan, elektrotlara bağlanan ve yayılan hücrelerle dengeye ulaştıktan sonra empedans ölçümlerinden çıkarılır. Hücre İndeksi (CI) olarak adlandırılan bir elektrot üzerindeki hücrelerin durumunun birimsiz bir parametresi aşağıdaki gibi hesaplanır: CI = (dengeden sonra empedans - hücrelerin yokluğunda empedans) / nominal empedans değeri6. Farklı hücre çizgilerinin geçiş oranları karşılaştırıldığında, Delta CI, ilk birkaç ölçümde temsil edilen bağlanma farkından bağımsız olarak hücre durumunu karşılaştırmak için kullanılabilir.
Yeni tasarlanan üç odacıklı dizi, mevcut tasarıma dayanır ve elektrotları içeren çift amaçlı hücre analizörü sisteminin üst odacığını kullanır. Modifiye edilmiş orta ve alt odalar, entegre yazılım kullanılarak empedans ölçümü ve analizi için montajın çift amaçlı hücre analizörüne sığdırılması için uyarlanmıştır. Yeni tasarımın mevcut çift odacıklı CIM-plakası (bundan böyle hücre analizörü plakası olarak adlandırılacaktır) üzerinde sağladığı iki önemli gelişme şunlardır: i) heterojen hücre karışımlarında bulunan invaziv hücre alt popülasyonlarını kurtarma ve daha sonra analiz etme yeteneği ve ii) ko-kültürlü stromal veya bağışıklık hücrelerinden salgılanan faktörlerin hücre invazyonu üzerindeki etkisini değerlendirme seçeneği (Şekil 1).
Bu teknoloji, farklı invaziv kapasitelere sahip hücrelerin alt popülasyonlarını incelemede yararlı olabilir. Bu, (a) çevre dokuları veya kan ve lenfatik damarları istila eden veya uzak organlardaki metastatik tohumlama bölgelerinde ekstravazasyon yapan invaziv kanser hücrelerini, (b) patojenleri veya hastalıklı hücreleri ele almak için dokuları istila eden bağışıklık sisteminden hücreleri, (c) doku yeniden yapılanması veya yara iyileşmesi sırasında yeni kan damarları oluşturmak için dokuları istila eden endotel hücrelerini, ayrıca (d) kanser hücrelerini destekleyen ve istila eden tümör mikro ortamından stromal hücreler. Bu yaklaşım, hücre motilitesini ve invazyonunu modüle edebilen stromal çapraz konuşmanın dahil edilmesine izin verir. Burada gösterilen fizibilite çalışmaları, kanser hücresi invazyonuna ve kanser hücrelerinden gelen diferansiyel sinyallere yanıt olarak endotel invazyonu da dahil olmak üzere stroma ile etkileşime odaklanan bu modifiye diziyi model bir sistem olarak kullanmaktadır. Yaklaşım, kanser hücrelerini ve bağışıklık hücrelerinin alt popülasyonları, fibroblastlar veya endotel hücreleri gibi diğer hücre tiplerini izole etmek için tahmin edilebilir. İnvaziv ve non-invaziv yerleşmiş meme kanseri hücre hatlarını ilkenin bir kanıtı olarak test ettik. Ayrıca, klinik tanı ortamlarında da gelecekteki kullanım için fizibilite göstermek için insan kemik iliğinden bağışıklık hücrelerine yanıt olarak hasta kaynaklı ksenogreft (PDX) invazyonundan elde edilen hücreleri kullandık. PDX, orijinal hasta için büyüme, progresyon ve tedavi seçeneklerinin incelenmesine izin vermek için bağışıklık sistemi baskılanmış veya insanlaştırılmış fareler modeline implante edilen hasta tümör dokularıdır 7,8.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.05% Trypsin-EDTA</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>25300-054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adhesive</td>
			<td>Norland Optical Adhesive</td>
			<td>NOA63</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell lifter</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.1832</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholera Toxin from Vibrio cholerae</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>12585-014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CIM-plate</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5665817001</td>
			<td>Cell analyzer plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase from Clostridium histolyticum</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C0130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase</td>
			<td>StemCell</td>
			<td>7913</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>11995-065</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM-F12</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>11875-093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS), Heat Inactivated</td>
			<td>Omega Scientific</td>
			<td>FB-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>15630106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse serum (HS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>16050-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human EGF</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>AF-100-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human umbilical Vein endothelail cells (HUVEC)</td>
			<td>LONZA (RRID:CVCL_2959)</td>
			<td>C-2517A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HUVEC media</td>
			<td>LONZA</td>
			<td>CC-3162</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrocortisone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H4001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin Transferrin Selenium Ethanolamine (ITSX) (100x)</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>51500056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin, Human Recombinant, Zinc Solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C8052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>J2 Fibroblasts</td>
			<td>Stemcell (RRID:CVCL_W667)</td>
			<td>100-0353</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LymphoPrep</td>
			<td>Stemcell</td>
			<td>7851</td>
			<td>Density gradient medium for the isolation of mononuclear cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354230</td>
			<td>Basement membrane matrix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MCFDCIS.com cells ( DCIS)</td>
			<td>RRID:CVCL_5552</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MDA-MB-231 cells</td>
			<td>RRID:CVCL_0062</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Milling machine</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Bridgeport Series 1 Vertical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline (1x)</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>10010049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethersulfone (PES) membrane</td>
			<td>Sterlitech</td>
			<td>PCTF029030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RBC lysis solution</td>
			<td>Stemcell</td>
			<td>7800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy Micro Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RTCA DP analyzer</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>3X16</td>
			<td>Dual purpose cell analyzer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T4799</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

real-time detection and capture of invasive cell subpopulations from co-cultures

Kanser hücrelerinin invazyonu ve metastatik yayılımı kanserden ölümün başlıca nedenidir. Kanser hücresi popülasyonlarının invaziv potansiyelini ölçmek için erken geliştirilen testler, tipik olarak, farklı invaziv potansiyele sahip kanser hücresi alt popülasyonları arasında ayrım yapmayan tek bir son nokta ölçümü oluşturur. Ayrıca, tümör mikroçevresi, kanser hücrelerinin invaziv davranışını değiştiren ve bunlara katılan farklı yerleşik stromal ve bağışıklık hücrelerinden oluşur. Dokulara invazyon, bağışıklık hücresi alt popülasyonlarının mikroorganizmaları savuşturmada veya doku yeniden şekillenmesi ve anjiyogenez sırasında parankim ve endotel hücrelerinden hastalıklı hücreleri ortadan kaldırmada da rol oynar. Hücre invazyonunu izlemek için empedans biyosensörlerini kullanan Gerçek Zamanlı Hücresel Analiz (RTCA), invazyonun son nokta ölçümünün ötesinde ileriye doğru atılmış büyük bir adımdı: bu, zaman içinde sürekli ölçümler sağlar ve böylece son nokta analizinde kaybolan istila oranlarındaki farklılıkları ortaya çıkarabilir. Mevcut RTCA teknolojisini kullanarak, stromal ve / veya bağışıklık hücreleri içerebilen ve zaman içinde ko-kültürlü stromal veya bağışıklık hücrelerinden salgılanan faktörlerin etkisi altında invazyon oranını ölçmeye izin veren başka bir oda ekleyerek çift odacıklı dizileri genişlettik. Bunun ötesinde, benzersiz tasarım, odaların herhangi bir zamanda ayrılmasına ve en invaziv kanser hücresinin veya test edilen tümör izolatlarının heterojen karışımlarında bulunan diğer hücre alt popülasyonlarının izole edilmesine izin verir. Bu en invaziv kanser hücreleri ve diğer hücre alt popülasyonları, metastatik hastalığa malign ilerlemeyi tetikler ve moleküler özellikleri, derinlemesine mekanik çalışmalar, tespitleri için tanısal probların geliştirilmesi ve kırılganlıkların değerlendirilmesi için önemlidir. Bu nedenle, küçük veya büyük moleküllü ilaçların dahil edilmesi, invaziv davranışı inhibe etmek (örneğin, kanser hücreleri) veya arttırmak (örneğin, bağışıklık hücreleri) amacıyla kanser ve / veya stromal hücre alt popülasyonlarını hedef alan tedavilerin potansiyelini test etmek için kullanılabilir.

Yeni tasarlanan üç odacıklı dizi kullanılarak, hücrelerin istilası, fibroblastlar gibi stromal hücrelerin varlığında veya yokluğunda test edildi. MDA-MB-231 hücre invazyonu, ışınlanmış İsviçre 3T3 fibroblastları (J2 suşu) alt odaya tohumlandığında artmış ve iki hücre hattı arasındaki faktörlerin değişimine izin vermiştir. İlginç bir şekilde, MDA-MB-231 invazyonu, 3T3-J2 hücrelerinin sayısı iki katına çıkarıldığında artmıştır (Şekil 3A). Öte...

Watch this Scientific Journal Video about Real-Time Detection and Capture of Invasive Cell Subpopulations from Co-Cultures at JoVE.com

Real-Time Detection and Capture of Invasive Cell Subpopulations from Co-Cultures

İnvaziv hücre alt popülasyonlarını gerçek zamanlı olarak tespit etmek ve yakalamak için bir yaklaşım açıklıyoruz. Deneysel tasarım, hücrelerin elektrik empedansındaki değişiklikleri izleyerek Gerçek Zamanlı Hücresel Analiz kullanır. Kompleks dokulardaki invaziv kanser, immün, endotel veya stromal hücreler yakalanabilir ve ko-kültürlerin etkisi değerlendirilebilir.

Ko-kültürlerden İnvaziv Hücre Alt Popülasyonlarının Gerçek Zamanlı Tespiti ve Yakalanması

Invasion and metastatic spread of cancer cells are the major cause of death from cancer. Assays developed early on to measure the invasive potential of ...

Bu teknik, ko-kültürlü stromal hücrelerden salgılanan faktörlerin etkisi altında farklı invaziv kapasitelere sahip hücrelerin tanımlanmasını sağlar. Teknik, ko-kültürlü stromal veya immün hücrelerden salgılanan faktörlerin hücre invazyonu üzerindeki etkisini değerlendirir. Ayrıca, heterojen hücre karışımlarında bulunan invaziv hücre alt popülasyonlarının geri kazanılmasına ve analizine izin verir.Bu teknik, hangi tümörlerin metastaza yol açan invaziv hücre alt popülasyonlarını barındırdığını belirleyebilir. İnvaziv kanser hücrelerinin yakalanması ve analizi tedavi kararlarını bilgilendirebilir. Hücre kültürüne başlamak için, yaklaşık% 70 oranında akıcılığa sahip yapışkan hücre kültürlerini 1X fosfat tamponlu salin ile yıkayın.Daha sonra hücreleri kaldırmak için% 0.05 tripsin ve EDTA çözeltisi ekleyin. Tripsin çözeltisini serum içeren hücre kültürü ortamı ile nötralize edin ve hücre süspansiyonunun bir aliquot'unu kullanarak hücreleri sayın. Üç steril odacığı da doku kültürü başlığına yerleştirin.Düğmeyi alt odanın kısa tarafına yerleştirin ve alt odayı topuz deneyciye bakacak şekilde yönlendirin. Herhangi bir kabarcık oluşturmadan alt odadan her bir kuyucuğa 90 mikrolitre ortamda 30.000 ila 50.000 hücre ekleyin. Fetal sığır serumu takviyeli ortamın %5'ini hücre hareketliliği için pozitif kontrol olarak iki alt odacıkta kullanın ve negatif kontrol olarak %0 serum takviyeli ortam kullanın.Kaputta 10 ila 15 dakika beklettikten sonra alt odayı 90 derecede döndürün. Ardından orta odayı üste yerleştirin, böylece alt odadaki düğme orta odadaki çentiğin içine kayar. Montajın uzun kenarlarının her birinden bir tıklama duyulana kadar odacığı dikey olarak aşağı doğru itin.Orta odanın tüm kuyularına 160 mikrolitre serumsuz ortam ekleyin. Kuyular doldurulduktan sonra kubbe şeklinde bir menisküsün görülebildiğinden emin olun ve orta ve üst bölmelerdeki mavi noktaları hizalamak için üst odayı elektrotlarla orta odaya yerleştirin. Montajın uzun taraflarının her birinden bir tıklama sesi duyulana kadar odayı dikey olarak aşağı doğru itin.Üst odaya 20 ila 50 mikrolitre serumsuz ortam ekleyin. Düzeneği doku kültürü inkübatöründeki çift amaçlı hücre analizörüne monte edin ve arka planı ölçmeden önce 30 dakika bekleyin. Hücre analizörü yazılımını açın, ardından kullanılacak beşiği seçin, ardından mesaj sekmesine tıklayın ve dizinin beşiğe iyi yerleştirildiğinden ve elektrotların sensörlerle iyi hizalandığından emin olmak için Bağlantılar tamam" yazdığından emin olun.Deneme notları sekmesini tıklayın ve denemeyle ilgili olası tüm bilgileri doldurun. Ardından düzen sekmesine tıklayın ve dizi düzeninin açıklamasını doldurun. Ardından zamanlama sekmesine tıklayın ve adımlar menüsünden iki adım, bir süpürme ile bir arka plan adımı ve 100 süpürme ile bir test adımı ekleyin.Dizi, 30 dakika boyunca çift amaçlı hücre analizörü inkübatöründe kaldıktan sonra, arka plan ölçümünü başlatmak için oynat düğmesine tıklayın. Arka plan ölçümü yapıldıktan sonra, diziyi beşikten çıkarın ve hücre kültürü başlığına geri yerleştirin. Ardından, üst odanın her bir kuyucuğuna 100 mikrolitre serumsuz ortamda 30.000 ila 50.000 hücre ekleyin.Bunlar, elektrotun membrandan başarıyla göç ettikten sonra tespit edeceği hücrelerdir. Empedans ölçümü için çift amaçlı hücre analizörüne monte etmeden önce tertibatı 30 dakika boyunca kaputta bekletin. Diziyi tekrar çift amaçlı hücre analizörüne yerleştirin ve Bağlantılar tamam" mesajı için mesaj sekmesini kontrol edin.Empedans ölçümünü başlatmak için oynat düğmesine tıklayın ve ardından sinyalin ilerlemesini izlemek için grafik sekmesine tıklayın. Uç noktaya 25 saatten önce ulaşılırsa, yürüt açılır menüsünden iptal adımına tıklayın. Verileri dışa aktarmak için grafiğe sağ tıklayın, liste biçiminde kopyala'yı seçin ve ardından verileri bir elektronik tabloya yapıştırın.İlgilenilen durma noktasını belirlemek için çift amaçlı hücre analizöründe geçiş oranını gerçek zamanlı olarak izleyin. Başarıldığında, tertibatı çift amaçlı hücre analizöründen çıkarın ve doku kültürü başlığına yerleştirin. Hücreleri ilgilenilen kuyucuklardan toplamak için uygun sayıda 1,5 mililitre mikrosantrifüj tüpü hazırlayın.Odalar ayrıldığında sıvı içermesi için tertibatı 10 santimetrelik bir kaba yerleştirin. Bir tıklama sesi duyulana kadar orta odanın uzun tarafındaki esnek yapışma uçlarını içeri doğru itin, ardından üst odayı sökün ve 10 santimetrelik yeni bir kaba çevirin. Aynı deneysel durumu barındıran tüm kuyulardan hücreleri toplamak için 13 milimetrelik bir bıçağa sahip bir hücre kaldırıcı kullanın.Hücreleri 1,5 mililitrelik mikrosantrifüj tüplerinde toplamak için bıçağı 1X fosfat tamponlu salin içinde durulayın veya daldırın. Daha sonra hücreleri beş dakika boyunca 500 kez G'de döndürün ve toplanan bu hücreleri çoğaltın veya tek hücreli RNA dizilimi gibi son nokta analizi yapın. Stromal hücrelerin varlığında veya yokluğunda hücrelerin invazyonunun değerlendirilmesi, MDA-MB-231 hücre invazyonunun, iki hücre hattı arasındaki faktörlerin değişimi için alt odaya ışınlanmış İsviçre-3T3 fibroblastları J2 suşu yerleştirildiğinde arttığını göstermiştir.İlginç bir şekilde, MDA-MB-231 istilası, 3T3 J2 hücrelerinin sayısı iki katına çıktığında artmıştır. Öte yandan, MCFDCIS hücrelerinin invaziv bir klonu olan DCIS-Delta Four'un istila hızı, 3T3 J2 hücreleri ile çapraz konuşma tarafından inhibe edilmiş gibi görünmektedir, bu da stromanın değişen etkilerini ölçmek için üç odacıklı dizinin değerli bir şekilde uygulanmasını düşündürmektedir. Bu durumda, hücre invazyonu üzerinde fibroblastlar.İnsan göbek damarı endotel hücreleri, MDA-MB-231 hücreleri tarafından salgılanan faktörlere yanıt olarak, DCIS hücreleri tarafından salgılananların aksine, invaziv tümörlerin kan damarı oluşumu için endotel hücrelerini işe alma ve daha sonra dolaşıma yayılma kabiliyeti ile tutarlı olarak daha invazivdi. Üst odacıktan hasta kaynaklı ksenogreft hücre invazyonu, ko-kültürlü insan kemik iliği bağışıklık hücrelerine yanıt olarak artmıştır. İlginçtir ki, insan kemik iliği immün hücreleri ile alt odacıkta% 2 serum varlığı, hasta kaynaklı ksenogreft invazyonu için gerekliydi.Kuyular, bazal membran bariyerini taklit etmek için hücre dışı bir matrisle kaplanabilir. İnvazyon üzerindeki etkilerini izlemek için kuyucuklardaki ortama terapötik ajanlar eklenebilir.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Capture and Release of Viable Circulating Tumor Cells from Blood

Yakalama ve Kan gelen Canlı Sirkülasyon Tümör Hücrelerinin Yayın

We demonstrate a method for size based capture of viable circulating tumor cell (CTC) from whole blood, along with the release of these cells from chip ...

Invasive Behavior of Human Breast Cancer Cells in Embryonic Zebrafish

Embriyonik Zebra balığı İnsan Kanser Hücrelerinin İnvazif Davranış

In many cases, cancer patients do not die of a primary tumor, but rather because of metastasis. Although numerous rodent models are available for studying ...

Four-color Fluorescence Immunohistochemistry of T-cell Subpopulations in Archival Formalin-fixed, Paraffin-embedded Human Oropharyngeal Squamous Cell Carcinoma Samples

Arşiv Formalin Sabitlenmiş, Parafin Gömülü İnsan Orofaringeal Skuamöz Hücreli Karsinoma Örneklerinde T-hücresi Subpopülasyonlarının Dört Renkli Floresan İmmunohistokimyası

The four-color fluorescence immunohistochemistry (IHC) technique is a method to quantify cell populations of interest while taking into account their ...

Preparation and Metabolic Assay of 3-dimensional Spheroid Co-cultures of Pancreatic Cancer Cells and Fibroblasts

Hazırlık ve pankreas kanseri hücreleri ve fibroblastlar 3 boyutlu küresel ortak kültürlerin metabolik tahlil

Many cancer types, including pancreatic cancer, have a dense fibrotic stroma that plays an important role in tumor progression and invasion. Activated ...

Serum and Plasma Copy Number Detection Using Real-time PCR

Serum ve plazma kopya sayı algılama gerçek zamanlı PCR kullanarak

Serum and plasma cell free DNA (cfDNA) has been shown as an informative, non-invasive source of biomarkers for cancer diagnosis, prognosis, monitoring, ...

Real Time Detection of In Vitro Tumor Cell Apoptosis Induced by CD8+ T Cells to Study Immune Suppressive Functions of Tumor-infiltrating Myeloid Cells

Real Time Detection of In Vitro Tumor Cell Apoptosis Induced by CD8+ T Cells to Study Immune Suppressive Functions of Tumor-infiltrating Myeloid Cells

Gerçek zamanlı hafiye-in Vitro tümör hücre Apoptosis içinde CD8 tarafından indüklenen+ T hücreleri Myeloid hücrelerin tümör infiltre bağışıklık baskılayıcı işlevlerini çalışmaya

Potentiation of the tumor-killing ability of CD8+ T cells in tumors, along with their efficient tumor infiltration, is a key element of successful ...

Real-Time Monitoring of Human Glioma Cell Migration on Dorsal Root Ganglion Axon-Oligodendrocyte Co-Cultures

Dorsal Kök Ganglion Akson-Oligodendrocyte Co-Kültürler İnsan Glioma Hücre Göç Gerçek Zamanlı İzleme

Glioblastoma is one of the most aggressive human cancers due to extensive cellular heterogeneity and the migration properties of hGCs. In order to better ...

Time-Lapse 2D Imaging of Phagocytic Activity in M1 Macrophage-4T1 Mouse Mammary Carcinoma Cells in Co-cultures

Eş-Kültürlerde M1 Makrofaj-4T1 Fare Mammary Karsinom Hücrelerinde Fagositik Aktivitenin Zaman Atlamalı 2D Görüntülemesi

Tumor-associated macrophages (TAMs) have been identified as an important component for tumor growth, invasion, metastasis, and resistance to cancer ...

Combined Use of Tail Vein Metastasis Assays and Real-Time In Vivo Imaging to Quantify Breast Cancer Metastatic Colonization and Burden in the Lungs

Kuyruk Ven Metastaz Tahlilleri ve Gerçek Zamanlı Vivo Görüntüleme Kombine Kullanımı Meme Kanseri Metastatik Kolonizasyon ve Yük Akciğerlerde Quantify için

Metastasis is the main cause of cancer-related deaths and there are limited therapeutic options for patients with metastatic disease. The identification ...

Impedance-based Real-time Measurement of Cancer Cell Migration and Invasion

Empedans tabanlı Gerçek Zamanlı Kanser Hücre Göçü ve İstilası Ölçümü

Cancer arises due to uncontrolled proliferation of cells initiated by genetic instability, mutations, and environmental and other stress factors. These ...