Name: electrophysiological methods for measuring photopigment levels in drosophila photoreceptors
Uploaded: 2022-06-02T12:40:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Electrophysiological Methods for Measuring Photopigment Levels in Drosophila Photoreceptors at JoVE.com

이 연구는 이스라엘 과학 재단 (ISF)과 미국 - 이스라엘 이중 국가 과학 재단 (BSF)의 보조금으로 지원되었습니다. 왁스 필라멘트 히터 건설에 대해 Anatoly Shapochnikov 씨에게 감사드립니다.

1. 일렉트로레티노그램을 사용하여 강도 반응 관계, 장기간의 탈분극 후전위(PDA) 및 초기 수용체 전위(ERP) 측정
<ol><li>D. 멜라노가스터 준비에 적합한 양육 조건<ol>
<li>D. melanogaster 는 24 °C의 온도와 12 시간의 어두운/밝은 주기로 유지되는 인큐베이터에서 음식이 들어있는 표준 노란색 옥수수가 들어있는 병에서 날아갑니다.</li>
		<li>실험 전에 적어도 24 시간 전에 비행 병...

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	<li>Vogt, K., Kirschfeld, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+identity+of+the+chromophores+of+fly+visual+pigment.">Chemical identity of the chromophores of fly visual pigment.</a> Naturwissenschaften. 77, 211-213 (1984).</li><li>Hillman, P., Hochstein, S., Minke, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transduction+in+invertebrate+photoreceptors:+role+of+pigment+bistability.">Transduction in invertebrate photoreceptors: role of pigment bistability.</a> Physiological Reviews. 63 (2), 668 (1983).</li><li>Hamdorf, K., Autrum, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Handbook of Sensory Physiology. 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K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arrestin+translocation+is+stoichiometric+to+rhodopsin+isomerization+and+accelerated+by+phototransduction+in+Drosophila+photoreceptors.">Arrestin translocation is stoichiometric to rhodopsin isomerization and accelerated by phototransduction in Drosophila photoreceptors.</a> Neuron. 67 (6), 997-1008 (2010).</li><li>Byk, T., Bar Yaacov, M., Doza, Y. N., Minke, B., Selinger, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulatory+arrestin+cycle+secures+the+fidelity+and+maintenance+of+the+fly+photoreceptor+cell.">Regulatory arrestin cycle secures the fidelity and maintenance of the fly photoreceptor cell.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90, 1907-1911 (1993).</li><li>Dolph, P. 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G., Hardie, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metarhodopsin+control+by+arrestin,+light-filtering+screening+pigments,+and+visual+pigment+turnover+in+invertebrate+microvillar+photoreceptors.">Metarhodopsin control by arrestin, light-filtering screening pigments, and visual pigment turnover in invertebrate microvillar photoreceptors.</a> Journal of Comparative Physiology. A, Neuroethology, Sensory, Neural, and Behavioral Physiology. 197 (3), 227-241 (2011).</li><li>Stark, W. S., Zitzmann, W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+adaptation+mechanisms+and+photopigment+spectra+by+vitamin+A+deprivation.">Isolation of adaptation mechanisms and photopigment spectra by vitamin A deprivation.</a> Journal of Comparative Physiology. 105, 15-27 (1976).</li><li>Minke, B., Kirschfeld, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+contribution+of+a+sensitizing+pigment+to+the+photosensitivity+spectra+of+fly+rhodopsin+and+metarhodopsin.">The contribution of a sensitizing pigment to the photosensitivity spectra of fly rhodopsin and metarhodopsin.</a> The Journal of General Physiology. 73, 517-540 (1979).</li><li>Cone, R. A., Cobbs, W. 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C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photolysis+of+caged+Ca+2++facilitates+and+inactivates+but+does+not+directly+excite+light-sensitive+channels+in+Drosophila+photoreceptors.">Photolysis of caged Ca 2+ facilitates and inactivates but does not directly excite light-sensitive channels in Drosophila photoreceptors.</a> The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 15, 889-902 (1995).</li><li>Hardie, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-cell+recordings+of+the+light+induced+current+in+dissociated+Drosophila+photoreceptors:+evidence+for+feedback+by+calcium+permeating+the+light-sensitive+channels.">Whole-cell recordings of the light induced current in dissociated Drosophila photoreceptors: evidence for feedback by calcium permeating the light-sensitive channels.</a> Proceedings of the Royal Society of London. Series B, Containing Papers of a Biological Character. Royal Society (Great Britain). 245, 203-210 (1991).</li><li>Ranganathan, R., Harris, G. L., Stevens, C. F., Zuker, C. 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C., Minke, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrophysiological+method+for+whole-cell+voltage+clamp+recordings+from+drosophila+photoreceptors.">Electrophysiological method for whole-cell voltage clamp recordings from drosophila photoreceptors.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (124), e55627 (2017).</li><li>Selinger, Z., Minke, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inositol+lipid+cascade+of+vision+studied+in+mutant+flies.">Inositol lipid cascade of vision studied in mutant flies.</a> Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology. 53, 333-341 (1988).</li><li>Minke, B., Kirschfeld, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microspectrophotometric+evidence+for+two+photoconvertible+states+of+visual+pigments+in+the+barnacle+lateral+eye.">Microspectrophotometric evidence for two photoconvertible states of visual pigments in the barnacle lateral eye.</a> The Journal of General Physiology. 71, 37-45 (1978).</li><li>Ranganathan, R., Harris, W. A., Zuker, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+molecular+genetics+of+invertebrate+phototransduction.">The molecular genetics of invertebrate phototransduction.</a> Trends in Neurosciences. 14, 486-493 (1991).</li><li>Henderson, S. R., Reuss, H., Hardie, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+photon+responses+in+Drosophila+photoreceptors+and+their+regulation+by+Ca+2.">Single photon responses in Drosophila photoreceptors and their regulation by Ca 2.</a> The Journal of Physiology. 524, 179-194 (2000).</li><li>Dimitracos, S. A., Tsacopoulos, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+recovery+from+a+transient+inhibition+of+the+oxidative+metabolism+of+the+photoreceptors+of+the+drone+(Apis+mellifera).">The recovery from a transient inhibition of the oxidative metabolism of the photoreceptors of the drone (Apis mellifera).</a> Journal of Experimental Biology. 119, 165-181 (1985).</li><li>Agam, K., Frechter, S., Minke, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+the+Drosophila+TRP+and+TRPL+channels+requires+both+Ca+2++and+protein+dephosphorylation.">Activation of the Drosophila TRP and TRPL channels requires both Ca 2+ and protein dephosphorylation.</a> Cell Calcium. 35 (2), 87-105 (2004).</li></ol>

초파리 광수용체 제제를 사용하는 가장 큰 장점은 접근성, 광 자극의 용이성 및 정확성, 그리고 가장 중요한 것은 분자 유전학의 힘을 적용 할 수있는 능력입니다 7. 광범위한 유전 연구는 초파리를 복잡한 생물학적 과정의 유전 적 해부를위한 매우 유용한 모델 시스템으로 확립했습니다7. 초파리 게놈의 비교적 간단한 구조 (X 및 Y 성 염색체, 2 개?...

G-단백질 결합 수용체(GPCR)인 광활성화 로돕신(R)은 7개의 막횡단 단백질(opsin)과 발색단으로 구성된다. 초파리 멜라노가스터(fruit fly)에서, 광자 흡수는 11-시스-3-OH-망막 발색단의 모든 트랜스-3-OH-망막1에 대한 이성체화를 유도하여, 로돕신의 메타로돕신으로의 형태적 변화를 촉진한다(M, 도 1A). 척추동물 로돕신과는 달리, 무척추동물 발색단의 우세한 분획은 옵신으로부터 해리되지 않으며, 생리활성 암-안정한 색소 상태 M을 초래한다. 차례로, 모든 트랜스-3-OH-망막 발색단에 의한 추가적인 광자 흡수는 발색단2,3의 이성체화를 유도하여, 11-시스-3-OH-망막 발색단과 함께 R 안료 상태를 생성한다. R 상태는 어둡고, 안정하고, 생리학적으로 비활성 광안료이다. 척추동물 광색소와 마찬가지로 발색단4의 매우 빠른 광자 재생 경로 외에도, 발색단 재생을 위한 대안적인 효소적 느린 경로가 무척추동물에 존재하며, 이 경로에서 일부 단계는 광수용체 세포(5,6)를 둘러싸고 있는 망막 세포에서 수행된다.
초파리는 무척추 동물 광수용체를 연구하기위한 모델 유기체로서 큰 이점을 수반합니다. 특히, 제제의 접근성과 분자 유전학을 적용 할 수있는 능력은 초파리를 강력한 모델 시스템7로 만들었습니다. 따라서, 일반적으로 광형질도입 및 광안료 수준을 연구하기 위한 몇 가지 생체내 및 생체외 실험 방법, 특히 확립되었다. 가장 간단한 생체 내 방법은 초파리 눈의 빛에 대한 상대적으로 큰 세포 외 기록 된 전압 반응을 이용합니다. 따라서, 광 자극은 척추동물 눈의 빛에 대한 ERG 반응보다 ∼3배 더 큰 세포외 전기망막(ERG) 기록을 사용하여 측정될 수 있는 전체 눈에서 전기 전압 반응을 불러일으킨다(8,9). 초파리 ERG 반응은 견고하고 쉽게 얻을 수 있으므로 돌연변이로 인한 광 반응의 이상을 확인하는 편리한 방법입니다. 빛에 대한 ERG 반응은 주로 광수용체, 색소 (glia) 세포 및 라미나의 이차 뉴런에서 발생합니다 (그림 1B 참조). ERG의 주요 구성 요소는 (i) 광수용체의 세포외 전압 반응, (ii) 라미나 뉴런으로부터 발생하는 광 자극의 시작과 끝에서의 "on" 및 "off" 과도 상태 (도 2A, inset, ON, OFF), (iii) 신경교세포의 느린 반응 (도 2A, inset, arrows), 및 (iv) 짧고 일시적인 반응이고, ON 과도 상태10보다 앞선 광안료 활성화 동안의 전하 변위로 인한 결과(도 2C[inset], D, E). 이 짧은 반응은 2 단계 (M1 및 M2, 그림 2C [inset])로 구성되며 수백만 개의 광안료 분자를 동시에 활성화시키는 매우 강한 광 자극에 의해서만 유도 될 수 있습니다. 청색 자극 (그림 2D, 청색 흔적) 또는 광색소 수준이 고도로 감소 된 돌연변이 (그림 2E, 적색 흔적)에서는 관찰되지 않지만 PLC 활성을 폐지하는 돌연변이에서 진폭이 약간 향상됩니다 (그림 2E, 주황색 흔적). M1 상은 광수용체에서 M의 활성화로부터 발생하는 파리의 전형적인 ERP이다. 긍정적 인 극성 (세포 내)을 갖는 M1 단계는 신호 반전 시냅스에서 정상적인 방식으로 신경 전달 물질을 방출하고 시냅스 적으로 증폭 된 M2 상을 생성하여 광수용체 탈분극에 반응하는 라미나 뉴런을 활성화시킵니다. 따라서, M1 및 M2 상 모두 M 활성화(10,11)를 반영한다.
광수용체의 탈분극은 각막 양성 "온" 과도기를 생성하며, 이는 라미나10,11의 광수용체 축색돌기와 단극성 뉴런 사이의 부호 반전 시냅스로부터 발생한다(도 1B). ERG의 느린 상승 및 붕괴는 주로 일시적인 수용체 전위 (TRP) 및 TRP 유사 (TRPL) 채널 13,14,15를 통한 광수용체 세포 (12)로부터의 K+ 유출로 인해 색소 세포의 탈분극 (도 2A, 인셋, 화살표)으로부터 발생한다. 이러한 느린 운동 성분은 광(9,10)에 대한 광수용체 반응의 세포내 또는 전체 세포 기록과 비교할 때 광수용체 반응의 파형을 크게 가릴 수 있고 왜곡시킨다. 또한, 매우 강한 조명에서, "온" 과도 상태와 선행하고 부분적으로 융합되는 추가적인 과도 응답이 관찰될 수 있다(그림 2C [inset],D,E). 이 신호는 광안료(10)의 거대한 활성화로부터 직접 기인한다.
중성 밀도 (ND) 및 컬러 필터뿐만 아니라 강력한 조명 플래시를 사용하는 여러 광 정권 프로토콜이 일반적으로 눈과 특히 광전달 캐스케이드를 조사하기 위해 개발되었습니다. 이들 프로토콜은 또한 광안료의 특성을 조사하기 위해 사용되었다.
강도-응답 프로토콜은 증가하는 광도에 대해 전체 눈의 ERG 전압 응답의 피크 진폭을 측정합니다(그림 2A,B). 이 프로토콜은 광수용체 9에대한 광수용체 세포의 민감도의 변화를 검출하는데 도움을 준다.
장기간의 탈분극 후전위(PDA) 프로토콜은 로돕신과 메타로돕신의 흡수 스펙트럼의 차이를 이용하여, 초파리에서 R의 광안료를 생리활성이고 암-안정한 중간체 M 상태2로 대량으로 전환시킬 수 있게 한다. ERG 전압 응답에서, 포화 광의 비교적 짧은 펄스가 주어지고, 그 결과 전압 응답이 기록된다. 이러한 조건 하에서, 천장(반전 전위)은 엄청난 양의 로돕신 분자(~1 x 10,8)의 퍼센트의 분율의 활성화가 천장에 도달하기에 충분하기 때문에 탈분극 신호에 의해 도달된다. 광전달 성분이 매우 풍부하게 존재하면 광전달 성분의 농도가 크게 감소하거나 미묘한 오작동이있는 돌연변이에서도 천장에 도달 할 수 있습니다. 이 상황은 이러한 돌연변이체의 분리를 배제한다. Pak et al.은 시각 돌연변이체를 분리하기 위한 신뢰성 있고 공개적인 시험을 추구하는 PDA 스크리닝7을 도입하였다. 초파리에서, PDA 반응은 광안료 전환을 허용하는 적색 스크리닝 안료를 유전적으로 제거하고, 로돕신에 의해 우선적으로 흡수되는 청색광의 적용에 의해 야기되고(도 3A), 따라서, R을 M 광안료 상태로 큰 순 전환을 초래한다. 광전달 종결은 R에서 M으로의 큰 순 변환에 의해 광안료의 수준에서 붕괴되고, 이는 차례로 광이 꺼진 후 오랫동안 지속적인 여기를 초래한다 (도 2C, 도 4A [상단]). PDA 기간 동안, 광수용체는 후속 테스트 라이트에 덜 민감하고 부분적으로 탈감작된다(불활성화). PDA는 로돕신 생물발생의 사소한 결함까지도 검출하고 장기간 흥분을 유지하기 위해 광수용체 세포의 최대 용량을 시험한다. 그것은 엄격하게 로돕신의 고농도의 존재에 의존하기 때문에, 그것은 쉽게 광전달 성분의 부족 보충에 대한 점수. 놀랍게도, PDA 스크린은 많은 새롭고 매우 중요한 시각적 돌연변이체를 산출하였다 (Pak et al.7에서 검토됨). 따라서, Pak et al.7에 의해 단리된 PDA 돌연변이체는 초파리 시각 시스템을 분석하는데 여전히 매우 유용하다.
PDA는 청색광을 포화시킴으로써 초파리에서 유도되어, 광 오프셋 후 오랫동안 지속적인 탈분극을 초래한다(그림 4A [상단]). PDA 유도 청색광을 포화시킨 후, 주변 광수용체(R1-6)는 최대 용량으로 어둠 속에서 지속적으로 활성 상태를 유지하여 포화에 도달한다. PDA 동안 추가적인 포화 청색광은 수초 동안 R1-6 세포에서 어떠한 추가적인 반응도 생성하지 않지만, PDA 상에 중첩되는 R7-8 세포에서 반응을 유도한다. 중첩된 반응은 이들 세포에서 발현된 광안료의 상이한 흡수 스펙트럼에 의해 설명된다(R7-8)16. PDA는 포화 오렌지 빛으로 M을 R로 다시 광변환함으로써 억제될 수 있다(그림 4A [상단]). 강렬한 백색광에 의해 달성 될 수없는 상황 인 광수용체 세포를 최대 활성 용량으로 가져 오는 PDA의 능력은 초파리의 시각적 돌연변이를 스크리닝하는 주요 도구 인 이유를 설명합니다. 이는 정상적인 광색소 수준17,18의 생물발생에 관여하는 단백질의 사소한 결함조차도 검출할 수 있기 때문이다. PDA 결함 돌연변이체의 두 그룹이 단리되었다: 불활성화 또는 사후전위(니나) 돌연변이체 및 불활성화는 아니지만 애프터포텐셜(ina) 돌연변이체는 아니다. 전자의 표현형은 광안료 수준의 큰 감소로부터 발생하는 PDA 및 연관된 불활성화의 결여이다(도 4A[중간]). 후자의 표현형은 정상적인 로돕신 수준을 가진 돌연변이체에서 아직 알려지지 않은 메커니즘으로 인해 불활성화를 나타내지 만 TRP 채널과 상호 작용하는 단백질이 부족하기 때문에 청색광 후 어두운 탈분극을 보이지 않습니다 (그림 4A [하단]).
PDA 는 M 활성19,20,21에 결합하고 종결시키는 레스틴(ARR2)에 비해 광안료의 양의 차이로부터 발생한다(도 1A). 초파리 광수용체에서, 광안료의 양은 ARR219의 양보다 약 5배 더 크다. 따라서, ARR2 수준은 R에서 M으로의 큰 순 광변환에 의해 생성된 모든 M 분자를 불활성화시키기에 불충분하고, 과량의 M이 어둠 속에서 지속적으로 활성화되도록 남겨둔다 17,19,20,22,23. 이 메카니즘은 돌연변이 또는 카로티노이드 박탈24,25에 의한 PDA 반응의 제거를 설명하고, 광안료 수준의 감소를 야기하지만, arrestin 수준에는 영향을 미치지 않는다. 더욱이, 이러한 설명은 또한 널 ARR2 (arr23) 돌연변이 대립유전자21의 표현형을 설명하는데, 여기서 PDA는 ~10배 조광기 청색 광 강도19,20,21에서 달성될 수 있었다(도 4B,C). PDA는 파리 광수용체의 독특한 특징이 아니며, R 상태와 다른 흡수 스펙트럼을 가진 어두운 안정한 M을 갖는 모든 테스트 된 종에서 나타나므로 R에서 M 상태로 광안료의 충분한 광변환이 가능합니다. PDA 현상학이 발견된 철저하게 조사된 종은 바나클(Balanus) 광수용체이며, 여기서 R 상태의 흡수 스펙트럼은 M 상태2보다 더 긴 파장에 있다(도 3B). 따라서, 파리의 상황과는 달리, 바나클에서는 주황색-적색광이 PDA를 유도하고, 청색광은PDA2를 억제한다.
초기 수용체 전위(ERP) 프로토콜은 R 또는 M 활성화 동안 발생하는 전하 변위를 이용한다. 시각 안료는 척추동물 및 무척추동물 막(3) 둘 다의 신호전달 구획의 표면막의 필수적인 부분이다. 따라서, 광안료 분자가 하나의 중간 상태에서 다음 상태로 변하는 활성화 과정은 전하 변위(4,26)를 수반한다. 광안료 분자가 막 커패시턴스(4)와 병렬로 전기적으로 정렬됨에 따라, 급격하게 동기화된 형태 변화는 표면 막의 빠른 분극 변화를 발생시키며, 파리에서는 횡문재라고 불리는 ~30,000-50,000 마이크로빌리의 스택으로 구성된 신호전달 구획에서 발생한다. 이 분극은 세포막이 똑같이 분극 될 때까지 세포체의 막 커패시턴스를 통해 수동적으로 방전됩니다. ERP는 전하 변위의 세포외 기록이다. 세포내 기록된 ERP는 세포막 4,27,28의 시간 상수에 의해 통합된 세포외 ERP를 나타낸다. 시각적 안료 전하 변위에 의해 활성화된 전류는 또한 전체 세포 전압 클램프 기록(29,30)(도 5A-D)에서 측정될 수 있었고, 신호의 동역학에 대한 막 커패시턴스의 영향을 최소화하는 주요 이점(초기 수용체 전류(ERC) 기록에서)을 갖는다.
프로토콜 섹션은 초파리 눈9에서 ERG 측정을 수행하는 방법 및 초파리 분리 옴마티디아31,32로부터의 전체 세포 기록에 의한 ERC 측정을 기술한다. 우리는 또한 일반적으로 광형질도입과 특히 광안료를 조사하는 데 사용되는 특정 프로토콜을 설명합니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 mL syringe with elongated tip</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Figure 6M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 rough tweezers</td>
			<td></td>
			<td>Dumont #5, Standard</td>
			<td>0.1 mm x 0.06 mm, length 110 mm, Inox (Figure 6H)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 condenser lenses</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A/D converter</td>
			<td>Molecular Device</td>
			<td>Digidata 1200</td>
			<td>Possible replacement: any digidata from molecular devices (e.g 1440A) -Figure 7C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amplifier</td>
			<td>Almost perfect electronics</td>
			<td></td>
			<td>Possible replacement: Warner instruments- IE251A or IE-210 (comes with headstage)- Figure 7D</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-vibration Table</td>
			<td>Newport</td>
			<td>VW-3036-OPT-01</td>
			<td>Figure 7H</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Capillaries</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>Borosilicate glass capillaries</td>
			<td>1 mm x 0.58 mm (Figure 6O)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clampex</td>
			<td>Molecular Device</td>
			<td></td>
			<td>Software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 tank</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cold light source</td>
			<td>Schott</td>
			<td>KL1500 LCD</td>
			<td>Figure 6C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Delicate wipers</td>
			<td>Kimtech</td>
			<td></td>
			<td>Kimwipes (Figure 6K)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrode holder</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Suitable for capillary O.D. 1 mm (Figure 6N, Figure 7N, and Figure 7P)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Faraday cage</td>
			<td>Home made</td>
			<td></td>
			<td>Electromagnetic noise shielding and black front curtain (Figure 7K)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter (Color)</td>
			<td>Schott</td>
			<td>OG590, Edge filter</td>
			<td>Figure 7S</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter (Color)</td>
			<td>Schott</td>
			<td>BP450/40 nm</td>
			<td>Figure 7S</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter (Color)</td>
			<td>Blazers</td>
			<td>550 nm</td>
			<td>Figure 7S</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter (Color) for cold light source</td>
			<td>Schott</td>
			<td>RG630</td>
			<td>Figure 6C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter (Heat)</td>
			<td>Schott</td>
			<td>KG3</td>
			<td>Figure 7S</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filters (Neutral density filter)</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>6,5,4,3,2,1,0.5,0.3</td>
			<td>Figure 7S</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flash Lamp system</td>
			<td>Honeywell</td>
			<td></td>
			<td>Figure 7U</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fly sleeper system with injector</td>
			<td>Inject + matic</td>
			<td></td>
			<td>Figure 6A-B</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lamp power supply</td>
			<td>PTI</td>
			<td>LPS-220</td>
			<td>Figure 7W</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light detector</td>
			<td>Home made</td>
			<td></td>
			<td>Phototransistor (Figure 7O)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light guide</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>3 mm diameter, 1.3 m long (Figure 7L,M)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light source</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>High-pressure ozone-free 75 W Xenon lamp (operating on 50 W), possible replacement: Cairn research- OptoLED (Figure 7R)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low temperature melting wax</td>
			<td>Home made</td>
			<td></td>
			<td>Composed of mixture of beeswax (Tm&#8776;62 &#176;C) and paraffin at ~3:1 to reach a melting temperature of ~55&#8211;56 &#176;C (Figure 6J)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic stand for flies</td>
			<td>Home made</td>
			<td></td>
			<td>Figure 6I and Figure 7Q</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microelectrode preamplifier system with head-stage</td>
			<td>Almost perfect electronics</td>
			<td></td>
			<td>Impedance tester (Figure 7G)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulator (mechanical coarse)</td>
			<td>Tritech Research, Narishige</td>
			<td>M-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulator (mechanical fine)</td>
			<td>Leitz Microsystems</td>
			<td>Leitz Mechanical Micromanipulator</td>
			<td>Figure 7F</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pCLAMP</td>
			<td>Molecular Device</td>
			<td></td>
			<td>Software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>60 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pulse generator</td>
			<td>AMPI</td>
			<td>Master 8</td>
			<td>Figure 7A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Redux cream for electrocardiography</td>
			<td>Parker Laboratories</td>
			<td>Redux Electrolyte Cr&#232;me</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shutter driver</td>
			<td>Uniblitz, Vincent Associates</td>
			<td>VCM-D1 Single Channel Uni-stable</td>
			<td>Figure 7V</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shutter system</td>
			<td>Uniblitz, Vincent Associates</td>
			<td>LS2 2 mm Uni-stable Shutters</td>
			<td>Figure 7V</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silver Wire</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td></td>
			<td>0.25&#8211;1 mm diameter, needs to be chloridized</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Soldering iron composed of a platinum-iridium filament</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>0.25 mm diameter (Figure 6F)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereoscopic zoom Microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>SMZ-2B</td>
			<td>Figure 6D</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereoscopic zoom Microscope</td>
			<td>Wild</td>
			<td>Wild M5</td>
			<td>With 6, 12, 25 and 50 magnification settings (Figure 7E)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe filters</td>
			<td>Millex</td>
			<td></td>
			<td>22 &#181;m PVDF filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vertical pipette puller</td>
			<td>Sutter/ Narishige</td>
			<td>Model P-97/PP-830</td>
			<td>Use either vertical or horizontal puller, as preferred (Figure 6L)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wax filament heater</td>
			<td>Home made</td>
			<td></td>
			<td>See figure S1 (Figure 6E-G)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xenon Flash Lamp system</td>
			<td>Dr. Rapp OptoElectronic</td>
			<td>JML-C2</td>
			<td>Figure 7X</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

electrophysiological methods for measuring photopigment levels in drosophila photoreceptors

초 파리 G-단백질-결합된 광색소 로돕신(등록상표)은 단백질(opsin)과 발색단으로 구성된다. 로돕신의 활성화 과정은 발색단의 광자 흡수 유도 이성체화에 의해 개시되고, 옵신의 형태적 변화를 촉진하고, 두 번째 어두운 안정한 광안료 상태(metarhodopsin, M)를 초래한다. 무작위 돌연변이 유발을 사용하여 이러한 이중안정한 광안료를 조사하려면 돌연변이 파리를 스크리닝하기 위한 간단하고 강력한 방법이 필요하다. 따라서, 기능성 광안료 수준의 감소를 측정하기 위한 몇몇 방법들이 설계되었다. 그러한 방법 중 하나는 광자 흡수 및 광수용체에서 발현되는 엄청난 양의 광안료 분자에 따른 광안료 내의 전하 변위를 이용한다. 초기 수용체 전위(또는 초기 수용체 전류)로 명명된 이 전기 신호는 다양한 전기생리학적 방법(예를 들어, 일렉트로레티노그램 및 전체 세포 기록)에 의해 측정되며, 기능적 광안료 수준에 선형적으로 비례한다. 이 방법의 장점은 높은 신호 대 잡음비, 광안료 수준의 직접 선형 측정, 로돕신 또는 메타로돕신 활성화에 대한 하류의 광전달 메커니즘의 독립성이다. 장기간 탈분극 후전위(PDA)라고 불리는 추가적인 전기생리학적 방법은 초파리 광안료의 이중 안정성과 플라이 R 및 M 안료 상태의 흡수-스펙트럼 차이를 이용한다. PDA는 강렬한 청색광에 의해 유도되어 포화 된 양의 로돕신을 메타 로돕신으로 변환하여 어둠 속에서 오랜 시간 동안 광 반응 종료가 실패하지만 강렬한 오렌지 빛을 사용하여 메타 로돕신에서 로돕신 변환으로 종료 될 수 있습니다. PDA는 방대한 광안료 전환을 필요로 하는 강력한 신호이기 때문에, 광안료의 생물발생에 있어서 작은 결함이라도 비정상적 PDA를 쉽게 검출할 수 있다. 실제로, 결함 있는 PDA 돌연변이체는 광형질도입에 중요한 신규한 신호전달 단백질의 동정을 이끌었다.

도 2는 ERG 기술을 사용하는 견고성 및 용이성을 예시한다. 그것은 간단한 전기 생리학 적 설정을 필요로하는 세포 외 전압 기록의 간단한 기술에 의해 사실상 손상되지 않은 파리에 기록되기 때문에 견고합니다. 견고성은 돌연변이가 광 반응을 강하게 감소시키거나 왜곡하는 경우에도 상대적으로 큰 진폭 (밀리볼트 범위)을 갖는 광 반응의 기록을 얻음으로써 나타납니다. 따...

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Electrophysiological Methods for Measuring Photopigment Levels in Drosophila Photoreceptors

우리는 전기생리학적으로 이중 안정한 광안료를 특성화하기 위한 프로토콜을 제시한다: (i) 광자-흡수 및 광수용체에서의 그들의 엄청난 양에 뒤따르는 광안료 분자 내의 전하 변위를 이용하고, (ii) 로돕신과 메타로돕신 광안료 상태의 흡수-스펙트럼 차이를 이용한다. 이들 프로토콜은 이중-안정한 광안료 시스템에 영향을 미치는 돌연변이를 스크리닝하는데 유용하다.

초파리 광수용체에서 광안료 수준을 측정하기 위한 전기생리학적 방법

The Drosophila G-protein-coupled photopigment rhodopsin (R) is composed of a protein (opsin) and a chromophore. The activation process of rhodopsin is ...

이 프로토콜은 시각적으로 결함이 있는 초파리 돌연변이체의 유전자 스크리닝에 특히 적합합니다. 이는 초파리 광변환의 작은 이상, 특히 광색소 수준 및 계층 동료 관련 기능에서도 감지할 수 있기 때문입니다. 이 기술은 생체 내에서 심오하며 실행하기 쉽고 매우 견고하여 광변환 단백질 활성의 작은 변화를 감지할 수 있습니다.제 생각에는 생존력을 유지하면서 파리를 고정하는 것이 아마도이 방법의 중요한 부분 일 것입니다. 컴퓨터를 켜고 Clampex 소프트웨어를 엽니다. 앰프와 Master-8 펄스 발생기를 켠 다음 크세논 램프와 셔터 컨트롤러를 켭니다.풀러를 켜고 풀러에 유리 모세관을 놓고 당깁니다. 풀러에서 유리 모세관을 제거합니다. 길쭉한 팁 주사기를 사용하여 여과 된 링거 용액으로 유리 모세관을 채 웁니다.와이어 전극을 유리 모세관에 삽입합니다. 모세관 내의 용액이 은선과 접촉하는지 확인하십시오. 전극 홀더를 두 개의 전극 마이크로 매니퓰레이터에 삽입합니다.납땜 인두의 전원 공급 장치를 켭니다. 전류를 약 2.25암페어로 설정합니다. 이 전류는 0.25mm 백금-이리듐 필라멘트를 섭씨 약 55도에서 56도까지 가열해야 합니다.납땜 인두에 녹는 온도가 낮은 왁스 한 방울을 놓습니다. 병 안의 파리를 마취하십시오. 마취 된 파리를 침목 용기에 붓고 파리 하나를 선택하고 나머지 파리를 페트리 접시로 덮으십시오.날카로운 핀셋을 사용하여 날개로 파리를 조심스럽게 잡고 플라이 홀더에 놓습니다. 플라이 홀더에서 플라이를 옆으로 눕히고 등을 손으로 향하게 합니다. 핀셋을 사용하여 날개에서 파리를 들어 올리고 납땜 인두를 사용하여 날개를 플라이 홀더에 고정하십시오.납땜 인두를 사용하여 왁스로 플라이의 등을 스탠드 표면에 연결합니다. 납땜 인두의 끝을 다리의 연결 지점까지 내린 다음 왁스를 녹여 모든 다리를 함께 덮습니다. 목 부위의 머리와 목 사이에 작은 왁스 방울을 놓습니다.플라이 홀더를 자석 블록의 어두운 패러데이 케이지에 놓고 플라이가 라이트 가이드 끝에서 약 5mm 떨어져 있는지 확인합니다. 마이크로 매니퓰레이터를 사용하여 기록 전극을 파리의 눈 위에 놓고 접지 전극을 파리의 등 위쪽에 놓습니다. 그런 다음 마이크로 매니퓰레이터를 사용하여 접지 전극을 플라이 뒤쪽에 삽입합니다.기록 전극을 파리의 눈의 바깥 둘레에 삽입하는 것이 바람직하며, 마이크로 매니퓰레이터를 사용하는 것이 좋습니다. 패러데이 케이지를 닫고 방의 조명을 꺼서 5 분 동안 어둠에 적응할 수 있도록하십시오. 초당 500미터의 펄스 지속 시간, 60초의 펄스 간격 및 6으로 설정된 펄스 수에서 시작하는 매개변수를 입력합니다.PDA를 측정하려면 Master-8 펄스 발생기를 TRAIN 모드로 설정 한 다음 주황색 필터를 사용하여 최대 강도의 5 초 광 펄스를 제공합니다. 전압 응답을 확인하십시오. 주황색 필터를 광대역 파란색 필터로 교체하고 최대 강도로 3개의 5초 광 펄스를 제공합니다.전압 응답을 확인하십시오. 어둠 속에서 60 초 이상 기다리십시오. 파란색 필터를 이전 주황색 필터로 교체합니다.그런 다음 60 초 간격으로 두 개의 5 초 광 펄스를줍니다. 전압 응답을 확인하십시오. ERP M 전위를 측정하려면 정상 상태 전압 응답에 도달할 때까지 연속 청색광 펄스를 제공합니다.20 나노 미터 대역 통과 필터를 사용하여 350에서 700 나노 미터 사이의 파장의 짧고 강렬한 빛을 제공합니다. 그런 다음 M-전위 응답의 M1 위상의 피크 진폭을 측정하는데, 이는 광평형에서 이 특정 파장에서의 메타로돕신 흡수를 반영합니다. PDA 반응은 상이한 돌연변이 파리에 대해 평가되었다.야생형 파리는 강렬한 청색광 자극 후 장기간의 각막 음성 ERG로 나타난 어둠 속에서 포화 탈분극을 보였다. 다음 청색광은 PDA에 겹쳐진 작은 응답을 생성했으며 켜기 및 끄기 과도 현상이 없었습니다. ninaE와 같은 비정상적인 광 색소 생물 발생을 가진 돌연변이 파리에서 전압 반응은 강렬한 청색광 자극 후 기준선으로 돌아 왔으며 추가 청색광에 대한 반응은 억제되지 않았으며 정상적인 켜기 및 끄기 과도 상태를 보였습니다.파리의 야생형 ERP는 동일한 프로토콜로 얻어 지지만 PDA 중에 강렬한 녹색 플래시가 적용됩니다. 이 녹색 섬광은 ERP를 유도하고 PDA를 억제합니다. M- 전위는 파란색 조명 후 녹색 플래시에 의해 얻어졌지만 야생형 플라이에서 파란색 조명 후 파란색 플래시에 의해 얻어지지 않았습니다.이 프로토콜은 야생형, 광색소 하이포모프 돌연변이 ninaE, 및 정상 광색소 수준 norpA를 갖는 광변환 결핍 돌연변이에서 반복되었습니다. 플라이로돕신 및 메타로돕신의 상대 흡수 스펙트럼은 상이한 스펙트럼 및 광평형 스펙트럼의 측광 측정으로부터 계산되었다. 파리의 생존을 위해서는 과열을 자제하여 왁스 점도에주의를 기울이는 것이 중요합니다.이 절차는 유전 적 및 결함이있는 시각 돌연변이의 스크리닝을 통해 적합합니다. 시각적 돌연변이를 무작위로 분리하고 식별하는 방법은 초파리 광형질도입과 관련된 새로운 단백질 및 메커니즘의 발견을 용이하게 할 수 있습니다. PDA 프로토콜은 중요하고 새로운 시각적 메커니즘의 분리를 가능하게했습니다.참여는 아마도 발견되지 않았거나 그렇지 않으면 예상되지 않았을 것입니다.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Electrophysiological Methods for Measuring Photopigment Levels in Drosophila Photoreceptors

Methods to Assay Drosophila Behavior

Methods to Assay Drosophila Behavior

분석의 방법 Drosophila 행동

Drosophila melanogaster, the fruit fly, has been used to study molecular mechanisms of a wide range of human diseases such as cancer, cardiovascular ...

연구

신경과학

Local and Global Methods of Assessing Thermal Nociception in Drosophila Larvae

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에서 열 Nociception를 평가 지역 및 글로벌 방법<em&gt; Drosophila</em&gt; 애벌레

In this article, we demonstrate assays to study thermal nociception in Drosophila larvae. One assay involves spatially-restricted (local) stimulation of ...

Dual Electrophysiological Recordings of Synaptically-evoked Astroglial and Neuronal Responses in Acute Hippocampal Slices

급성 Hippocampal 슬라이스에 Synaptically-evoked Astroglial와 Neuronal 응답의 듀얼 Electrophysiological 레코딩

Astrocytes form together with neurons tripartite synapses, where they integrate and modulate neuronal activity. Indeed, astrocytes sense neuronal inputs ...

In Vivo Electrophysiological Measurements on Mouse Sciatic Nerves

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마우스 좌골 신경에 생체 전기 생리 측정에서

Electrophysiological studies allow a rational classification of various neuromuscular diseases and are of help, together with neuropathological ...

Electrophysiological Recording From Drosophila Labellar Taste Sensilla

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The peripheral taste response of insects can be powerfully investigated with electrophysiological techniques. The method described here allows the ...

An Inexpensive, Scalable Behavioral Assay for Measuring Ethanol Sedation Sensitivity and Rapid Tolerance in Drosophila

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에탄올 진정 감도 및 신속한 공차 측정을위한 저렴하고 확장 가능한 행동 분석<em&gt; 초파리</em

Alcohol use disorder (AUD) is a serious health challenge. Despite a large hereditary component to AUD, few genes have been unambiguously implicated in ...

Electrophysiological Method for Recording Intracellular Voltage Responses of Drosophila Photoreceptors and Interneurons to Light Stimuli In Vivo

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의 기록 세포 내 전압 응답에 대한 전기 생리 방법<em&gt; 초파리</em&gt; 빛 자극에 광수와의 interneurons<em&gt; 생체</em

Voltage responses of insect photoreceptors and visual interneurons can be accurately recorded with conventional sharp microelectrodes. The method ...

Analyzing Synaptic Modulation of Drosophila melanogaster Photoreceptors after Exposure to Prolonged Light

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의 시냅틱 변조 분석<em&gt; 노랑 초파리</em&gt; 장시간 빛에 노출 후 광수

The nervous system has the remarkable ability to adapt and respond to various stimuli. This neural adjustment is largely achieved through plasticity at ...

Measuring and Altering Mating Drive in Male Drosophila melanogaster

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측정과 남성의 변경 결합 드라이브<em&gt; 노랑 초파리</em

Despite decades of investigation, the neuronal and molecular bases of motivational states remain mysterious. We have recently developed a novel, ...

Electrophysiological Method for Whole-cell Voltage Clamp Recordings from Drosophila Photoreceptors

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전 세포 전압 클램프 기록을위한 전기 생리 학적 방법<em&gt; Drosophila</em&gt; 광 수용체

Whole-cell voltage clamp recordings from Drosophila melanogaster photoreceptors have revolutionized the field of invertebrate visual transduction, ...