Name: standardization and maintenance of 3d canine hepatic and intestinal organoid cultures for use in biomedical research
Uploaded: 2022-01-31T15:00:00
Duration: 8 min 39 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Standardization and Maintenance of 3D Canine Hepatic and Intestinal Organoid Cultures for Use in Biomedical Research at JoVE.com

يريد المؤلفون التعبير عن امتنانهم لموظفي مختبر التشخيص البيطري التابع لجامعة ولاية أيوا ، وهم هالي م. لامبرت ، وإميلي راهي ، وروزالين م. برانامان ، وفيكتوريا ج. غرين ، وجنيفر م. غرولتز ثراش ، على معالجة العينات المقدمة في الوقت المناسب. يرغب المؤلفون في الاعتراف بالدعم المقدم من بدء تشغيل أعضاء هيئة التدريس ، وجائزة ISU VPR Miller ، وجائزة ISU VPR Miller ، والجائزة الفرعية NSF SBIR إلى ISU # 1912948.

<ol>
	<li>Hickman, D. L., Johnson, J., Vemulapalli, T. H., Crisler, J. R., Shepherd, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Commonly+used+animal+models.">Commonly used animal models.</a> Principles of Animal Research for Graduate and Undergraduate Students. , 117-175 (2017).</li><li>De Jong, M., Maina, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Of+mice+and+humans:+Are+they+the+same?+-+Implications+in+cancer+translational+research.">Of mice and humans: Are they the same? - Implications in cancer translational research.</a> Journal of Nuclear Medicine. 51 (4), 501-504 (2010).</li><li>Cannarozzi, G., Schneider, A., Gonnet, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+phylogenomic+study+of+human,+dog,+and+mouse.">A phylogenomic study of human, dog, and mouse.</a> PLoS Computational Biology. 3 (1), 0009-0014 (2007).</li><li>Jacob, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Researchers+turn+to+canine+clinical+trials+to+advance+cancer+therapies.">Researchers turn to canine clinical trials to advance cancer therapies.</a> JAMA - Journal of the American Medical Association. 315 (15), 1550-1552 (2016).</li><li>Ziegler, A., Gonzalez, L., Blikslager, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large+animal+models:+The+key+to+translational+discovery+in+digestive+disease+research.">Large animal models: The key to translational discovery in digestive disease research.</a> Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 2 (6), 716-724 (2016).</li><li>Swanson, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phylogenetic+and+gene-centric+metagenomics+of+the+canine+intestinal+microbiome+reveals+similarities+with+humans+and+mice.">Phylogenetic and gene-centric metagenomics of the canine intestinal microbiome reveals similarities with humans and mice.</a> ISME Journal. 5 (4), 639-649 (2011).</li><li>Coelho, L. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Similarity+of+the+dog+and+human+gut+microbiomes+in+gene+content+and+response+to+diet.">Similarity of the dog and human gut microbiomes in gene content and response to diet.</a> Microbiome. 6 (1), 72 (2018).</li><li>Nguyen, T. L. A., Vieira-Silva, S., Liston, A., Raes, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+informative+is+the+mouse+for+human+gut+microbiota+research.">How informative is the mouse for human gut microbiota research.</a> DMM Disease Models and Mechanisms. 8 (1), 1-16 (2015).</li><li>Bontempo, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nutrition+and+health+of+dogs+and+cats:+Evolution+of+petfood.">Nutrition and health of dogs and cats: Evolution of petfood.</a> Veterinary Research Communications. 29, 45-50 (2005).</li><li>Allenspach, K., Gaschen, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Canine+chronic+enteropathies:+A+review.">Canine chronic enteropathies: A review.</a> Schweizer Archiv fur Tierheilkunde. 145 (5), 209-222 (2003).</li><li>Tribuddharatana, T., Kongpiromchean, Y., Sribhen, K., Sribhen, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biochemical+alterations+and+their+relationships+with+the+metabolic+syndrome+components+in+canine+obesity.">Biochemical alterations and their relationships with the metabolic syndrome components in canine obesity.</a> Kasetsart Journal - Natural Science. 45 (4), 622-628 (2011).</li><li>Chandra, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derivation+of+adult+canine+intestinal+organoids+for+translational+research+in+gastroenterology.">Derivation of adult canine intestinal organoids for translational research in gastroenterology.</a> BMC Biology. 17 (1), 33 (2019).</li><li>Schaefer, K., Rensing, S., Hillen, H., Burkhardt, J. E., Germann, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Is+Science+the+only+driver+in+species+selection?+An+internal+study+to+evaluate+compound+requirements+in+the+minipig+compared+to+the+dog+in+preclinical+studies.">Is Science the only driver in species selection? An internal study to evaluate compound requirements in the minipig compared to the dog in preclinical studies.</a> Toxicologic Pathology. 44 (3), 474-479 (2016).</li><li>MacArthur Clark, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+3Rs+in+research:+A+contemporary+approach+to+replacement,+reduction+and+refinement.">The 3Rs in research: A contemporary approach to replacement, reduction and refinement.</a> British Journal of Nutrition. 120, 1-7 (2018).</li><li>Schneider, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Model-based+reverse+translation+between+veterinary+and+human+medicine:+The+one+health+initiative.">Model-based reverse translation between veterinary and human medicine: The one health initiative.</a> CPT: Pharmacometrics and Systems Pharmacology. 7 (2), 65-68 (2018).</li><li>Lehmann, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+organoids:+A+new+dimension+in+cell+biology.">Human organoids: A new dimension in cell biology.</a> Molecular Biology of the Cell. 30 (10), 1129-1137 (2019).</li><li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+Lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche.">Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).</li><li>Kim, J., Koo, B. K., Knoblich, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+organoids:+model+systems+for+human+biology+and+medicine.">Human organoids: model systems for human biology and medicine.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 21 (10), 571-584 (2020).</li><li>Jensen, C., Teng, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Is+it+time+to+start+transitioning+from+2D+to+3D+cell+culture.">Is it time to start transitioning from 2D to 3D cell culture.</a> Frontiers in Molecular Biosciences. 7, 33 (2020).</li><li>Ho, B. X., Pek, N. M. Q., Soh, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disease+modeling+using+3D+organoids+derived+from+human+induced+pluripotent+stem+cells.">Disease modeling using 3D organoids derived from human induced pluripotent stem cells.</a> International Journal of Molecular Sciences. 19 (4), 936 (2018).</li><li>Truskey, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+microphysiological+systems+and+organoids+as+in+vitro+models+for+toxicological+studies.">Human microphysiological systems and organoids as in vitro models for toxicological studies.</a> Frontiers in Public Health. 6, 185 (2018).</li><li>Caipa Garcia, A. L., Arlt, V. M., Phillips, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoids+for+toxicology+and+genetic+toxicology:+applications+with+drugs+and+prospects+for+environmental+carcinogenesis.">Organoids for toxicology and genetic toxicology: applications with drugs and prospects for environmental carcinogenesis.</a> Mutagenesis. , (2021).</li><li>Augustyniak, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoids+are+promising+tools+for+species-specific+in+vitro+toxicological+studies.">Organoids are promising tools for species-specific in vitro toxicological studies.</a> Journal of Applied Toxicology. 39 (12), 1610-1622 (2019).</li><li>Zietek, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoids+to+study+intestinal+nutrient+transport,+drug+uptake+and+metabolism+-+Update+to+the+human+model+and+expansion+of+applications.">Organoids to study intestinal nutrient transport, drug uptake and metabolism - Update to the human model and expansion of applications.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 577656 (2020).</li><li>Zietek, T., Rath, E., Haller, D., Daniel, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+organoids+for+assessing+nutrient+transport,+sensing+and+incretin+secretion.">Intestinal organoids for assessing nutrient transport, sensing and incretin secretion.</a> Scientific Reports. 5 (1), 1-10 (2015).</li><li>Kar, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoids:+a+promising+new+in+vitro+platform+in+livestock+and+veterinary+research.">Organoids: a promising new in vitro platform in livestock and veterinary research.</a> Veterinary Research. 52 (1), 1-17 (2021).</li><li>Borcherding, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sa1976+polyphenols+reverse+the+pathologic+effects+of+palmitic+acid+and+high+fat+diet+in+canine+enteroids.">Sa1976 polyphenols reverse the pathologic effects of palmitic acid and high fat diet in canine enteroids.</a> Gastroenterology. 158 (6), 486 (2020).</li><li>Ambrosini, Y. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recapitulation+of+the+accessible+interface+of+biopsy-derived+canine+intestinal+organoids+to+study+epithelial-luminal+interactions.">Recapitulation of the accessible interface of biopsy-derived canine intestinal organoids to study epithelial-luminal interactions.</a> PLoS ONE. 15 (4), 0231423 (2020).</li><li>Zdyrski, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Su124+homology+directed+repair+in+canine+duodenal+enteroids+to+mimic+the+wild-type+P-glycoprotein+mutation.">Su124 homology directed repair in canine duodenal enteroids to mimic the wild-type P-glycoprotein mutation.</a> Gastroenterology. 160 (6), 625 (2021).</li><li>Li, Y., Tang, P., Cai, S., Peng, J., Hua, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoid+based+personalized+medicine:+from+bench+to+bedside.">Organoid based personalized medicine: from bench to bedside.</a> Cell Regeneration. 9 (1), 21 (2020).</li><li>Kurr, L. A., Allenspach, K., Jergens, A., Mochel, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Harnessing+the+biology+of+intestinal+organoids+to+accelerate+drug+discovery+in+inflammatory+bowel+disease:+A+one+health+approach.">Harnessing the biology of intestinal organoids to accelerate drug discovery in inflammatory bowel disease: A one health approach.</a> The FASEB Journal. 34, 1 (2020).</li><li>Nantasanti, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disease+modeling+and+gene+therapy+of+copper+storage+disease+in+canine+hepatic+organoids.">Disease modeling and gene therapy of copper storage disease in canine hepatic organoids.</a> Stem Cell Reports. 5 (5), 895-907 (2015).</li><li>Favier, R. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=COMMD1-Deficient+dogs+accumulate+copper+in+hepatocytes+and+provide+a+good+model+for+chronic+hepatitis+and+fibrosis.">COMMD1-Deficient dogs accumulate copper in hepatocytes and provide a good model for chronic hepatitis and fibrosis.</a> PLoS ONE. 7 (8), 42158 (2012).</li><li>Kruitwagen, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+survival+of+transplanted+autologous+canine+liver+organoids+in+a+COMMD1-deficient+dog+model+of+metabolic+liver+disease.">Long-term survival of transplanted autologous canine liver organoids in a COMMD1-deficient dog model of metabolic liver disease.</a> Cells. 9 (2), 410 (2020).</li><li>Vilgelm, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fine-needle+aspiration-based+patient-derived+cancer+organoids.">Fine-needle aspiration-based patient-derived cancer organoids.</a> iScience. 23 (8), 101408 (2020).</li><li>Saxena, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+intestinal+enteroids:+A+new+model+to+study+human+rotavirus+infection,+host+restriction,+and+pathophysiology.">Human intestinal enteroids: A new model to study human rotavirus infection, host restriction, and pathophysiology.</a> Journal of Virology. 90 (1), 43-56 (2016).</li><li>VanDussen, K. L., Sonnek, N. M., Stappenbeck, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=L-WRN+conditioned+medium+for+gastrointestinal+epithelial+stem+cell+culture+shows+replicable+batch-to-batch+activity+levels+across+multiple+research+teams.">L-WRN conditioned medium for gastrointestinal epithelial stem cell culture shows replicable batch-to-batch activity levels across multiple research teams.</a> Stem Cell Research. 37, 101430 (2019).</li><li>Powell, R. H., Behnke, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=WRN+conditioned+media+is+sufficient+for+in+vitro+propagation+of+intestinal+organoids+from+large+farm+and+small+companion+animals.">WRN conditioned media is sufficient for in vitro propagation of intestinal organoids from large farm and small companion animals.</a> Biology Open. 6 (5), 698-705 (2017).</li><li>Mackenzie, J. S., Jeggo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+one+health+approach-why+is+it+so+important.">The one health approach-why is it so important.</a> Tropical Medicine and Infectious Disease. 4 (2), 88 (2019).</li><li>Artegiani, B., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+and+application+of+3D-organoid+technology.">Use and application of 3D-organoid technology.</a> Human Molecular Genetics. 27 (2), 99-107 (2018).</li></ol>

K. Allenspach هو المؤسس المشارك ل LifEngine Animal Health و 3D Health Solutions. وهي تعمل كمستشارة ل Ceva Animal Health و Bioiberica و LifeDiagnostics و Antech Diagnostics و Deerland Probiotics و Mars. J. P. Mochel هو المؤسس المشارك لشركة LifEngine Animal Health و 3D Health Solutions. يعمل الدكتور موشيل كمستشار ل Ceva Animal Health و Ethos Animal Health. المؤلفون الآخرون ليس لديهم أي تضارب في المصالح للإعلان.

يوجد حاليا نقص في البروتوكولات الموحدة المتاحة لعزل وصيانة الكلاب العضوية الكبدية والمعوية. إن وضع إجراءات تشغيل موحدة للمزارع العضوية له ما يبرره لكي يكون هذا النموذج قابلا للتطبيق في بيئات مختبرية مختلفة. على وجه التحديد ، يعد توفير بروتوكولات تشغيل موحدة لزراعة نماذج الكلاب العضوية هذه أمرا أساسيا لتوصيف النمو الطبيعي للعضويات أثناء الزراعة والمرور لاشتقاق نقاط زمنية مثالية للتوسع والصيانة. وقد سبق أن تميزت الكلاب العضوية المعوية المستزرعة باستخدام البروتوكول من قبل تشاندرا وآخرون 12.
واحدة من أهم خطوات البروتوكول هي تمرير المواد العضوية. تم تحديد الوقت الأمثل للمرور الأول من الكرويات الكبدية ليكون في اليوم 7 بعد العزل بناء على قياسات كروية كبدية. تم تحقيق الحد الأقصى لحجم الكرويات بحلول اليوم 7 ، وفي الوقت نفسه ، بدأت الكرويات في البرعم وشكلت عضويات كبدية. كانت الزيادة في الحجم الكلي للعضويات من اليوم 2-7 بعد العزل أكثر من 365 مرة ، مما يشير إلى أن وقت المرور الأمثل أطول من ثقافة الكلاب العضوية المعوية. بعد 7 أيام في الثقافة ، لم تلاحظ أي علامات إجمالية على موت الخلايا المبرمج الخلوي في الكروية الكبدية ، حتى بدون تنظيف أو مرور (الشكل 7). يمكن أن يكون تمرير المواد العضوية المعوية والكبدية أمرا صعبا لأن الإجراء يمكن أن يؤدي إلى فقدان الخلايا وتغيير قابلية البقاء. تشير النتائج إلى أن الحضانة المطولة للعضويات الكبدية مع البروتياز الشبيه بالتريبسين (حتى 12 دقيقة) لا تؤثر سلبا على الثقافة الفرعية. احتضان المواد العضوية في البروتياز الشبيه بالتريبسين لفترة أطول من 24 دقيقة يمكن أن يكون ضارا بالثقافة الفرعية اللاحقة للعضويات.
في حالة الكسر دون المستوى الأمثل في مجموعات الخلايا مع الممر العضوي ، قد يكون التفكك الميكانيكي بدلا من الحضانة المطولة مع البروتياز الشبيه بالتريبسين أكثر فائدة. إذا واجهت مشاكل في الانفصال السليم للعضويات ، فقد تتم محاولة دوامة قصيرة للعينات لتعزيز عائد المرور. من ناحية أخرى ، فإن الدوامة لديها القدرة على تدمير الثقافة وإتلاف الخلايا ، لذلك يجب استخدامها فقط عندما تفشل الإجراءات الأخرى بشكل متكرر. إن كسر المواد العضوية الكبدية إلى خلايا مفردة يقلل من معدل نمو المواد العضوية ، في حين أن تقسيمها إلى مجموعات من الخلايا يمكن أن يحسن بشكل كبير من قدرتها على البقاء. تم اختيار عشر دقائق كوقت حضانة للبروتوكول العضوي. واعتبرت نقطة الحضانة التي تبلغ مدتها 12 دقيقة غير سامة للخلايا مقارنة بحضانة مدتها 24 دقيقة في تجربة البروتياز الشبيهة بالتريبسين.
أكدت تجربة البقاء على قيد الحياة أن الخلايا العضوية الكبدية للكلاب يمكن أن تعيش لمدة تصل إلى 19.5 يوما في ظروف غير مواتية (استنزاف هيكلي وتغذوي). تم استزراع المواد العضوية التي نجت من هذه الظروف لفترة أطول باستخدام وسائط CMGF +. قد تكون هذه الملاحظة ناتجة عن النمو البطيء للعضويات الكبدية في الوسائط غير المكملة بمثبطات الصخور و GSK3β. نمت الثقافات العضوية مع CMGF + R / G بشكل أسرع وربما استنفدت مواردها بشكل أسرع. تفتح هذه التجربة إمكانيات تصغير ثقافة الكلاب العضوية لتحقيق تحويل نظام عالي الإنتاجية. وتظهر هذه التكنولوجيا إمكانية تسهيل اكتشاف الأدوية أو دراسات علم السموم بتكلفة مخفضة إلى حد كبير.
بعض المشاكل الشائعة التي تواجهها أثناء صيانة تربية الكلاب العضوية هي تصلب العينات غير السليم عند الطلاء ، وتلوث الثقافة ، وتحديد الكثافة والحجم المناسبين للعضويات. إذا تصلب ECM القابل للذوبان قبل الأوان أثناء الطلاء ، فضعه على الفور على الجليد لمدة 10 دقائق. إذا لم يشكل ECM القابل للذوبان هياكل تشبه القبة ، فمن المحتمل أنه لم تتم إزالة وسائط كافية من العينة. إذا كان هذا هو الحال ، فقم بتخفيف العينة باستخدام ECM أكثر قابلية للذوبان حتى تتشكل القباب.
عندما يتم العثور على تلوث فطري أو بكتيري في لوحة كاملة (انظر الشكل 4) ، فإن أفضل حل هو التخلص من اللوحة. يمكن محاولة العلاج بالأدوية المضادة للفطريات أو المضادات الحيوية ، ولكن نجاح هذه المحاولة منخفض للغاية. إذا كانت بئر واحدة ملوثة في صفيحة، يمكن تنظيف الآبار القابلة للحياة وغير المتأثرة (اتبع الخطوات من 4.1 إلى 4.5) إلى صفيحة جديدة ومراقبتها عن كثب. إذا كانت العينة قد تم تجميدها بالفعل في حالات الطوارئ ، فمن المستحسن التخلص من العينة بأكملها ، لأن ذوبان العينة يعرض الحاضنة لخطر تلوث إضافي.
يجب أن تكون الثقافة العضوية الصحية على الأقل في فئة متوسطة الحجم ومتوسطة الكثافة أو أكبر. الكثافة المثلى أمر بالغ الأهمية لنمو الثقافة العضوية. يجب تصحيح الكثافة المنخفضة عن طريق تنظيف المواد العضوية إلى متوسطة الكثافة. إذا حدثت حالة الكثافة القصوى (الاكتظاظ) ، فيجب توسيع المواد العضوية إلى المزيد من الآبار. غالبا ما تصاحب العلامات الإجمالية لموت الخلايا المبرمج كلا من الاكتظاظ والكثافة المنخفضة للثقافة العضوية. إذا لم يتم تصحيح هذه المشكلات في الوقت المناسب ، فستتحول الثقافة العضوية بأكملها إلى استماتة في غضون أيام. إذا حققت المواد العضوية حجما كبيرا جدا أو كثافة عالية جدا ، فيجب استخدام الثقافة لإجراء تجربة أو تجميد أو تثبيت.
تحتوي الوسائط العضوية حاليا على 17 مكونا ، وبالتالي فإن إضافة عوامل النمو اللازمة لصيانة العضوية وتوسيعها يمكن أن تكون مكلفة. يمكن حل هذه المشكلة عن طريق زراعة مزارع الخلايا 2D التي تجمع عوامل النمو لإنتاج CMGF + مشروطة. تنتج زراعة الخلايا L-WRN عوامل نمو Wnt-3a و R-Spondin-3 و Noggin 37. تستخدم مستعمرة الخلية 90٪ DMEM / F12 و 10٪ وسائط ثقافة FBS. عندما تحقق الثقافة 90 في المئة من الالتقاء ، يتم حصاد وسائل الإعلام كل يوم لمدة 1 أسبوع. ثم يتم خلط الوسائط التي يتم حصادها مع 2x CMGF + (بدون عوامل النمو هذه). في حين أن الثقافات 2D يمكن أن تنتج عوامل النمو اللازمة في جزء صغير من التكلفة، يجب توقع الوقت الإضافي والاستعداد لإنتاج وسائل الإعلام. يمكن أن تختلف تركيزات عوامل النمو بين دفعات الوسائط المشروطة أيضا37,38.
تعد مزارع الكلاب العضوية المشتقة من الخلايا الجذعية للبالغين نموذجا طبيا حيويا فريدا يمكن أن يساعد في تحقيق أهداف مبادرة الصحة الواحدة39. يمكن استخدام التكنولوجيا العضوية في العديد من مجالات البحوث الأساسية والطبية الحيوية ، والتي تمتد من البيولوجيا التنموية ، والفيزيولوجيا المرضية ، واكتشاف الأدوية واختبارها ، وعلم السموم إلى دراسة الأمراض المعدية والطب التجديدي 40. البحوث الانتقالية والعكسية هي المجالات التي تنطبق فيها عضويات الكلاب 15. تم استخدام الكلاب لعدة قرون في إعدادات تجريبية متعدية ، كما أن وضعها الحيواني المصاحب لها قد سهل مكانتها كواحدة من أكثر الأنواع استكشافا في الطب البيطري.
في الختام ، توفر هذه المخطوطة بروتوكولات تشغيل موحدة لعزل وصيانة وحصاد وبنوك حيوية للكلاب العضوية الكبدية والمعوية لتسهيل تطبيق هذا النموذج في مختلف المجالات الطبية الحيوية. هذا النموذج مناسب بشكل فريد لتعزيز البحوث الانتقالية العكسية كأداة لمبادرة الصحة الواحدة لتعزيز تبادل المعرفة بين التخصصات وداخلها.

القوارض هي النموذج الحيواني الأكثر استخداما للبحوث الطبية الحيوية والانتقالية1. وهي مفيدة بشكل استثنائي للتحقيق في التسبب الجزيئي الأساسي للأمراض، على الرغم من أن أهميتها السريرية للأمراض المزمنة متعددة العوامل قد تم التشكيك فيها مؤخرا2. يظهر نموذج الكلاب العديد من المزايا مقارنة بالقوارض3,4. تشترك الكلاب والبشر في أوجه التشابه في الأيض والميكروبيوم المعوي الذي تطور بسبب استهلاك النظام الغذائي البشري طوال فترات مختلفة من تدجينها5،6،7. أوجه التشابه بين الكلاب وتشريح الجهاز الهضمي البشري وعلم وظائف الأعضاء هي مثال آخر من الأمثلة 8.
بالإضافة إلى ذلك ، غالبا ما تشارك الكلاب بيئات وأنماط حياة مماثلة مع أصحابها9. يسمح العمر الأطول للكلاب مقارنة بالقوارض بالتطور الطبيعي للعديد من الحالات المزمنة10. مرض التهاب الأمعاء أو متلازمة التمثيل الغذائي هي أمثلة على الأمراض المزمنة متعددة العوامل التي تشترك في أوجه تشابه مهمة بين البشر والكلاب11،12. يمكن للتجارب قبل السريرية للكلاب التي تشمل الكلاب المصابة بأمراض تحدث بشكل طبيعي أن تولد بيانات أكثر موثوقية من تلك المكتسبة من نماذج القوارض13. ومع ذلك ، لتقليل استخدام أبحاث الحيوانات الحية والامتثال لمبادئ 3Rs (تقليل ، صقل ، استبدال) 14 ، ظهرت بدائل للاختبار في الجسم الحي باستخدام عضويات الكلاب ثلاثية الأبعاد في المختبر 15.
Organoids هي هياكل مشتقة من الخلايا الجذعية ثلاثية الأبعاد ذاتية التجميع تلخص علم وظائف الأعضاء والتشريح الدقيق لأعضائها الأصلية16,17. تم وصف هذه التقنية لأول مرة من قبل ساتو وآخرون في عام 200917 وسمحت بإجراء دراسات أكثر قابلية للترجمة في المختبر في خطوط الخلايا الظهارية مما كان ممكنا في السابق باستخدام مزارع الخلايا السرطانية ثنائية الأبعاد18،19،20. المواد العضوية مفيدة في النماذج المختبرية في العديد من التخصصات الطبية الحيوية مثل السمية قبل السريرية 21،22،23 ، أو الامتصاص ، أو دراسات التمثيل الغذائي24،25،26،27،28 ، وكذلك في النهج الطبية الشخصية29،30،31 . تم وصف الثقافة الناجحة للعضويات المعوية للكلاب لأول مرة في عام 201912 ، في حين تم الإبلاغ عن المواد العضوية الكبدية المشتقة من لأول مرة من قبل Nantasanti et al. في عام 201532. ومنذ ذلك الحين تم استخدام عضويات الكلاب بنجاح في الدراسات التي تبحث في الاعتلالات المعوية المزمنة للكلاب ، وأورام اللحمية المعدية المعوية ، وسرطان القولون والمستقيم الغدي 12 ، ومرض ويلسون33،34.
في حين يمكن حصاد الخلايا الجذعية البالغة عن طريق الاستئصال ، فإن التكنولوجيا العضوية لا تتطلب دائما التضحية بالحيوانات. الخزعات بالمنظار والمنظار، أو حتى شفط الأعضاء بالإبرة الدقيقة35، هي مصدر قابل للتطبيق للخلايا الجذعية البالغة للعزل العضوي الظهاري12. ويسهل الاستخدام الواسع النطاق لهذه التقنيات غير الغازية في الممارسة البيطرية خيارات البحوث الانتقالية العكسية (ترجمة المعلومات من الممارسة السريرية البيطرية إلى الممارسة السريرية البشرية والعكس صحيح)15. يمكن ضمان المزيد من التقدم في التكنولوجيا العضوية من خلال توحيد ثقافة العضوية وطرق الصيانة. يعتمد البروتوكول العضوي المعروض هنا جزئيا على العمل المنشور سابقا ل Saxena et al. من عام 201536 ، وتم تكييف الطرق لتناسب تفاصيل ثقافة الكلاب المعوية والكبدية. ويبين الشكل 1 سير العمل العام لبروتوكولات الكلاب العضوية.
يقدم بروتوكول عزل الكلاب العضوي طرقا للحصول على عينات من الخزعات بالمنظار والمنظار والجراحة ، بالإضافة إلى النخر. وهو يحدد المعالجة الأولية المسبقة لعينات الأنسجة والمنهجيات المستخدمة للنقل إلى المختبر. يتم تلخيص المواد والكواشف اللازمة للعزل العضوي في قسم "التحضير للعزلة". يتم وصف عملية عزل الخلايا الجذعية البالغة من عينات الأنسجة بمزيد من التفصيل. أخيرا ، تتم مناقشة عملية طلاء المواد العضوية في هياكل تشبه القبة باستخدام مصفوفة غشاء خارج الخلية قابلة للذوبان.
البروتوكول الثاني ، بروتوكول صيانة الكلاب العضوية ، يصف طرق توثيق وزراعة المواد العضوية. تتم مناقشة تغييرات الوسائط وتواترها في هذا القسم. علاوة على ذلك ، يتم وصف الإجراءات المختبرية مثل تمرير وتنظيف مزارع الخلايا ، والتي تعد ضرورية لضمان الصيانة الناجحة للعضويات الكلاب 3D. يعد التمرير المناسب خطوة حاسمة في البروتوكول ، ويتم مناقشة التعديلات المحتملة واستكشاف الأخطاء وإصلاحها لهذه الخطوة بشكل أكبر في المخطوطة.
البروتوكول الأخير هو حصاد الكلاب العضوي وبروتوكول البنوك الحيوية الذي يحتوي على طرق لإعداد المواد العضوية الكاملة النمو لتضمين البارافين والحفاظ على الحمض النووي الريبي. كما يتم وصف طرق عينات العضوية من البنوك الحيوية في تخزين النيتروجين السائل هنا. وأخيرا، تتم مناقشة طرق إذابة العينات المجمدة ودعم نموها.
في الختام ، تهدف هذه المقالة إلى توفير إجراءات متسقة للاستزراع العضوي للكلاب من خلال توحيد البروتوكولات بين المختبرات. ومن خلال القيام بذلك، تهدف المخطوطة إلى تسهيل تكرار البيانات المستمدة من النماذج العضوية للكلاب لزيادة أهميتها في البحوث الطبية الحيوية الانتقالية.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63515/63515fig01.jpg"> الشكل 1: سير عمل بروتوكولات الكلاب العضوية. يصف بروتوكول عزل الكلاب العضوي إعداد المواد اللازمة للعزل العضوي ، وحصاد عينة من الأنسجة (من خلال وسائل النخر ، والمنظار ، والمنظار ، والخزعات الجراحية) ، والتوجيه بشأن تفكك الخلايا وطلاء السكان الخلويين. يناقش بروتوكول صيانة الكلاب العضوية تنظيف وتمرير ثقافة العضوي. يناقش بروتوكول الحصاد العضوي والبنوك الحيوية إعداد عينات عضوية لتضمين البارافين والمزيد من التوصيف العضوي. كما تناقش طرق المزارع العضوية للبنوك الحيوية وإحيائها من التخزين في النيتروجين السائل. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63515/63515fig01large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Chelating solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Sorbitol</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>BP439-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT</td>
			<td>Promega</td>
			<td>V3151</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>P217-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P5655-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4-2H2O</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S5136-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>S271-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen Strep</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>S5-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Organoid media</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>[Leu15]-Gastrin I human</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G9145-.5MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A-83-01</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>9094360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Advanced DMEM/F12</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12634-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17504-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Corning</td>
			<td>35-010-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamax</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>VWR Life Science</td>
			<td>J848-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human R-Spondin-1</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>120-38-500UG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Murine EGF</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>315-09-1MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Murine Noggin</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>250-38-250UG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Murine Wnt-3a</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>315-20-10UG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2 supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17502-048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-Acetyl-L-cysteine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9165-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nicotinamide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>N0636-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primocin</td>
			<td>InvivoGen</td>
			<td>ant-pm-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ROCK inhibitor (Y-27632)</td>
			<td>EMD Millipore Corp.</td>
			<td>SCM 075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SB202190 (P38 inhibitor)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S7067-25MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stemolecule CHIR99021 (GSK3&#946;)</td>
			<td>Reprocell</td>
			<td>04-0004-base</td>
			<td></td>
		</tr>
		
		<tr>
			<td>Trimethoprim</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T7883-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfamethoxazole</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7507-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic Acid, Glacial</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>A38-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl Sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Fisher Chemicals</td>
			<td>D128-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA, pH 8.0, 0.5 M</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15575-038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde (37%)</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>F79P-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G5882</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel Matrix For Organoid Culture</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356255</td>
			<td>Extracellular Membrane Matrix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde, 97%</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>A11313</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS, 1X (Phosphate-Buffered Saline)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-040-CM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS, 1X (Phosphate-Buffered Saline)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-040-CM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAlater Soln.</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM7021</td>
			<td>RNA Storage Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Express</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12604-021</td>
			<td>Trypsin-like Protease</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Other</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 Well Cell Culture Plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ACD Hybez II Hybridization System</td>
			<td>ACD a biotechne brand</td>
			<td>321710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge Tube, 15 mL</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430766</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CoolCell LX</td>
			<td>Corning</td>
			<td>BCS-405MC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryogenic Vials</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430488</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Centrifuge Tube (50 mL)</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>05-539-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GyroMini Nutating mixer (Rocker)</td>
			<td>Labnet</td>
			<td>S0500-230V-EU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat Bath</td>
			<td>Lab-Line Instruments</td>
			<td>3000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mr. Frosty Freezing Container</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>5100-0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop 2000</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>ND2000CLAPTOP</td>
			<td>SpectrophotometerAnalysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Panasonic incubator</td>
			<td>Panasonic</td>
			<td>MCO-170ML-PA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm M Wrapping Film</td>
			<td>Bemis Company Inc</td>
			<td>PM996/EMD</td>
			<td>Laboratory Flexible Film Tape</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protected Disposable Scalpels</td>
			<td>Bard-Parker</td>
			<td>239844</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAscope 2.5 HD Assay &#8211; RED</td>
			<td>ACD a biotechne brand</td>
			<td>322350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAscope H2O2 &#38; Protease Plus Reagents</td>
			<td>ACD a biotechne brand</td>
			<td>322330</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAscope Target Retrieval Reagents</td>
			<td>ACD a biotechne brand</td>
			<td>322000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAscope Wash Buffer Reagents</td>
			<td>ACD a biotechne brand</td>
			<td>310091</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Culture Dish</td>
			<td>Dot Scientific</td>
			<td>6676621</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Culture Plate 24 wells</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>FB012929</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

standardization and maintenance of 3d canine hepatic and intestinal organoid cultures for use in biomedical research

تصاب الكلاب بأمراض معقدة متعددة العوامل مماثلة للبشر ، بما في ذلك الأمراض الالتهابية وأمراض التمثيل الغذائي والسرطان. لذلك ، فإنها تمثل نماذج حيوانية كبيرة ذات صلة مع إمكانات انتقالية للطب البشري. المواد العضوية هي 3 أبعاد (3D) ، وهي هياكل ذاتية التجميع مشتقة من الخلايا الجذعية التي تحاكي التشريح الدقيق وعلم وظائف الأعضاء لجهازها الأصلي. يمكن استخدام هذه النماذج الانتقالية في المختبر لنفاذية الأدوية وتطبيقات الاكتشاف ، وتقييم السموم ، وتوفير فهم ميكانيكي للفيزيولوجيا المرضية للأمراض المزمنة متعددة العوامل. علاوة على ذلك ، يمكن للكلاب العضوية تحسين حياة الكلاب المرافقة ، وتوفير مدخلات في مختلف مجالات البحوث البيطرية وتسهيل تطبيقات العلاج الشخصية في الطب البيطري. يمكن لمجموعة صغيرة من المتبرعين إنشاء بنك حيوي من العينات العضوية ، مما يقلل من الحاجة إلى حصاد الأنسجة المستمر ، حيث يمكن زراعة خطوط الخلايا العضوية إلى أجل غير مسمى. هنا ، يتم تقديم ثلاثة بروتوكولات تركز على ثقافة عضويات الكلاب المعوية والكبدية المشتقة من الخلايا الجذعية البالغة. يحدد بروتوكول عزل الكلاب العضوي طرقا لمعالجة الأنسجة وتضمين عزل الخلية في مصفوفة داعمة (مصفوفة غشاء خارج الخلية قابلة للذوبان). يصف بروتوكول صيانة الكلاب العضوية نمو العضوية وصيانتها ، بما في ذلك التنظيف والمرور جنبا إلى جنب مع التوقيت المناسب للتوسع. يصف بروتوكول الحصاد العضوي والبنوك الحيوية طرقا لاستخراج المواد العضوية وتجميدها والحفاظ عليها لمزيد من التحليل.

Watch this Scientific Journal Video about Standardization and Maintenance of 3D Canine Hepatic and Intestinal Organoid Cultures for Use in Biomedical Research at JoVE.com

Standardization and Maintenance of 3D Canine Hepatic and Intestinal Organoid Cultures for Use in Biomedical Research

يتم وصف الطرق التجريبية لحصاد الخلايا الجذعية البالغة من الأنسجة المعوية والكبدية للكلاب لإنشاء ثقافات عضوية 3D. علاوة على ذلك ، تتم مناقشة التقنيات المختبرية لضمان النمو المتسق وتوفير إجراءات تشغيل قياسية للحصاد والبنك الحيوي وإحياء مزارع الكلاب المعوية والكبدية.

توحيد وصيانة 3D الكلاب الكبد والثقافات العضوية المعوية للاستخدام في البحوث الطبية الحيوية

Dogs develop complex multifactorial diseases analogous to humans, including inflammatory diseases, metabolic diseases, and cancer. Therefore, they ...

بروتوكولات زراعة الكلاب العضوية الكبدية والمعوية مهمة لتوحيد هذه التكنولوجيا الجديدة. تسمح هذه التقنية بإنشاء موثوق به وقابل للتكرار لثقافة الكلاب العضوية بما في ذلك العزل العضوي والصيانة والحصاد والبنوك الحيوية اللاحقة للعينات. يمكن أن توفر عضويات الكلاب نموذجا ممتازا للعديد من التطبيقات التي تمتد من البيولوجيا ، وتطوير الأمراض المعدية ، واختبار الأدوية واكتشافها ، وكذلك أدوية الانتقال.للبدء ، قم بإعداد خمسة أنابيب طرد مركزي 15 ملليلتر مع خمسة ملليلترات من محلول مخلب كامل 1X ، وأنبوب واحد مع ثلاثة ملليلترات من محلول مخلب كامل 1X ، وأنبوب فارغ واحد ، وأنبوب واحد مع خمسة ملليلتر من محلول مخلب كامل 1X ، وملليلتر من مصل البقر الجنيني. في يوم العزل ، ضع طبق بتري معقم ومشرط ودلو ثلج وخليط مغذيات DMEM متقدم بارد F12 في خزانة السلامة الأحيائية. ضع العدد المطلوب من لوحة زراعة الخلايا المكونة من 24 بئرا في حاضنة ثاني أكسيد الكربون لتسخينها مسبقا.ضع مصفوفة الغشاء خارج الخلية المذابة على الجليد للذوبان. قم بتبريد جهاز الطرد المركزي مسبقا إلى أربع درجات مئوية. انقل الوسائط الكاملة مع عوامل النمو من الفريزر إلى حمام مائي 37 درجة مئوية لتجنب التعرض المباشر للضوء.رج عينات الأنسجة في أنبوب النقل لمدة 30 ثانية. قم بإزالة السوبرناتانت المفرط دون التخلص من أي أنسجة عن طريق السحب البطيء بالقرب من سطح السائل حتى يتم ترك 0.5 ملليلتر في الأنبوب. انقل الأنسجة وبقايا السوبرنات إلى طبق بتري معقم.باستخدام مشرط يمكن التخلص منه ، قم بتقطيع الأنسجة وفرمها إلى قطع أصغر تشبه قوام الهريس لمدة خمس دقائق تقريبا. قم بتقطيع الأنسجة المفرومة بالسائل من طبق بتري إلى أول أنبوب محلول مخلبي كامل ، ثم أضف ملليلترين من خليط المغذيات DMEM المتقدم F12 إلى طبق بتري. اغسل الأنسجة المتبقية وانقلها إلى أول أنبوب محلول مخلب كامل.دوامة أنبوب محلول مخلب كامل 1X حوالي خمس مرات لمدة خمس ثوان. اسمح للخزعات بالاستقرار في قاع الأنبوب لمدة دقيقة واحدة وقم بإزالة supernatant حتى يتم ترك خمسة ملليلترات. انقل محلول المخلب الكامل 1X من الأنبوب الجديد إلى أنبوب العينة.كرر الخطوة السابقة للأنبوبين التاليين. وفي الغسلتين الأخيرتين ، قم بإزالة supernatant إلى ثلاثة ملليلتر المتبقية في الأنبوب. انقل الخزعات ومحلول مخلب كامل 1X من أنبوب العينة إلى بئر واحد من صفيحة من ستة آبار.أضف ثلاثة ملليلترات من محلول مخلب كامل 1X إلى أنبوب العينة. تدور بلطف لجمع أي أنسجة متبقية ونقلها إلى نفس البئر من اللوحة. أضف 150 ميكرولتر من 0.5 حمض رباعي أسيتيك الإيثيلين ديامين المولي في بئر وضع الصفيحة المكونة من ستة آبار على هزاز 20 درجة و 24 دورة في الدقيقة عند أربع درجات مئوية.احتضان عينات الكبد لمدة 10 دقائق والعينات المعوية لمدة ساعة واحدة على الروك المتحرك. انقل الصفيحة المكونة من ستة آبار مرة أخرى إلى خزانة السلامة الأحيائية وانقل الأنسجة المفرومة والسائل إلى أنبوب يحتوي على محلول مخلب كامل 1X مع مصل بقري جنيني. اسمح للأنسجة بالاستقرار ونقل السوبرناتانت مع 0.2 ملليلتر من الجزء العلوي من الأنسجة إلى أنبوب فارغ.قم بتدوير الأنبوب الذي يحتوي على العينة عند 700 XG لمدة خمس دقائق عند أربع درجات مئوية. يتم الآن تكوير الخلايا الجذعية جنبا إلى جنب مع الأنسجة المفرومة. قم بإزالة والتخلص من supernatant بعناية حتى لا تزعج الكرية.أعد تعليق الكريات في DMEM F12 المتقدم. قم بتدوير الأنبوب مرة أخرى وقم بشفط supernatant دون إزعاج الكرية. أضف الحجم المحسوب لمصفوفة الغشاء خارج الخلية المذابة إلى أنبوب العينة.كن حذرا عند إزالة الوسائط حتى لا تفقد حبيبات الخلية. عند إضافة مصفوفة غشاء خارج الخلية ، ماصة ببطء لعدم إنشاء فقاعات مفرطة في التعليق العضوي. احتفظ بالعينة مع مصفوفة الغشاء خارج الخلية المذابة على الجليد وزرع التعليق في منتصف الآبار بحيث تشكل مصفوفة الغشاء خارج الخلية المذابة بنية تشبه القبة.انقل اللوحة إلى حاضنة واسمح لمصفوفة الغشاء خارج الخلية المذابة بالتصلب لمدة 30 دقيقة. امزج مثبط ROCK و GSK3 beta في وسائط كاملة مع عوامل النمو وأضف 500 ميكرولتر من هذا الحل إلى كل بئر. ضع اللوحة في الحاضنة.عادة ما يولد بروتوكول الكلاب العضوي حوالي 50،000 إلى 150،000 خلية معوية أو كبدية لكل بئر. بعد عزل الخلايا الجذعية ، تبدأ عضويات الكلاب الكبدية دورة حياتها ككرويات موسعة ، وبعد سبعة أيام ، تتحول إلى عضويات ناشئة ومميزة. تم حساب الحجم ومساحة السطح ومنطقة القطع الناقص 2D ومحيط الكرويات.تم استخدام منطقة القطع الناقص 2D ومحيطها لتقييم صحة الثقافة العضوية. أظهر تقييم التعبير عن العلامات بطريقة شبه كمية أن الكرويات عبرت بشكل تفضيلي عن علامة الخلايا الصفراوية KRT7 التي تتراوح من واحد إلى 26٪ تراوح تعبير علامة الخلايا الجذعية LGR5 بين 0.17 و 0.78٪ في حين تم التعبير عن علامات خلايا الكبد إلى حد أقل عند 0.05 إلى 0.34٪ لصندوق الرأس الشوكي 1A و 0.03 إلى 0.28٪ للسيتوكروم-P450. لم تمنع الحضانة لمدة 12 دقيقة مع البروتياز الشبيه بالتريبسين نمو المواد العضوية.ومع ذلك ، تأثر نمو المواد العضوية سلبا باستخدام حضانة لمدة 24 دقيقة. تم تحليل قدرة الأعضاء الكبدية الكلاب على البقاء في بيئة غير مواتية لتحديد حجم الوسائط العضوية ومصفوفة الطابق السفلي اللازمة للنمو الناجح للعضويات الكبدية وبقائها. تراوح معدل البقاء على قيد الحياة من المواد العضوية من 12.9 يوما إلى 18 يوما.تقنيات زراعة الخلايا الأساسية والنهج المعقمة هي المتطلبات الأساسية للعزل العضوي السليم والصيانة.

Research

JoVE Journal

Medicine

In Vivo Canine Muscle Function Assay

In Vivo Canine Muscle Function Assay

فيفو الناب في العضلات وظيفة الفحص

We describe a minimally-invasive and reproducible method to measure canine pelvic limb muscle strength and muscle response to repeated eccentric 
...

Generation of Alginate Microspheres for Biomedical Applications

جيل من المجهرية الجيني للتطبيقات الطبية الحيوية

Alginate-based materials have received considerable attention for biomedical applications because of their hydrophilic nature, biocompatibility, and ...

The Bovine Lung in Biomedical Research: Visually Guided Bronchoscopy, Intrabronchial Inoculation and In Vivo Sampling Techniques

The Bovine Lung in Biomedical Research: Visually Guided Bronchoscopy, Intrabronchial Inoculation and In Vivo Sampling Techniques

والبقري الرئة في البحوث الطبية الحيوية: إذ تسترشد بصريا القصبات، داخل القصبة التلقيح و<em&gt; في فيفو</em&gt; تقنيات أخذ العينات

There is an ongoing search for alternative animal models in research of respiratory medicine. Depending on the goal of the research, large animals as ...

Use of a Low-flow Digital Anesthesia System for Mice and Rats

استخدام نظام التخدير الرقمية منخفضة لتدفق الفئران والجرذان

A traditional vaporizer depends on flowing gas and atmospheric pressure for passive anesthetic vaporization. Newly developed direct injection vaporizers ...

Forskolin-induced Swelling in Intestinal Organoids: An In Vitro Assay for Assessing Drug Response in Cystic Fibrosis Patients

Forskolin-induced Swelling in Intestinal Organoids: An In Vitro Assay for Assessing Drug Response in Cystic Fibrosis Patients

Forskolin-الناجم عن تورم في الأمعاء Organoids: ل<em&gt; في المختبر</em&gt; الفحص لتقييم الاستجابة للدواء في التليف الكيسي المرضى

Recently-developed cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR)-modulating drugs correct surface expression and/or function of the mutant ...

Optimized Analysis of In Vivo and In Vitro Hepatic Steatosis

Optimized Analysis of In Vivo and In Vitro Hepatic Steatosis

تحليل الأمثل ل<em&gt; في فيفو</em&gt; و<em&gt; في المختبر</em&gt; كبدي تشحم

Establishing a system of procedures to qualitatively and quantitatively characterize in vivo and in vitro hepatic steatosis is important for metabolic ...

Improvement of a Closed Chest Porcine Myocardial Infarction Model by Standardization of Tissue and Blood Sampling Procedures

تحسين نموذج احتشاء عضلة القلب الخنزير الصدر مغلقة بتوحيد إجراءات أخذ عينات الدم والأنسجة

Myocardial ischemia reperfusion (I/R) injury contributes to almost half of the necrotic area after myocardial infarction. To date there is no approved ...

Generation of Human 3D Lung Tissue Cultures (3D-LTCs) for Disease Modeling

Generation of Human 3D Lung Tissue Cultures 3D-LTCs for Disease Modeling

جيل زرع الأنسجة البشرية الرئة 3D (3D-الصلب) للنمذجة المرض

Translation of novel discoveries to human disease is limited by the availability of human tissue-based models of disease. Precision-cut lung slices (PCLS) ...

Use of 3D Robotic Ultrasound for In Vivo Analysis of Mouse Kidneys

Use of 3D Robotic Ultrasound for In Vivo Analysis of Mouse Kidneys

استخدام الموجات فوق الصوتية الروبوتية 3D لتحليل في الجسم الحي من الكلى الماوس

Common modalities for in vivo imaging of rodents include positron emission tomography (PET), computed tomography (CT), magnetic resonance imaging (MRI), ...

Standardizing the Responses to Platelet Agonist Collagen-Related Peptide

Reproducibility and Harmonization in Research Using Biological Standards: The Example of Platelet Agonist Collagen-Related Peptide

Biological Standardization to Ensure Reproducibility and Harmonization in Research (Video) | JoVE

التكاثر والمواءمة في البحث باستخدام المعايير البيولوجية: مثال على الببتيد المرتبط بالكولاجين ناهض الصفائح الدموية

Metrology - the science of measure - is a subject few biological scientists are taught about in their training to their detriment; the application of ...