Name: standardization and maintenance of 3d canine hepatic and intestinal organoid cultures for use in biomedical research
Uploaded: 2022-01-31T15:00:00
Duration: 8 min 39 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Standardization and Maintenance of 3D Canine Hepatic and Intestinal Organoid Cultures for Use in Biomedical Research at JoVE.com

Forfatterne ønsker at udtrykke taknemmelighed over for Veterinary Diagnostic Laboratory of Iowa State University medarbejdere, nemlig Haley M. Lambert, Emily Rahe, Rosalyn M. Branaman, Victoria J. Green og Jennifer M. Groeltz-Thrush, for rettidig behandling af de leverede prøver. Forfatterne ønsker at anerkende støtte fra fakultetets opstart, ISU VPR Miller Award, ISU VPR Miller Award og NSF SBIR sub-award til ISU # 1912948.

<ol>
	<li>Hickman, D. L., Johnson, J., Vemulapalli, T. H., Crisler, J. R., Shepherd, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Commonly+used+animal+models.">Commonly used animal models.</a> Principles of Animal Research for Graduate and Undergraduate Students. , 117-175 (2017).</li><li>De Jong, M., Maina, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Of+mice+and+humans:+Are+they+the+same?+-+Implications+in+cancer+translational+research.">Of mice and humans: Are they the same? - Implications in cancer translational research.</a> Journal of Nuclear Medicine. 51 (4), 501-504 (2010).</li><li>Cannarozzi, G., Schneider, A., Gonnet, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+phylogenomic+study+of+human,+dog,+and+mouse.">A phylogenomic study of human, dog, and mouse.</a> PLoS Computational Biology. 3 (1), 0009-0014 (2007).</li><li>Jacob, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Researchers+turn+to+canine+clinical+trials+to+advance+cancer+therapies.">Researchers turn to canine clinical trials to advance cancer therapies.</a> JAMA - Journal of the American Medical Association. 315 (15), 1550-1552 (2016).</li><li>Ziegler, A., Gonzalez, L., Blikslager, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large+animal+models:+The+key+to+translational+discovery+in+digestive+disease+research.">Large animal models: The key to translational discovery in digestive disease research.</a> Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 2 (6), 716-724 (2016).</li><li>Swanson, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phylogenetic+and+gene-centric+metagenomics+of+the+canine+intestinal+microbiome+reveals+similarities+with+humans+and+mice.">Phylogenetic and gene-centric metagenomics of the canine intestinal microbiome reveals similarities with humans and mice.</a> ISME Journal. 5 (4), 639-649 (2011).</li><li>Coelho, L. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Similarity+of+the+dog+and+human+gut+microbiomes+in+gene+content+and+response+to+diet.">Similarity of the dog and human gut microbiomes in gene content and response to diet.</a> Microbiome. 6 (1), 72 (2018).</li><li>Nguyen, T. L. A., Vieira-Silva, S., Liston, A., Raes, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+informative+is+the+mouse+for+human+gut+microbiota+research.">How informative is the mouse for human gut microbiota research.</a> DMM Disease Models and Mechanisms. 8 (1), 1-16 (2015).</li><li>Bontempo, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nutrition+and+health+of+dogs+and+cats:+Evolution+of+petfood.">Nutrition and health of dogs and cats: Evolution of petfood.</a> Veterinary Research Communications. 29, 45-50 (2005).</li><li>Allenspach, K., Gaschen, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Canine+chronic+enteropathies:+A+review.">Canine chronic enteropathies: A review.</a> Schweizer Archiv fur Tierheilkunde. 145 (5), 209-222 (2003).</li><li>Tribuddharatana, T., Kongpiromchean, Y., Sribhen, K., Sribhen, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biochemical+alterations+and+their+relationships+with+the+metabolic+syndrome+components+in+canine+obesity.">Biochemical alterations and their relationships with the metabolic syndrome components in canine obesity.</a> Kasetsart Journal - Natural Science. 45 (4), 622-628 (2011).</li><li>Chandra, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derivation+of+adult+canine+intestinal+organoids+for+translational+research+in+gastroenterology.">Derivation of adult canine intestinal organoids for translational research in gastroenterology.</a> BMC Biology. 17 (1), 33 (2019).</li><li>Schaefer, K., Rensing, S., Hillen, H., Burkhardt, J. E., Germann, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Is+Science+the+only+driver+in+species+selection?+An+internal+study+to+evaluate+compound+requirements+in+the+minipig+compared+to+the+dog+in+preclinical+studies.">Is Science the only driver in species selection? An internal study to evaluate compound requirements in the minipig compared to the dog in preclinical studies.</a> Toxicologic Pathology. 44 (3), 474-479 (2016).</li><li>MacArthur Clark, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+3Rs+in+research:+A+contemporary+approach+to+replacement,+reduction+and+refinement.">The 3Rs in research: A contemporary approach to replacement, reduction and refinement.</a> British Journal of Nutrition. 120, 1-7 (2018).</li><li>Schneider, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Model-based+reverse+translation+between+veterinary+and+human+medicine:+The+one+health+initiative.">Model-based reverse translation between veterinary and human medicine: The one health initiative.</a> CPT: Pharmacometrics and Systems Pharmacology. 7 (2), 65-68 (2018).</li><li>Lehmann, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+organoids:+A+new+dimension+in+cell+biology.">Human organoids: A new dimension in cell biology.</a> Molecular Biology of the Cell. 30 (10), 1129-1137 (2019).</li><li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+Lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche.">Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).</li><li>Kim, J., Koo, B. K., Knoblich, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+organoids:+model+systems+for+human+biology+and+medicine.">Human organoids: model systems for human biology and medicine.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 21 (10), 571-584 (2020).</li><li>Jensen, C., Teng, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Is+it+time+to+start+transitioning+from+2D+to+3D+cell+culture.">Is it time to start transitioning from 2D to 3D cell culture.</a> Frontiers in Molecular Biosciences. 7, 33 (2020).</li><li>Ho, B. X., Pek, N. M. Q., Soh, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disease+modeling+using+3D+organoids+derived+from+human+induced+pluripotent+stem+cells.">Disease modeling using 3D organoids derived from human induced pluripotent stem cells.</a> International Journal of Molecular Sciences. 19 (4), 936 (2018).</li><li>Truskey, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+microphysiological+systems+and+organoids+as+in+vitro+models+for+toxicological+studies.">Human microphysiological systems and organoids as in vitro models for toxicological studies.</a> Frontiers in Public Health. 6, 185 (2018).</li><li>Caipa Garcia, A. L., Arlt, V. M., Phillips, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoids+for+toxicology+and+genetic+toxicology:+applications+with+drugs+and+prospects+for+environmental+carcinogenesis.">Organoids for toxicology and genetic toxicology: applications with drugs and prospects for environmental carcinogenesis.</a> Mutagenesis. , (2021).</li><li>Augustyniak, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoids+are+promising+tools+for+species-specific+in+vitro+toxicological+studies.">Organoids are promising tools for species-specific in vitro toxicological studies.</a> Journal of Applied Toxicology. 39 (12), 1610-1622 (2019).</li><li>Zietek, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoids+to+study+intestinal+nutrient+transport,+drug+uptake+and+metabolism+-+Update+to+the+human+model+and+expansion+of+applications.">Organoids to study intestinal nutrient transport, drug uptake and metabolism - Update to the human model and expansion of applications.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 577656 (2020).</li><li>Zietek, T., Rath, E., Haller, D., Daniel, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+organoids+for+assessing+nutrient+transport,+sensing+and+incretin+secretion.">Intestinal organoids for assessing nutrient transport, sensing and incretin secretion.</a> Scientific Reports. 5 (1), 1-10 (2015).</li><li>Kar, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoids:+a+promising+new+in+vitro+platform+in+livestock+and+veterinary+research.">Organoids: a promising new in vitro platform in livestock and veterinary research.</a> Veterinary Research. 52 (1), 1-17 (2021).</li><li>Borcherding, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sa1976+polyphenols+reverse+the+pathologic+effects+of+palmitic+acid+and+high+fat+diet+in+canine+enteroids.">Sa1976 polyphenols reverse the pathologic effects of palmitic acid and high fat diet in canine enteroids.</a> Gastroenterology. 158 (6), 486 (2020).</li><li>Ambrosini, Y. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recapitulation+of+the+accessible+interface+of+biopsy-derived+canine+intestinal+organoids+to+study+epithelial-luminal+interactions.">Recapitulation of the accessible interface of biopsy-derived canine intestinal organoids to study epithelial-luminal interactions.</a> PLoS ONE. 15 (4), 0231423 (2020).</li><li>Zdyrski, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Su124+homology+directed+repair+in+canine+duodenal+enteroids+to+mimic+the+wild-type+P-glycoprotein+mutation.">Su124 homology directed repair in canine duodenal enteroids to mimic the wild-type P-glycoprotein mutation.</a> Gastroenterology. 160 (6), 625 (2021).</li><li>Li, Y., Tang, P., Cai, S., Peng, J., Hua, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoid+based+personalized+medicine:+from+bench+to+bedside.">Organoid based personalized medicine: from bench to bedside.</a> Cell Regeneration. 9 (1), 21 (2020).</li><li>Kurr, L. A., Allenspach, K., Jergens, A., Mochel, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Harnessing+the+biology+of+intestinal+organoids+to+accelerate+drug+discovery+in+inflammatory+bowel+disease:+A+one+health+approach.">Harnessing the biology of intestinal organoids to accelerate drug discovery in inflammatory bowel disease: A one health approach.</a> The FASEB Journal. 34, 1 (2020).</li><li>Nantasanti, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disease+modeling+and+gene+therapy+of+copper+storage+disease+in+canine+hepatic+organoids.">Disease modeling and gene therapy of copper storage disease in canine hepatic organoids.</a> Stem Cell Reports. 5 (5), 895-907 (2015).</li><li>Favier, R. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=COMMD1-Deficient+dogs+accumulate+copper+in+hepatocytes+and+provide+a+good+model+for+chronic+hepatitis+and+fibrosis.">COMMD1-Deficient dogs accumulate copper in hepatocytes and provide a good model for chronic hepatitis and fibrosis.</a> PLoS ONE. 7 (8), 42158 (2012).</li><li>Kruitwagen, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+survival+of+transplanted+autologous+canine+liver+organoids+in+a+COMMD1-deficient+dog+model+of+metabolic+liver+disease.">Long-term survival of transplanted autologous canine liver organoids in a COMMD1-deficient dog model of metabolic liver disease.</a> Cells. 9 (2), 410 (2020).</li><li>Vilgelm, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fine-needle+aspiration-based+patient-derived+cancer+organoids.">Fine-needle aspiration-based patient-derived cancer organoids.</a> iScience. 23 (8), 101408 (2020).</li><li>Saxena, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+intestinal+enteroids:+A+new+model+to+study+human+rotavirus+infection,+host+restriction,+and+pathophysiology.">Human intestinal enteroids: A new model to study human rotavirus infection, host restriction, and pathophysiology.</a> Journal of Virology. 90 (1), 43-56 (2016).</li><li>VanDussen, K. L., Sonnek, N. M., Stappenbeck, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=L-WRN+conditioned+medium+for+gastrointestinal+epithelial+stem+cell+culture+shows+replicable+batch-to-batch+activity+levels+across+multiple+research+teams.">L-WRN conditioned medium for gastrointestinal epithelial stem cell culture shows replicable batch-to-batch activity levels across multiple research teams.</a> Stem Cell Research. 37, 101430 (2019).</li><li>Powell, R. H., Behnke, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=WRN+conditioned+media+is+sufficient+for+in+vitro+propagation+of+intestinal+organoids+from+large+farm+and+small+companion+animals.">WRN conditioned media is sufficient for in vitro propagation of intestinal organoids from large farm and small companion animals.</a> Biology Open. 6 (5), 698-705 (2017).</li><li>Mackenzie, J. S., Jeggo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+one+health+approach-why+is+it+so+important.">The one health approach-why is it so important.</a> Tropical Medicine and Infectious Disease. 4 (2), 88 (2019).</li><li>Artegiani, B., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+and+application+of+3D-organoid+technology.">Use and application of 3D-organoid technology.</a> Human Molecular Genetics. 27 (2), 99-107 (2018).</li></ol>

K. Allenspach er medstifter af LifEngine Animal Health og 3D Health Solutions. Hun fungerer som konsulent for Ceva Animal Health, Bioiberica, LifeDiagnostics, Antech Diagnostics, Deerland Probiotics og Mars. J. P. Mochel er medstifter af LifEngine Animal Health og 3D Health Solutions. Dr. Mochel fungerer som konsulent for Ceva Animal Health og Ethos Animal Health. Andre forfattere har ingen interessekonflikter at erklære.

Der mangler i øjeblikket standardiserede protokoller til isolering og vedligeholdelse af hundes lever- og tarmorganoider. Etablering af standardprocedurer for organoidkulturer er berettiget for, at denne model kan anvendes i forskellige laboratorieindstillinger. Specifikt er tilvejebringelse af standardiserede driftsprotokoller til dyrkning af disse hundeorganoidmodeller nøglen til at karakterisere organoidernes normale vækst under kultur og passaging for at udlede optimale tidspunkter for udvidelse og vedligeholdelse. Hunde tarmorganoider dyrket ved hjælp af protokollen har tidligere været karakteriseret ved Chandra et al.12.
Et af de mest kritiske trin i protokollen er passaging af organoider. Den optimale tid for den første passage af leversfæroider blev bestemt til at være på dag 7 efter isolering baseret på de hepatiske sfæroidmålinger. Det maksimale volumen af sfæroider blev opnået på dag 7, og samtidig begyndte sfæroider at knoppe og dannede leverorganoider. Stigningen i det samlede organoidvolumen fra dag 2-7 efter isolation var mere end 365 gange, hvilket tyder på, at den optimale passagetid er længere end hundens tarmorganoidkultur. Efter 7 dage i dyrkning blev der ikke observeret grove tegn på cellulær apoptose i leversfæroiden, selv uden rengøring eller passaging (figur 7). Passaging af tarm- og leverorganoider kan være udfordrende, da proceduren kan føre til tab af celler og ændret levedygtighed. Resultaterne tyder på, at langvarig inkubation af leverorganoider med trypsinlignende protease (op til 12 minutter) ikke påvirker subkulturen negativt. Inkubation af organoiderne i trypsinlignende protease i mere end 24 minutter kan være skadeligt for den efterfølgende subkultur af organoiderne.
I tilfælde af suboptimal brud i celleklyngerne med organoidpassagen kan mekanisk dissociation i stedet for langvarig inkubation med trypsinlignende protease være mere gavnlig. Hvis der opstår problemer med korrekt dissociation af organoiderne, kan kort hvirvel af prøverne forsøges for at forbedre passageudbyttet. På den anden side har hvirvel potentialet til at ødelægge en kultur og beskadige celler, så det bør kun bruges, når andre procedurer gentagne gange har fejlet. At bryde leverorganoider i enkeltceller sænker organoidernes væksthastighed, mens de brydes i klynger af celler, kan i høj grad forbedre deres levedygtighed. Ti minutter blev valgt som inkubationstid for organoidprotokollen. Et inkubationstidspunkt på 12 minutter blev anset for ikke cytotoksisk sammenlignet med en 24 minutters inkubation i det trypsinlignende proteaseeksperiment.
Overlevelsesforsøget bekræftede, at hundes leverorganoider kunne overleve i op til 19,5 dage under ugunstige forhold (strukturel og ernæringsmæssig udtømning). Organoider, der overlevede disse forhold længst, blev dyrket med CMGF + medier. Denne observation kan have været forårsaget af den langsommere vækst af leverorganoider i medier, der ikke er suppleret med Rock-hæmmer og GSK3β. Organoidkulturer med CMGF + R / G voksede hurtigere og kan have udtømt deres ressourcer hurtigere. Dette eksperiment åbner muligheder for at miniaturisere hundens organoidkultur for at opnå en systemkonvertering med høj gennemstrømning. En sådan teknologi viser potentialet til at lette lægemiddelopdagelse eller toksikologiske undersøgelser til en væsentligt reduceret pris.
Nogle almindelige problemer, der opstår under vedligeholdelse af hundeorganoidkultur, er forkert prøvestørkning ved plettering, kulturforurening og etablering af den korrekte tæthed og størrelse af organoiderne. Hvis opløselig ECM størkner for tidligt under plettering, skal du straks placere den på is i 10 minutter. Hvis opløselig ECM ikke danner kuppellignende strukturer, er det sandsynligt, at der ikke blev fjernet nok medier fra prøven. Hvis dette er tilfældet, fortyndes prøven med en mere opløselig ECM, indtil der dannes kupler.
Når der findes svampe- eller bakterieforurening i en hel plade (se figur 4), er den bedste løsning at kassere pladen. Behandling med svampedræbende eller antibiotiske lægemidler kan forsøges, men succesen med et sådant forsøg er ekstremt lavt. Hvis en enkelt brønd er forurenet i en plade, kan levedygtige og upåvirkede brønde rengøres (følg trin 4.1 til 4.5) til en ny plade og overvåges nøje. Hvis prøven allerede er nødfrosset, anbefales det at kassere hele prøven, da optøning af prøven udsætter inkubatoren for yderligere forureningsrisiko.
Sund organoidkultur bør være mindst i kategorien mellemstørrelse og medium densitet eller større. Optimal tæthed er afgørende for organoid kultur vækst. Lavere densitet skal korrigeres ved at rense organoiderne til medium densitet. Hvis situationen med ekstrem tæthed opstår (overbelægning), skal organoiderne udvides til flere brønde. Grove tegn på cellulær apoptose ledsager ofte både overbelægning og lav densitet af organoidkulturen. Hvis disse problemer ikke korrigeres i tide, vil hele organoidkulturen blive apoptotisk i løbet af få dage. Hvis organoider opnår ekstra stor størrelse eller meget høj densitet, skal kulturen bruges til et eksperiment, frysning eller fiksering.
Organoidmediet indeholder i øjeblikket 17 komponenter, og tilføjelsen af vækstfaktorer, der er nødvendige for vedligeholdelse og ekspansion af organoider, kan derfor være dyr. Dette problem kan løses ved at dyrke 2D-cellekulturer, der syntetiserer vækstfaktorerne for at producere betinget CMGF +. Cellekultur L-WRN producerer Wnt-3a, R-Spondin-3 og Noggin vækstfaktorer37. Cellekolonien bruger 90% DMEM / F12 og 10% FBS kulturmedier. Når kulturen opnår 90 procent sammenløb, høstes medier hver dag i 1 uge. De høstede medier blandes derefter med 2x CMGF+ (uden disse vækstfaktorer). Mens 2D-kulturer kan producere de nødvendige vækstfaktorer til en brøkdel af prisen, må den ekstra tid og forberedelse til at producere medierne forventes. Koncentrationerne af vækstfaktorer mellem konditionerede mediebatcher kan også variere37,38.
Voksne stamcelleafledte organoidkulturer af hunde er en unik biomedicinsk model, der kan hjælpe med at nå målene for One Health Initiative39. Organoidteknologien kan anvendes inden for mange grundlæggende og biomedicinske forskningsområder, der spænder fra udviklingsbiologi, patofysiologi, lægemiddelopdagelse og -testning, toksikologi til undersøgelse af infektionssygdomme og regenerativ medicin40. Translationel og omvendt translationel forskning er begge områder, hvor hundeorganoider er anvendelige15. Hunde er blevet brugt i århundreder i translationelle eksperimentelle omgivelser, og deres ledsagende dyrstatus har også lettet deres position som en af de mest udforskede arter inden for veterinærmedicin.
Afslutningsvis giver dette manuskript standardiserede driftsprotokoller til isolering, vedligeholdelse, høst og biobanking af hundes lever- og tarmorganoider for at lette anvendelsen af denne model på forskellige biomedicinske områder. Denne model er unikt egnet til at fremme omvendt translationel forskning som et redskab i One Health-initiativet til at fremme inter- og intradisciplinær deling af viden.

Gnavere er den mest anvendte dyremodel til biomedicinsk og translationel forskning1. De er usædvanligt nyttige til at undersøge grundlæggende molekylær patogenese af sygdommene, selv om deres kliniske relevans for kroniske multifaktorielle sygdomme for nylig er blevet stillet spørgsmålstegn ved2. Hundemodellen udviser flere fordele i forhold til gnavere3,4. Hunde og mennesker deler ligheder i metabolomics og intestinal mikrobiom, der udviklede sig på grund af forbrug af menneskelig kost gennem forskellige perioder af deres domesticering5,6,7. Ligheder mellem hundes og menneskets mave-tarm-anatomi og fysiologi er et andet af eksemplerne8.
Derudover deler hunde ofte lignende miljøer og livsstil med deres ejere9. Hundens længere levetid i forhold til gnavere giver mulighed for en naturlig udvikling af mange kroniske tilstande10. Inflammatorisk tarmsygdom eller metabolisk syndrom er eksempler på multifaktorielle kroniske sygdomme, der deler vigtige ligheder mellem mennesker og hunde11,12. Prækliniske forsøg med hunde, der involverer hunde med naturligt forekommende sygdomme, kan generere mere pålidelige data end dem, der er opnået fra gnavermodeller13. For at minimere brugen af levende dyreforskning og overholde principperne i 3R'erne (Reduce, Refine, Replace)14 er der imidlertid opstået alternativer til in vivo-test ved hjælp af 3D in vitro-hundeorganoider15.
Organoider er selvsamlede 3D-stamcelleafledte strukturer, der rekapitulerer fysiologien og mikroanatomien i deres oprindelige organer16,17. Denne teknologi blev først beskrevet af Sato et al. i 200917 og tillod mere oversættelige in vitro-undersøgelser i epitelcellelinjer, end det tidligere var muligt ved hjælp af 2D-kræftcellekulturer18,19,20. Organoider er nyttige in vitro-modeller i mange biomedicinske discipliner såsom i præklinisk toksikologiske21,22,23, absorptions- eller metabolismeundersøgelser24,25,26,27,28 samt i personlige medicinske tilgange29,30,31 . Den vellykkede kultur af hundes tarmorganoider er blevet beskrevet for første gang i 201912, mens leverorganoider afledt af en hund først blev rapporteret af Nantasanti et al. i 201532. Hundeorganoider er siden blevet anvendt med succes i undersøgelser, der undersøger kroniske enteropatier hos hunde, gastrointestinale stromale tumorer, kolorektal adenocarcinom12 og Wilsons sygdom33,34.
Mens voksne stamceller kan høstes via obduktioner, kræver organoidteknologien ikke altid ofring af dyrene. Endoskopiske og laparoskopiske biopsier eller endda finnålespirater af organer35 er en levedygtig kilde til voksne stamceller til epitelorganoidisolering12. Udbredt anvendelse af sådanne ikke-invasive teknikker i veterinærpraksis letter mulighederne for omvendt translationel forskning (oversættelse af oplysninger fra veterinær klinisk praksis til human klinisk praksis og omvendt)15. Yderligere fremskridt inden for organoidteknologi kan sikres ved standardisering af organoidkultur og vedligeholdelsesmetoder. Den organoidprotokol, der præsenteres her, er delvist baseret på tidligere offentliggjort arbejde af Saxena et al. fra 201536, og metoder blev tilpasset til at passe til specifikationer for hundetarm og leverorganoidkultur. Den overordnede arbejdsgang for hundens organoidprotokoller er afbildet i figur 1.
Canine Organoid Isolation Protocol introducerer metoder til opnåelse af prøver fra endoskopiske, laparoskopiske og kirurgiske biopsier samt obduktioner. Den skitserer den indledende forbehandling af vævsprøver og metoder, der anvendes til transport til laboratoriet. Materialer og reagenser, der er nødvendige for organoidisolering, er opsummeret i afsnittet 'Forberedelse til isolering'. Processen med isolering af voksne stamceller fra vævsprøver er nærmere beskrevet. Endelig diskuteres processen med plettering af organoider i kuppellignende strukturer ved hjælp af en opløselig ekstracellulær membranmatrix.
Den anden protokol, Canine Organoid Maintenance Protocol, beskriver metoder til dokumentation og dyrkning af organoider. Medieændringer og deres hyppighed diskuteres i dette afsnit. Desuden beskrives laboratorieprocedurerne såsom passaging og rengøring af cellekulturerne, som er afgørende for at sikre en vellykket vedligeholdelse af 3D-hundeorganoider. Passende passaging er et kritisk trin i protokollen, og mulige justeringer og fejlfinding af dette trin diskuteres yderligere i manuskriptet.
Den sidste protokol er Canine Organoid Harvesting and Biobanking Protocol, der indeholder metoder til fremstilling af fuldvoksne organoider til paraffinindlejring og RNA-konservering. Metoder til biobanking af organoidprøver i flydende nitrogenlagring er også beskrevet her. Endelig diskuteres måderne til optøning af frosne prøver og støtte deres vækst.
Afslutningsvis har denne artikel til formål at tilvejebringe konsekvente procedurer for hundeorganoidkultur gennem standardisering af protokoller mellem laboratorier. Dermed har manuskriptet til formål at lette reproducerbarheden af data fra hundeorganoidmodeller for at øge deres relevans i translationel biomedicinsk forskning.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63515/63515fig01.jpg"> Figur 1: Arbejdsgang af hundeorganoidprotokoller. Canine Organoid Isolation Protocol beskriver forberedelsen af de materialer, der er nødvendige for organoidisolering, høst af en vævsprøve (ved hjælp af obduktioner, endoskopiske, laparoskopiske og kirurgiske biopsier) og vejledning om celle dissociation og plettering af den cellulære population. Hundeorganoidvedligeholdelsesprotokollen diskuterer rengøring og passering af organoidkulturen. Organoid Harvesting and Biobanking Protocol diskuterer forberedelsen af organoidprøver til paraffinindlejring og yderligere organoidkarakterisering. Metoder til biobankorganoidkulturer og genoplivning af dem fra opbevaring i flydende nitrogen diskuteres også. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63515/63515fig01large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Chelating solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Sorbitol</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>BP439-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT</td>
			<td>Promega</td>
			<td>V3151</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>P217-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P5655-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4-2H2O</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S5136-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>S271-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen Strep</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>S5-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Organoid media</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>[Leu15]-Gastrin I human</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G9145-.5MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A-83-01</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>9094360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Advanced DMEM/F12</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12634-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17504-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Corning</td>
			<td>35-010-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamax</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>VWR Life Science</td>
			<td>J848-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human R-Spondin-1</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>120-38-500UG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Murine EGF</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>315-09-1MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Murine Noggin</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>250-38-250UG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Murine Wnt-3a</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>315-20-10UG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2 supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17502-048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-Acetyl-L-cysteine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9165-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nicotinamide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>N0636-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primocin</td>
			<td>InvivoGen</td>
			<td>ant-pm-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ROCK inhibitor (Y-27632)</td>
			<td>EMD Millipore Corp.</td>
			<td>SCM 075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SB202190 (P38 inhibitor)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S7067-25MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stemolecule CHIR99021 (GSK3&#946;)</td>
			<td>Reprocell</td>
			<td>04-0004-base</td>
			<td></td>
		</tr>
		
		<tr>
			<td>Trimethoprim</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T7883-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfamethoxazole</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7507-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic Acid, Glacial</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>A38-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl Sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Fisher Chemicals</td>
			<td>D128-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA, pH 8.0, 0.5 M</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15575-038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde (37%)</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>F79P-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G5882</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel Matrix For Organoid Culture</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356255</td>
			<td>Extracellular Membrane Matrix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde, 97%</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>A11313</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS, 1X (Phosphate-Buffered Saline)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-040-CM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS, 1X (Phosphate-Buffered Saline)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-040-CM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAlater Soln.</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM7021</td>
			<td>RNA Storage Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Express</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12604-021</td>
			<td>Trypsin-like Protease</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Other</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 Well Cell Culture Plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ACD Hybez II Hybridization System</td>
			<td>ACD a biotechne brand</td>
			<td>321710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge Tube, 15 mL</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430766</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CoolCell LX</td>
			<td>Corning</td>
			<td>BCS-405MC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryogenic Vials</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430488</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Centrifuge Tube (50 mL)</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>05-539-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GyroMini Nutating mixer (Rocker)</td>
			<td>Labnet</td>
			<td>S0500-230V-EU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat Bath</td>
			<td>Lab-Line Instruments</td>
			<td>3000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mr. Frosty Freezing Container</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>5100-0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop 2000</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>ND2000CLAPTOP</td>
			<td>SpectrophotometerAnalysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Panasonic incubator</td>
			<td>Panasonic</td>
			<td>MCO-170ML-PA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm M Wrapping Film</td>
			<td>Bemis Company Inc</td>
			<td>PM996/EMD</td>
			<td>Laboratory Flexible Film Tape</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protected Disposable Scalpels</td>
			<td>Bard-Parker</td>
			<td>239844</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAscope 2.5 HD Assay &#8211; RED</td>
			<td>ACD a biotechne brand</td>
			<td>322350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAscope H2O2 &#38; Protease Plus Reagents</td>
			<td>ACD a biotechne brand</td>
			<td>322330</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAscope Target Retrieval Reagents</td>
			<td>ACD a biotechne brand</td>
			<td>322000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAscope Wash Buffer Reagents</td>
			<td>ACD a biotechne brand</td>
			<td>310091</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Culture Dish</td>
			<td>Dot Scientific</td>
			<td>6676621</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Culture Plate 24 wells</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>FB012929</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

standardization and maintenance of 3d canine hepatic and intestinal organoid cultures for use in biomedical research

Hunde udvikler komplekse multifaktorielle sygdomme analogt med mennesker, herunder inflammatoriske sygdomme, metaboliske sygdomme og kræft. Derfor repræsenterer de relevante store dyremodeller med det translationelle potentiale til humanmedicin. Organoider er 3-dimensionelle (3D), selvmonterede strukturer afledt af stamceller, der efterligner mikroanatomien og fysiologien i deres oprindelsesorgan. Disse translationelle in vitro-modeller kan bruges til lægemiddelpermeabilitet og opdagelsesapplikationer, toksikologivurdering og til at give en mekanistisk forståelse af patofysiologien af multifaktorielle kroniske sygdomme. Desuden kan hundeorganoider forbedre livet for selskabshunde, give input inden for forskellige områder af veterinærforskning og lette personlige behandlingsapplikationer inden for veterinærmedicin. En lille gruppe donorer kan oprette en biobank af organoidprøver, hvilket reducerer behovet for kontinuerlig vævshøst, da organoidcellelinjer kan subdyrkes på ubestemt tid. Heri præsenteres tre protokoller, der fokuserer på kulturen af tarm- og leverkolseorganoider afledt af voksne stamceller. Canine Organoid Isolation Protocol skitserer metoder til behandling af væv og indlejring af celleisolatet i en understøttende matrix (opløselig ekstracellulær membranmatrix). Hundeorganoid vedligeholdelsesprotokollen beskriver organoidvækst og vedligeholdelse, herunder rengøring og passering sammen med passende timing for ekspansion. Organoid Harvesting and Biobanking Protocol beskriver måder at udvinde, fryse og bevare organoider til yderligere analyse.

Hundens organoidprotokol genererer typisk ~ 50.000 til ~ 150.000 tarm- eller leverceller pr. Brønd af en 24-brønds plade. Repræsentative organoider kan ses i figur 6.
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63515/63515fig06.jpg"> Figur 6: Repræsentative billeder af hundeorganoider. Billeder af organoider isoleret ved hjælp af denne protokol er afbildet. (A,B) Tarmorganoider afledt af tolvfingertarmen (taget ved 10x og 5x objektiv forstørrelse). Bemærk tilstedeværelsen af ældre budded organoider og yngre sfæroider. (C,D) Hunde enteroider fra den nederste del af jejunum (taget ved 10x og 20x objektiv forstørrelse). (E,F) Ileale enteroider (taget ved 20x og 5x objektiv forstørrelse) og (G,H) kolonoider (taget ved 10x objektiv forstørrelse). (I) Et repræsentativt billede af leverorganoider taget ved 20x objektiv forstørrelse. De fleste af organoiderne er i deres spirende form. Yngre leversfæroider kan også ses på billedet. (J) Repræsentativt billede, der viser en sjældenhepatisk organoid, der danner en kanallignende struktur (taget ved 10x objektiv forstørrelse). Skaleringsbjælken (500 μm) findes i øverste venstre hjørne af hvert billede. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63515/63515fig06large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>
Enteroider og kolonoider afledt ved hjælp af denne protokol blev tidligere karakteriseret af Chandra et al. i 201912. Hunde tarmorganoider består af en regelmæssig cellulær population af tarmepitelet. Anvendelse af RNA in situ-hybridisering , ekspression af stamcellebiomarkører (Leucin-rig gentagelse indeholdende G-proteinkoblet receptor 5 - LGR5 og SRY-Box transkriptionsfaktor 9 - SOX9), Paneth Cell Biomarker (Ephrin type-B-receptor 2 - EPHB2), absorberende epitelcellemarkører (alkalisk phosphatase - ALP) og enteroendokrin markør (Neurogenin-3 - Neuro G3)12 blev bekræftet. Alcian Blue farvning blev udført på paraffinindlejrede dias for at bekræfte tilstedeværelsen af bægerceller. Derudover blev funktionelle assays såsom optisk metabolisk billeddannelse (OMI) eller cystisk fibrose transmembrane konduktansregulator (CFTR) hævelsesassay udført for at bekræfte organoidernes metaboliske aktivitet. Hundeorganoider fra hunde diagnosticeret med inflammatorisk tarmsygdom, gastrointestinale stromale tumorer (GIST) eller kolorektal adenocarcinom blev også isoleret ved hjælp af denne protokol12.
Efter stamcelleisolering starter leverorganoider deres livscyklus som ekspanderende sfæroider, og efter ~ 7 dage bliver de til spirende og differentierende organoider. Hundesphetiske sfæroider isoleret og dyrket i henhold til denne protokol blev målt for at kvantificere deres vækst og bestemme den ideelle tid til passage. Sfæroider afledt af laparoskopiske leverbiopsier af raske voksne hunde (n = 7) blev målt i løbet af deres første 7 dyrkningsdage. Repræsentative billeder blev taget, og den langsgående (a) og diagonale (b) radius af sfæroiderne (n = 845) blev målt i hele kulturen. Volumenet (V), overfladearealet (P), 2D-ellipsearealet (A) og omkredsen (C) af sfæroiderne blev beregnet. Beregningerne og resultaterne af eksperimentet er opsummeret i figur 7. 2D-ellipseområde og omkreds blev brugt til at vurdere organoidkulturens sundhed ved hjælp af lysmikroskopi. Disse værdier kan tjene som en vejledning til beslutninger om kulturvedligeholdelse.
Kort fortalt udvidede sfæroider sig hurtigt i volumen, overfladeareal, 2D-ellipseareal og omkreds. Måledataene fra de syv beagler blev beregnet i gennemsnit for følgende beregninger. Volumenet steg med 479% (±6%) fra dag 2 til 3. Samtidig steg sfæroidoverfladearealet og 2D-ellipsearealet med henholdsvis 211% (±208%) og 209% (±198%). 2D-ellipseomkredsen steg fra dag 2 til 3 med 73% (±57%). Stigningen i det samlede volumen af leverorganoider fra dag 2-7 var mere end 365 gange, overfladeareal og 2D-ellipseareal steg 49 gange, og 2D-ellipseomkredsen steg seks gange.
Dernæst blev sfæroider afledt af to voksne hundeprøver yderligere dyrket efter passage og indsamlet hver dag (dag 2-7) til RNA in situ-hybridisering (RNA ISH). Hundesonder blev designet (sondeliste er angivet som supplerende tabel 2), og mRNA-ekspression blev evalueret for stamcellemarkører (LGR5), markører, der er specifikke for cholangiocytter (cytokeratin 7 - KRT-7 og aquaporin 1 - AQP1) samt hepatocytmarkører (gaffelkasseprotein A1 - FOXA1; og cytokrom P450 3A12 - CYP3A12). Markørernes udtryk blev vurderet semi-kvantitativt (repræsentative billeder i figur 8). Sfæroider udtrykte fortrinsvis cholangiocytmarkøren KRT-7 fra 1% til 26% i signalareal / samlet areal af celler. AQP1 blev ikke udtrykt i organoidprøverne, uden tvivl fordi dets tilstedeværelse i hundes leverprøver er sparsom. Stamcellemarkørekspressionen (LGR5) varierede mellem 0,17 % og 0,78 %, mens hepatocytmarkører blev udtrykt i lavere grad ved 0,05%-0,34% for FOXA1 og 0,03%-0,28% for CYP3A12.
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63515/63515fig07.jpg"> Figur 7: Hepatiske sfæroide målinger. (A) Hepatisk sfæroid vækst blev observeret hver dag af kulturer fra dag 2-7. Sfæroider blev først dannet på dag 2, og de sidste sfæroider startede den spirende proces på dag 7. Et efterfølgende eksperiment brugte to hundeorganoidlinjer efter passage til at høste sfæroider hver dag til paraffinindlejring for at udføre RNA ISH (dag 2-billedet blev taget ved 40x, dag 6-billedet ved 10x, og resten af billederne blev taget ved 20x forstørrelse). (B) En leversfæroidklynge er vist fastgjort til en vævsklump indlejret i opløselig ECM 4 dage efter isolering. Langsgående og diagonale radier af sfæroiderne blev målt (billede taget ved 10x). Panel (C) viser den formel, der bruges til beregninger for at udlede volumen (V), overfladeareal (P), 2D-ellipseareal (A) og omkreds (C). Til disse beregninger blev det antaget, at hundespepatiske sfæroider er ideelle sfæroider. Resultater af målinger af leversfæroiders volumen, overfladeareal, 2D-ellipseareal og 2D-ellipseomkreds for individuelle vækstdage er afbildet i panel (D). Fejllinjer repræsenterer standardfejlen i gennemsnittet (SEM). (E) mRNA-ekspression af KRT-7, LGR5, FOXA1 og CYP3A12 blev målt i prøver af leversfæroider hos hunde efter passage fra dag 2 til dag 7. AQP1 blev ikke udtrykt i disse prøver. En skalabjælke (5x: 500 μm; 10x: 200 μm; 20x: 100 μm; 40x: 50 μm) er til stede øverst til venstre i hvert billede. Objektiv forstørrelse noteret. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63515/63515fig07large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>
Organoider ville sjældent ikke bryde op under passaging processen efter denne standardiserede teknik. Hvis dissociation ikke forekommer, kan passagetider justeres for at opnå optimal celleklyngeopløsning. Langvarig eksponering for trypsinlignende protease kan imidlertid påvirke organoidernes vækst negativt. Leverorganoider blev anvendt i et efterfølgende eksperiment for at undersøge den optimale dissociationstid og etablere en korrekt passaging metode. Kort fortalt blev leverorganoider fra to raske hunde (6 brøndreplikater hver) passeret med trypsinlignende protease i 12 minutter og 24 minutter. Prøver blev omrørt hvert 6. minut. Ved afslutningen af dissociationstidspunktet blev der tilsat 6 ml iskold Advanced DMEM/F12 til opløsningen, og prøverne blev spundet (700 x g i 5 minutter ved 4 °C). Supernatanten (Advanced DMEM/F12 med fortyndet trypsinlignende protease) blev fjernet, og pellets blev indlejret i opløselig ECM som beskrevet ovenfor (trin 4.4-4.5). Efter 12 timers dyrkning i opløselig ECM og CMGF+ R/G blev der observeret forskelle i begge prøver. En 12 minutters inkubation med trypsinlignende protease hæmmede ikke organoidvæksten. Væksten af organoider blev imidlertid negativt påvirket (se figur 9) ved hjælp af en 24 minutters inkubation.
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63515/63515fig09.jpg"> Figur 9: Forsøg med leverorganoidpassage hos hunde. Repræsentative billeder af organoider afledt af to hunde (D_1 og D_2) passeret ved hjælp af den trypsinlignende proteaseinkubationsmetode i 12 minutter eller 24 minutter. Kontrolprøver blev passeret med trypsinlignende protease i 10 minutter. En skalabjælke (μm) er til stede øverst til venstre i hvert billede og repræsenterer 500 μm (5x objektiv forstørrelse). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63515/63515fig09large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>
Dernæst blev undersøgelsen af overlevelsesevnen af hundes leverorganoider afledt af denne protokol i et ugunstigt miljø (berøvelse af strukturel støtte og ernæring) udført. Undersøgelsen fokuserede på at bestemme mængden af organoidmedier og kældermatrix, der var nødvendig for leverorganoids vellykkede vækst og overlevelse og også etablere sådanne betingelsers indflydelse på organoidkulturen. Overlevelsesevnen blev målt i en plade med 96 brønde med et begrænset antal organoider. Organoider fra to hunde blev passeret som beskrevet ovenfor og indlejret (12 replikater) i forskellige volumener af opløselig ECM (10 μL eller 15 μL). Cellerne blev belagt i en koncentration på 400 celler/10 μL brønd og 600 celler/15 μL brønd svarende til 40.000 celler/ml. To medietyper (CMGF+ eller CMGF+ R/G) blev tilsat i forskellige volumener (25 μL, 30 μL eller 35 μL). Medierne blev aldrig ændret, og der blev ikke udført vedligeholdelsesprocedurer. Organoidernes overlevelsesevne blev overvåget hver dag. Organoiddød blev defineret som opløsning af mere end 50% af organoidstrukturerne. Overlevelsesraten for organoider under disse forhold varierede fra 12,9 (±2,3) dage til 18 (±1,5) dage, og resultaterne er opsummeret i tabel 3. De to prøver, der overlevede længst, var organoider afledt af hunde indlejret i 15 μL opløselig ECM og 30 μL CMGF + -medier. Begge prøver blev indlejret i opløselig ECM (30 μL) og friske medier (500 μL) i en standard 24-brønds plade efter 18 dages deprivation for at sikre, at organoidudvidelse stadig var mulig (figur 10).
<table border="1" fo:font-size="6px" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td></td>
			<td>Medietype</td>
			<td>Middel (dage overlevede)</td>
			<td>Median</td>
			<td>CV%</td>
			<td>Middel (dage overlevede)</td>
			<td>Median</td>
			<td>CV%</td>
			<td>Middel (dage overlevede)</td>
			<td>Median</td>
			<td>CV%</td>
			<td>Middel (dage overlevede)</td>
			<td>Median</td>
			<td>CV%</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Medier (μL)</td>
			<td colspan="3">30</td>
			<td colspan="3">25</td>
			<td colspan="3">35</td>
			<td colspan="3">30</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">ECM (μL)</td>
			<td colspan="3">10</td>
			<td colspan="3">10</td>
			<td colspan="3">10</td>
			<td colspan="3">15</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="2">D_1</td>
			<td>CMGF+ R/G</td>
			<td>12.50</td>
			<td>13</td>
			<td>11.57</td>
			<td>12.83</td>
			<td>13</td>
			<td>4.50</td>
			<td>11.83</td>
			<td>11.5</td>
			<td>12.91</td>
			<td>12.08</td>
			<td>13</td>
			<td>12.46</td>
		</tr>
<tr>
<td>CMGF+</td>
			<td>17.08</td>
			<td>17</td>
			<td>16.26</td>
			<td>18.50</td>
			<td>19</td>
			<td>4.89</td>
			<td>18.42</td>
			<td>19</td>
			<td>14.54</td>
			<td>17.82</td>
			<td>19</td>
			<td>8.99</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="2">D_2</td>
			<td>CMGF+ R/G</td>
			<td>13.67</td>
			<td>14</td>
			<td>13.36</td>
			<td>13.00</td>
			<td>13</td>
			<td>12.70</td>
			<td>14.00</td>
			<td>14.5</td>
			<td>17.23</td>
			<td>13.08</td>
			<td>13</td>
			<td>8.90</td>
		</tr>
<tr>
<td>CMGF+</td>
			<td>15.50</td>
			<td>15</td>
			<td>18.56</td>
			<td>17.50</td>
			<td>18</td>
			<td>10.48</td>
			<td>17.50</td>
			<td>19</td>
			<td>20.89</td>
			<td>17.00</td>
			<td>17</td>
			<td>14.41</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="2">TOTAL</td>
			<td>CMGF+ R/G</td>
			<td>13.08</td>
			<td>13</td>
			<td>13.13</td>
			<td>12.92</td>
			<td>13</td>
			<td>9.39</td>
			<td>12.92</td>
			<td>13</td>
			<td>17.52</td>
			<td>12.58</td>
			<td>13</td>
			<td>11.22</td>
		</tr>
<tr>
<td>CMGF+</td>
			<td>16.29</td>
			<td>16.5</td>
			<td>17.69</td>
			<td>18.00</td>
			<td>18.5</td>
			<td>8.35</td>
			<td>17.96</td>
			<td>19</td>
			<td>17.65</td>
			<td>17.43</td>
			<td>17</td>
			<td>11.70</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td colspan="13">død= mere end 50% af organoidmassen er ikke levedygtig</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabel 3: Resultater af forsøg med overlevelsesevne. Eksperimentet var baseret på berøvelse af strukturel støtte eller ernæring af to organoidkulturer. Resultaterne omfatter middel-, median- og standardafvigelsen (CV%) af individuelle koncentrationer af opløselig ECM og medier hos individuelle hunde.
<img alt="Figure 10" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63515/63515fig10.jpg"> Figur 10: Organoider ernæringsmæssige og strukturelle afsavn. Organoider blev ombelagt i 24-brønds plader for at bekræfte evnen til ekspansion efter deprivation (A). Repræsentative billeder fra dag 4 og dag 7 efter replating viser udvidelsen af organoiderne, hvilket bekræfter evnen til at identificere levedygtige organoider visuelt (billeder er taget ved 5x objektiv forstørrelse). Repræsentative billeder af organoider, der betragtes som levende eller døde, ses i (B). Billeder tages ved 5x objektiv forstørrelse. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63515/63515fig10large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63515/63515fig8v2.jpg"> Figur 8: Hepatiske sfæroider RNA in situ hybridisering repræsentative billeder. Repræsentative billeder af LGR5-, KRT7-, FOXA1- og CYP3A12-markører blev taget ved 60x objektiv forstørrelse af prøver fra dag 2-7 efter passage. Positive mRNA-molekyler pletter rødt. AQP1 blev ikke udtrykt i prøverne. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63515/63515fig8v2large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Ufuldstændig chelateringsopløsning (ICS) sammensætning</td>
			<td>Endelig koncentration</td>
		</tr>
<tr>
<td>500 ml H2O</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
<tr>
<td>2,49 g Na2HPO4-2H2O</td>
			<td>4,98 mg/ml</td>
		</tr>
<tr>
<td>2,7 g KH2PO4
</td>
			<td>5,4 mg/ml</td>
		</tr>
<tr>
<td>14 g NaCl</td>
			<td>28 mg/ml</td>
		</tr>
<tr>
<td>0,3 g KCl</td>
			<td>0,6 mg/ml</td>
		</tr>
<tr>
<td>37,5 g Saccharose</td>
			<td>75 mg/ml</td>
		</tr>
<tr>
<td>25 g D-Sorbitol</td>
			<td>50 mg/ml</td>
		</tr>
<tr>
<td>Komplet chelateringsopløsning (CCS) sammensætning</td>
			<td>V/V % eller endelig koncentration</td>
		</tr>
<tr>
<td>Ufuldstændig chelationsopløsning</td>
			<td>20%</td>
		</tr>
<tr>
<td>Steril H2O</td>
			<td>80%</td>
		</tr>
<tr>
<td>DTT</td>
			<td>520 μM</td>
		</tr>
<tr>
<td>Pen Strep</td>
			<td>Pen: 196 U/mL; Strep 196 ug/ml</td>
		</tr>
<tr>
<td>Organoid medie sammensætning</td>
			<td>Endelig koncentration</td>
		</tr>
<tr>
<td>Avanceret DMEM/F12</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
<tr>
<td>FBS</td>
			<td>8%</td>
		</tr>
<tr>
<td>Glutamax</td>
			<td>2 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>HEPES</td>
			<td>10 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>Primocin</td>
			<td>100 μg/ml</td>
		</tr>
<tr>
<td>B27-tillæg</td>
			<td>1x</td>
		</tr>
<tr>
<td>N2 supplement</td>
			<td>1x</td>
		</tr>
<tr>
<td>N-Acetyl-L-cystein</td>
			<td>1 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>Murine EGF</td>
			<td>50 ng/ml</td>
		</tr>
<tr>
<td>Murine Noggin</td>
			<td>100 ng/ml</td>
		</tr>
<tr>
<td>Menneskelig R-Spondin-1</td>
			<td>500 ng/ml</td>
		</tr>
<tr>
<td>Murine Wnt-3a</td>
			<td>100 ng/ml</td>
		</tr>
<tr>
<td>[Leu15]-Gastrin I menneske</td>
			<td>10 nM</td>
		</tr>
<tr>
<td>Nicotinamid</td>
			<td>10 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>A-83-01</td>
			<td>500 nM</td>
		</tr>
<tr>
<td>SB202190 (P38-hæmmer)</td>
			<td>10 μM</td>
		</tr>
<tr>
<td>TMS (trimethoprim sulfamethoxazol)</td>
			<td>10 μg/ml</td>
		</tr>
<tr>
<td>Yderligere komponenter</td>
			<td>Endelig koncentration</td>
		</tr>
<tr>
<td>ROCK-hæmmer (Y-27632)</td>
			<td>10 μM</td>
		</tr>
<tr>
<td>Stemolecule CHIR99021 (GSK3β)</td>
			<td>2,5 μM</td>
		</tr>
<tr>
<td>Frysning af mediesammensætning</td>
			<td>V/V procent</td>
		</tr>
<tr>
<td>Organoide medier og ROCK-hæmmer</td>
			<td>50%</td>
		</tr>
<tr>
<td>FBS</td>
			<td>40%</td>
		</tr>
<tr>
<td>Dimethylsulfoxid (DMSO)</td>
			<td>10%</td>
		</tr>
<tr>
<td>FAA sammensætning</td>
			<td>V/V procent</td>
		</tr>
<tr>
<td>Ethanol (100%)</td>
			<td>50%</td>
		</tr>
<tr>
<td>Eddikesyre, Is</td>
			<td>5%</td>
		</tr>
<tr>
<td>Formaldehyd (37%)</td>
			<td>10%</td>
		</tr>
<tr>
<td>Destilleret vand</td>
			<td>35%</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabel 1: Sammensætning af opløsninger og medier. En liste over komponenter og koncentrationer af ufuldstændige og komplette chelateringsopløsninger, CMGF+ (organoidmedier), frysemedier og FAA.
Supplerende tabel 1: Skabelon til organoid pleje. Denne skabelon giver mulighed for nøjagtig og reproducerbar organoid notetaking for hver dag. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63515/Supplementary%20Table%201.xlsx" target="_blank">Klik her for at downloade denne tabel.</a>
Supplerende tabel 2: RNA in situ-hybridiseringssonder. Liste over sonder specielt designet til hunde-mRNA-mål af en producent af teknologien til at udføre RNA in situ-hybridiseringsteknik. Oplysninger om betydningen af individuelle markører, navnet på en sonde, dens referencenummer og målregion er angivet. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63515/Supplementary%20Table%202.xlsx" target="_blank">Klik her for at downloade denne tabel.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Standardization and Maintenance of 3D Canine Hepatic and Intestinal Organoid Cultures for Use in Biomedical Research at JoVE.com

Standardization and Maintenance of 3D Canine Hepatic and Intestinal Organoid Cultures for Use in Biomedical Research

Eksperimentelle metoder til at høste voksne stamceller fra hundetarm- og levervæv for at etablere 3D-organoidkulturer er beskrevet. Desuden diskuteres laboratorieteknikkerne til at sikre ensartet vækst og tilvejebringe standardprocedurer til høst, biobank og genoplivning af hundetarm- og leverorganoidkulturer.

Standardisering og vedligeholdelse af 3D-hundes lever- og tarmorganoidkulturer til brug i biomedicinsk forskning

Dogs develop complex multifactorial diseases analogous to humans, including inflammatory diseases, metabolic diseases, and cancer. Therefore, they ...

Protokollerne for dyrkning af hundes lever- og tarmorganoider er vigtige for at standardisere denne nye teknologi. Denne teknik muliggør pålidelig og reproducerbar etablering af hundens organoidkultur, herunder organoidisolering, vedligeholdelse, høst og efterfølgende biobankning af prøver. Hundeorganoider kan give en fremragende model til mange applikationer, der spænder fra biologi, udvikling af infektionssygdomme, lægemiddeltest og opdagelse samt transmissionsmedicin.Til at begynde med fremstilles fem 15 ml centrifugerør med fem ml 1X komplet chelateringsopløsning, et rør med tre milliliter 1X komplet chelateringsopløsning, et tomt rør og et rør med fem milliliter 1X komplet chelatationsopløsning og to milliliter føtalt kvægserum. På isolationsdagen skal du placere en steril petriskål, skalpel, isspand og kold avanceret DMEM-næringsblanding F12 i biosikkerhedsskabet. Anbring det krævede antal 24-brønds cellekulturplade i kuldioxidinkubatoren for at forvarme.Placer opløselig ekstracellulær membranmatrix på is til optøning. Forkøl centrifugen til fire grader Celsius. Flyt komplette medier med vækstfaktorer fra fryseren til et vandbad på 37 grader Celsius, så du undgår direkte lyseksponering.Ryst vævsprøver i transportrøret i 30 sekunder. Fjern overdreven supernatant uden at kassere noget væv ved langsom pipettering nær væskeoverfladen, indtil der er 0,5 ml tilbage i røret. Overfør væv og resterende supernatant til en steril petriskål.Brug en engangsskalpel til at skære og hakke vævet i mindre stykker, der ligner en moskonsistens i cirka fem minutter. Pipette hakket væv med væske fra petriskålen til det første komplette chelaterende opløsningsrør, og tilsæt derefter to milliliter avanceret DMEM-næringsblanding F12 til petriskålen. Skyl det resterende væv og overfør til det første komplette chelateringsopløsningsrør.Vortex 1X komplette chelateringsopløsningsrør cirka fem gange i fem sekunder. Lad biopsier sætte sig i bunden af røret i et minut, og fjern supernatanten, indtil der er fem milliliter tilbage. Overfør den komplette 1X chelateringsopløsning fra det nye rør til prøverøret.Gentag det forrige trin for de følgende to rør. Og på de sidste to vaske skal du fjerne supernatanten ned til tre milliliter, der er tilbage i røret. Overfør biopsierne og 1X komplet chelateringsopløsning fra prøverøret til en brønd af en seks-brønds plade.Tilsæt tre milliliter 1X komplet chelateringsopløsning til prøverøret. Hvirvl forsigtigt for at samle resterende væv og overføre til den samme brønd på pladen. Tilsæt 150 mikroliter 0,5 molær ethylendiamintetraeddikesyre i en brønd, og læg pladen med seks brønde på en 20 graders 24 rpm rocker ved fire grader Celsius.Inkuber leverprøverne i 10 minutter og tarmprøverne i en time på den bevægelige vipper. Transporter pladen med seks brønde tilbage til biosikkerhedsskabet, og overfør hakket væv og væske til et rør, der indeholder 1X komplet chelateringsopløsning med føtalt kvægserum. Lad vævene sætte sig og transportere supernatanten med 0,2 ml af den øverste del af vævet til et tomt rør.Spin ned i røret, der indeholder prøven ved 700 XG i fem minutter ved fire grader Celsius. Stamceller pelleteres nu sammen med hakket væv. Fjern og kassér supernatanten forsigtigt for ikke at forstyrre pillen.Resuspend pelleten i avanceret DMEM F12. Drej røret igen og aspirer supernatanten uden at forstyrre pelleten. Tilsæt det beregnede volumen af opløselig ekstracellulær membranmatrix til prøverøret.Vær forsigtig, når du fjerner medier for ikke at miste cellepillen. Når du tilføjer en ekstracellulær membranmatrix, pipette langsomt for ikke at skabe overdrevne bobler i organoidsuspensionen. Opbevar prøven med den opløselige ekstracellulære membranmatrix på is og frø suspensionen midt i brøndene, så den opløselige ekstracellulære membranmatrix danner en kuppellignende struktur.Transporter pladen til en inkubator og lad den opløselige ekstracellulære membranmatrix størkne i 30 minutter. Bland ROCK-hæmmer og GSK3 beta i komplette medier med vækstfaktorer, og tilsæt 500 mikroliter af denne opløsning til hver brønd. Placer pladen i inkubatoren.Hundens organoidprotokol genererer typisk ca. 50.000 til 150.000 tarm- eller leverceller pr. Brønd. Efter stamcelleisolering starter leverorganoider deres livscyklus som ekspanderende sfæroider, og efter syv dage bliver de til spirende og differentierende organoider. Volumen, overfladeareal, 2D-ellipseareal og omkreds af sfæroiderne blev beregnet.2D-ellipseområde og omkreds blev brugt til at vurdere organoidkulturens sundhed. Vurdering af ekspressionen af markørerne på en semikvantitær måde viste, at sfæroiderne fortrinsvis udtrykte cholangiocytmarkøren KRT7 fra en til 26%Stamcellemarkøren LGR5-ekspression varierede mellem 0,17 og 0,78%, mens hepatocytmarkører blev udtrykt i lavere grad ved 0,05 til 0,34% for Gaffelhovedboks 1A og 0,03 til 0,28% for cytokrom-P450. En 12-minutters inkubation med trypsinlignende protease hæmmede ikke organoidvæksten.Væksten af organoider blev imidlertid negativt påvirket ved hjælp af en 24-minutters inkubation. Overlevelsesevnen af hundes leverorganoider i et ugunstigt miljø blev analyseret for at bestemme mængden af organoidmedier og kældermatrix, der var nødvendig for leverorganoidernes vellykkede vækst og overlevelse. Overlevelsesraten for organoider varierede fra 12,9 dage til 18 dage.Grundlæggende cellekulturteknikker og aseptiske tilgange er de væsentlige forudsætninger for korrekt organoidisolering og vedligeholdelse.

Research

JoVE Journal

Medicine

In Vivo Canine Muscle Function Assay

In Vivo Canine Muscle Function Assay

We describe a minimally-invasive and reproducible method to measure canine pelvic limb muscle strength and muscle response to repeated eccentric 
...

Generation of Alginate Microspheres for Biomedical Applications

Generering af alginat mikrosfærer til biomedicinske anvendelser

Alginate-based materials have received considerable attention for biomedical applications because of their hydrophilic nature, biocompatibility, and ...

The Bovine Lung in Biomedical Research: Visually Guided Bronchoscopy, Intrabronchial Inoculation and In Vivo Sampling Techniques

The Bovine Lung in Biomedical Research: Visually Guided Bronchoscopy, Intrabronchial Inoculation and In Vivo Sampling Techniques

Den Bovine Lung i biomedicinsk forskning: Visuelt Guided bronkoskopi, intrabronchial Podning og<em&gt; In Vivo</em&gt; stikprøveteknikker

There is an ongoing search for alternative animal models in research of respiratory medicine. Depending on the goal of the research, large animals as ...

Use of a Low-flow Digital Anesthesia System for Mice and Rats

Anvendelse af en lav-flow Digital Anæstesi System til mus og rotter

A traditional vaporizer depends on flowing gas and atmospheric pressure for passive anesthetic vaporization. Newly developed direct injection vaporizers ...

Forskolin-induced Swelling in Intestinal Organoids: An In Vitro Assay for Assessing Drug Response in Cystic Fibrosis Patients

Forskolin-induced Swelling in Intestinal Organoids: An In Vitro Assay for Assessing Drug Response in Cystic Fibrosis Patients

Forskolininduceret Hævelse i Intestinal Organoids: An<em&gt; In vitro</em&gt; Assay for Vurdering Drug respons i patienter med cystisk fibrose

Recently-developed cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR)-modulating drugs correct surface expression and/or function of the mutant ...

Optimized Analysis of In Vivo and In Vitro Hepatic Steatosis

Optimized Analysis of In Vivo and In Vitro Hepatic Steatosis

Optimeret Analyse af<em&gt; In vivo</em&gt; og<em&gt; In vitro</em&gt; Nedsat Steatose

Establishing a system of procedures to qualitatively and quantitatively characterize in vivo and in vitro hepatic steatosis is important for metabolic ...

Improvement of a Closed Chest Porcine Myocardial Infarction Model by Standardization of Tissue and Blood Sampling Procedures

Forbedring af en lukket brystet svin myokardieinfarkt Model af standardisering af væv og blod prøveudtagningsprocedurer

Myocardial ischemia reperfusion (I/R) injury contributes to almost half of the necrotic area after myocardial infarction. To date there is no approved ...

Generation of Human 3D Lung Tissue Cultures (3D-LTCs) for Disease Modeling

Generation of Human 3D Lung Tissue Cultures 3D-LTCs for Disease Modeling

Generation af menneskelige 3D lungevæv kulturer (3D-LTCs) for sygdommen modellering

Translation of novel discoveries to human disease is limited by the availability of human tissue-based models of disease. Precision-cut lung slices (PCLS) ...

Use of 3D Robotic Ultrasound for In Vivo Analysis of Mouse Kidneys

Use of 3D Robotic Ultrasound for In Vivo Analysis of Mouse Kidneys

Brug af 3D-robot ultralyd til In Vivo-analyse af musenyrer

Common modalities for in vivo imaging of rodents include positron emission tomography (PET), computed tomography (CT), magnetic resonance imaging (MRI), ...

Standardizing the Responses to Platelet Agonist Collagen-Related Peptide

Reproducibility and Harmonization in Research Using Biological Standards: The Example of Platelet Agonist Collagen-Related Peptide

Biological Standardization to Ensure Reproducibility and Harmonization in Research (Video) | JoVE

Reproducerbarhed og harmonisering i forskning ved hjælp af biologiske standarder: Eksemplet på blodpladeagonist kollagenrelateret peptid

Metrology - the science of measure - is a subject few biological scientists are taught about in their training to their detriment; the application of ...