Name: standardization and maintenance of 3d canine hepatic and intestinal organoid cultures for use in biomedical research
Uploaded: 2022-01-31T15:00:00
Duration: 8 min 39 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Standardization and Maintenance of 3D Canine Hepatic and Intestinal Organoid Cultures for Use in Biomedical Research at JoVE.com

De auteurs willen dankbaarheid uitspreken aan de medewerkers van het Veterinary Diagnostic Laboratory van de Iowa State University, namelijk Haley M. Lambert, Emily Rahe, Rosalyn M. Branaman, Victoria J. Green en Jennifer M. Groeltz-Thrush, voor de tijdige verwerking van de verstrekte monsters. De auteurs willen de steun van de Faculty Startup, ISU VPR Miller Award, ISU VPR Miller Award en NSF SBIR sub-award aan ISU # 1912948 erkennen.

<ol>
	<li>Hickman, D. L., Johnson, J., Vemulapalli, T. H., Crisler, J. R., Shepherd, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Commonly+used+animal+models.">Commonly used animal models.</a> Principles of Animal Research for Graduate and Undergraduate Students. , 117-175 (2017).</li><li>De Jong, M., Maina, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Of+mice+and+humans:+Are+they+the+same?+-+Implications+in+cancer+translational+research.">Of mice and humans: Are they the same? - Implications in cancer translational research.</a> Journal of Nuclear Medicine. 51 (4), 501-504 (2010).</li><li>Cannarozzi, G., Schneider, A., Gonnet, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+phylogenomic+study+of+human,+dog,+and+mouse.">A phylogenomic study of human, dog, and mouse.</a> PLoS Computational Biology. 3 (1), 0009-0014 (2007).</li><li>Jacob, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Researchers+turn+to+canine+clinical+trials+to+advance+cancer+therapies.">Researchers turn to canine clinical trials to advance cancer therapies.</a> JAMA - Journal of the American Medical Association. 315 (15), 1550-1552 (2016).</li><li>Ziegler, A., Gonzalez, L., Blikslager, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large+animal+models:+The+key+to+translational+discovery+in+digestive+disease+research.">Large animal models: The key to translational discovery in digestive disease research.</a> Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 2 (6), 716-724 (2016).</li><li>Swanson, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phylogenetic+and+gene-centric+metagenomics+of+the+canine+intestinal+microbiome+reveals+similarities+with+humans+and+mice.">Phylogenetic and gene-centric metagenomics of the canine intestinal microbiome reveals similarities with humans and mice.</a> ISME Journal. 5 (4), 639-649 (2011).</li><li>Coelho, L. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Similarity+of+the+dog+and+human+gut+microbiomes+in+gene+content+and+response+to+diet.">Similarity of the dog and human gut microbiomes in gene content and response to diet.</a> Microbiome. 6 (1), 72 (2018).</li><li>Nguyen, T. L. A., Vieira-Silva, S., Liston, A., Raes, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+informative+is+the+mouse+for+human+gut+microbiota+research.">How informative is the mouse for human gut microbiota research.</a> DMM Disease Models and Mechanisms. 8 (1), 1-16 (2015).</li><li>Bontempo, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nutrition+and+health+of+dogs+and+cats:+Evolution+of+petfood.">Nutrition and health of dogs and cats: Evolution of petfood.</a> Veterinary Research Communications. 29, 45-50 (2005).</li><li>Allenspach, K., Gaschen, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Canine+chronic+enteropathies:+A+review.">Canine chronic enteropathies: A review.</a> Schweizer Archiv fur Tierheilkunde. 145 (5), 209-222 (2003).</li><li>Tribuddharatana, T., Kongpiromchean, Y., Sribhen, K., Sribhen, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biochemical+alterations+and+their+relationships+with+the+metabolic+syndrome+components+in+canine+obesity.">Biochemical alterations and their relationships with the metabolic syndrome components in canine obesity.</a> Kasetsart Journal - Natural Science. 45 (4), 622-628 (2011).</li><li>Chandra, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derivation+of+adult+canine+intestinal+organoids+for+translational+research+in+gastroenterology.">Derivation of adult canine intestinal organoids for translational research in gastroenterology.</a> BMC Biology. 17 (1), 33 (2019).</li><li>Schaefer, K., Rensing, S., Hillen, H., Burkhardt, J. E., Germann, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Is+Science+the+only+driver+in+species+selection?+An+internal+study+to+evaluate+compound+requirements+in+the+minipig+compared+to+the+dog+in+preclinical+studies.">Is Science the only driver in species selection? An internal study to evaluate compound requirements in the minipig compared to the dog in preclinical studies.</a> Toxicologic Pathology. 44 (3), 474-479 (2016).</li><li>MacArthur Clark, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+3Rs+in+research:+A+contemporary+approach+to+replacement,+reduction+and+refinement.">The 3Rs in research: A contemporary approach to replacement, reduction and refinement.</a> British Journal of Nutrition. 120, 1-7 (2018).</li><li>Schneider, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Model-based+reverse+translation+between+veterinary+and+human+medicine:+The+one+health+initiative.">Model-based reverse translation between veterinary and human medicine: The one health initiative.</a> CPT: Pharmacometrics and Systems Pharmacology. 7 (2), 65-68 (2018).</li><li>Lehmann, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+organoids:+A+new+dimension+in+cell+biology.">Human organoids: A new dimension in cell biology.</a> Molecular Biology of the Cell. 30 (10), 1129-1137 (2019).</li><li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+Lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche.">Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).</li><li>Kim, J., Koo, B. K., Knoblich, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+organoids:+model+systems+for+human+biology+and+medicine.">Human organoids: model systems for human biology and medicine.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 21 (10), 571-584 (2020).</li><li>Jensen, C., Teng, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Is+it+time+to+start+transitioning+from+2D+to+3D+cell+culture.">Is it time to start transitioning from 2D to 3D cell culture.</a> Frontiers in Molecular Biosciences. 7, 33 (2020).</li><li>Ho, B. X., Pek, N. M. Q., Soh, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disease+modeling+using+3D+organoids+derived+from+human+induced+pluripotent+stem+cells.">Disease modeling using 3D organoids derived from human induced pluripotent stem cells.</a> International Journal of Molecular Sciences. 19 (4), 936 (2018).</li><li>Truskey, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+microphysiological+systems+and+organoids+as+in+vitro+models+for+toxicological+studies.">Human microphysiological systems and organoids as in vitro models for toxicological studies.</a> Frontiers in Public Health. 6, 185 (2018).</li><li>Caipa Garcia, A. L., Arlt, V. M., Phillips, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoids+for+toxicology+and+genetic+toxicology:+applications+with+drugs+and+prospects+for+environmental+carcinogenesis.">Organoids for toxicology and genetic toxicology: applications with drugs and prospects for environmental carcinogenesis.</a> Mutagenesis. , (2021).</li><li>Augustyniak, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoids+are+promising+tools+for+species-specific+in+vitro+toxicological+studies.">Organoids are promising tools for species-specific in vitro toxicological studies.</a> Journal of Applied Toxicology. 39 (12), 1610-1622 (2019).</li><li>Zietek, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoids+to+study+intestinal+nutrient+transport,+drug+uptake+and+metabolism+-+Update+to+the+human+model+and+expansion+of+applications.">Organoids to study intestinal nutrient transport, drug uptake and metabolism - Update to the human model and expansion of applications.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 577656 (2020).</li><li>Zietek, T., Rath, E., Haller, D., Daniel, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+organoids+for+assessing+nutrient+transport,+sensing+and+incretin+secretion.">Intestinal organoids for assessing nutrient transport, sensing and incretin secretion.</a> Scientific Reports. 5 (1), 1-10 (2015).</li><li>Kar, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoids:+a+promising+new+in+vitro+platform+in+livestock+and+veterinary+research.">Organoids: a promising new in vitro platform in livestock and veterinary research.</a> Veterinary Research. 52 (1), 1-17 (2021).</li><li>Borcherding, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sa1976+polyphenols+reverse+the+pathologic+effects+of+palmitic+acid+and+high+fat+diet+in+canine+enteroids.">Sa1976 polyphenols reverse the pathologic effects of palmitic acid and high fat diet in canine enteroids.</a> Gastroenterology. 158 (6), 486 (2020).</li><li>Ambrosini, Y. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recapitulation+of+the+accessible+interface+of+biopsy-derived+canine+intestinal+organoids+to+study+epithelial-luminal+interactions.">Recapitulation of the accessible interface of biopsy-derived canine intestinal organoids to study epithelial-luminal interactions.</a> PLoS ONE. 15 (4), 0231423 (2020).</li><li>Zdyrski, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Su124+homology+directed+repair+in+canine+duodenal+enteroids+to+mimic+the+wild-type+P-glycoprotein+mutation.">Su124 homology directed repair in canine duodenal enteroids to mimic the wild-type P-glycoprotein mutation.</a> Gastroenterology. 160 (6), 625 (2021).</li><li>Li, Y., Tang, P., Cai, S., Peng, J., Hua, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoid+based+personalized+medicine:+from+bench+to+bedside.">Organoid based personalized medicine: from bench to bedside.</a> Cell Regeneration. 9 (1), 21 (2020).</li><li>Kurr, L. A., Allenspach, K., Jergens, A., Mochel, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Harnessing+the+biology+of+intestinal+organoids+to+accelerate+drug+discovery+in+inflammatory+bowel+disease:+A+one+health+approach.">Harnessing the biology of intestinal organoids to accelerate drug discovery in inflammatory bowel disease: A one health approach.</a> The FASEB Journal. 34, 1 (2020).</li><li>Nantasanti, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disease+modeling+and+gene+therapy+of+copper+storage+disease+in+canine+hepatic+organoids.">Disease modeling and gene therapy of copper storage disease in canine hepatic organoids.</a> Stem Cell Reports. 5 (5), 895-907 (2015).</li><li>Favier, R. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=COMMD1-Deficient+dogs+accumulate+copper+in+hepatocytes+and+provide+a+good+model+for+chronic+hepatitis+and+fibrosis.">COMMD1-Deficient dogs accumulate copper in hepatocytes and provide a good model for chronic hepatitis and fibrosis.</a> PLoS ONE. 7 (8), 42158 (2012).</li><li>Kruitwagen, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+survival+of+transplanted+autologous+canine+liver+organoids+in+a+COMMD1-deficient+dog+model+of+metabolic+liver+disease.">Long-term survival of transplanted autologous canine liver organoids in a COMMD1-deficient dog model of metabolic liver disease.</a> Cells. 9 (2), 410 (2020).</li><li>Vilgelm, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fine-needle+aspiration-based+patient-derived+cancer+organoids.">Fine-needle aspiration-based patient-derived cancer organoids.</a> iScience. 23 (8), 101408 (2020).</li><li>Saxena, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+intestinal+enteroids:+A+new+model+to+study+human+rotavirus+infection,+host+restriction,+and+pathophysiology.">Human intestinal enteroids: A new model to study human rotavirus infection, host restriction, and pathophysiology.</a> Journal of Virology. 90 (1), 43-56 (2016).</li><li>VanDussen, K. L., Sonnek, N. M., Stappenbeck, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=L-WRN+conditioned+medium+for+gastrointestinal+epithelial+stem+cell+culture+shows+replicable+batch-to-batch+activity+levels+across+multiple+research+teams.">L-WRN conditioned medium for gastrointestinal epithelial stem cell culture shows replicable batch-to-batch activity levels across multiple research teams.</a> Stem Cell Research. 37, 101430 (2019).</li><li>Powell, R. H., Behnke, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=WRN+conditioned+media+is+sufficient+for+in+vitro+propagation+of+intestinal+organoids+from+large+farm+and+small+companion+animals.">WRN conditioned media is sufficient for in vitro propagation of intestinal organoids from large farm and small companion animals.</a> Biology Open. 6 (5), 698-705 (2017).</li><li>Mackenzie, J. S., Jeggo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+one+health+approach-why+is+it+so+important.">The one health approach-why is it so important.</a> Tropical Medicine and Infectious Disease. 4 (2), 88 (2019).</li><li>Artegiani, B., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+and+application+of+3D-organoid+technology.">Use and application of 3D-organoid technology.</a> Human Molecular Genetics. 27 (2), 99-107 (2018).</li></ol>

K. Allenspach is mede-oprichter van LifEngine Animal Health en 3D Health Solutions. Ze dient als consultant voor Ceva Animal Health, Bioiberica, LifeDiagnostics, Antech Diagnostics, Deerland Probiotics en Mars. J.P. Mochel is mede-oprichter van LifEngine Animal Health en 3D Health Solutions. Dr. Mochel fungeert als consultant voor Ceva Animal Health en Ethos Animal Health. Andere auteurs hebben geen belangenconflicten te melden.

Er is momenteel een gebrek aan gestandaardiseerde protocollen beschikbaar voor de isolatie en het onderhoud van canine hepatische en intestinale organoïden. Het vaststellen van standaard operationele procedures voor organoïde culturen is gerechtvaardigd om dit model toepasbaar te maken in verschillende laboratoriumomgevingen. In het bijzonder is het verstrekken van gestandaardiseerde bedrijfsprotocollen voor de cultuur van deze canine organoïde modellen de sleutel tot het karakteriseren van de normale groei van organoïden tijdens cultuur en passaging om optimale tijdspunten voor expansie en onderhoud af te leiden. Canine intestinale organoïden gekweekt met behulp van het protocol zijn eerder gekarakteriseerd door Chandra et al.12.
Een van de meest kritieke stappen van het protocol is het passeren van organoïden. De optimale tijd voor de eerste passage van leversferoïden werd bepaald op dag 7 na isolatie op basis van de hepatische sferoïde metingen. Het maximale volume van sferoïden werd bereikt op dag 7, en tegelijkertijd begonnen sferoïden te knopen en vormden ze leverorganoïden. De toename van het totale organoïde volume vanaf dag 2-7 na isolatie was meer dan 365 keer, wat suggereert dat de optimale passagetijd langer is dan de intestinale organoïdecultuur van de hond. Na 7 dagen in cultuur werden geen grove tekenen van cellulaire apoptose in de leversferoïde waargenomen, zelfs niet zonder reiniging of passaging (figuur 7). Het passeren van de intestinale en hepatische organoïden kan een uitdaging zijn, omdat de procedure kan leiden tot het verlies van cellen en veranderde levensvatbaarheid. De resultaten geven aan dat langdurige incubatie van leverorganoïden met trypsine-achtig protease (tot 12 min) de subcultuur niet negatief beïnvloedt. Het langer dan 24 minuten incuberen van de organoïden in trypsine-achtig protease kan schadelijk zijn voor de daaropvolgende subcultuur van de organoïden.
In geval van suboptimale breuk in de celclusters met de organoïde passage, kan mechanische dissociatie in plaats van langdurige incubatie met trypsine-achtig protease gunstiger zijn. Als er problemen worden ondervonden met de juiste dissociatie van de organoïden, kan worden geprobeerd de passageopbrengst te kort te vortexen. Aan de andere kant heeft vortexing het potentieel om een cultuur te ruïneren en cellen te beschadigen, dus het mag alleen worden gebruikt als andere procedures herhaaldelijk hebben gefaald. Het breken van leverorganoïden in enkele cellen verlaagt de groeisnelheid van de organoïden, terwijl het breken ervan in clusters van cellen hun levensvatbaarheid aanzienlijk kan verbeteren. Tien minuten werd gekozen als incubatietijd voor het organoïde protocol. Een incubatietijdpunt van 12 minuten werd als niet cytotoxisch beschouwd in vergelijking met een incubatietijd van 24 minuten in het trypsine-achtige protease-experiment.
Het overlevingsexperiment bevestigde dat canine hepatische organoïden tot 19,5 dagen konden overleven in ongunstige omstandigheden (structurele en nutritionele uitputting). Organoïden die deze aandoeningen het langst overleefden, werden gekweekt met CMGF + -media. Deze waarneming kan zijn veroorzaakt door de tragere groei van leverorganoïden in media die niet zijn aangevuld met Rock-remmer en GSK3β. Organoïde culturen met CMGF + R / G groeiden sneller en hebben hun bronnen mogelijk sneller uitgeput. Dit experiment opent mogelijkheden voor het miniaturiseren van de organoïdecultuur van honden om een systeemconversie met hoge doorvoer te bereiken. Een dergelijke technologie toont het potentieel om de ontdekking van geneesmiddelen of toxicologische studies tegen aanzienlijk lagere kosten te vergemakkelijken.
Enkele veel voorkomende problemen tijdens het onderhoud van de organoïde cultuur bij honden zijn onjuiste stolling van het monster bij het plateren, kweekbesmetting en het vaststellen van de juiste dichtheid en grootte van de organoïden. Als opgeloste ECM voortijdig stolt tijdens het beplating, plaats het dan onmiddellijk op ijs gedurende 10 minuten. Als opgeloste ECM geen koepelachtige structuren vormt, is het waarschijnlijk dat er niet genoeg media uit het monster zijn verwijderd. Als dit het geval is, verdunt u het monster met een meer opgeloste ECM totdat zich koepels vormen.
Wanneer schimmel- of bacteriële besmetting in een hele plaat wordt aangetroffen (zie figuur 4), is de beste oplossing om de plaat weg te gooien. Behandeling met antischimmel- of antibiotica kan worden geprobeerd, maar het succes van een dergelijke poging is extreem laag. Als een enkele put in een plaat is verontreinigd, kunnen levensvatbare en niet-aangetaste putten worden gereinigd (volg stappen 4.1 tot 4.5) naar een nieuwe plaat en nauwlettend worden gecontroleerd. Als het monster al Emergency Frozen is geweest, is het raadzaam om het volledige monster weg te gooien, omdat het ontdooien van het monster de incubator blootstelt aan extra besmettingsrisico.
Gezonde organoïde cultuur moet ten minste in de categorie middelgroot en middelgroot of groter zijn. Optimale dichtheid is cruciaal voor de groei van organoïdenkweek. Lagere dichtheid moet worden gecorrigeerd door de organoïden te reinigen tot gemiddelde dichtheid. Als de situatie van extreme dichtheid optreedt (overbevolking), moeten de organoïden worden uitgebreid naar meer putten. Grove tekenen van cellulaire apoptose gaan vaak gepaard met zowel overbevolking als lage dichtheid van de organoïde cultuur. Als deze problemen niet op tijd worden gecorrigeerd, zal de hele organoïde cultuur binnen enkele dagen apoptotisch worden. Als organoïden een extra grote omvang of zeer hoge dichtheid bereiken, moet de cultuur worden gebruikt voor een experiment, bevriezing of fixatie.
Het organoïde medium bevat momenteel 17 componenten en de toevoeging van groeifactoren die nodig zijn voor organoïde onderhoud en expansie kan daarom duur zijn. Dit probleem kan worden opgelost door 2D-celculturen te kweken die de groeifactoren synthetiseren om geconditioneerde CMGF + te produceren. Celkweek L-WRN produceert Wnt-3a, R-Spondin-3 en Noggin groeifactoren37. De celkolonie gebruikt 90% DMEM/F12 en 10% FBS kweekmedia. Wanneer de cultuur 90 procent samenvloeiing bereikt, wordt media gedurende 1 week elke dag geoogst. De geoogste media worden vervolgens gemengd met 2x CMGF+ (zonder deze groeifactoren). Hoewel 2D-culturen de benodigde groeifactoren kunnen produceren tegen een fractie van de kosten, moet de extra tijd en voorbereiding om de media te produceren worden verwacht. Concentraties van groeifactoren tussen geconditioneerde mediabatches kunnen ook verschillen37,38.
Canine volwassen stamcel-afgeleide organoïde culturen zijn een uniek biomedisch model dat kan helpen bij het bereiken van de doelen van het One Health Initiative39. De organoïde technologie kan worden gebruikt in vele fundamentele en biomedische onderzoeksgebieden, variërend van ontwikkelingsbiologie, pathofysiologie, ontdekking en testen van geneesmiddelen, toxicologie tot de studie van infectieziekten en regeneratieve geneeskunde40. Translationeel en omgekeerd translationeel onderzoek zijn beide gebieden waar canine organoïden van toepassing zijn15. Honden worden al eeuwenlang gebruikt in translationele experimentele omgevingen en hun status van gezelschapsdier heeft ook hun positie als een van de meest onderzochte soorten in de diergeneeskunde vergemakkelijkt.
Kortom, dit manuscript biedt gestandaardiseerde operationele protocollen voor isolatie, onderhoud, oogsten en biobanking van canine hepatische en intestinale organoïden om de toepassing van dit model op verschillende biomedische gebieden te vergemakkelijken. Dit model is bij uitstek geschikt om reverse translationeel onderzoek te bevorderen als instrument van het One Health Initiative om het inter- en intradisciplinaire delen van kennis te bevorderen.

Knaagdieren zijn het meest gebruikte diermodel voor biomedisch en translationeel onderzoek1. Ze zijn buitengewoon nuttig voor het onderzoeken van de fundamentele moleculaire pathogenese van de ziekten, hoewel hun klinische relevantie voor chronische multifactoriële ziekten onlangs in twijfel is getrokken2. Het hondenmodel vertoont verschillende voordelen ten opzichte van knaagdieren3,4. Honden en mensen delen overeenkomsten in metabolomica en darmmicrobioom die zich ontwikkelden als gevolg van consumptie van menselijke voeding gedurende verschillende perioden van hun domesticatie5,6,7. Overeenkomsten tussen de gastro-intestinale anatomie en fysiologie van honden en mensen is een van de voorbeelden8.
Bovendien delen honden vaak vergelijkbare omgevingen en levensstijlen met hun eigenaren9. De langere levensduur van honden in vergelijking met knaagdieren zorgt voor de natuurlijke ontwikkeling van tal van chronische aandoeningen10. Inflammatoire darmaandoeningen of metabool syndroom zijn voorbeelden van multifactoriële chronische ziekten die belangrijke overeenkomsten hebben tussen mensen en honden11,12. Preklinische onderzoeken bij honden waarbij honden met van nature voorkomende ziekten betrokken zijn, kunnen betrouwbaardere gegevens genereren dan die van knaagdiermodellen13. Om het gebruik van levend dieronderzoek te minimaliseren en te voldoen aan de principes van de 3V's (Reduce, Refine, Replace)14, zijn er alternatieven voor in vivo testen met behulp van 3D in vitro canine organoïden naar voren15.
Organoïden zijn zelfgeassembleerde 3D-stamcel-afgeleide structuren die de fysiologie en microanatomie van hun oorspronkelijke organen samenvatten16,17. Deze technologie werd voor het eerst beschreven door Sato et al. in 200917 en maakte meer vertaalbare in vitro studies in epitheelcellijnen mogelijk dan voorheen mogelijk was met behulp van 2D-kankercelculturen18,19,20. Organoïden zijn nuttige in vitro modellen in vele biomedische disciplines, zoals in preklinische toxicologische21,22,23, absorptie- of metabolismestudies24,25,26,27,28, evenals in gepersonaliseerde medische benaderingen29,30,31 . De succesvolle cultuur van intestinale organoïden bij honden is voor het eerst beschreven in 201912, terwijl leverorganoïden afgeleid van een hond voor het eerst werden gemeld door Nantasanti et al. in 201532. Canine organoïden zijn sindsdien met succes gebruikt in studies naar canine chronische enteropathieën, gastro-intestinale stromale tumoren, colorectaal adenocarcinoom12 en wilson's disease33,34.
Hoewel volwassen stamcellen kunnen worden geoogst via obducties, vereist de organoïde technologie niet altijd het offeren van de dieren. Endoscopische en laparoscopische biopsieën, of zelfs fijnnaaldspiraten van organen35, zijn een levensvatbare bron van volwassen stamcellen voor epitheliale organoïde-isolatie12. Wijdverbreid gebruik van dergelijke niet-invasieve technieken in de dierenartspraktijk vergemakkelijkt de mogelijkheden voor omgekeerd translationeel onderzoek (vertaling van informatie van de veterinaire klinische praktijk naar de klinische praktijk bij de mens en vice versa)15. Verdere vooruitgang van organoïde technologie kan worden gewaarborgd door de standaardisatie van organoïde cultuur en onderhoudsmethoden. Het organoïdeprotocol dat hier wordt gepresenteerd, is gedeeltelijk gebaseerd op eerder gepubliceerd werk van Saxena et al. uit 201536, en methoden werden aangepast aan de specifieke kenmerken van de intestinale en hepatische organoïdecultuur van honden. De totale workflow van de canine organoid protocollen is weergegeven in figuur 1.
Canine Organoid Isolation Protocol introduceert methoden voor het verkrijgen van monsters van endoscopische, laparoscopische en chirurgische biopsieën, evenals obducties. Het schetst de eerste voorbehandeling van weefselmonsters en methoden die worden gebruikt voor transport naar het laboratorium. Materialen en reagentia die nodig zijn voor organoïde-isolatie worden samengevat in de sectie 'Voorbereiding op isolatie'. Het proces van volwassen stamcelisolatie uit weefselmonsters wordt verder in detail beschreven. Ten slotte wordt het proces van het platen van organoïden in koepelachtige structuren met behulp van een opgeloste extracellulaire membraanmatrix besproken.
Het tweede protocol, Canine Organoid Maintenance Protocol, beschrijft methoden voor het documenteren en kweken van organoïden. Veranderingen in de media en hun frequentie worden in deze sectie besproken. Verder worden de laboratoriumprocedures beschreven, zoals het passeren en reinigen van de celculturen, die essentieel zijn voor het succesvolle onderhoud van 3D-canine organoïden. Passende passageing is een kritieke stap van het protocol en mogelijke aanpassingen en probleemoplossing van deze stap worden verder besproken in het manuscript.
Het laatste protocol is Canine Organoid Harvesting and Biobanking Protocol met methoden voor het bereiden van volgroeide organoïden voor paraffine-inbedding en RNA-conservering. Methoden voor het biobanken van organoïdemonsters in vloeibare stikstofopslag worden hier ook beschreven. Ten slotte worden de manieren besproken om bevroren monsters te ontdooien en hun groei te ondersteunen.
Kortom, dit artikel heeft tot doel consistente organoïde kweekprocedures voor honden te bieden door de standaardisatie van interlaboratoriumprotocollen. Hiermee wil het manuscript de reproduceerbaarheid van gegevens afgeleid van canine organoïde modellen vergemakkelijken om hun relevantie in translationeel biomedisch onderzoek te vergroten.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63515/63515fig01.jpg"> Figuur 1: Workflow van canine organoid protocollen. Het Canine Organoid Isolation Protocol beschrijft de voorbereiding van de materialen die nodig zijn voor organoïde-isolatie, het oogsten van een weefselmonster (door middel van obducties, endoscopische, laparoscopische en chirurgische biopsieën) en richtlijnen voor celdissociatie en plating van de cellulaire populatie. Het Canine Organoid Maintenance Protocol bespreekt het reinigen en doorgeven van de organoïde cultuur. Het Organoid Harvesting and Biobanking Protocol bespreekt de voorbereiding van organoïde monsters voor paraffine-inbedding en verdere organoïde karakterisering. Methoden om organoïde culturen te biobanken en ze te doen herleven uit opslag in vloeibare stikstof worden ook besproken. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63515/63515fig01large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Chelating solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Sorbitol</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>BP439-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT</td>
			<td>Promega</td>
			<td>V3151</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>P217-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P5655-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4-2H2O</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S5136-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>S271-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen Strep</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>S5-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Organoid media</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>[Leu15]-Gastrin I human</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G9145-.5MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A-83-01</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>9094360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Advanced DMEM/F12</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12634-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17504-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Corning</td>
			<td>35-010-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamax</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>VWR Life Science</td>
			<td>J848-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human R-Spondin-1</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>120-38-500UG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Murine EGF</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>315-09-1MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Murine Noggin</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>250-38-250UG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Murine Wnt-3a</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>315-20-10UG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2 supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17502-048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-Acetyl-L-cysteine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9165-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nicotinamide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>N0636-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primocin</td>
			<td>InvivoGen</td>
			<td>ant-pm-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ROCK inhibitor (Y-27632)</td>
			<td>EMD Millipore Corp.</td>
			<td>SCM 075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SB202190 (P38 inhibitor)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S7067-25MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stemolecule CHIR99021 (GSK3&#946;)</td>
			<td>Reprocell</td>
			<td>04-0004-base</td>
			<td></td>
		</tr>
		
		<tr>
			<td>Trimethoprim</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T7883-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfamethoxazole</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7507-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic Acid, Glacial</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>A38-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl Sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Fisher Chemicals</td>
			<td>D128-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA, pH 8.0, 0.5 M</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15575-038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde (37%)</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>F79P-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G5882</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel Matrix For Organoid Culture</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356255</td>
			<td>Extracellular Membrane Matrix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde, 97%</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>A11313</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS, 1X (Phosphate-Buffered Saline)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-040-CM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS, 1X (Phosphate-Buffered Saline)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-040-CM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAlater Soln.</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM7021</td>
			<td>RNA Storage Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Express</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12604-021</td>
			<td>Trypsin-like Protease</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Other</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 Well Cell Culture Plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ACD Hybez II Hybridization System</td>
			<td>ACD a biotechne brand</td>
			<td>321710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge Tube, 15 mL</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430766</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CoolCell LX</td>
			<td>Corning</td>
			<td>BCS-405MC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryogenic Vials</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430488</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Centrifuge Tube (50 mL)</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>05-539-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GyroMini Nutating mixer (Rocker)</td>
			<td>Labnet</td>
			<td>S0500-230V-EU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat Bath</td>
			<td>Lab-Line Instruments</td>
			<td>3000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mr. Frosty Freezing Container</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>5100-0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop 2000</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>ND2000CLAPTOP</td>
			<td>SpectrophotometerAnalysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Panasonic incubator</td>
			<td>Panasonic</td>
			<td>MCO-170ML-PA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm M Wrapping Film</td>
			<td>Bemis Company Inc</td>
			<td>PM996/EMD</td>
			<td>Laboratory Flexible Film Tape</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protected Disposable Scalpels</td>
			<td>Bard-Parker</td>
			<td>239844</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAscope 2.5 HD Assay &#8211; RED</td>
			<td>ACD a biotechne brand</td>
			<td>322350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAscope H2O2 &#38; Protease Plus Reagents</td>
			<td>ACD a biotechne brand</td>
			<td>322330</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAscope Target Retrieval Reagents</td>
			<td>ACD a biotechne brand</td>
			<td>322000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAscope Wash Buffer Reagents</td>
			<td>ACD a biotechne brand</td>
			<td>310091</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Culture Dish</td>
			<td>Dot Scientific</td>
			<td>6676621</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Culture Plate 24 wells</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>FB012929</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

standardization and maintenance of 3d canine hepatic and intestinal organoid cultures for use in biomedical research

Honden ontwikkelen complexe multifactoriële ziekten analoog aan mensen, waaronder ontstekingsziekten, stofwisselingsziekten en kanker. Daarom vertegenwoordigen ze relevante grote diermodellen met het translationele potentieel naar de menselijke geneeskunde. Organoïden zijn 3-dimensionale (3D), zelfgeassembleerde structuren afgeleid van stamcellen die de microanatomie en fysiologie van hun orgaan van oorsprong nabootsen. Deze translationele in vitro modellen kunnen worden gebruikt voor medicijnpermeabiliteit en ontdekkingstoepassingen, toxicologische beoordeling en om een mechanistisch begrip te bieden van de pathofysiologie van multifactoriële chronische ziekten. Bovendien kunnen hondenorganoïden het leven van gezelschapshonden verbeteren, input leveren op verschillende gebieden van veterinair onderzoek en gepersonaliseerde behandelingstoepassingen in de diergeneeskunde vergemakkelijken. Een kleine groep donoren kan een biobank van organoïde monsters creëren, waardoor de noodzaak voor continue weefseloogst wordt verminderd, omdat organoïde cellijnen voor onbepaalde tijd kunnen worden gesubkweekt. Hierin worden drie protocollen gepresenteerd die zich richten op de kweek van intestinale en hepatische canine organoïden afgeleid van volwassen stamcellen. Het Canine Organoid Isolation Protocol schetst methoden om weefsel te verwerken en het celisolaat in te bedden in een ondersteunende matrix (opgeloste extracellulaire membraanmatrix). Het Canine Organoid Maintenance Protocol beschrijft organoïde groei en onderhoud, inclusief reiniging en passaging, samen met de juiste timing voor uitbreiding. Het Organoid Harvesting and Biobanking Protocol beschrijft manieren om organoïden te extraheren, te bevriezen en te bewaren voor verdere analyse.

Watch this Scientific Journal Video about Standardization and Maintenance of 3D Canine Hepatic and Intestinal Organoid Cultures for Use in Biomedical Research at JoVE.com

Standardization and Maintenance of 3D Canine Hepatic and Intestinal Organoid Cultures for Use in Biomedical Research

Experimentele methoden om volwassen stamcellen uit intestinale en leverweefsels van honden te oogsten om 3D-organoïde culturen vast te stellen, worden beschreven. Bovendien worden de laboratoriumtechnieken besproken om een consistente groei te garanderen en standaard operationele procedures te bieden om intestinale en hepatische organoïdeculturen van honden te oogsten, biobank en nieuw leven in te blazen.

Standaardisatie en onderhoud van 3D canine hepatische en intestinale organoïde culturen voor gebruik in biomedisch onderzoek

Dogs develop complex multifactorial diseases analogous to humans, including inflammatory diseases, metabolic diseases, and cancer. Therefore, they ...

De protocollen voor de kweek van hondenhepatische en intestinale organoïden zijn belangrijk voor het standaardiseren van deze nieuwe technologie. Deze techniek maakt de betrouwbare en reproduceerbare vaststelling van de organoïde cultuur van de hond mogelijk, inclusief de organoïde isolatie, onderhoud, oogst en daaropvolgende biobanking van monsters. Canine organoïden kunnen een uitstekend model bieden voor tal van toepassingen, variërend van biologie, ontwikkeling van infectieziekten, het testen en ontdekken van geneesmiddelen, en ook transmissiegeneeskunde.Bereid om te beginnen vijf centrifugebuizen van 15 milliliter met vijf milliliter 1X complete chelaatoplossing, één buis met drie milliliter 1X complete chelaatoplossing, één lege buis en één buis met vijf milliliter 1X complete chelaatoplossing en twee milliliter foetaal runderserum. Plaats op de dag van isolatie een steriele petrischaal, scalpel, ijsemmer en koud geavanceerd DMEM-voedingsmengsel F12 in de bioveiligheidskast. Plaats het vereiste aantal 24-well celkweekplaat in de kooldioxide-incubator om voor te verwarmen.Plaats opgeloste extracellulaire membraanmatrix op ijs om te ontdooien. Koel de centrifuge voor op vier graden Celsius. Verplaats complete media met groeifactoren van de vriezer naar een waterbad van 37 graden Celsius om directe blootstelling aan licht te voorkomen.Schud weefselmonsters gedurende 30 seconden in de transportbuis. Verwijder overtollig supernatant zonder weefsel weg te gooien door langzaam te pipetteren in de buurt van het vloeistofoppervlak totdat er 0,5 milliliter in de buis achterblijft. Breng weefsel en restant over in een steriel petrischaaltje.Snijd en gehakt het weefsel met behulp van een wegwerp scalpel in kleinere stukjes die lijken op een pureeconsistentie gedurende ongeveer vijf minuten. Pipetteer het gehakte weefsel met vloeistof uit de petrischaal naar de eerste complete chelaatoplossingsbuis en voeg vervolgens twee milliliter geavanceerd DMEM-voedingsmengsel F12 toe aan de petrischaal. Spoel het resterende weefsel en breng het over naar de eerste volledige chelaatoplossingsbuis.Vortex de 1X complete chelaatoplossingsbuis ongeveer vijf keer gedurende vijf seconden. Laat biopten gedurende één minuut op de bodem van de buis bezinken en verwijder het supernatant totdat er vijf milliliter over is. Breng de 1x complete chelaatoplossing over van de nieuwe buis naar de monsterbuis.Herhaal de vorige stap voor de volgende twee buizen. En verwijder bij de laatste twee wasbeurten het supernatant tot drie milliliter die nog in de buis zitten. Breng de biopten en 1x volledige chelaatoplossing van de monsterbuis over naar één put van een plaat met zes putten.Voeg drie milliliter 1x complete chelaatoplossing toe aan de monsterbuis. Draai voorzichtig om eventueel overgebleven weefsel te verzamelen en breng het over naar dezelfde put van de plaat. Voeg 150 microliter ethyleendiamine tetra-azijnzuur toe aan 0,5 molair ethyleendiaminetetra-azijnzuur en plaats de zesputplaat op een rocker van 20 graden 24 RPM bij vier graden Celsius.Incubeer de levermonsters gedurende 10 minuten en de darmmonsters gedurende een uur op de bewegende rocker. Transporteer de zes-well plaat terug naar de bioveiligheidskast en breng het gehakte weefsel en de vloeistof over in een buis met 1X complete chelaatoplossing met foetaal runderserum. Laat de weefsels bezinken en transporteer het supernatant met 0,2 milliliter van het bovenste deel van het weefsel naar een lege buis.Draai de buis met het monster gedurende vijf minuten bij vier graden Celsius op 700 XG. Stamcellen worden nu samen met het gehakte weefsel gepelletiseerd. Verwijder en gooi het bovennatuurlijk voorzichtig weg om de pellet niet te verstoren.Resuspend de pellet in geavanceerde DMEM F12. Draai de buis opnieuw en zuig het supernatant op zonder de pellet te storen. Voeg het berekende volume van de opgeloste extracellulaire membraanmatrix toe aan de monsterbuis.Wees voorzichtig bij het verwijderen van media om de celkorrel niet te verliezen. Pipetteer bij het toevoegen van een extracellulaire membraanmatrix langzaam om geen overmatige bubbels in de organoïde suspensie te creëren. Houd het monster met de opgeloste extracellulaire membraanmatrix op ijs en zaai de suspensie in het midden van de putten, zodat de opgeloste extracellulaire membraanmatrix een koepelachtige structuur vormt.Transporteer de plaat naar een incubator en laat de opgeloste extracellulaire membraanmatrix gedurende 30 minuten stollen. Meng ROCK-remmer en GSK3 beta in complete media met groeifactoren en voeg 500 microliter van deze oplossing toe aan elke put. Plaats het bord in de couveuse.Het canine organoïde protocol genereert meestal ongeveer 50.000 tot 150.000 darm- of levercellen per put. Na stamcelisolatie beginnen hepatische hondenorganoïden hun levenscyclus als expanderende sferoïden en na zeven dagen veranderen ze in ontluikende en differentiërende organoïden. Het volume, het oppervlak, het 2D-ellipsoppervlak en de omtrek van de sferoïden werden berekend.2D-ellipsgebied en omtrek werden gebruikt om de gezondheid van de organoïdecultuur te beoordelen. Beoordeling van de expressie van de markers op een semi-kwantitatieve manier toonde aan dat de sferoïden bij voorkeur de cholangiocytmarker KRT7 tot expressie brachten, variërend van één tot 26%De stamcelmarker LGR5-expressie varieerde tussen 0,17 en 0,78%, terwijl hepatocytmarkers in lagere mate tot expressie kwamen bij 0,05 tot 0,34% voor Forkhead box 1A en 0,03 tot 0,28% voor cytochroom-P450. Een incubatie van 12 minuten met trypsine-achtig protease remde de groei van organoïden niet.De groei van organoïden werd echter negatief beïnvloed met behulp van een incubatie van 24 minuten. De overlevingskansen van canine hepatische organoïden in een ongunstige omgeving werd geanalyseerd om het volume van organoïde media en keldermatrix te bepalen dat nodig is voor de succesvolle groei en overleving van leverorganoïden. De overlevingskans van organoïden varieerde van 12,9 dagen tot 18 dagen.Basis celkweektechnieken en aseptische benaderingen zijn de essentiële voorwaarden voor een goede organoïde isolatie en onderhoud.

Research

JoVE Journal

Medicine

In Vivo Canine Muscle Function Assay

In Vivo Canine Muscle Function Assay

In vivo Canine spierfunctie Assay

We describe a minimally-invasive and reproducible method to measure canine pelvic limb muscle strength and muscle response to repeated eccentric 
...

Generation of Alginate Microspheres for Biomedical Applications

Genereren van alginaat Microspheres voor biomedische toepassingen

Alginate-based materials have received considerable attention for biomedical applications because of their hydrophilic nature, biocompatibility, and ...

The Bovine Lung in Biomedical Research: Visually Guided Bronchoscopy, Intrabronchial Inoculation and In Vivo Sampling Techniques

The Bovine Lung in Biomedical Research: Visually Guided Bronchoscopy, Intrabronchial Inoculation and In Vivo Sampling Techniques

De Bovine Lung in het biomedisch onderzoek: visueel geleide Bronchoscopie, intrabronchiale Enten en<em&gt; In Vivo</em&gt; Sampling Technieken

There is an ongoing search for alternative animal models in research of respiratory medicine. Depending on the goal of the research, large animals as ...

Use of a Low-flow Digital Anesthesia System for Mice and Rats

Toepassing van een lage stroom digitale anesthesiesysteem voor muizen en ratten

A traditional vaporizer depends on flowing gas and atmospheric pressure for passive anesthetic vaporization. Newly developed direct injection vaporizers ...

Forskolin-induced Swelling in Intestinal Organoids: An In Vitro Assay for Assessing Drug Response in Cystic Fibrosis Patients

Forskolin-induced Swelling in Intestinal Organoids: An In Vitro Assay for Assessing Drug Response in Cystic Fibrosis Patients

Forskoline-geïnduceerde zwelling in Intestinal Organoids: An<em&gt; In Vitro</em&gt; Assay voor het beoordelen van de Drug Response in patiënten met cystische fibrose

Recently-developed cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR)-modulating drugs correct surface expression and/or function of the mutant ...

Optimized Analysis of In Vivo and In Vitro Hepatic Steatosis

Optimized Analysis of In Vivo and In Vitro Hepatic Steatosis

Geoptimaliseerd Analyse van<em&gt; In Vivo</em&gt; en<em&gt; In Vitro</em&gt; Leversteatose

Establishing a system of procedures to qualitatively and quantitatively characterize in vivo and in vitro hepatic steatosis is important for metabolic ...

Improvement of a Closed Chest Porcine Myocardial Infarction Model by Standardization of Tissue and Blood Sampling Procedures

Verbetering van een gesloten borst varkens myocardiaal infarct Model door standaardisatie van weefsel en bloed bemonsteringsprocedures

Myocardial ischemia reperfusion (I/R) injury contributes to almost half of the necrotic area after myocardial infarction. To date there is no approved ...

Generation of Human 3D Lung Tissue Cultures (3D-LTCs) for Disease Modeling

Generation of Human 3D Lung Tissue Cultures 3D-LTCs for Disease Modeling

Generatie van menselijke 3D longweefsel culturen (3D-LTCs) voor ziekte modelleren

Translation of novel discoveries to human disease is limited by the availability of human tissue-based models of disease. Precision-cut lung slices (PCLS) ...

Use of 3D Robotic Ultrasound for In Vivo Analysis of Mouse Kidneys

Use of 3D Robotic Ultrasound for In Vivo Analysis of Mouse Kidneys

Gebruik van 3D-robotechografie voor in vivo analyse van muizennieren

Common modalities for in vivo imaging of rodents include positron emission tomography (PET), computed tomography (CT), magnetic resonance imaging (MRI), ...

Standardizing the Responses to Platelet Agonist Collagen-Related Peptide

Reproducibility and Harmonization in Research Using Biological Standards: The Example of Platelet Agonist Collagen-Related Peptide

Biological Standardization to Ensure Reproducibility and Harmonization in Research (Video) | JoVE

Reproduceerbaarheid en harmonisatie in onderzoek met behulp van biologische standaarden: het voorbeeld van bloedplaatjesagonist collageen-gerelateerd peptide

Metrology - the science of measure - is a subject few biological scientists are taught about in their training to their detriment; the application of ...