Name: standardization and maintenance of 3d canine hepatic and intestinal organoid cultures for use in biomedical research
Uploaded: 2022-01-31T15:00:00
Duration: 8 min 39 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Standardization and Maintenance of 3D Canine Hepatic and Intestinal Organoid Cultures for Use in Biomedical Research at JoVE.com

Les auteurs tiennent à exprimer leur gratitude aux employés du Laboratoire de diagnostic vétérinaire de l’Université d’État de l’Iowa, à savoir Haley M. Lambert, Emily Rahe, Rosalyn M. Branaman, Victoria J. Green et Jennifer M. Groeltz-Thrush, pour le traitement en temps opportun des échantillons fournis. Les auteurs souhaitent reconnaître le soutien du Faculty Startup, du prix ISU VPR Miller, du prix ISU VPR Miller et du sous-prix NSF SBIR à l’ISU # 1912948.

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K. Allenspach est cofondateur de LifEngine Animal Health et 3D Health Solutions. Elle est consultante pour Ceva Animal Health, Bioiberica, LifeDiagnostics, Antech Diagnostics, Deerland Probiotics et Mars. J. P. Mochel est co-fondateur de LifEngine Animal Health et 3D Health Solutions. Le Dr Mochel est consultant pour Ceva Animal Health et Ethos Animal Health. Les autres auteurs n’ont pas de conflits d’intérêts à déclarer.

Il existe actuellement un manque de protocoles normalisés disponibles pour l’isolement et le maintien des organoïdes hépatiques et intestinaux canins. L’établissement de procédures opérationnelles normalisées pour les cultures organoïdes est justifié pour que ce modèle soit applicable dans différents contextes de laboratoire. Plus précisément, fournir des protocoles d’exploitation normalisés pour la culture de ces modèles organoïdes canins est essentiel pour caractériser la croissance normale des organoïdes pendant la culture et le passage afin d’obtenir des points temporels optimaux pour l’expansion et la maintenance. Les organoïdes intestinaux canins cultivés selon le protocole ont déjà été caractérisés par Chandra et al.12.
L’une des étapes les plus critiques du protocole est le passage des organoïdes. Le moment optimal pour le premier passage des sphéroïdes hépatiques a été déterminé comme étant le jour 7 après l’isolement sur la base des mesures des sphéroïdes hépatiques. Le volume maximal de sphéroïdes a été atteint au jour 7, et en même temps, les sphéroïdes ont commencé à bourgeonner et à former des organoïdes hépatiques. L’augmentation du volume organoïde global du jour 2 à 7 après l’isolement a été plus de 365 fois, ce qui suggère que le temps de passage optimal est plus long que la culture organoïde intestinale canine. Après 7 jours de culture, aucun signe grossier d’apoptose cellulaire dans le sphéroïde hépatique n’a été observé, même sans nettoyage ni passage (Figure 7). Le passage des organoïdes intestinaux et hépatiques peut être difficile car la procédure peut entraîner la perte de cellules et une altération de la viabilité. Les résultats indiquent que l’incubation prolongée d’organoïdes hépatiques avec de la protéase de type trypsine (jusqu’à 12 min) n’influence pas négativement la sous-culture. L’incubation des organoïdes dans la protéase de type trypsine pendant plus de 24 minutes peut être préjudiciable à la sous-culture ultérieure des organoïdes.
En cas de rupture sous-optimale dans les amas cellulaires avec le passage organoïde, une dissociation mécanique au lieu d’une incubation prolongée avec une protéase de type trypsine pourrait être plus bénéfique. Si des problèmes sont rencontrés avec la dissociation correcte des organoïdes, un bref vortex des échantillons peut être tenté pour améliorer le rendement de passage. D’autre part, le vortex a le potentiel de ruiner une culture et d’endommager les cellules, il ne devrait donc être utilisé que lorsque d’autres procédures ont échoué à plusieurs reprises. Briser les organoïdes hépatiques en cellules individuelles réduit le taux de croissance des organoïdes, tandis que les diviser en grappes de cellules peut grandement améliorer leur viabilité. Dix minutes ont été choisies comme temps d’incubation pour le protocole organoïde. Un point de temps d’incubation de 12 minutes a été jugé non cytotoxique par rapport à une incubation de 24 minutes dans l’expérience de protéase de type trypsine.
L’expérience de survie a confirmé que les organoïdes hépatiques canins pouvaient survivre jusqu’à 19,5 jours dans des conditions défavorables (épuisement structurel et nutritionnel). Les organoïdes qui ont survécu le plus longtemps à ces conditions ont été cultivés avec des milieux CMGF+. Cette observation pourrait avoir été causée par la croissance plus lente des organoïdes hépatiques dans les milieux non supplémentés par l’inhibiteur de Rock et GSK3β. Les cultures organoïdes avec CMGF+ R/G se sont développées plus rapidement et ont peut-être épuisé leurs ressources plus rapidement. Cette expérience ouvre des possibilités de miniaturisation de la culture organoïde canine pour obtenir une conversion du système à haut débit. Une telle technologie montre le potentiel de faciliter la découverte de médicaments ou les études toxicologiques à un coût considérablement réduit.
Certains problèmes courants rencontrés lors de l’entretien de la culture organoïde canine sont une solidification incorrecte de l’échantillon lors du placage, la contamination de la culture et l’établissement de la densité et de la taille appropriées des organoïdes. Si l’ECM solubilisé se solidifie prématurément pendant le placage, placez-le immédiatement sur de la glace pendant 10 min. Si l’ECM solubilisé ne forme pas de structures en forme de dôme, il est probable qu’un nombre insuffisant de supports ait été retiré de l’échantillon. Si tel est le cas, diluer l’échantillon avec un ECM plus solubilisé jusqu’à ce que des dômes se forment.
Lorsqu’une contamination fongique ou bactérienne est trouvée dans une plaque entière (voir la figure 4), la meilleure solution est de jeter la plaque. Un traitement avec des médicaments antifongiques ou antibiotiques peut être tenté, mais le succès d’une telle tentative est extrêmement faible. Si un seul puits est contaminé dans une plaque, les puits viables et non affectés peuvent être nettoyés (suivez les étapes 4.1 à 4.5) sur une nouvelle plaque et surveillés de près. Si l’échantillon a déjà été congelé d’urgence, il est conseillé de jeter l’échantillon entier, car la décongélation de l’échantillon expose l’incubateur à un risque de contamination supplémentaire.
La culture organoïde saine doit être au moins dans la catégorie de taille moyenne et de densité moyenne ou plus grande. Une densité optimale est cruciale pour la croissance de la culture organoïde. Une densité plus faible doit être corrigée en nettoyant les organoïdes à une densité moyenne. Si la situation de densité extrême se produit (surpeuplement), les organoïdes doivent être étendus à plus de puits. Les signes bruts d’apoptose cellulaire accompagnent souvent à la fois la surpopulation et la faible densité de la culture organoïde. Si ces problèmes ne sont pas corrigés à temps, toute la culture organoïde deviendra apoptotique en quelques jours. Si les organoïdes atteignent une très grande taille ou une densité très élevée, la culture doit être utilisée pour une expérience, une congélation ou une fixation.
Le milieu organoïde contient actuellement 17 composants, et l’ajout de facteurs de croissance nécessaires à l’entretien et à l’expansion des organoïdes peut donc être coûteux. Ce problème peut être résolu en cultivant des cultures cellulaires 2D qui synthétisent les facteurs de croissance pour produire du CMGF+ conditionné. La culture cellulaire L-WRN produit des facteurs de croissance Wnt-3a, R-Spondin-3 et Noggin37. La colonie cellulaire utilise 90 % de milieux de culture DMEM/F12 et 10 % de FBS. Lorsque la culture atteint 90% de confluence, les médias sont récoltés tous les jours pendant 1 semaine. Le milieu récolté est ensuite mélangé avec 2x CMGF+ (sans ces facteurs de croissance). Alors que les cultures 2D peuvent produire les facteurs de croissance nécessaires à une fraction du coût, il faut s’attendre à un temps et à une préparation supplémentaires pour produire le média. Les concentrations de facteurs de croissance entre les lots de milieux conditionnés peuvent également différer37,38.
Les cultures organoïdes canines dérivées de cellules souches adultes sont un modèle biomédical unique qui peut aider à atteindre les objectifs de l’Initiative Une seule santé39. La technologie organoïde peut être utilisée dans de nombreux domaines de recherche fondamentale et biomédicale, allant de la biologie du développement, de la physiopathologie, de la découverte et des essais de médicaments, de la toxicologie à l’étude des maladies infectieuses et de la médecine régénérative40. La recherche translationnelle et la recherche translationnelle inverse sont deux domaines où les organoïdes canins sont applicables15. Les chiens sont utilisés depuis des siècles dans des contextes expérimentaux translationnels, et leur statut d’animal de compagnie a également facilité leur position comme l’une des espèces les plus explorées en médecine vétérinaire.
En conclusion, ce manuscrit fournit des protocoles d’exploitation normalisés pour l’isolement, l’entretien, le prélèvement et la biobanque d’organoïdes hépatiques et intestinaux canins afin de faciliter l’application de ce modèle dans divers domaines biomédicaux. Ce modèle est particulièrement approprié pour promouvoir la recherche translationnelle inversée en tant qu’outil de l’initiative Une seule santé afin de promouvoir le partage inter et intradisciplinaire des connaissances.

Les rongeurs sont le modèle animal le plus couramment utilisé pour la recherche biomédicale et translationnelle1. Ils sont exceptionnellement utiles pour étudier la pathogenèse moléculaire de base des maladies, bien que leur pertinence clinique pour les maladies multifactorielles chroniques ait récemment été remise en question2. Le modèle canin présente plusieurs avantages par rapport aux rongeurs3,4. Les chiens et les humains partagent des similitudes dans la métabolomique et le microbiome intestinal qui se sont développées en raison de la consommation de l’alimentation humaine à diverses périodes de leur domestication5,6,7. Les similitudes entre l’anatomie et la physiologie gastro-intestinales canines et humaines en sont un autre exemple8.
De plus, les chiens partagent souvent des environnements et des modes de vie similaires avec leurs propriétaires9. La durée de vie plus longue des chiens par rapport aux rongeurs permet le développement naturel de nombreuses maladies chroniques10. Les maladies inflammatoires de l’intestin ou syndrome métabolique sont des exemples de maladies chroniques multifactorielles qui partagent des similitudes importantes entre les humains et les chiens11,12. Les essais précliniques canins impliquant des chiens atteints de maladies naturelles peuvent générer des données plus fiables que celles obtenues à partir de modèles de rongeurs13. Cependant, pour minimiser l’utilisation de la recherche sur les animaux vivants et se conformer aux principes des 3R (Réduire, Raffiner, Remplacer)14, des alternatives aux tests in vivo utilisant des organoïdes canins in vitro 3D ont émergé15.
Les organoïdes sont des structures auto-assemblées dérivées de cellules souches 3D qui récapitulent la physiologie et la microanatomie de leurs organes d’origine16,17. Cette technologie a été décrite pour la première fois par Sato et al. en 200917 et a permis plus d’études in vitro traduisibles dans des lignées cellulaires épithéliales qu’auparavant possibles avec des cultures de cellules cancéreuses 2D18,19,20. Les organoïdes sont des modèles in vitro utiles dans de nombreuses disciplines biomédicales telles que les études toxicologiques précliniques21,22,23, d’absorption ou de métabolisme24,25,26,27,28, ainsi que dans les approches médicales personnalisées29,30,31 . La culture réussie d’organoïdes intestinaux canins a été décrite pour la première fois en 201912, tandis que des organoïdes hépatiques dérivés d’un chien ont été signalés pour la première fois par Nantasanti et al. en 201532. Les organoïdes canins ont depuis été utilisés avec succès dans des études portant sur les entéropathies chroniques canines, les tumeurs stromales gastro-intestinales, l’adénocarcinome colorectal12 et la maladie de Wilson33,34.
Alors que les cellules souches adultes peuvent être prélevées par nécropsies, la technologie organoïde ne nécessite pas toujours le sacrifice des animaux. Les biopsies endoscopiques et laparoscopiques, ou même les aspirations à l’aiguille fine d’organes35, sont une source viable de cellules souches adultes pour l’isolement organoïde épithélial12. L’utilisation généralisée de ces techniques non invasives dans la pratique vétérinaire facilite les options de recherche translationnelle inverse (traduction de l’information de la pratique clinique vétérinaire à la pratique clinique humaine et vice versa)15. Les progrès de la technologie organoïde peuvent être assurés par la normalisation des méthodes de culture et de maintenance organoïdes. Le protocole organoïde présenté ici est partiellement basé sur les travaux précédemment publiés de Saxena et al. de 201536, et les méthodes ont été adaptées pour s’adapter aux spécificités de la culture organoïde intestinale et hépatique canine. Le flux de travail global des protocoles organoïdes canins est illustré à la figure 1.
Le protocole d’isolement organoïde canin introduit des méthodes d’obtention d’échantillons à partir de biopsies endoscopiques, laparoscopiques et chirurgicales, ainsi que de nécropsies. Il décrit le prétraitement initial des échantillons de tissus et les méthodologies utilisées pour le transport vers le laboratoire. Les matériaux et les réactifs nécessaires à l’isolation organoïde sont résumés dans la section « Préparation à l’isolement ». Le processus d’isolement des cellules souches adultes à partir d’échantillons de tissus est décrit plus en détail. Enfin, le processus de placage des organoïdes dans des structures en forme de dôme à l’aide d’une matrice membranaire extracellulaire solubilisée est discuté.
Le deuxième protocole, Canine Organoid Maintenance Protocol, décrit les méthodes de documentation et de culture des organoïdes. Les changements de médias et leur fréquence sont abordés dans cette section. En outre, les procédures de laboratoire telles que le passage et le nettoyage des cultures cellulaires, qui sont essentielles pour assurer le maintien réussi des organoïdes canins 3D, sont décrites. Le passage approprié est une étape critique du protocole, et les ajustements et le dépannage possibles de cette étape sont discutés plus en détail dans le manuscrit.
Le dernier protocole est le protocole de prélèvement d’organoïdes canins et de biobanque contenant des méthodes de préparation d’organoïdes adultes pour l’incorporation de paraffine et la préservation de l’ARN. Les méthodes de biobanque d’échantillons organoïdes dans le stockage d’azote liquide sont également décrites ici. Enfin, les moyens de décongeler les échantillons congelés et de soutenir leur croissance sont discutés.
En conclusion, cet article vise à fournir des procédures cohérentes de culture organoïde canine grâce à la normalisation des protocoles inter-laboratoires. Ce faisant, le manuscrit vise à faciliter la reproductibilité des données dérivées de modèles organoïdes canins afin d’accroître leur pertinence dans la recherche biomédicale translationnelle.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63515/63515fig01.jpg"> Figure 1 : Flux de travail des protocoles organoïdes canins. Le protocole d’isolement organoïde canin décrit la préparation du matériel nécessaire à l’isolement organoïde, le prélèvement d’un échantillon de tissu (au moyen de nécropsies, de biopsies endoscopiques, laparoscopiques et chirurgicales) et des conseils sur la dissociation cellulaire et le placage de la population cellulaire. Le protocole d’entretien des organoïdes canins traite du nettoyage et du passage de la culture organoïde. Le protocole de prélèvement d’organoïdes et de biobanque traite de la préparation d’échantillons organoïdes pour l’incorporation de paraffine et la caractérisation plus poussée des organoïdes. Les méthodes permettant de biobanquer les cultures organoïdes et de les faire revivre du stockage dans de l’azote liquide sont également discutées. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63515/63515fig01large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Chelating solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Sorbitol</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>BP439-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT</td>
			<td>Promega</td>
			<td>V3151</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>P217-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P5655-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4-2H2O</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S5136-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>S271-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen Strep</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>S5-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Organoid media</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>[Leu15]-Gastrin I human</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G9145-.5MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A-83-01</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>9094360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Advanced DMEM/F12</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12634-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17504-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Corning</td>
			<td>35-010-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamax</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>VWR Life Science</td>
			<td>J848-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human R-Spondin-1</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>120-38-500UG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Murine EGF</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>315-09-1MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Murine Noggin</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>250-38-250UG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Murine Wnt-3a</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>315-20-10UG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2 supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17502-048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-Acetyl-L-cysteine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9165-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nicotinamide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>N0636-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primocin</td>
			<td>InvivoGen</td>
			<td>ant-pm-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ROCK inhibitor (Y-27632)</td>
			<td>EMD Millipore Corp.</td>
			<td>SCM 075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SB202190 (P38 inhibitor)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S7067-25MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stemolecule CHIR99021 (GSK3&#946;)</td>
			<td>Reprocell</td>
			<td>04-0004-base</td>
			<td></td>
		</tr>
		
		<tr>
			<td>Trimethoprim</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T7883-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfamethoxazole</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7507-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic Acid, Glacial</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>A38-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl Sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Fisher Chemicals</td>
			<td>D128-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA, pH 8.0, 0.5 M</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15575-038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde (37%)</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>F79P-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G5882</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel Matrix For Organoid Culture</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356255</td>
			<td>Extracellular Membrane Matrix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde, 97%</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>A11313</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS, 1X (Phosphate-Buffered Saline)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-040-CM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS, 1X (Phosphate-Buffered Saline)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-040-CM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAlater Soln.</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM7021</td>
			<td>RNA Storage Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Express</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12604-021</td>
			<td>Trypsin-like Protease</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Other</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 Well Cell Culture Plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ACD Hybez II Hybridization System</td>
			<td>ACD a biotechne brand</td>
			<td>321710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge Tube, 15 mL</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430766</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CoolCell LX</td>
			<td>Corning</td>
			<td>BCS-405MC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryogenic Vials</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430488</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Centrifuge Tube (50 mL)</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>05-539-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GyroMini Nutating mixer (Rocker)</td>
			<td>Labnet</td>
			<td>S0500-230V-EU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat Bath</td>
			<td>Lab-Line Instruments</td>
			<td>3000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mr. Frosty Freezing Container</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>5100-0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop 2000</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>ND2000CLAPTOP</td>
			<td>SpectrophotometerAnalysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Panasonic incubator</td>
			<td>Panasonic</td>
			<td>MCO-170ML-PA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm M Wrapping Film</td>
			<td>Bemis Company Inc</td>
			<td>PM996/EMD</td>
			<td>Laboratory Flexible Film Tape</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protected Disposable Scalpels</td>
			<td>Bard-Parker</td>
			<td>239844</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAscope 2.5 HD Assay &#8211; RED</td>
			<td>ACD a biotechne brand</td>
			<td>322350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAscope H2O2 &#38; Protease Plus Reagents</td>
			<td>ACD a biotechne brand</td>
			<td>322330</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAscope Target Retrieval Reagents</td>
			<td>ACD a biotechne brand</td>
			<td>322000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAscope Wash Buffer Reagents</td>
			<td>ACD a biotechne brand</td>
			<td>310091</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Culture Dish</td>
			<td>Dot Scientific</td>
			<td>6676621</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Culture Plate 24 wells</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>FB012929</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

standardization and maintenance of 3d canine hepatic and intestinal organoid cultures for use in biomedical research

Les chiens développent des maladies multifactorielles complexes analogues aux humains, y compris les maladies inflammatoires, les maladies métaboliques et le cancer. Par conséquent, ils représentent de grands modèles animaux pertinents avec le potentiel translationnel de la médecine humaine. Les organoïdes sont des structures auto-assemblées en 3 dimensions (3D) dérivées de cellules souches qui imitent la microanatomie et la physiologie de leur organe d’origine. Ces modèles translationnels in vitro peuvent être utilisés pour des applications de perméabilité et de découverte de médicaments, l’évaluation toxicologique et pour fournir une compréhension mécaniste de la physiopathologie des maladies chroniques multifactorielles. En outre, les organoïdes canins peuvent améliorer la vie des chiens de compagnie, en fournissant des informations dans divers domaines de la recherche vétérinaire et en facilitant les applications de traitement personnalisé en médecine vétérinaire. Un petit groupe de donneurs peut créer une biobanque d’échantillons organoïdes, réduisant ainsi le besoin de prélèvement continu de tissus, car les lignées cellulaires organoïdes peuvent être sous-cultivées indéfiniment. Ici, trois protocoles axés sur la culture d’organoïdes canins intestinaux et hépatiques dérivés de cellules souches adultes sont présentés. Le canine Organoid Isolation Protocol décrit les méthodes de traitement des tissus et l’incorporation de l’isolat cellulaire dans une matrice de soutien (matrice membranaire extracellulaire solubilisée). Le protocole d’entretien des organoïdes canins décrit la croissance et l’entretien des organoïdes, y compris le nettoyage et le passage ainsi que le moment approprié pour l’expansion. Le protocole de prélèvement d’organoïdes et de biobanque décrit les moyens d’extraire, de congeler et de conserver les organoïdes pour une analyse plus approfondie.

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Standardization and Maintenance of 3D Canine Hepatic and Intestinal Organoid Cultures for Use in Biomedical Research

Des méthodes expérimentales de prélèvement de cellules souches adultes dans des tissus intestinaux et hépatiques canins afin d’établir des cultures organoïdes 3D sont décrites. En outre, les techniques de laboratoire permettant d’assurer une croissance constante et de fournir des procédures opérationnelles normalisées pour prélever, biobanquer et raviver les cultures organoïdes intestinales et hépatiques canines sont discutées.

Normalisation et maintenance des cultures organoïdes hépatiques et intestinales canines 3D pour une utilisation dans la recherche biomédicale

Dogs develop complex multifactorial diseases analogous to humans, including inflammatory diseases, metabolic diseases, and cancer. Therefore, they ...

Les protocoles pour la culture d’organoïdes hépatiques et intestinaux canins sont importants pour normaliser cette nouvelle technologie. Cette technique permet l’établissement fiable et reproductible de la culture organoïde canine, y compris l’isolement organoïde, l’entretien, le prélèvement et la biobanque ultérieure des échantillons. Les organoïdes canins peuvent fournir un excellent modèle pour de nombreuses applications allant de la biologie, du développement de maladies infectieuses, du dépistage et de la découverte de médicaments, ainsi que de la médecine de transmission.Pour commencer, préparez cinq tubes centrifuges de 15 millilitres avec cinq millilitres de solution chélatante complète 1X, un tube avec trois millilitres de solution chélatante complète 1X, un tube vide et un tube avec cinq millilitres de 1X solution chélatante complète et deux millilitres de sérum bovin fœtal. Le jour de l’isolement, placez une boîte de Petri stérile, un scalpel, un seau à glace et un mélange de nutriments DMEM avancé froid F12 dans l’armoire de biosécurité. Placez le nombre requis de plaque de culture cellulaire de 24 puits dans l’incubateur à dioxyde de carbone pour préchauffer.Placez la matrice de membrane extracellulaire solubilisée sur la glace pour la décongélation. Pré-refroidir la centrifugeuse à quatre degrés Celsius. Déplacez le support complet avec des facteurs de croissance du congélateur vers un bain-marie de 37 degrés Celsius en évitant l’exposition directe à la lumière.Agiter les échantillons de tissus dans le tube de transport pendant 30 secondes. Enlevez l’excès de surnageant sans jeter de tissu en pipetant lentement près de la surface du liquide jusqu’à ce qu’il reste 0,5 millilitre dans le tube. Transférer le tissu et le surnageant restant dans une boîte de Petri stérile.À l’aide d’un scalpel jetable, coupez et hachez le tissu en plus petits morceaux ressemblant à une consistance de purée pendant environ cinq minutes. Pipeter le tissu haché avec du liquide de la boîte de Petri dans le premier tube de solution chélatante complète, puis ajouter deux millilitres de mélange nutritif DMEM avancé F12 à la boîte de Pétri. Rincer le tissu restant et transférer dans le premier tube de solution chélatante complète.Vortex le tube de solution chélatante complète 1X environ cinq fois pendant cinq secondes. Laissez les biopsies se déposer au fond du tube pendant une minute et retirez le surnageant jusqu’à ce qu’il reste cinq millilitres. Transférer la solution chélatante complète 1X du nouveau tube vers le tube d’échantillonnage.Répétez l’étape précédente pour les deux tubes suivants. Et lors des deux derniers lavages, retirez le surnageant jusqu’à trois millilitres restant dans le tube. Transférer les biopsies et la solution chélatante complète 1X du tube d’échantillonnage à un puits d’une plaque de six puits.Ajouter trois millilitres de solution chélatante complète 1X au tube d’échantillonnage. Tourbillonnez doucement pour recueillir tout tissu restant et transférez-le dans le même puits de la plaque. Ajouter 150 microlitres d’acide tétraacétique d’éthylène diamine 0,5 molaire dans un puits et placer la plaque de six puits sur une bascule à 20 degrés 24 tr/min à quatre degrés Celsius.Incuber les échantillons de foie pendant 10 minutes et les échantillons intestinaux pendant une heure sur la bascule en mouvement. Transportez la plaque à six puits jusqu’à l’armoire de biosécurité et transférez le tissu haché et le liquide dans un tube contenant 1 fois une solution chélatante complète avec du sérum bovin fœtal. Laissez les tissus se déposer et transporter le surnageant avec 0,2 millilitre de la partie supérieure du tissu vers un tube vide.Faites tourner le tube contenant l’échantillon à 700 XG pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius. Les cellules souches sont maintenant entassées avec le tissu haché. Retirez et jetez soigneusement le surnageant pour ne pas déranger la pastille.Remettez en suspension la pastille dans le DMEM F12 avancé. Faites tourner à nouveau le tube et aspirez le surnageant sans perturber la pastille. Ajouter le volume calculé de matrice de membrane extracellulaire solubilisée au tube d’échantillonnage.Soyez prudent lorsque vous retirez le média afin de ne pas perdre la pastille cellulaire. Lors de l’ajout d’une matrice membranaire extracellulaire, pipettez lentement pour ne pas créer de bulles excessives dans la suspension organoïde. Conservez l’échantillon avec la matrice de membrane extracellulaire solubilisée sur de la glace et ensemencez la suspension au milieu des puits afin que la matrice de membrane extracellulaire solubilisée forme une structure en forme de dôme.Transportez la plaque vers un incubateur et laissez la matrice de membrane extracellulaire solubilisée se solidifier pendant 30 minutes. Mélangez l’inhibiteur de ROCK et GSK3 bêta dans un milieu complet avec des facteurs de croissance et ajoutez 500 microlitres de cette solution à chaque puits. Placez la plaque dans l’incubateur.Le protocole organoïde canin génère généralement environ 50 000 à 150 000 cellules intestinales ou hépatiques par puits. Après l’isolement des cellules souches, les organoïdes canins hépatiques commencent leur cycle de vie en tant que sphéroïdes en expansion, et après sept jours, ils se transforment en organoïdes bourgeonnants et différenciants. Le volume, la surface, la surface, la zone d’ellipse 2D et la circonférence des sphéroïdes ont été calculés.La zone d’ellipse 2D et la circonférence ont été utilisées pour évaluer la santé de la culture organoïde. L’évaluation de l’expression des marqueurs de manière semi-quantitative a montré que les sphéroïdes exprimaient préférentiellement le marqueur cholangiocyte KRT7 allant de un à 26%L’expression du marqueur de cellules souches LGR5 variait entre 0,17 et 0,78%, tandis que les marqueurs hépatocytaires étaient exprimés dans une moindre mesure à 0,05 à 0,34% pour la boîte fourche 1A et de 0,03 à 0,28% pour le cytochrome-P450. Une incubation de 12 minutes avec de la protéase de type trypsine n’a pas inhibé la croissance organoïde.Cependant, la croissance des organoïdes a été affectée négativement en utilisant une incubation de 24 minutes. La capacité de survie des organoïdes hépatiques canins dans un environnement défavorable a été analysée pour déterminer le volume de milieux organoïdes et de matrice sous-jacente nécessaires à la croissance et à la survie réussies des organoïdes hépatiques. Le taux de survie des organoïdes variait de 12,9 jours à 18 jours.Les techniques de culture cellulaire de base et les approches aseptiques sont les conditions préalables essentielles à l’isolement et au maintien appropriés des organoïdes.

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