Name: standardization and maintenance of 3d canine hepatic and intestinal organoid cultures for use in biomedical research
Uploaded: 2022-01-31T15:00:00
Duration: 8 min 39 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Standardization and Maintenance of 3D Canine Hepatic and Intestinal Organoid Cultures for Use in Biomedical Research at JoVE.com

המחברים רוצים להביע הכרת תודה למעבדת האבחון הווטרינרית של עובדי אוניברסיטת איווה סטייט, כלומר, היילי מ' למברט, אמילי רה, רוזלין מ. ברנמן, ויקטוריה ג'יי גרין וג'ניפר מ. גרולץ-קיכלי, על העיבוד בזמן של הדגימות שסופקו. המחברים מבקשים להכיר בתמיכת הסטארט-אפ של הפקולטה, פרס ISU VPR מילר, פרס ISU VPR מילר, ופרס המשנה של NSF SBIR ל- ISU # 1912948.

<ol>
	<li>Hickman, D. L., Johnson, J., Vemulapalli, T. H., Crisler, J. R., Shepherd, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Commonly+used+animal+models.">Commonly used animal models.</a> Principles of Animal Research for Graduate and Undergraduate Students. , 117-175 (2017).</li><li>De Jong, M., Maina, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Of+mice+and+humans:+Are+they+the+same?+-+Implications+in+cancer+translational+research.">Of mice and humans: Are they the same? - Implications in cancer translational research.</a> Journal of Nuclear Medicine. 51 (4), 501-504 (2010).</li><li>Cannarozzi, G., Schneider, A., Gonnet, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+phylogenomic+study+of+human,+dog,+and+mouse.">A phylogenomic study of human, dog, and mouse.</a> PLoS Computational Biology. 3 (1), 0009-0014 (2007).</li><li>Jacob, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Researchers+turn+to+canine+clinical+trials+to+advance+cancer+therapies.">Researchers turn to canine clinical trials to advance cancer therapies.</a> JAMA - Journal of the American Medical Association. 315 (15), 1550-1552 (2016).</li><li>Ziegler, A., Gonzalez, L., Blikslager, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large+animal+models:+The+key+to+translational+discovery+in+digestive+disease+research.">Large animal models: The key to translational discovery in digestive disease research.</a> Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 2 (6), 716-724 (2016).</li><li>Swanson, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phylogenetic+and+gene-centric+metagenomics+of+the+canine+intestinal+microbiome+reveals+similarities+with+humans+and+mice.">Phylogenetic and gene-centric metagenomics of the canine intestinal microbiome reveals similarities with humans and mice.</a> ISME Journal. 5 (4), 639-649 (2011).</li><li>Coelho, L. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Similarity+of+the+dog+and+human+gut+microbiomes+in+gene+content+and+response+to+diet.">Similarity of the dog and human gut microbiomes in gene content and response to diet.</a> Microbiome. 6 (1), 72 (2018).</li><li>Nguyen, T. L. A., Vieira-Silva, S., Liston, A., Raes, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+informative+is+the+mouse+for+human+gut+microbiota+research.">How informative is the mouse for human gut microbiota research.</a> DMM Disease Models and Mechanisms. 8 (1), 1-16 (2015).</li><li>Bontempo, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nutrition+and+health+of+dogs+and+cats:+Evolution+of+petfood.">Nutrition and health of dogs and cats: Evolution of petfood.</a> Veterinary Research Communications. 29, 45-50 (2005).</li><li>Allenspach, K., Gaschen, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Canine+chronic+enteropathies:+A+review.">Canine chronic enteropathies: A review.</a> Schweizer Archiv fur Tierheilkunde. 145 (5), 209-222 (2003).</li><li>Tribuddharatana, T., Kongpiromchean, Y., Sribhen, K., Sribhen, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biochemical+alterations+and+their+relationships+with+the+metabolic+syndrome+components+in+canine+obesity.">Biochemical alterations and their relationships with the metabolic syndrome components in canine obesity.</a> Kasetsart Journal - Natural Science. 45 (4), 622-628 (2011).</li><li>Chandra, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derivation+of+adult+canine+intestinal+organoids+for+translational+research+in+gastroenterology.">Derivation of adult canine intestinal organoids for translational research in gastroenterology.</a> BMC Biology. 17 (1), 33 (2019).</li><li>Schaefer, K., Rensing, S., Hillen, H., Burkhardt, J. E., Germann, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Is+Science+the+only+driver+in+species+selection?+An+internal+study+to+evaluate+compound+requirements+in+the+minipig+compared+to+the+dog+in+preclinical+studies.">Is Science the only driver in species selection? An internal study to evaluate compound requirements in the minipig compared to the dog in preclinical studies.</a> Toxicologic Pathology. 44 (3), 474-479 (2016).</li><li>MacArthur Clark, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+3Rs+in+research:+A+contemporary+approach+to+replacement,+reduction+and+refinement.">The 3Rs in research: A contemporary approach to replacement, reduction and refinement.</a> British Journal of Nutrition. 120, 1-7 (2018).</li><li>Schneider, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Model-based+reverse+translation+between+veterinary+and+human+medicine:+The+one+health+initiative.">Model-based reverse translation between veterinary and human medicine: The one health initiative.</a> CPT: Pharmacometrics and Systems Pharmacology. 7 (2), 65-68 (2018).</li><li>Lehmann, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+organoids:+A+new+dimension+in+cell+biology.">Human organoids: A new dimension in cell biology.</a> Molecular Biology of the Cell. 30 (10), 1129-1137 (2019).</li><li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+Lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche.">Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).</li><li>Kim, J., Koo, B. K., Knoblich, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+organoids:+model+systems+for+human+biology+and+medicine.">Human organoids: model systems for human biology and medicine.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 21 (10), 571-584 (2020).</li><li>Jensen, C., Teng, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Is+it+time+to+start+transitioning+from+2D+to+3D+cell+culture.">Is it time to start transitioning from 2D to 3D cell culture.</a> Frontiers in Molecular Biosciences. 7, 33 (2020).</li><li>Ho, B. X., Pek, N. M. Q., Soh, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disease+modeling+using+3D+organoids+derived+from+human+induced+pluripotent+stem+cells.">Disease modeling using 3D organoids derived from human induced pluripotent stem cells.</a> International Journal of Molecular Sciences. 19 (4), 936 (2018).</li><li>Truskey, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+microphysiological+systems+and+organoids+as+in+vitro+models+for+toxicological+studies.">Human microphysiological systems and organoids as in vitro models for toxicological studies.</a> Frontiers in Public Health. 6, 185 (2018).</li><li>Caipa Garcia, A. L., Arlt, V. M., Phillips, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoids+for+toxicology+and+genetic+toxicology:+applications+with+drugs+and+prospects+for+environmental+carcinogenesis.">Organoids for toxicology and genetic toxicology: applications with drugs and prospects for environmental carcinogenesis.</a> Mutagenesis. , (2021).</li><li>Augustyniak, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoids+are+promising+tools+for+species-specific+in+vitro+toxicological+studies.">Organoids are promising tools for species-specific in vitro toxicological studies.</a> Journal of Applied Toxicology. 39 (12), 1610-1622 (2019).</li><li>Zietek, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoids+to+study+intestinal+nutrient+transport,+drug+uptake+and+metabolism+-+Update+to+the+human+model+and+expansion+of+applications.">Organoids to study intestinal nutrient transport, drug uptake and metabolism - Update to the human model and expansion of applications.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 577656 (2020).</li><li>Zietek, T., Rath, E., Haller, D., Daniel, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+organoids+for+assessing+nutrient+transport,+sensing+and+incretin+secretion.">Intestinal organoids for assessing nutrient transport, sensing and incretin secretion.</a> Scientific Reports. 5 (1), 1-10 (2015).</li><li>Kar, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoids:+a+promising+new+in+vitro+platform+in+livestock+and+veterinary+research.">Organoids: a promising new in vitro platform in livestock and veterinary research.</a> Veterinary Research. 52 (1), 1-17 (2021).</li><li>Borcherding, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sa1976+polyphenols+reverse+the+pathologic+effects+of+palmitic+acid+and+high+fat+diet+in+canine+enteroids.">Sa1976 polyphenols reverse the pathologic effects of palmitic acid and high fat diet in canine enteroids.</a> Gastroenterology. 158 (6), 486 (2020).</li><li>Ambrosini, Y. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recapitulation+of+the+accessible+interface+of+biopsy-derived+canine+intestinal+organoids+to+study+epithelial-luminal+interactions.">Recapitulation of the accessible interface of biopsy-derived canine intestinal organoids to study epithelial-luminal interactions.</a> PLoS ONE. 15 (4), 0231423 (2020).</li><li>Zdyrski, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Su124+homology+directed+repair+in+canine+duodenal+enteroids+to+mimic+the+wild-type+P-glycoprotein+mutation.">Su124 homology directed repair in canine duodenal enteroids to mimic the wild-type P-glycoprotein mutation.</a> Gastroenterology. 160 (6), 625 (2021).</li><li>Li, Y., Tang, P., Cai, S., Peng, J., Hua, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoid+based+personalized+medicine:+from+bench+to+bedside.">Organoid based personalized medicine: from bench to bedside.</a> Cell Regeneration. 9 (1), 21 (2020).</li><li>Kurr, L. A., Allenspach, K., Jergens, A., Mochel, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Harnessing+the+biology+of+intestinal+organoids+to+accelerate+drug+discovery+in+inflammatory+bowel+disease:+A+one+health+approach.">Harnessing the biology of intestinal organoids to accelerate drug discovery in inflammatory bowel disease: A one health approach.</a> The FASEB Journal. 34, 1 (2020).</li><li>Nantasanti, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disease+modeling+and+gene+therapy+of+copper+storage+disease+in+canine+hepatic+organoids.">Disease modeling and gene therapy of copper storage disease in canine hepatic organoids.</a> Stem Cell Reports. 5 (5), 895-907 (2015).</li><li>Favier, R. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=COMMD1-Deficient+dogs+accumulate+copper+in+hepatocytes+and+provide+a+good+model+for+chronic+hepatitis+and+fibrosis.">COMMD1-Deficient dogs accumulate copper in hepatocytes and provide a good model for chronic hepatitis and fibrosis.</a> PLoS ONE. 7 (8), 42158 (2012).</li><li>Kruitwagen, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+survival+of+transplanted+autologous+canine+liver+organoids+in+a+COMMD1-deficient+dog+model+of+metabolic+liver+disease.">Long-term survival of transplanted autologous canine liver organoids in a COMMD1-deficient dog model of metabolic liver disease.</a> Cells. 9 (2), 410 (2020).</li><li>Vilgelm, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fine-needle+aspiration-based+patient-derived+cancer+organoids.">Fine-needle aspiration-based patient-derived cancer organoids.</a> iScience. 23 (8), 101408 (2020).</li><li>Saxena, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+intestinal+enteroids:+A+new+model+to+study+human+rotavirus+infection,+host+restriction,+and+pathophysiology.">Human intestinal enteroids: A new model to study human rotavirus infection, host restriction, and pathophysiology.</a> Journal of Virology. 90 (1), 43-56 (2016).</li><li>VanDussen, K. L., Sonnek, N. M., Stappenbeck, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=L-WRN+conditioned+medium+for+gastrointestinal+epithelial+stem+cell+culture+shows+replicable+batch-to-batch+activity+levels+across+multiple+research+teams.">L-WRN conditioned medium for gastrointestinal epithelial stem cell culture shows replicable batch-to-batch activity levels across multiple research teams.</a> Stem Cell Research. 37, 101430 (2019).</li><li>Powell, R. H., Behnke, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=WRN+conditioned+media+is+sufficient+for+in+vitro+propagation+of+intestinal+organoids+from+large+farm+and+small+companion+animals.">WRN conditioned media is sufficient for in vitro propagation of intestinal organoids from large farm and small companion animals.</a> Biology Open. 6 (5), 698-705 (2017).</li><li>Mackenzie, J. S., Jeggo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+one+health+approach-why+is+it+so+important.">The one health approach-why is it so important.</a> Tropical Medicine and Infectious Disease. 4 (2), 88 (2019).</li><li>Artegiani, B., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+and+application+of+3D-organoid+technology.">Use and application of 3D-organoid technology.</a> Human Molecular Genetics. 27 (2), 99-107 (2018).</li></ol>

ק. אלנספאך הוא מייסד שותף של LifEngine בריאות בעלי חיים ופתרונות בריאות 3D. היא משמשת כיועצת לבריאות בעלי חיים של Ceva, Bioiberica, LifeDiagnostics, אבחון אנטק, פרוביוטיקה דירלנד, ומאדים. ג'יי פי מוכל הוא מייסד שותף של LifEngine Animal Health Health ופתרונות בריאות תלת-ממדיים. ד"ר Mochel משמש כיועץ לבריאות בעלי חיים Ceva ובריאות בעלי חיים אתוס. למחברים אחרים אין ניגוד אינטרסים להצהיר.

כיום קיים מחסור בפרוטוקולים מתוקננים הזמינים לבידוד ותחזוקה של כבד כלבים ואורגנוידים במעיים. קביעת נהלי הפעלה סטנדרטיים עבור תרביות organoid נדרשת עבור מודל זה להיות ישים בהגדרות מעבדה שונות. באופן ספציפי, מתן פרוטוקולי הפעלה סטנדרטיים לתרבות של מודלים אורגנוידים כלבים אלה הוא המפתח לאפיון הצמיחה הרגילה של organoids במהלך התרבות ועובר כדי להפיק נקודות זמן אופטימליות להתרחבות ותחזוקה. אורגנוידים מעיים כלבים בתרבית באמצעות הפרוטוקול אופיינו בעבר על ידי Chandra et al.12.
אחד הצעדים הקריטיים ביותר של הפרוטוקול הוא העברת אורגנוידים. הזמן האופטימלי למעבר הראשון של כדורי כבד נקבע להיות ביום 7 לאחר הבידוד בהתבסס על מדידות ספרואיד בכבד. הנפח המרבי של כדוריות הושג על ידי יום 7, ובאותו הזמן, spheroids החלו ניצן ויצרו organoids כבד. העלייה בנפח האורגנויד הכולל מהיום 2-7 לאחר הבידוד הייתה יותר מפי 365, מה שמצביע על כך שזמן המעבר האופטימלי ארוך יותר מתרבות האורגנויד במעיים של הכלבים. לאחר 7 ימים בתרבות, לא נצפו סימנים גסים לאפופטוזיס תאי בספרואיד הכבד, גם ללא ניקוי או מעבר (איור 7). העברת האורגנוידים המעיים והכבד יכול להיות מאתגר כמו ההליך יכול להוביל לאובדן תאים ואת הכדאיות שונה. התוצאות מצביעות על כך דגירה ממושכת של אורגנוידים בכבד עם פרוטאז דמוי טריפסין (עד 12 דקות) אינו משפיע לרעה על תת התרבות. דגירה של האורגנוידים בפרוטאז דמוי טריפסין במשך יותר מ -24 דקות יכולה להיות מזיקה לתת התרבות הבאה של האורגנוידים.
במקרה של שבירה תת-אופטימלית באשכולות התאים עם המעבר האורגנויד, דיסוציאציה מכנית במקום דגירה ממושכת עם פרוטאז דמוי טריפסין עשויה להיות מועילה יותר. אם נתקלים בבעיות עם ניתוק נאות של האורגנוידים, מערבולת קצרה של הדגימות עשויה להיות ניסיון לשפר את תפוקת המעבר. מצד שני, למערבולת יש פוטנציאל להרוס תרבית ולפגוע בתאים, ולכן יש להשתמש בה רק כאשר הליכים אחרים נכשלו שוב ושוב. פירוק אורגנוידים כבדיים לתאים בודדים מוריד את קצב הצמיחה של האורגנוידים, בעוד שבירתם לאשכולות של תאים יכולה לשפר מאוד את הכדאיות שלהם. עשר דקות נבחרו כזמן הדגירה לפרוטוקול האורגנויד. נקודת זמן של דגירה של 12 דקות נחשבה לא ציטוטוקסית בהשוואה לדגירה של 24 דקות בניסוי הפרוטאז דמוי הטריפסין.
ניסוי השרידות אישר כי אורגנוידים כבדים כלבים יכולים לשרוד עד 19.5 ימים בתנאים שליליים (דלדול מבני ותזונתי). אורגנוידים ששרדו את התנאים האלה הכי הרבה זמן היו מתורבתים עם CMGF + מדיה. תצפית זו אולי נגרמה על ידי הצמיחה האיטית יותר של organoids כבד במדיה לא בתוספת עם מעכבי סלע ו GSK3β. תרביות אורגנויד עם CMGF+ R/G גדלו מהר יותר וייתכן שרוקנו את המשאבים שלהם מהר יותר. ניסוי זה פותח אפשרויות למזעור תרבות האורגנוידים של הכלבים כדי להשיג המרה של מערכת בעלת תפוקה גבוהה. טכנולוגיה כזו מראה את הפוטנציאל להקל על גילוי תרופות או מחקרי טוקסיקולוגיה בעלות מופחתת באופן משמעותי.
כמה בעיות נפוצות שנתקלו במהלך תחזוקת תרבות האורגנוידים של הכלבים הן התגבשות מדגם לא נכונה בעת ציפוי, זיהום תרבות, וביסוס הצפיפות והגודל הנכונים של האורגנוידים. אם ECM solubilized מתמצק בטרם עת במהלך ציפוי, מיד למקם אותו על קרח במשך 10 דקות. אם ECM solubilized אינו יוצר מבנים דמויי כיפה, סביר להניח כי לא מספיק מדיה הוסרה מן המדגם. אם זה המקרה, לדלל את המדגם עם ECM solubilized יותר עד כיפות טופס.
כאשר זיהום פטרייתי או חיידקי נמצא בצלחת שלמה (ראו איור 4), הפתרון הטוב ביותר הוא להשליך את הצלחת. ניתן לנסות טיפול בתרופות אנטי פטרייתיות או אנטיביוטיות, אך הצלחתו של ניסיון כזה נמוכה ביותר. אם באר אחת מזוהמת בצלחת, בארות קיימא ולא מושפעות ניתן לנקות (בצע את השלבים 4.1 עד 4.5) לצלחת חדשה ומנוטר מקרוב. אם המדגם כבר היה חירום קפוא, מומלץ להשליך את המדגם כולו, כמו הפשרת המדגם חושף את החממה לסיכון זיהום נוסף.
תרבות אורגנויד בריאה צריכה להיות לפחות בקטגוריית הגודל הבינוני והצפיפות הבינונית או גדולה יותר. צפיפות אופטימלית חיונית לצמיחת תרבות האורגנויד. יש לתקן צפיפות נמוכה יותר על ידי ניקוי האורגנוידים לצפיפות בינונית. אם מתרחש מצב של צפיפות קיצונית (צפיפות יתר), האורגנוידים צריכים להיות מורחבים לבארות נוספות. סימנים גסים של אפופטוזיס הסלולר לעתים קרובות ללוות הן צפיפות יתר וצפיפות נמוכה של תרבות organoid. אם בעיות אלה לא יתוקנו בזמן, כל תרבות האורגנויד תהפוך אפופטוטית תוך ימים ספורים. אם organoids להשיג גודל גדול במיוחד או צפיפות גבוהה מאוד, התרבות צריכה לשמש לניסוי, הקפאה, או קיבעון.
מדיה organoid מכיל כיום 17 רכיבים, ואת התוספת של גורמי גדילה הדרושים לתחזוקה אורגניואידית והתרחבות ולכן יכול להיות יקר. בעיה זו ניתן לפתור על ידי גידול תרביות תאים 2D לסנתז את גורמי הגדילה כדי לייצר CMGF מותנה +. תרבית התא L-WRN מייצרת גורמי גדילה Wnt-3a, R-Spondin-3 ו- Noggin37. מושבת התאים משתמשת ב-90% מדיית תרבות DMEM/F12 ו-10% FBS. כאשר התרבות משיגה 90 אחוזי שיתוף פעולה, התקשורת נקצרים כל יום במשך שבוע אחד. לאחר מכן, המדיה שנקטפה מעורבבת עם 2x CMGF+ (ללא גורמי גדילה אלה). בעוד שתרבויות דו-ממדיות יכולות לייצר את גורמי הצמיחה הדרושים בשבריר מהעלות, יש לצפות לזמן ולהכנה הנוספים להפקת המדיה. ריכוזים של גורמי גדילה בין אצוות מדיה מותנות יכול גם להיות שונה 37,38.
תרבויות אורגנויד בוגרות של תאי גזע בוגרים של כלבים הן מודל ביו-רפואי ייחודי שיכול לסייע בהשגת המטרות של יוזמת הבריאות האחת39. ניתן להשתמש בטכנולוגיית האורגנויד בתחומים בסיסיים וביו-רפואיים רבים, המשתרעים על פני ביולוגיה התפתחותית, פתולוגיה, גילוי ובדיקות של תרופות, טוקסיקולוגיה לחקר מחלות זיהומיות ורפואה רגנרטיבית40. מחקר תרגומי ותרגום הפוך הם שני התחומים שבהם אורגנוידים של כלבים ישימים15. כלבים שימשו במשך מאות שנים בסביבה ניסיונית תרגומית, ומעמדם החייתי המלווה הקל גם על מעמדם כאחד המינים הנחקרים ביותר ברפואה הווטרינרית.
לסיכום, כתב יד זה מספק פרוטוקולי הפעלה סטנדרטיים לבידוד, תחזוקה, קציר וביו-בנקאות של כבד כלבים ואורגנוידים במעיים כדי להקל על יישום מודל זה בתחומים ביו-רפואיים שונים. מודל זה מתאים באופן ייחודי לקידום מחקר תרגומי הפוך ככלי של יוזמת בריאות אחת לקידום שיתוף בין-תחומי ואינטרדיסציפלינרי של ידע.

מכרסמים הם המודל החייתי הנפוץ ביותר למחקר ביו-רפואי ותרגום1. הם שימושיים במיוחד לחקירת פתוגנזה מולקולרית בסיסית של המחלות, אם כי הרלוונטיות הקלינית שלהם למחלות רב-גורמיות כרוניות נחקרה לאחרונה2. מודל הכלבים מציג מספר יתרונות בהשוואה למכרסמים 3,4. כלבים ובני אדם חולקים קווי דמיון במטבולומיקה ובמיקרוביום מעיים שהתפתחו עקב צריכת תזונה אנושית לאורך תקופות שונות של ביותם 5,6,7. קווי דמיון בין אנטומיה ופיזיולוגיה של כלבים ופיזיולוגיה במערכת העיכול האנושית הם עוד אחת הדוגמאות8.
בנוסף, כלבים חולקים לעתים קרובות סביבות ואורח חיים דומים עם בעליהם9. תוחלת החיים הארוכה יותר של כלבים בהשוואה למכרסמים מאפשרת התפתחות טבעית של מצבים כרוניים רבים10. מחלות מעי דלקתיות או תסמונת מטבולית הן דוגמאות למחלות כרוניות רב-גורמיות החולקות קווי דמיון חשובים בין בני אדם לכלבים 11,12. ניסויים פרה-קליניים של כלבים המערבים כלבים עם מחלות טבעיות יכולים להפיק נתונים אמינים יותר מאלה שנצברו ממודלים של מכרסמים13. עם זאת, כדי למזער את השימוש במחקר בבעלי חיים ולעמוד בעקרונות של 3Rs (להפחית, לעדן, להחליף)14, חלופות לבדיקות in vivo באמצעות אורגנוידים כלבים במבחנה 3D במבחנה הופיעו15.
אורגנוידים הם מבנים תלת-ממדיים שמקורם בתאי גזע תלת-ממדיים, אשר מסכמים מחדש את הפיזיולוגיה והמיקרואנטומיה של האיברים המקוריים שלהם16,17. טכנולוגיה זו תוארה לראשונה על ידי סאטו ואח ' בשנת 200917 ואפשרה מחקרי הפריה חוץ גופית הניתנים לתרגום יותר בשורות תאי אפיתל מאשר היו אפשריים בעבר באמצעות תרביות תאים סרטניים 2D18,19,20. Organoids הם שימושיים במבחנה מודלים במבחנה בדיסציפלינות ביו-רפואיות רבות כגון טוקסיקולוגיה פרה קלינית21,22,23, ספיגה, או מחקרי חילוף חומרים24,25,26,27,28, כמו גם בגישות רפואיות מותאמות אישית29,30,31 . התרבות המוצלחת של אורגנוידים במעיים של כלבים תוארה לראשונה בשנת 201912, ואילו אורגנוידים כבדיים שמקורם בכלב דווחו לראשונה על ידי Nantasanti ואח 'בשנת 201532. אורגנוידים כלבים שימשו מאז בהצלחה במחקרים לחקור enteropathies כרונית כלבים, גידולים סטרומליים במערכת העיכול, אדנוקרצינומה המעי הגס12, ומחלת וילסון33,34.
בעוד תאי גזע בוגרים ניתן לקצור באמצעות נמקים, הטכנולוגיה organoid לא תמיד דורש הקרבה של בעלי החיים. ביופסיות אנדוסקופיות ולפרוסקופיות, או אפילו שאיפות מחט עדינות של איברים35, הן מקור בר קיימא של תאי גזע בוגרים לבידוד אורגנויד אפיתל12. שימוש נרחב בטכניקות לא פולשניות כאלה בפרקטיקה הווטרינרית מקל על אפשרויות למחקר תרגומי הפוך (תרגום מידע מהפרקטיקה הקלינית הווטרינרית לפרקטיקה הקלינית האנושית ולהיפך)15. התקדמות נוספת של טכנולוגיית organoid ניתן להבטיח על ידי סטנדרטיזציה של תרבות organoid ושיטות תחזוקה. פרוטוקול האורגנויד המוצג כאן מבוסס בחלקו על עבודה שפורסמה בעבר של סקסנה ואח 'משנת 201536, ושיטות הותאמו כדי להתאים לפרטים של תרבות האורגנויד של המעיים והכבד. זרימת העבודה הכוללת של פרוטוקולי האורגנוידים של הכלבים מתוארת באיור 1.
פרוטוקול בידוד אורגנויד כלבים מציג שיטות להשגת דגימות מביופסיות אנדוסקופיות, לפרוסקופיות וניתוחיות, כמו גם נמקים. הוא מתאר את הטיפול הראשוני של דגימות רקמות ומתודולוגיות המשמשות להובלה למעבדה. החומרים והריאגנטים הדרושים לבידוד אורגנויד מסוכמים בסעיף 'הכנה לבידוד'. התהליך של בידוד תאי גזע בוגרים מדגימות רקמה מתואר עוד יותר בפירוט. לבסוף, תהליך ציפוי organoids לתוך מבנים דמויי כיפה באמצעות מטריצת ממברנה חוץ תאית solubilized נדון.
הפרוטוקול השני, פרוטוקול תחזוקת אורגנויד כלבים, מתאר שיטות של תיעוד ו culturing organoids. שינויים במדיה ותדירותם נדונים בסעיף זה. יתר על כן, מתוארים נהלי המעבדה כגון מעבר וניקוי תרביות התאים, החיוניים כדי להבטיח תחזוקה מוצלחת של אורגנוידים של כלבים תלת-ממדיים. מעבר מתאים הוא צעד קריטי בפרוטוקול, והתאמות אפשריות ופתרון בעיות של שלב זה נדונות בהמשך בכתב היד.
הפרוטוקול האחרון הוא קצירת אורגנויד כלבים ופרוטוקול ביובנקינג המכיל שיטות להכנת אורגנוידים בוגרים להטמעת פרפין ושימור RNA. שיטות של דגימות אורגנויד biobanking באחסון חנקן נוזלי מתוארים גם כאן. לבסוף, נדונות הדרכים להפשיר דגימות קפואות ולתמוך בצמיחתן.
לסיכום, מאמר זה נועד לספק נהלי תרבות אורגנויד כלבים עקביים באמצעות סטנדרטיזציה של פרוטוקולים בין מעבדות. בעשותו כן, כתב היד נועד להקל על שחזור של נתונים הנגזרים ממודלים אורגנוידים כלבים כדי להגביר את הרלוונטיות שלהם במחקר ביו-רפואי תרגומי.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63515/63515fig01.jpg"> איור 1: זרימת עבודה של פרוטוקולי אורגנויד כלבים. פרוטוקול בידוד האורגנויד הכלבי מתאר את הכנת החומרים הדרושים לבידוד אורגנויד, קצירת דגימת רקמה (באמצעות נמקים, אנדוסקופיים, לפרוסקופיים וביופסיות כירורגיות), והדרכה על פירוק תאים וציפוי של האוכלוסייה התאית. פרוטוקול התחזוקה של האורגנויד הכלבים דן בניקוי והעברה של תרבות האורגנויד. פרוטוקול קצירת אורגנויד וביו-בנקינג דן בהכנת דגימות אורגנויד להטמעת פרפין ואפיון אורגנויד נוסף. שיטות לביו-בנק תרביות אורגנויד והחיות אותן מאחסון בחנקן נוזלי נדונות גם הן. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63515/63515fig01large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Chelating solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Sorbitol</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>BP439-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT</td>
			<td>Promega</td>
			<td>V3151</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>P217-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P5655-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4-2H2O</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S5136-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>S271-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen Strep</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>S5-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Organoid media</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>[Leu15]-Gastrin I human</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G9145-.5MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A-83-01</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>9094360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Advanced DMEM/F12</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12634-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17504-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Corning</td>
			<td>35-010-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamax</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>VWR Life Science</td>
			<td>J848-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human R-Spondin-1</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>120-38-500UG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Murine EGF</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>315-09-1MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Murine Noggin</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>250-38-250UG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Murine Wnt-3a</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>315-20-10UG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2 supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17502-048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-Acetyl-L-cysteine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9165-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nicotinamide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>N0636-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primocin</td>
			<td>InvivoGen</td>
			<td>ant-pm-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ROCK inhibitor (Y-27632)</td>
			<td>EMD Millipore Corp.</td>
			<td>SCM 075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SB202190 (P38 inhibitor)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S7067-25MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stemolecule CHIR99021 (GSK3&#946;)</td>
			<td>Reprocell</td>
			<td>04-0004-base</td>
			<td></td>
		</tr>
		
		<tr>
			<td>Trimethoprim</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T7883-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfamethoxazole</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7507-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic Acid, Glacial</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>A38-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl Sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Fisher Chemicals</td>
			<td>D128-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA, pH 8.0, 0.5 M</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15575-038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde (37%)</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>F79P-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G5882</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel Matrix For Organoid Culture</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356255</td>
			<td>Extracellular Membrane Matrix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde, 97%</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>A11313</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS, 1X (Phosphate-Buffered Saline)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-040-CM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS, 1X (Phosphate-Buffered Saline)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-040-CM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAlater Soln.</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM7021</td>
			<td>RNA Storage Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Express</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12604-021</td>
			<td>Trypsin-like Protease</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Other</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 Well Cell Culture Plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ACD Hybez II Hybridization System</td>
			<td>ACD a biotechne brand</td>
			<td>321710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge Tube, 15 mL</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430766</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CoolCell LX</td>
			<td>Corning</td>
			<td>BCS-405MC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryogenic Vials</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430488</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Centrifuge Tube (50 mL)</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>05-539-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GyroMini Nutating mixer (Rocker)</td>
			<td>Labnet</td>
			<td>S0500-230V-EU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat Bath</td>
			<td>Lab-Line Instruments</td>
			<td>3000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mr. Frosty Freezing Container</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>5100-0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop 2000</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>ND2000CLAPTOP</td>
			<td>SpectrophotometerAnalysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Panasonic incubator</td>
			<td>Panasonic</td>
			<td>MCO-170ML-PA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm M Wrapping Film</td>
			<td>Bemis Company Inc</td>
			<td>PM996/EMD</td>
			<td>Laboratory Flexible Film Tape</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protected Disposable Scalpels</td>
			<td>Bard-Parker</td>
			<td>239844</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAscope 2.5 HD Assay &#8211; RED</td>
			<td>ACD a biotechne brand</td>
			<td>322350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAscope H2O2 &#38; Protease Plus Reagents</td>
			<td>ACD a biotechne brand</td>
			<td>322330</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAscope Target Retrieval Reagents</td>
			<td>ACD a biotechne brand</td>
			<td>322000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAscope Wash Buffer Reagents</td>
			<td>ACD a biotechne brand</td>
			<td>310091</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Culture Dish</td>
			<td>Dot Scientific</td>
			<td>6676621</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Culture Plate 24 wells</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>FB012929</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

standardization and maintenance of 3d canine hepatic and intestinal organoid cultures for use in biomedical research

כלבים מפתחים מחלות רב-תכליתיות מורכבות המקבילות לבני אדם, כולל מחלות דלקתיות, מחלות מטבוליות וסרטן. לכן, הם מייצגים מודלים בעלי חיים גדולים רלוונטיים עם פוטנציאל תרגום לרפואה האנושית. אורגנוידים הם מבנים תלת-ממדיים (תלת-ממדיים), מורכבים עצמית שמקורם בתאי גזע המחקים את המיקרואנטומיה והפיזיולוגיה של איבר המוצא שלהם. מודלים תרגומיים אלה במבחנה יכולים לשמש עבור יישומי חדירות וגילוי תרופות, הערכת טוקסיקולוגיה, וכדי לספק הבנה מכנית של הפתולוגיה של מחלות כרוניות רב-גורמיות. יתר על כן, אורגנוידים כלבים יכולים לשפר את חייהם של כלבים לוויה, מתן קלט בתחומים שונים של מחקר וטרינרי והקלה על יישומי טיפול מותאמים אישית ברפואה הווטרינרית. קבוצה קטנה של תורמים יכולה ליצור ביובנק של דגימות אורגנויד, מה שמפחית את הצורך בקצירת רקמות מתמשכת, שכן קווי תאים אורגנוידים יכולים להיות תת-תרבותיים ללא הגבלת זמן. להלן מוצגים שלושה פרוטוקולים המתמקדים בתרבות האורגנוידים של המעיים והכבד שמקורם בתאי גזע בוגרים. פרוטוקול בידוד אורגנויד כלבים מתאר שיטות לעיבוד רקמות והטבעה של התא מבודד במטריצה תומכת (מטריצת ממברנה חוץ-תאית solubilized). פרוטוקול התחזוקה של אורגנויד כלבים מתאר צמיחה ותחזוקה של אורגנוידים, כולל ניקוי והעברה יחד עם תזמון מתאים להתרחבות. פרוטוקול קצירת האורגנוידים והביו-בנקינג מתאר דרכים לחילוץ, הקפאה ושימור של אורגנוידים לניתוח נוסף.

Watch this Scientific Journal Video about Standardization and Maintenance of 3D Canine Hepatic and Intestinal Organoid Cultures for Use in Biomedical Research at JoVE.com

Standardization and Maintenance of 3D Canine Hepatic and Intestinal Organoid Cultures for Use in Biomedical Research

שיטות ניסיוניות לקצור תאי גזע בוגרים ממעי כלבים ורקמות כבד כדי להקים תרביות אורגנויד 3D מתוארים. יתר על כן, טכניקות המעבדה כדי להבטיח צמיחה עקבית ולספק נהלי הפעלה סטנדרטיים כדי לקצור, biobank, ולהחיות תרבויות מעיים כלבים וכבד אורגנויד נדונים.

סטנדרטיזציה ותחזוקה של תרבויות כבד כבד קנים ומעיים תלת-ממדיות לשימוש במחקר ביו-רפואי

Dogs develop complex multifactorial diseases analogous to humans, including inflammatory diseases, metabolic diseases, and cancer. Therefore, they ...

הפרוטוקולים לתרבות של כבד כלבים ואורגנוידים במעיים חשובים לתקנון טכנולוגיה חדשנית זו. טכניקה זו מאפשרת את ההקמה האמינה והניתנת לשחזור של תרבות האורגנוידים כולל בידוד האורגנויד, תחזוקה, קציר, ו biobanking הבאים של דגימות. אורגנוידים של כלבים יכולים לספק מודל מצוין ליישומים רבים המשתרעים על פני ביולוגיה, פיתוח מחלות זיהומיות, בדיקות וגילוי תרופות, וגם רפואת העברה.כדי להתחיל, להכין חמישה צינורות צנטריפוגה 15 מיליליטר עם חמישה מיליליטר של פתרון 1X שלם chelating פתרון, צינור אחד עם שלושה מיליליטרים של פתרון 1X שלמות כלאט, צינור ריק אחד, צינור אחד, צינור אחד עם חמישה מיליליטרים של פתרון 1X שלמות כלאט, ושני מיליליטר של סרום בקר עוברי. ביום הבידוד, הניחו צלחת פטרי סטרילית, אזמל, דלי קרח ותערובת חומרים מזינים DMEM מתקדמת קרה F12 בארון הבטיחות הביולוגית. מניחים את המספר הנדרש של צלחת תרבית תאים 24-well בחממת דו תחמוצת הפחמן כדי להתחמם מראש.מניחים מטריצת ממברנה חוץ-תאית על קרח להפשרה. מצננים מראש את הצנטריפוגה ל-4 מעלות צלזיוס. העבר מדיה מלאה עם גורמי גדילה מהמקפיא לאמבט מים של 37 מעלות צלזיוס תוך הימנעות מחשיפה ישירה לאור.לנער דגימות רקמה בצינור התחבורה במשך 30 שניות. הסר supernatant מוגזם מבלי להשליך כל רקמה על ידי צנרת איטית ליד פני הנוזל עד 0.5 מיליליטר נשאר בצינור. מעבירים רקמות ונשארים סופר-טבעיים לצלחת פטרי סטרילית.בעזרת אזמל חד פעמי, חותכים ומרככים את הרקמה לחתיכות קטנות יותר הדומות למחית במשך כחמש דקות. פיפטה הרקמה הטחונה עם נוזל מצלחת פטרי לצינור פתרון הכלאט המלא הראשון, ולאחר מכן להוסיף שני מיליליטרים של תערובת מזין DMEM מתקדמת F12 לצלחת פטרי. לשטוף את הרקמה הנותרת ולהעביר את צינור פתרון chelating המלא הראשון.מערבולת 1X להשלים את צינור פתרון chelating כחמש פעמים במשך חמש שניות. אפשר ביופסיות להתיישב בתחתית הצינור במשך דקה אחת ולהסיר את supernatant עד חמישה מיליליטר נשאר. העבר את פתרון הכלטינג המלא פי 1 מהצינור החדש לצינור הדגימה.חזור על השלב הקודם עבור שני הצינורות הבאים. ובשתי השטיפות האחרונות, להסיר את supernatant עד שלושה מיליליטר שנותרו בצינור. מעבירים את הביופסיות ואת פתרון הכליטציה המלא פי 1 מצינור הדגימה לבאר אחת של צלחת שש בארות.הוסף שלושה מיליליטרים של 1X פתרון chelating מלא לצינור מדגם. מערבבים בעדינות כדי לאסוף את כל הרקמה שנותרה ולהעביר לאותה באר של הצלחת. מוסיפים 150 מיקרוליטרים של חומצה אתילן דיאמין טטראצטית 0.5 טטראצטית בבאר ומניחים את צלחת שש הבארות על רוקר 20 מעלות 24 סל"ד בארבע מעלות צלזיוס.לדגור על דגימות הכבד במשך 10 דקות ואת דגימות המעיים במשך שעה אחת על נדנדה נעה. העבירו את הצלחת בעלת שש הבארות בחזרה לארון הבטיחות הביולוגית והעבירו את הרקמה הטחונה והנוזל לצינור המכיל פתרון כלאט מלא פי 1 עם סרום בקר עוברי. אפשר לרקמות להתיישב ולהעביר את supernatant עם 0.2 מיליליטר של החלק העליון של הרקמה לצינור ריק.לסובב את הצינור המכיל את המדגם ב 700 XG במשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס. תאי גזע הם עכשיו גלולה יחד עם הרקמה הטחונה. הסר ולהשליך את supernatant בזהירות כדי לא להפריע את הכדור.Resuspend את הכדור ב- DMEM F12 מתקדם. לסובב את הצינור שוב ולשאוף את supernatant מבלי להפריע לכדור. הוסף את הנפח המחושב של מטריצת ממברנה חוץ-תאית סולובילית לצינור הדגימה.היזהר בעת הסרת מדיה כדי לא לאבד את גלולה התא. בעת הוספת מטריצת ממברנה חוץ תאית, פיפטה לאט לא ליצור בועות מוגזמות בהשעיית האורגנויד. שמור את המדגם עם מטריצת הממברנה החוץ תאית solubilized על קרח ולזרוע את ההשעיה באמצע הבארות, כך מטריצת קרום חוץ תאי solubilized יוצר מבנה דמוי כיפה.להעביר את הצלחת לאינקובטור ולאפשר מטריצת קרום חוץ תאי solubilized להתמצק במשך 30 דקות. ערבבו מעכבי ROCK ובטא GSK3 במדיה מלאה עם גורמי גדילה והוסיפו 500 מיקרוליטרים של פתרון זה לכל באר. מניחים את הצלחת באינקובטור.פרוטוקול אורגנויד כלבים מייצר בדרך כלל כ 50, 000 עד 150, 000 תאי מעיים או כבד לבאר. לאחר בידוד תאי גזע, אורגנוידים של כלבים כבדיים מתחילים את מחזור החיים שלהם כספרואידים מתרחבים, ואחרי שבעה ימים, הם הופכים לאורגנואידים ניצנים ומבדלים. הנפח, שטח הפנים, אזור האליפסה הדו-ממדית וההיקף של הספרואידים חושבו.אזור אליפסה דו-ממדי והיקפו שימשו להערכת בריאותה של תרבות האורגנויד. הערכת הביטוי של הסמנים באופן חצי כמותי הראתה כי הספרואידים מבטאים באופן מועדף את סמן כולנגיוציט KRT7 הנע בין אחד ל -26% ביטוי סמן תא הגזע LGR5 נע בין 0.17 ל 0.78%, בעוד סמני hepatocyte באו לידי ביטוי במידה נמוכה יותר ב 0.05 עד 0.34% עבור תיבת מזלג 1A ו 0.03 עד 0.28% עבור ציטוכרום-P450. דגירה של 12 דקות עם פרוטאז דמוי טריפסין לא מנעה צמיחה אורגנויד.עם זאת, הצמיחה של organoids הושפע לרעה באמצעות דגירה של 24 דקות. שרידותם של אורגנוידים כבדים של כלבים בסביבה שלילית נותחה כדי לקבוע את נפח המדיה האורגנוידית ואת מטריצת המרתף הדרושה לצמיחה והישרדות מוצלחות של אורגנוידים כבדיים. שיעור ההישרדות של organoids נע בין 12.9 ימים ל 18 ימים.טכניקות בסיסיות של תרביות תאים וגישות אספטיות הן התנאים המוקדמים החיוניים לבידוד ותחזוקה נאותים של אורגנויד.

Research

JoVE Journal

Medicine

In Vivo Canine Muscle Function Assay

In Vivo Canine Muscle Function Assay

In vivo Assay שרירים כלב פונקציה

We describe a minimally-invasive and reproducible method to measure canine pelvic limb muscle strength and muscle response to repeated eccentric 
...

Generation of Alginate Microspheres for Biomedical Applications

דור של אלגינט microspheres עבור יישומים ביו

Alginate-based materials have received considerable attention for biomedical applications because of their hydrophilic nature, biocompatibility, and ...

The Bovine Lung in Biomedical Research: Visually Guided Bronchoscopy, Intrabronchial Inoculation and In Vivo Sampling Techniques

The Bovine Lung in Biomedical Research: Visually Guided Bronchoscopy, Intrabronchial Inoculation and In Vivo Sampling Techniques

ברונכוסקופיה מודרכת מבחינה ויזואלית, Intrabronchial הרכבת חיסון ו: ריאות שור במחקר ביו<em&gt; בVivo</em&gt; טכניקות דגימה

There is an ongoing search for alternative animal models in research of respiratory medicine. Depending on the goal of the research, large animals as ...

Use of a Low-flow Digital Anesthesia System for Mice and Rats

שימוש של מערכת הרדמה דיגיטלית זרימה נמוכה עבור עכברים וחולדות

A traditional vaporizer depends on flowing gas and atmospheric pressure for passive anesthetic vaporization. Newly developed direct injection vaporizers ...

Forskolin-induced Swelling in Intestinal Organoids: An In Vitro Assay for Assessing Drug Response in Cystic Fibrosis Patients

Forskolin-induced Swelling in Intestinal Organoids: An In Vitro Assay for Assessing Drug Response in Cystic Fibrosis Patients

Forskolin-induced נפיחות מעיים Organoids: An<em&gt; במבחנה</em&gt; Assay עבור הערכת תגובה לתרופה בחולי סיסטיק פיברוזיס

Recently-developed cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR)-modulating drugs correct surface expression and/or function of the mutant ...

Optimized Analysis of In Vivo and In Vitro Hepatic Steatosis

Optimized Analysis of In Vivo and In Vitro Hepatic Steatosis

ניתוח אופטימלי של<em&gt; In vivo</em&gt; ו<em&gt; במבחנה</em&gt; כבדית steatosis

Establishing a system of procedures to qualitatively and quantitatively characterize in vivo and in vitro hepatic steatosis is important for metabolic ...

Improvement of a Closed Chest Porcine Myocardial Infarction Model by Standardization of Tissue and Blood Sampling Procedures

שיפור של מודל חזירי אוטם שריר החזה סגור על ידי סטנדרטיזציה של רקמות ופרוצדורות דגימה דם

Myocardial ischemia reperfusion (I/R) injury contributes to almost half of the necrotic area after myocardial infarction. To date there is no approved ...

Generation of Human 3D Lung Tissue Cultures (3D-LTCs) for Disease Modeling

Generation of Human 3D Lung Tissue Cultures 3D-LTCs for Disease Modeling

דור של תרבויות רקמות אמבריולוגיה תלת-ממד (3D-LTCs) עבור מידול המחלה

Translation of novel discoveries to human disease is limited by the availability of human tissue-based models of disease. Precision-cut lung slices (PCLS) ...

Use of 3D Robotic Ultrasound for In Vivo Analysis of Mouse Kidneys

Use of 3D Robotic Ultrasound for In Vivo Analysis of Mouse Kidneys

שימוש באולטרסאונד רובוטי 3D לניתוח In Vivo של כליות עכבר

Common modalities for in vivo imaging of rodents include positron emission tomography (PET), computed tomography (CT), magnetic resonance imaging (MRI), ...

Standardizing the Responses to Platelet Agonist Collagen-Related Peptide

Reproducibility and Harmonization in Research Using Biological Standards: The Example of Platelet Agonist Collagen-Related Peptide

Biological Standardization to Ensure Reproducibility and Harmonization in Research (Video) | JoVE

שכפול והרמוניזציה במחקר באמצעות סטנדרטים ביולוגיים: הדוגמה של אגוניסט טסיות פפטיד הקשור לקולגן

Metrology - the science of measure - is a subject few biological scientists are taught about in their training to their detriment; the application of ...