Name: standardization and maintenance of 3d canine hepatic and intestinal organoid cultures for use in biomedical research
Uploaded: 2022-01-31T15:00:00
Duration: 8 min 39 s
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著者らは、アイオワ州立大学の獣医診断研究所の職員、すなわちヘイリー・M・ランバート、エミリー・レイエ、ロザリン・M・ブラナマン、ビクトリア・J・グリーン、ジェニファー・M・グロールツ・ツグミに、提供されたサンプルのタイムリーな処理に感謝の意を表したいと考えている。著者らは、教員スタートアップ、ISU VPR Miller Award、ISU VPR Miller Award、NSF SBIR sub AwardからISU # 1912948への支援に感謝したいと考えている。

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K. Allenspach は、LifEngine Animal Health と 3D Health Solutions の共同設立者です。彼女はCeva Animal Health、Bioiberica、LifeDiagnostics、Antech Diagnostics、Deerland Probiotics、Marsのコンサルタントを務めています。J. P. Mochel は、LifEngine Animal Health と 3D Health Solutions の共同設立者です。モシェル博士は、Ceva Animal HealthとEthos Animal Healthのコンサルタントを務めています。他の著者は、宣言する利益相反を持っていません。

現在、犬の肝臓および腸のオルガノイドの単離および維持に利用可能な標準化されたプロトコルが不足している。オルガノイド培養の標準操作手順を確立することは、このモデルが異なる実験室設定で適用可能であることを保証する。具体的には、これらのイヌオルガノイドモデルの培養に標準化された動作プロトコルを提供することは、培養および継代中のオルガノイドの正常な成長を特徴付け、拡張および維持のための最適なタイムポイントを導き出すための鍵となる。プロトコールを用いて培養されたイヌ腸管オルガノイドは、チャンドラらによって以前に特徴付けられてきた12。
プロトコルの最も重要なステップの1つは、オルガノイドの継代である。肝スフェロイドの最初の通過のための最適時間は、肝スフェロイド測定に基づいて単離後7日目であると決定された。スフェロイドの最大体積は7日目までに達成され、同時にスフェロイドは芽を出し始め、肝臓オルガノイドを形成した。単離後2〜7日目からの全体的なオルガノイド体積の増加は365倍以上であり、最適な通過時間がイヌ腸オルガノイド培養よりも長いことを示唆している。培養7日後、肝臓スフェロイドにおける細胞アポトーシスの肉眼徴は、洗浄または継代を行わなくても観察されなかった(図7)。腸および肝臓オルガノイドの継代は、細胞の喪失および生存率の変化につながる可能性があるため、困難な場合があります。この結果は、肝オルガノイドとトリプシン様プロテアーゼとの長期インキュベーション(最大12分)が継代培養に悪影響を及ぼさないことを示している。オルガノイドをトリプシン様プロテアーゼ中で24分より長くインキュベートすることは、オルガノイドのその後の継代培養に有害であり得る。
オルガノイド継代を伴う細胞集塊の最適でない切断の場合、トリプシン様プロテアーゼによる長時間のインキュベーションの代わりに機械的解離がより有益であり得る。オルガノイドの適切な解離に問題が発生した場合、サンプルの短時間のボルテックス処理が、通過収率を高めるために試みられ得る。一方、ボルテックスは培養物を台無しにし、細胞に損傷を与える可能性があるため、他の手順が繰り返し失敗した場合にのみ使用してください。肝臓オルガノイドを単一細胞に分解すると、オルガノイドの増殖速度が低下しますが、細胞のクラスターに分解すると、生存率が大幅に向上します。オルガノイドプロトコールのインキュベーション時間として10分を選択した。12分間のインキュベーション時点は、トリプシン様プロテアーゼ実験における24分間のインキュベーションと比較して細胞毒性がないとみなされた。
生存可能性実験は、犬の肝臓オルガノイドが不利な条件(構造的および栄養的枯渇)で最大19.5日間生存できることを確認した。これらの条件を最も長く生存したオルガノイドは、CMGF+培地で培養した。この観察は、Rock阻害剤およびGSK3βを補充していない培地中の肝臓オルガノイドの遅い成長によって引き起こされた可能性がある。CMGF+ R/Gを用いたオルガノイド培養は、より速く成長し、資源をより早く枯渇させた可能性がある。この実験は、イヌオルガノイド培養を小型化し、ハイスループットなシステム変換を実現する可能性を開きます。このような技術は、大幅に低減されたコストで創薬または毒物学研究を促進する可能性を示している。
イヌオルガノイド培養の維持中に遭遇するいくつかの一般的な問題は、めっき時の不適切なサンプル凝固、培養汚染、およびオルガノイドの適切な密度およびサイズの確立である。可溶化ECMがめっき中に早期に固化した場合は、直ちに氷上に10分間置く。可溶化ECMがドーム様構造を形成しない場合、試料から除去された培地が十分でない可能性がある。この場合、ドームが形成されるまで、より可溶化されたECMでサンプルを希釈する。
プレート全体に真菌または細菌の汚染が見つかった場合( 図4参照)、最善の解決策はプレートを廃棄することです。抗真菌薬または抗生物質薬による治療を試みることができるが、そのような試みの成功は非常に低い。1つのウェルがプレート内で汚染されている場合、生存可能で影響を受けていないウェルを新しいプレートに洗浄し(ステップ4.1〜4.5に従ってください)、注意深く監視することができます。サンプルがすでに緊急凍結されている場合は、サンプルを解凍するとインキュベーターが追加の汚染リスクにさらされるため、サンプル全体を廃棄することをお勧めします。
健康なオルガノイド培養は、少なくとも中規模および中密度のカテゴリー以上でなければならない。最適な密度は、オルガノイド培養の成長に不可欠です。低密度は、オルガノイドを中密度に洗浄することによって補正されなければならない。極端な密度の状況(過密状態)が発生した場合、オルガノイドはより多くの井戸に拡張されるべきである。細胞アポトーシスの肉眼的徴候は、しばしばオルガノイド培養の過密状態および低密度の両方を伴う。これらの問題が時間内に修正されなければ、オルガノイド培養全体が数日でアポトーシスに変わります。オルガノイドが特大サイズまたは非常に高い密度を達成する場合、培養物を実験、凍結、または固定に使用するべきである。
オルガノイド培地は現在17の成分を含み、したがって、オルガノイドの維持および拡大に必要な成長因子の添加は高価であり得る。この問題は、成長因子を合成して馴化CMGF+を産生する2D細胞培養物を増殖させることによって解決することができる。細胞培養L-WRNは、Wnt-3a、R-スポンジン-3、およびノギン増殖因子37を産生する。細胞コロニーは、90%DMEM/F12および10%FBS培養培地を使用する。培養物が90%のコンフルエントを達成すると、培地は1週間毎日収穫される。次いで、収穫した培地を2x CMGF+(これらの成長因子を含まない)と混合する。2D 培養では、必要な成長因子をわずかなコストで生産できますが、培地を製造するための時間と準備の追加を期待する必要があります。馴化培地バッチ間の成長因子の濃度も異なる可能性がある37,38。
犬の成体幹細胞由来オルガノイド培養は、One Health Initiativeの目標達成に役立つユニークな生物医学モデルです39。オルガノイド技術は、発生生物学、病態生理学、創薬・検査、毒物学から感染症や再生医療の研究まで、多くの基礎研究および生物医学研究分野で使用することができます40。トランスレーショナル研究と逆トランスレーショナル研究は、どちらもイヌオルガノイドが適用可能な分野です15。犬は何世紀にもわたって翻訳実験環境で使用されてきました、そして彼らのコンパニオンアニマルの地位はまた獣医学で最も探求された種の1つとしての彼らの地位を促進しました。
結論として、この原稿は、様々な生物医学分野でのこのモデルの適用を容易にするために、イヌ肝臓および腸オルガノイドの単離、維持、収穫、およびバイオバンキングのための標準化された動作プロトコルを提供する。このモデルは、知識の学際的および学際的な共有を促進するためのOne Health Initiativeのツールとして、逆トランスレーショナル研究を促進するのにユニークに適しています。

げっ歯類は、生物医学的およびトランスレーショナル研究に最も一般的に利用されている動物モデルです1。これらは、疾患の基本的な分子病因を調査するのに非常に有用であるが、慢性多因子疾患に対する臨床的関連性が最近疑問視されている2。犬のモデルは、げっ歯類と比較していくつかの利点を示しています3,4。イヌとヒトは、家畜化のさまざまな期間を通じて人間の食事を摂取したために発達したメタボロミクスと腸内微生物叢の類似点を共有しています5,6,7。イヌとヒトの胃腸解剖学および生理学との類似点は、実施例8の別のものである。
さらに、犬はしばしば飼い主と似たような環境やライフスタイルを共有しています9。げっ歯類と比較して犬の寿命が長いため、多数の慢性疾患の自然な発達が可能になります10。炎症性腸疾患またはメタボリックシンドロームは、ヒトとイヌとの間に重要な類似点を共有する多因子性慢性疾患の例です11,12。自然発生的な疾患を持つ犬を対象とした犬の前臨床試験では、げっ歯類モデルから得られたものよりも信頼性の高いデータを生成することができます13。しかし、生きた動物研究の使用を最小限に抑え、3R(Reduce、Refine、Replace)14の原則に準拠するために、3D in vitroイヌオルガノイドを使用したin vivo試験に代わるものが登場しました15。
オルガノイドは自己組織化された3D幹細胞由来の構造で、元の臓器の生理学とミクロ解剖学を再現します16,17。この技術は、200917年にSatoらによって初めて記載され、2D癌細胞培養物を使用して以前に可能であったよりも上皮細胞株においてより多くの翻訳可能なインビトロ研究を可能にした18,19,20。オルガノイドは、前臨床毒物学21,22,23、吸収、または代謝研究24,25,26,27,28、ならびに個別化医療アプローチ29,30,31など、多くの生物医学分野においてインビトロモデルとして有用である。.犬腸オルガノイドの培養の成功は2019年に初めて記載され12、犬由来の肝臓オルガノイドは201532年にNantasantiらによって最初に報告されました。それ以来、犬のオルガノイドは、犬の慢性腸内障、胃腸間質腫瘍、結腸直腸腺癌12、およびウィルソン病を調査する研究で首尾よく使用されています33,34。
成体幹細胞は剖検によって採取することができるが、オルガノイド技術は必ずしも動物を犠牲にする必要はない。内視鏡的および腹腔鏡的生検、あるいは臓器の細い針吸引液35でさえ、上皮オルガノイド単離のための成体幹細胞の生存可能な供給源である12。このような非侵襲的技術が獣医診療において広く使用されることで、逆翻訳研究(獣医臨床診療からヒト臨床診療への情報の翻訳、またはその逆)の選択肢が容易になります15。オルガノイド技術のさらなる進歩は、オルガノイド培養・維持方法の標準化によって保証することができる。ここで提示されたオルガノイドプロトコルは、201536年からSaxenaらの以前に発表された研究に部分的に基づいており、方法は犬の腸および肝臓オルガノイド培養の特異に合うように適合させた。イヌオルガノイドプロトコルの全体的なワークフローを図1に示します。
犬オルガノイド単離プロトコルは、内視鏡、腹腔鏡、外科生検、ならびに剖検からサンプルを得る方法を導入しています。組織サンプルの初期前処理と、実験室への輸送に使用される方法論を概説しています。オルガノイドの単離に必要な材料および試薬は、「単離の準備」セクションに要約されています。組織試料からの成体幹細胞単離のプロセスは、さらに詳細に説明される。最後に、可溶化された細胞外膜マトリックスを用いてオルガノイドをドーム状構造にメッキするプロセスが議論される。
第2のプロトコルである犬オルガノイド維持プロトコルは、オルガノイドを文書化および培養する方法を記載している。このセクションでは、メディアの変更とその頻度について説明します。さらに、3Dイヌオルガノイドの維持を確実に成功させるために不可欠な細胞培養物の継代および洗浄などの実験室手順が記載されている。適切な継代はプロトコルの重要なステップであり、このステップの可能な調整とトラブルシューティングについては、原稿でさらに詳しく説明します。
最後のプロトコルは、パラフィン包埋およびRNA保存のために完全に成長したオルガノイドを調製するための方法を含むイヌオルガノイド収穫およびバイオバンキングプロトコルである。液体窒素貯蔵中のオルガノイドサンプルをバイオバンキングする方法もここで記載されている。最後に、凍結サンプルを解凍し、その成長をサポートする方法について説明します。
結論として、この記事は、実験室間プロトコルの標準化を通じて一貫した犬オルガノイド培養手順を提供することを目的としている。そうすることで、この原稿は、イヌオルガノイドモデルに由来するデータの再現性を促進し、トランスレーショナル生物医学研究におけるそれらの関連性を高めることを目的としている。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63515/63515fig01.jpg"> 図1:イヌオルガノイドプロトコルのワークフロー。 イヌオルガノイド単離プロトコルは、オルガノイド単離に必要な材料の調製、組織サンプルの採取(剖検、内視鏡、腹腔鏡、および外科的生検の手段による)、および細胞集団の細胞解離およびプレーティングに関するガイダンスを記載しています。犬オルガノイド維持プロトコルは、オルガノイド培養物の洗浄と継代について論じている。オルガノイドハーベスティングおよびバイオバンキングプロトコルでは、パラフィン包埋およびさらなるオルガノイド特性評価のためのオルガノイドサンプルの調製について説明しています。オルガノイド培養物をバイオバンクし、液体窒素中での貯蔵からそれらを復活させる方法も議論されている。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63515/63515fig01large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Chelating solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Sorbitol</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>BP439-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT</td>
			<td>Promega</td>
			<td>V3151</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>P217-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P5655-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4-2H2O</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S5136-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>S271-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen Strep</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>S5-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Organoid media</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>[Leu15]-Gastrin I human</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G9145-.5MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A-83-01</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>9094360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Advanced DMEM/F12</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12634-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17504-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Corning</td>
			<td>35-010-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamax</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>VWR Life Science</td>
			<td>J848-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human R-Spondin-1</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>120-38-500UG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Murine EGF</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>315-09-1MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Murine Noggin</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>250-38-250UG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Murine Wnt-3a</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>315-20-10UG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2 supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17502-048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-Acetyl-L-cysteine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9165-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nicotinamide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>N0636-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primocin</td>
			<td>InvivoGen</td>
			<td>ant-pm-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ROCK inhibitor (Y-27632)</td>
			<td>EMD Millipore Corp.</td>
			<td>SCM 075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SB202190 (P38 inhibitor)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S7067-25MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stemolecule CHIR99021 (GSK3&#946;)</td>
			<td>Reprocell</td>
			<td>04-0004-base</td>
			<td></td>
		</tr>
		
		<tr>
			<td>Trimethoprim</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T7883-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfamethoxazole</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7507-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic Acid, Glacial</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>A38-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl Sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Fisher Chemicals</td>
			<td>D128-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA, pH 8.0, 0.5 M</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15575-038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde (37%)</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>F79P-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G5882</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel Matrix For Organoid Culture</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356255</td>
			<td>Extracellular Membrane Matrix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde, 97%</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>A11313</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS, 1X (Phosphate-Buffered Saline)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-040-CM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS, 1X (Phosphate-Buffered Saline)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-040-CM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAlater Soln.</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM7021</td>
			<td>RNA Storage Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Express</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12604-021</td>
			<td>Trypsin-like Protease</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Other</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 Well Cell Culture Plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ACD Hybez II Hybridization System</td>
			<td>ACD a biotechne brand</td>
			<td>321710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge Tube, 15 mL</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430766</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CoolCell LX</td>
			<td>Corning</td>
			<td>BCS-405MC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryogenic Vials</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430488</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Centrifuge Tube (50 mL)</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>05-539-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GyroMini Nutating mixer (Rocker)</td>
			<td>Labnet</td>
			<td>S0500-230V-EU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat Bath</td>
			<td>Lab-Line Instruments</td>
			<td>3000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mr. Frosty Freezing Container</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>5100-0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop 2000</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>ND2000CLAPTOP</td>
			<td>SpectrophotometerAnalysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Panasonic incubator</td>
			<td>Panasonic</td>
			<td>MCO-170ML-PA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm M Wrapping Film</td>
			<td>Bemis Company Inc</td>
			<td>PM996/EMD</td>
			<td>Laboratory Flexible Film Tape</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protected Disposable Scalpels</td>
			<td>Bard-Parker</td>
			<td>239844</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAscope 2.5 HD Assay &#8211; RED</td>
			<td>ACD a biotechne brand</td>
			<td>322350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAscope H2O2 &#38; Protease Plus Reagents</td>
			<td>ACD a biotechne brand</td>
			<td>322330</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAscope Target Retrieval Reagents</td>
			<td>ACD a biotechne brand</td>
			<td>322000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAscope Wash Buffer Reagents</td>
			<td>ACD a biotechne brand</td>
			<td>310091</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Culture Dish</td>
			<td>Dot Scientific</td>
			<td>6676621</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Culture Plate 24 wells</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>FB012929</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

standardization and maintenance of 3d canine hepatic and intestinal organoid cultures for use in biomedical research

イヌは、炎症性疾患、代謝性疾患、および癌を含むヒトに類似した複雑な多因子疾患を発症する。したがって、それらは、ヒト医学への翻訳の可能性を有する関連する大型動物モデルを表す。オルガノイドは、幹細胞に由来する3次元(3D)の自己組織化構造であり、その起源の器官のミクロ解剖学および生理学を模倣する。これらのトランスレーショナル インビトロ モデルは、薬物透過性および発見用途、毒物学評価、および多因子慢性疾患の病態生理学の機構的理解を提供するために使用することができる。さらに、犬のオルガノイドは、コンパニオンドッグの生活を向上させ、獣医学研究のさまざまな分野でのインプットを提供し、獣医学におけるパーソナライズされた治療アプリケーションを容易にします。ドナーの小さなグループは、オルガノイド細胞株を無期限に継代培養することができるため、オルガノイドサンプルのバイオバンクを作成し、継続的な組織採取の必要性を低減することができる。本明細書には、成体幹細胞に由来する腸および肝臓イヌオルガノイドの培養に焦点を当てた3つのプロトコールが提示される。犬オルガノイド単離プロトコルは、支持マトリックス(可溶化細胞外膜マトリックス)における細胞単離物の組織および埋め込みを処理する方法を概説している。犬オルガノイド維持プロトコルは、拡張のための適切なタイミングとともに、洗浄および継代を含むオルガノイドの成長および維持を記述する。オルガノイド採取およびバイオバンキングプロトコルは、さらなる分析のためにオルガノイドを抽出、凍結、および保存する方法を説明しています。

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Standardization and Maintenance of 3D Canine Hepatic and Intestinal Organoid Cultures for Use in Biomedical Research

イヌの腸組織および肝組織から成体幹細胞を採取して3Dオルガノイド培養物を確立するための実験方法が記載されている。さらに、一貫した成長を確保し、イヌの腸および肝臓オルガノイド培養物を収穫、バイオバンク、および復活させるための標準的な操作手順を提供するための実験室技術が議論される。

生物医学研究に使用するための3D犬肝および腸オルガノイド培養の標準化と維持

Dogs develop complex multifactorial diseases analogous to humans, including inflammatory diseases, metabolic diseases, and cancer. Therefore, they ...

イヌの肝臓および腸内オルガノイドの培養のためのプロトコルは、この新規技術を標準化するために重要である。この技術は、オルガノイドの単離、維持、収穫、およびその後のサンプルのバイオバンキングを含む、イヌオルガノイド培養の信頼性が高く再現可能な確立を可能にする。犬オルガノイドは、生物学、感染症開発、薬物検査と発見、そして伝染医学にまたがる多数の用途のための優れたモデルを提供することができます。まず、5ミリリットルの1X完全キレート溶液を含む5つの15ミリリットル遠沈管、3ミリリットルの1X完全キレート溶液を含む1つのチューブ、1つの空のチューブ、および5ミリリットルの1X完全キレート溶液を含む1つのチューブ、および2ミリリットルのウシ胎児血清を準備する。単離の日に、滅菌ペトリ皿、メス、アイスバケツ、および冷たい高度なDMEM栄養素混合物F12をバイオセーフティキャビネットに入れます。必要数の24穴細胞培養プレートを二酸化炭素インキュベーターに入れ、予備加温する。融解のために可溶化した細胞外膜マトリックスを氷上に置く。遠心分離機を摂氏4度に予冷します。直接光への暴露を避けて、成長因子を含む完全な培地を冷凍庫から摂氏37度の水浴に移す。輸送管内の組織サンプルを30秒間振盪する。0.5ミリリットルがチューブ内に残るまで、流体表面の近くでゆっくりとピペッティングすることによって、組織を捨てることなく過剰な上清を除去する。組織および残りの上清を滅菌ペトリ皿に移す。使い捨てメスを使用して、組織を切断し、マッシュの一貫性に似た小さな断片に約5分間細かく刻む。ペトリ皿からの液体でミンチ組織を最初の完全なキレート溶液チューブにピペットし、次いで2ミリリットルの高度なDMEM栄養混合物F12をペトリ皿に加える。残りの組織をフラッシュし、最初の完全なキレート溶液チューブに移す。1X完全キレート溶液チューブを5秒間約5回ボルテックスします。生検をチューブの底に1分間沈降させ、5ミリリットルが残るまで上清を除去する。1X完全キレート溶液を新しいチューブからサンプルチューブに移します。次の 2 本のチューブについて、前の手順を繰り返します。そして最後の2回の洗浄で、チューブに残っている3ミリリットルまで上清を取り除きます。生検および1X完全キレート溶液をサンプルチューブから6ウェルプレートの1ウェルに移す。3ミリリットルの1X完全キレート溶液をサンプルチューブに加える。静かに旋回して残りの組織を収集し、プレートの同じウェルに移します。ウェルに150マイクロリットルの0.5モルエチレンジアミン四酢酸を加え、6ウェルプレートを摂氏4度の20度24RPMロッカー上に置きます。肝臓サンプルを10分間、腸サンプルを移動ロッカー上で1時間インキュベートする。6ウェルプレートをバイオセーフティキャビネットに戻し、ミンチ組織と液体をウシ胎児血清を含む1X完全キレート溶液を含むチューブに移します。組織が沈降し、組織の上部の0.2ミリリットルで上清を空のチューブに輸送する。サンプルを入れたチューブを700 XGで4°Cで5分間スピンダウンします。幹細胞は現在、ミンチ組織とともにペレット化されている。ペレットを乱さないように上澄み液を慎重に取り除いて捨てます。ペレットを高度なDMEM F12に再懸濁する。チューブを再び回転させ、ペレットを乱すことなく上清を吸引する。可溶化された細胞外膜マトリックスの計算された体積をサンプル管に加える。細胞ペレットを失わないように培地を除去するときは注意してください。細胞外膜マトリックスを添加する場合、ピペットはオルガノイド懸濁液中に過剰な気泡を生じないようにゆっくりとする。可溶化された細胞外膜マトリックスを含むサンプルを氷上に保管し、可溶化された細胞外膜マトリックスがドーム様構造を形成するように、ウェルの中央に懸濁液を播種する。プレートをインキュベーターに輸送し、可溶化された細胞外膜マトリックスを30分間固化させる。ROCK阻害剤およびGSK3ベータを成長因子を含む完全な培地で混合し、この溶液を500マイクロリットルをすべてのウェルに加える。プレートをインキュベーターに入れます。イヌオルガノイドプロトコルは、典型的には、ウェル当たり約50,000〜150,000個の腸細胞または肝細胞を生成する。幹細胞単離後、肝臓犬オルガノイドは拡大スフェロイドとしてライフサイクルを開始し、7日後には出芽および分化オルガノイドに変わります。回転楕円体の体積、表面積、2D楕円領域、および円周を計算した。2D楕円領域および円周を使用して、オルガノイド培養の健康状態を評価した。半定量的様式でのマーカーの発現の評価は、スフェロイドが1〜26%の範囲の胆管細胞マーカーKRT7を優先的に発現することを示した幹細胞マーカーLGR5発現は0.17〜0.78%の範囲であったが、肝細胞マーカーはフォークヘッドボックス1Aでは0.05〜0.34%、シトクロム−P450では0.03〜0.28%と低い程度に発現していた。トリプシン様プロテアーゼとの12分間のインキュベーションは、オルガノイド増殖を阻害しなかった。しかし、オルガノイドの成長は、24分間のインキュベーションを使用して悪影響を受けました。不利な環境におけるイヌ肝オルガノイドの生存率を分析して、肝臓オルガノイドの成長と生存を成功させるために必要なオルガノイド培地および地下マトリックスの量を決定した。オルガノイドの生存率は12.9日から18日の範囲であった。基本的な細胞培養技術と無菌アプローチは、適切なオルガノイドの単離と維持に不可欠な前提条件です。

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Standardizing the Responses to Platelet Agonist Collagen-Related Peptide

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Biological Standardization to Ensure Reproducibility and Harmonization in Research (Video) | JoVE

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