Name: standardization and maintenance of 3d canine hepatic and intestinal organoid cultures for use in biomedical research
Uploaded: 2022-01-31T15:00:00
Duration: 8 min 39 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Standardization and Maintenance of 3D Canine Hepatic and Intestinal Organoid Cultures for Use in Biomedical Research at JoVE.com

Forfatterne ønsker å uttrykke takknemlighet til ansatte ved Veterinary Diagnostic Laboratory of Iowa State University, nemlig Haley M. Lambert, Emily Rahe, Rosalyn M. Branaman, Victoria J. Green og Jennifer M. Groeltz-Thrush, for rettidig behandling av prøvene som tilbys. Forfatterne ønsker å anerkjenne støtte fra fakultetets oppstart, ISU VPR Miller Award, ISU VPR Miller Award og NSF SBIR underpris til ISU # 1912948.

<ol>
	<li>Hickman, D. L., Johnson, J., Vemulapalli, T. H., Crisler, J. R., Shepherd, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Commonly+used+animal+models.">Commonly used animal models.</a> Principles of Animal Research for Graduate and Undergraduate Students. , 117-175 (2017).</li><li>De Jong, M., Maina, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Of+mice+and+humans:+Are+they+the+same?+-+Implications+in+cancer+translational+research.">Of mice and humans: Are they the same? - Implications in cancer translational research.</a> Journal of Nuclear Medicine. 51 (4), 501-504 (2010).</li><li>Cannarozzi, G., Schneider, A., Gonnet, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+phylogenomic+study+of+human,+dog,+and+mouse.">A phylogenomic study of human, dog, and mouse.</a> PLoS Computational Biology. 3 (1), 0009-0014 (2007).</li><li>Jacob, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Researchers+turn+to+canine+clinical+trials+to+advance+cancer+therapies.">Researchers turn to canine clinical trials to advance cancer therapies.</a> JAMA - Journal of the American Medical Association. 315 (15), 1550-1552 (2016).</li><li>Ziegler, A., Gonzalez, L., Blikslager, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large+animal+models:+The+key+to+translational+discovery+in+digestive+disease+research.">Large animal models: The key to translational discovery in digestive disease research.</a> Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 2 (6), 716-724 (2016).</li><li>Swanson, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phylogenetic+and+gene-centric+metagenomics+of+the+canine+intestinal+microbiome+reveals+similarities+with+humans+and+mice.">Phylogenetic and gene-centric metagenomics of the canine intestinal microbiome reveals similarities with humans and mice.</a> ISME Journal. 5 (4), 639-649 (2011).</li><li>Coelho, L. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Similarity+of+the+dog+and+human+gut+microbiomes+in+gene+content+and+response+to+diet.">Similarity of the dog and human gut microbiomes in gene content and response to diet.</a> Microbiome. 6 (1), 72 (2018).</li><li>Nguyen, T. L. A., Vieira-Silva, S., Liston, A., Raes, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+informative+is+the+mouse+for+human+gut+microbiota+research.">How informative is the mouse for human gut microbiota research.</a> DMM Disease Models and Mechanisms. 8 (1), 1-16 (2015).</li><li>Bontempo, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nutrition+and+health+of+dogs+and+cats:+Evolution+of+petfood.">Nutrition and health of dogs and cats: Evolution of petfood.</a> Veterinary Research Communications. 29, 45-50 (2005).</li><li>Allenspach, K., Gaschen, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Canine+chronic+enteropathies:+A+review.">Canine chronic enteropathies: A review.</a> Schweizer Archiv fur Tierheilkunde. 145 (5), 209-222 (2003).</li><li>Tribuddharatana, T., Kongpiromchean, Y., Sribhen, K., Sribhen, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biochemical+alterations+and+their+relationships+with+the+metabolic+syndrome+components+in+canine+obesity.">Biochemical alterations and their relationships with the metabolic syndrome components in canine obesity.</a> Kasetsart Journal - Natural Science. 45 (4), 622-628 (2011).</li><li>Chandra, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derivation+of+adult+canine+intestinal+organoids+for+translational+research+in+gastroenterology.">Derivation of adult canine intestinal organoids for translational research in gastroenterology.</a> BMC Biology. 17 (1), 33 (2019).</li><li>Schaefer, K., Rensing, S., Hillen, H., Burkhardt, J. E., Germann, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Is+Science+the+only+driver+in+species+selection?+An+internal+study+to+evaluate+compound+requirements+in+the+minipig+compared+to+the+dog+in+preclinical+studies.">Is Science the only driver in species selection? An internal study to evaluate compound requirements in the minipig compared to the dog in preclinical studies.</a> Toxicologic Pathology. 44 (3), 474-479 (2016).</li><li>MacArthur Clark, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+3Rs+in+research:+A+contemporary+approach+to+replacement,+reduction+and+refinement.">The 3Rs in research: A contemporary approach to replacement, reduction and refinement.</a> British Journal of Nutrition. 120, 1-7 (2018).</li><li>Schneider, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Model-based+reverse+translation+between+veterinary+and+human+medicine:+The+one+health+initiative.">Model-based reverse translation between veterinary and human medicine: The one health initiative.</a> CPT: Pharmacometrics and Systems Pharmacology. 7 (2), 65-68 (2018).</li><li>Lehmann, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+organoids:+A+new+dimension+in+cell+biology.">Human organoids: A new dimension in cell biology.</a> Molecular Biology of the Cell. 30 (10), 1129-1137 (2019).</li><li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+Lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche.">Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).</li><li>Kim, J., Koo, B. K., Knoblich, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+organoids:+model+systems+for+human+biology+and+medicine.">Human organoids: model systems for human biology and medicine.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 21 (10), 571-584 (2020).</li><li>Jensen, C., Teng, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Is+it+time+to+start+transitioning+from+2D+to+3D+cell+culture.">Is it time to start transitioning from 2D to 3D cell culture.</a> Frontiers in Molecular Biosciences. 7, 33 (2020).</li><li>Ho, B. X., Pek, N. M. Q., Soh, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disease+modeling+using+3D+organoids+derived+from+human+induced+pluripotent+stem+cells.">Disease modeling using 3D organoids derived from human induced pluripotent stem cells.</a> International Journal of Molecular Sciences. 19 (4), 936 (2018).</li><li>Truskey, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+microphysiological+systems+and+organoids+as+in+vitro+models+for+toxicological+studies.">Human microphysiological systems and organoids as in vitro models for toxicological studies.</a> Frontiers in Public Health. 6, 185 (2018).</li><li>Caipa Garcia, A. L., Arlt, V. M., Phillips, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoids+for+toxicology+and+genetic+toxicology:+applications+with+drugs+and+prospects+for+environmental+carcinogenesis.">Organoids for toxicology and genetic toxicology: applications with drugs and prospects for environmental carcinogenesis.</a> Mutagenesis. , (2021).</li><li>Augustyniak, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoids+are+promising+tools+for+species-specific+in+vitro+toxicological+studies.">Organoids are promising tools for species-specific in vitro toxicological studies.</a> Journal of Applied Toxicology. 39 (12), 1610-1622 (2019).</li><li>Zietek, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoids+to+study+intestinal+nutrient+transport,+drug+uptake+and+metabolism+-+Update+to+the+human+model+and+expansion+of+applications.">Organoids to study intestinal nutrient transport, drug uptake and metabolism - Update to the human model and expansion of applications.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 577656 (2020).</li><li>Zietek, T., Rath, E., Haller, D., Daniel, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+organoids+for+assessing+nutrient+transport,+sensing+and+incretin+secretion.">Intestinal organoids for assessing nutrient transport, sensing and incretin secretion.</a> Scientific Reports. 5 (1), 1-10 (2015).</li><li>Kar, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoids:+a+promising+new+in+vitro+platform+in+livestock+and+veterinary+research.">Organoids: a promising new in vitro platform in livestock and veterinary research.</a> Veterinary Research. 52 (1), 1-17 (2021).</li><li>Borcherding, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sa1976+polyphenols+reverse+the+pathologic+effects+of+palmitic+acid+and+high+fat+diet+in+canine+enteroids.">Sa1976 polyphenols reverse the pathologic effects of palmitic acid and high fat diet in canine enteroids.</a> Gastroenterology. 158 (6), 486 (2020).</li><li>Ambrosini, Y. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recapitulation+of+the+accessible+interface+of+biopsy-derived+canine+intestinal+organoids+to+study+epithelial-luminal+interactions.">Recapitulation of the accessible interface of biopsy-derived canine intestinal organoids to study epithelial-luminal interactions.</a> PLoS ONE. 15 (4), 0231423 (2020).</li><li>Zdyrski, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Su124+homology+directed+repair+in+canine+duodenal+enteroids+to+mimic+the+wild-type+P-glycoprotein+mutation.">Su124 homology directed repair in canine duodenal enteroids to mimic the wild-type P-glycoprotein mutation.</a> Gastroenterology. 160 (6), 625 (2021).</li><li>Li, Y., Tang, P., Cai, S., Peng, J., Hua, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoid+based+personalized+medicine:+from+bench+to+bedside.">Organoid based personalized medicine: from bench to bedside.</a> Cell Regeneration. 9 (1), 21 (2020).</li><li>Kurr, L. A., Allenspach, K., Jergens, A., Mochel, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Harnessing+the+biology+of+intestinal+organoids+to+accelerate+drug+discovery+in+inflammatory+bowel+disease:+A+one+health+approach.">Harnessing the biology of intestinal organoids to accelerate drug discovery in inflammatory bowel disease: A one health approach.</a> The FASEB Journal. 34, 1 (2020).</li><li>Nantasanti, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disease+modeling+and+gene+therapy+of+copper+storage+disease+in+canine+hepatic+organoids.">Disease modeling and gene therapy of copper storage disease in canine hepatic organoids.</a> Stem Cell Reports. 5 (5), 895-907 (2015).</li><li>Favier, R. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=COMMD1-Deficient+dogs+accumulate+copper+in+hepatocytes+and+provide+a+good+model+for+chronic+hepatitis+and+fibrosis.">COMMD1-Deficient dogs accumulate copper in hepatocytes and provide a good model for chronic hepatitis and fibrosis.</a> PLoS ONE. 7 (8), 42158 (2012).</li><li>Kruitwagen, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+survival+of+transplanted+autologous+canine+liver+organoids+in+a+COMMD1-deficient+dog+model+of+metabolic+liver+disease.">Long-term survival of transplanted autologous canine liver organoids in a COMMD1-deficient dog model of metabolic liver disease.</a> Cells. 9 (2), 410 (2020).</li><li>Vilgelm, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fine-needle+aspiration-based+patient-derived+cancer+organoids.">Fine-needle aspiration-based patient-derived cancer organoids.</a> iScience. 23 (8), 101408 (2020).</li><li>Saxena, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+intestinal+enteroids:+A+new+model+to+study+human+rotavirus+infection,+host+restriction,+and+pathophysiology.">Human intestinal enteroids: A new model to study human rotavirus infection, host restriction, and pathophysiology.</a> Journal of Virology. 90 (1), 43-56 (2016).</li><li>VanDussen, K. L., Sonnek, N. M., Stappenbeck, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=L-WRN+conditioned+medium+for+gastrointestinal+epithelial+stem+cell+culture+shows+replicable+batch-to-batch+activity+levels+across+multiple+research+teams.">L-WRN conditioned medium for gastrointestinal epithelial stem cell culture shows replicable batch-to-batch activity levels across multiple research teams.</a> Stem Cell Research. 37, 101430 (2019).</li><li>Powell, R. H., Behnke, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=WRN+conditioned+media+is+sufficient+for+in+vitro+propagation+of+intestinal+organoids+from+large+farm+and+small+companion+animals.">WRN conditioned media is sufficient for in vitro propagation of intestinal organoids from large farm and small companion animals.</a> Biology Open. 6 (5), 698-705 (2017).</li><li>Mackenzie, J. S., Jeggo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+one+health+approach-why+is+it+so+important.">The one health approach-why is it so important.</a> Tropical Medicine and Infectious Disease. 4 (2), 88 (2019).</li><li>Artegiani, B., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+and+application+of+3D-organoid+technology.">Use and application of 3D-organoid technology.</a> Human Molecular Genetics. 27 (2), 99-107 (2018).</li></ol>

K. Allenspach er medgrunnlegger av LifEngine Animal Health og 3D Health Solutions. Hun er konsulent for Ceva Animal Health, Bioiberica, LifeDiagnostics, Antech Diagnostics, Deerland Probiotics og Mars. J. P. Mochel er medgrunnlegger av LifEngine Animal Health og 3D Health Solutions. Dr. Mochel fungerer som konsulent for Ceva Animal Health og Ethos Animal Health. Andre forfattere har ingen interessekonflikter å erklære.

Det er for tiden mangel på standardiserte protokoller tilgjengelig for isolering og vedlikehold av hunde lever- og tarmorganoider. Etablering av standard driftsprosedyrer for organoidkulturer er garantert at denne modellen skal gjelde i forskjellige laboratoriemiljøer. Spesielt å gi standardiserte driftsprotokoller for kulturen til disse hundeorganoidmodellene er nøkkelen til å karakterisere organoiders normale vekst under kultur og passivisere for å utlede optimale tidspunkter for ekspansjon og vedlikehold. Canine intestinale organoider dyrket ved hjelp av protokollen har tidligere vært preget av Chandra et al.12.
Et av de mest kritiske trinnene i protokollen er passivring av organoider. Den optimale tiden for den første passasjen av leversfæroider ble fastslått å være på dag 7 etter isolasjon basert på leversfæroidmålingene. Det maksimale volumet av sfæroider ble oppnådd ved dag 7, og samtidig begynte sfæroider å knoppe og danne leverorganoider. Økningen i det totale organoidvolumet fra dag 2-7 etter isolasjon var mer enn 365 ganger, noe som tyder på at den optimale gangtiden er lengre enn hundens tarmorganoidkultur. Etter 7 dager i kulturen ble det ikke observert grove tegn på cellulær apoptose i leversfæroidet, selv uten rengjøring eller passiving (figur 7). Passaging tarm- og leverorganoider kan være utfordrende, da prosedyren kan føre til tap av celler og endret levedyktighet. Resultatene indikerer at langvarig inkubasjon av leverorganoider med trypsinlignende protease (opptil 12 min) ikke påvirker subkulturen negativt. Inkubering av organoider i trypsinlignende protease i mer enn 24 min kan være skadelig for den etterfølgende subkulturen av organoidene.
Ved suboptimal brudd i celleklyngene med den organoide passasjen, kan mekanisk dissosiasjon i stedet for langvarig inkubasjon med trypsinlignende protease være mer fordelaktig. Hvis det oppstår problemer med riktig dissosiasjon av organoidene, kan kort vortexing av prøvene forsøkes å forbedre passasjeutbyttet. På den annen side har vortexing potensial til å ødelegge en kultur og skade celler, så det bør bare brukes når andre prosedyrer har mislyktes gjentatte ganger. Å bryte leverorganoider i enkeltceller senker vekstraten til organoidene, mens det å bryte dem inn i klynger av celler i stor grad kan forbedre deres levedyktighet. Ti minutter ble valgt som inkubasjonstid for organoidprotokollen. Et 12 min inkubasjonstidspunkt ble ansett som ikke cytotoksisk sammenlignet med en 24 min inkubasjon i det trypsinlignende proteaseeksperimentet.
Overlevelseseksperimentet bekreftet at leverorganoider hos hunder kunne overleve i opptil 19,5 dager under ugunstige forhold (strukturell og ernæringsmessig uttømming). Organoider som overlevde disse forholdene lengst ble dyrket med CMGF + media. Denne observasjonen kan ha vært forårsaket av den langsommere veksten av leverorganoider i medier som ikke er supplert med rockhemmer og GSK3β. Organoidkulturer med CMGF+ R/G vokste raskere og kan ha tømt ressursene raskere. Dette eksperimentet åpner muligheter for miniatyrisering av hundens organoidkultur for å oppnå en systemkonvertering med høy gjennomstrømning. En slik teknologi viser potensialet for å legge til rette for narkotikafunn eller toksikologistudier til en betydelig redusert kostnad.
Noen vanlige problemer som oppstår under vedlikehold av hundeorganoid kultur er feil prøvestørkning når du plating, kulturforurensning, og etablere riktig tetthet og størrelse på organoidene. Hvis solubilisert ECM størkner for tidlig under plating, legg den straks på is i 10 minutter. Hvis solubilized ECM ikke danner kuppellignende strukturer, er det sannsynlig at ikke nok medier ble fjernet fra prøven. Hvis dette er tilfelle, fortynn prøven med en mer solubilisert ECM til kupler dannes.
Når sopp- eller bakteriekontaminering finnes i en hel plate (se figur 4), er den beste løsningen å kaste platen. Behandling med antifungale eller antibiotikamedisiner kan forsøkes, men suksessen til et slikt forsøk er ekstremt lav. Hvis en enkelt brønn er forurenset i en plate, kan levedyktige og upåvirkede brønner rengjøres (følg trinn 4.1 til 4.5) til en ny plate og overvåkes nøye. Hvis prøven allerede er nødfrossen, anbefales det å kaste hele prøven, da opptining av prøven utsetter inkubatoren for ytterligere forurensningsrisiko.
Sunn organoid kultur bør være minst i kategorien middels størrelse og middels tetthet eller større. Optimal tetthet er avgjørende for organoid kulturvekst. Lavere tetthet må korrigeres ved å rengjøre organoidene til middels tetthet. Hvis situasjonen med ekstrem tetthet oppstår (overbefolkning), bør organoidene utvides til flere brønner. Grove tegn på cellulær apoptose følger ofte både overbefolkning og lav tetthet av organoidkulturen. Hvis disse problemene ikke korrigeres i tide, vil hele organoidkulturen bli apoptotisk om noen dager. Hvis organoider oppnår ekstra stor størrelse eller svært høy tetthet, bør kulturen brukes til et eksperiment, frysing eller fiksering.
De organoide mediene inneholder for tiden 17 komponenter, og tilsetningen av vekstfaktorer som trengs for organoid vedlikehold og ekspansjon kan derfor være dyrt. Dette problemet kan løses ved å vokse 2D-cellekulturer som syntetiserer vekstfaktorene for å produsere betinget CMGF +. Cellekulturen L-WRN produserer vekstfaktorene Wnt-3a, R-Spondin-3 og Noggin37. Cellekolonien bruker 90% DMEM / F12 og 10% FBS kulturmedier. Når kulturen oppnår 90 prosent samløp, høstes media hver dag i 1 uke. De høstede mediene blandes deretter med 2x CMGF + (uten disse vekstfaktorene). Mens 2D-kulturer kan produsere de nødvendige vekstfaktorene til en brøkdel av kostnaden, må det forventes ekstra tid og forberedelser til å produsere media. Konsentrasjoner av vekstfaktorer mellom betingede mediepartier kan også variere fra 37,38.
Canine voksen stamcelle-avledede organoidkulturer er en unik biomedisinsk modell som kan bidra til å nå målene til One Health Initiative39. Den organoide teknologien kan brukes på mange grunnleggende og biomedisinske forskningsområder, som spenner fra utviklingsbiologi, patofysiologi, legemiddeloppdagelse og testing, toksikologi til studiet av smittsomme sykdommer og regenerativ medisin40. Translasjonell og omvendt translasjonell forskning er begge områder der hundeorganoider gjelder15. Hunder har blitt brukt i århundrer i translasjonelle eksperimentelle omgivelser, og deres følgesvenn dyrestatus har også lagt til rette for sin posisjon som en av de mest utforskede artene i veterinærmedisin.
Til slutt gir dette manuskriptet standardiserte driftsprotokoller for isolasjon, vedlikehold, høsting og biobanking av hundehjerne- og tarmorganoider for å lette anvendelsen av denne modellen i ulike biomedisinske felt. Denne modellen er unikt egnet til å fremme omvendt translasjonell forskning som et verktøy for One Health Initiative for å fremme den inter- og intradisiplinære kunnskapsdelingen.

Gnagere er den mest brukte dyremodellen for biomedisinsk og translasjonell forskning1. De er usedvanlig nyttige for å undersøke grunnleggende molekylær patogenese av sykdommene, selv om deres kliniske relevans for kroniske multifaktorielle sykdommer nylig har blitt stilt spørsmål ved2. Hundemodellen har flere fordeler i forhold til gnagere3,4. Hunder og mennesker deler likheter i metabolomikk og tarmmikrobiom som utviklet seg på grunn av forbruk av menneskelig diett gjennom ulike perioder av domesticering5,6,7. Likheter mellom hund og human gastrointestinal anatomi og fysiologi er et annet av eksemplene8.
I tillegg deler hunder ofte lignende miljøer og livsstil med sine eiere9. Jo lengre levetid for hunder i forhold til gnagere tillater den naturlige utviklingen av mange kroniske tilstander10. Inflammatorisk tarmsykdom eller metabolsk syndrom er eksempler på multifaktorielle kroniske sykdommer som deler viktige likheter mellom mennesker og hunder11,12. Prekliniske studier av hunder som involverer hunder med naturlig forekommende sykdommer, kan generere mer pålitelige data enn de som er oppnådd fra gnagermodeller13. For å minimere bruken av levende dyreforskning og overholde prinsippene til 3Rs (Reduce, Refine, Replace)14, har det imidlertid dukket opp alternativer til in vivo-testing ved hjelp av 3D in vitro hundeorganoider15.
Organoider er selvmonterte 3D stamcelleavledede strukturer som rekapitulerer fysiologien og mikroanatomien til deres opprinnelige organer16,17. Denne teknologien ble først beskrevet av Sato et al. i 200917 og tillot mer overførbare in vitro-studier i epitelceller enn det som tidligere var mulig ved hjelp av 2D kreftcellekulturer18,19,20. Organoider er nyttige in vitro-modeller i mange biomedisinske disipliner som i preklinisk toksikologiske21,22,23, absorpsjons- eller metabolismestudier24,25,26,27,28, samt i personlige medisinske tilnærminger29,30,31 . Den vellykkede kulturen av hund intestinale organoider har blitt beskrevet for første gang i 201912, mens leverorganoider avledet fra en hund først ble rapportert av Nantasanti et al. i 201532. Canine organoider har siden blitt vellykket brukt i studier som undersøker hundens kroniske enteropatier, gastrointestinale stromale svulster, kolorektal adenokarsinom12 og Wilsons sykdom33,34.
Mens voksne stamceller kan høstes via nekropsier, krever organoidteknologien ikke alltid ofre for dyrene. Endoskopiske og laparoskopiske biopsier, eller til og med fin nål aspirater av organer35, er en levedyktig kilde til voksne stamceller for epitelial organoid isolasjon12. Utbredt bruk av slike ikke-invasive teknikker i veterinærpraksis legger til rette for alternativer for omvendt translasjonell forskning (oversettelse av informasjon fra veterinær klinisk praksis til menneskelig klinisk praksis og omvendt)15. Videreutvikling av organoid teknologi kan sikres ved standardisering av organoid kultur og vedlikeholdsmetoder. Den organoide protokollen som presenteres her er delvis basert på tidligere publisert arbeid av Saxena et al. fra 201536, og metoder ble tilpasset detaljer om hundens tarm- og leverorganoidkultur. Den generelle arbeidsflyten til hundens organoidprotokoller er avbildet i figur 1.
Canine Organoid Isolation Protocol introduserer metoder for å skaffe prøver fra endoskopisk, laparoskopisk og kirurgisk biopsi, samt nekropsier. Den skisserer den første forbehandlingen av vevsprøver og metoder som brukes til transport til laboratoriet. Materialer og reagenser som trengs for organoid isolasjon er oppsummert i avsnittet "Forberedelse for isolasjon". Prosessen med voksen stamcelleisolasjon fra vevsprøver er nærmere beskrevet. Til slutt diskuteres prosessen med å plating organoider i kuppellignende strukturer ved hjelp av en solubilisert ekstracellulær membranmatrise.
Den andre protokollen, Canine Organoid Maintenance Protocol, beskriver metoder for å dokumentere og dyrke organoider. Medieendringer og deres frekvens diskuteres i denne delen. Videre beskrives laboratorieprosedyrene som passivring og rengjøring av cellekulturene, som er avgjørende for å sikre vellykket vedlikehold av 3D-hundorganoider. Passende passivring er et kritisk skritt i protokollen, og mulige justeringer og feilsøking av dette trinnet diskuteres videre i manuskriptet.
Den siste protokollen er Canine Organoid Harvesting and Biobanking Protocol som inneholder metoder for å forberede fullvoksne organoider for parafin-innebygging og RNA-bevaring. Metoder for organoidprøver av biobanking i lagring av flytende nitrogen er også beskrevet her. Til slutt diskuteres måtene å tine frosne prøver og støtte veksten.
Til slutt tar denne artikkelen sikte på å gi konsistente organoide kulturprosedyrer for hunder gjennom standardisering av interlaboratoriumsprotokoller. Ved å gjøre dette har manuskriptet som mål å lette reproduserbarheten av data avledet fra hundeorganoidmodeller for å øke deres relevans i translasjonell biomedisinsk forskning.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63515/63515fig01.jpg"> Figur 1: Arbeidsflyt av organoidprotokoller for hunder. Canine Organoid Isolation Protocol beskriver utarbeidelsen av materialene som trengs for organoid isolasjon, høsting av en vevsprøve (ved hjelp av nekropsier, endoskopisk, laparoskopisk og kirurgisk biopsi), og veiledning om celledissosiasjon og plating av den cellulære befolkningen. Canine Organoid Maintenance Protocol diskuterer rengjøring og passivring av organoidkulturen. Organoid Harvesting and Biobanking Protocol diskuterer utarbeidelse av organoidprøver for parafin-innebygging og ytterligere organoid karakterisering. Metoder for å biobank organoid kulturer og gjenopplive dem fra lagring i flytende nitrogen er også diskutert. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63515/63515fig01large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Chelating solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Sorbitol</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>BP439-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT</td>
			<td>Promega</td>
			<td>V3151</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>P217-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P5655-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4-2H2O</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S5136-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>S271-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen Strep</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>S5-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Organoid media</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>[Leu15]-Gastrin I human</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G9145-.5MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A-83-01</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>9094360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Advanced DMEM/F12</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12634-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17504-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Corning</td>
			<td>35-010-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamax</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>VWR Life Science</td>
			<td>J848-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human R-Spondin-1</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>120-38-500UG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Murine EGF</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>315-09-1MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Murine Noggin</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>250-38-250UG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Murine Wnt-3a</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>315-20-10UG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2 supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17502-048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-Acetyl-L-cysteine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9165-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nicotinamide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>N0636-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primocin</td>
			<td>InvivoGen</td>
			<td>ant-pm-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ROCK inhibitor (Y-27632)</td>
			<td>EMD Millipore Corp.</td>
			<td>SCM 075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SB202190 (P38 inhibitor)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S7067-25MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stemolecule CHIR99021 (GSK3&#946;)</td>
			<td>Reprocell</td>
			<td>04-0004-base</td>
			<td></td>
		</tr>
		
		<tr>
			<td>Trimethoprim</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T7883-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfamethoxazole</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7507-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic Acid, Glacial</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>A38-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl Sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Fisher Chemicals</td>
			<td>D128-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA, pH 8.0, 0.5 M</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15575-038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde (37%)</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>F79P-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G5882</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel Matrix For Organoid Culture</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356255</td>
			<td>Extracellular Membrane Matrix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde, 97%</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>A11313</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS, 1X (Phosphate-Buffered Saline)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-040-CM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS, 1X (Phosphate-Buffered Saline)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-040-CM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAlater Soln.</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM7021</td>
			<td>RNA Storage Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Express</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12604-021</td>
			<td>Trypsin-like Protease</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Other</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 Well Cell Culture Plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ACD Hybez II Hybridization System</td>
			<td>ACD a biotechne brand</td>
			<td>321710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge Tube, 15 mL</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430766</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CoolCell LX</td>
			<td>Corning</td>
			<td>BCS-405MC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryogenic Vials</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430488</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Centrifuge Tube (50 mL)</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>05-539-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GyroMini Nutating mixer (Rocker)</td>
			<td>Labnet</td>
			<td>S0500-230V-EU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat Bath</td>
			<td>Lab-Line Instruments</td>
			<td>3000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mr. Frosty Freezing Container</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>5100-0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop 2000</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>ND2000CLAPTOP</td>
			<td>SpectrophotometerAnalysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Panasonic incubator</td>
			<td>Panasonic</td>
			<td>MCO-170ML-PA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm M Wrapping Film</td>
			<td>Bemis Company Inc</td>
			<td>PM996/EMD</td>
			<td>Laboratory Flexible Film Tape</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protected Disposable Scalpels</td>
			<td>Bard-Parker</td>
			<td>239844</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAscope 2.5 HD Assay &#8211; RED</td>
			<td>ACD a biotechne brand</td>
			<td>322350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAscope H2O2 &#38; Protease Plus Reagents</td>
			<td>ACD a biotechne brand</td>
			<td>322330</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAscope Target Retrieval Reagents</td>
			<td>ACD a biotechne brand</td>
			<td>322000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAscope Wash Buffer Reagents</td>
			<td>ACD a biotechne brand</td>
			<td>310091</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Culture Dish</td>
			<td>Dot Scientific</td>
			<td>6676621</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Culture Plate 24 wells</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>FB012929</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

standardization and maintenance of 3d canine hepatic and intestinal organoid cultures for use in biomedical research

Hunder utvikler komplekse multifaktorielle sykdommer analogt med mennesker, inkludert inflammatoriske sykdommer, metabolske sykdommer og kreft. Derfor representerer de relevante store dyremodeller med translasjonspotensialet til human medisin. Organoider er 3-dimensjonale (3D), selvmonterte strukturer avledet fra stamceller som etterligner mikroanatomi og fysiologi av deres opprinnelsesorgan. Disse translasjonelle in vitro-modellene kan brukes til stoffpermeabilitet og oppdagelsesapplikasjoner, toksikologivurdering og for å gi en mekanistisk forståelse av patofysiologien til multifaktorielle kroniske sykdommer. Videre kan hundeorganoider forbedre livene til følgesvenner, gi innspill på ulike områder av veterinærforskning og legge til rette for personlige behandlingsapplikasjoner i veterinærmedisin. En liten gruppe givere kan lage en biobank av organoidprøver, noe som reduserer behovet for kontinuerlig vevshøsting, da organoide cellelinjer kan underkultureres på ubestemt tid. Heri presenteres tre protokoller som fokuserer på kulturen av tarm- og levermusinorganoider avledet fra voksne stamceller. Canine Organoid Isolation Protocol skisserer metoder for å behandle vev og innebygging av celleisolering i en støttende matrise (solubilisert ekstracellulær membranmatrise). Canine Organoid Maintenance Protocol beskriver organoid vekst og vedlikehold, inkludert rengjøring og passivring sammen med passende tidspunkt for utvidelse. Organoid Harvesting and Biobanking Protocol beskriver måter å trekke ut, fryse og bevare organoider for videre analyse.

Hundens organoidprotokoll genererer vanligvis ~ 50.000 til ~ 150.000 tarm- eller leverceller per brønn av en 24-brønns plate. Representative organoider kan ses i figur 6.
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63515/63515fig06.jpg"> Figur 6: Representative bilder av hundeorganoider. Bilder av organoider isolert ved hjelp av denne protokollen er avbildet. (A,B) Intestinale organoider avledet fra tolvfingertarmen (tatt ved 10x og 5x objektiv forstørrelse). Legg merke til tilstedeværelsen av eldre budded organoider og yngre sfæroider. (C,D) Hund enteroider fra den nedre delen av jejunum (tatt ved 10x og 20x objektiv forstørrelse). (E,F) Ileal enteroider (tatt ved 20x og 5x objektiv forstørrelse), og (G, H) kolonoider (tatt ved 10x objektiv forstørrelse). (I) Et representativt bilde av leverorganoider tatt ved 20x objektiv forstørrelse. De fleste organoidene er i sin spirende form. Yngre leversfæroider kan også ses på bildet. (J) Representativt bilde som viser en sjeldenhepatisk organoid som danner en kanallignende struktur (tatt ved 10x objektiv forstørrelse). Skalalinjen (500 μm) er til stede øverst til venstre i hvert bilde. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63515/63515fig06large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
Enteroider og kolonoider avledet ved hjelp av denne protokollen ble tidligere preget av Chandra et al. i 201912. Canine intestinale organoider består av en vanlig cellulær populasjon av tarmepitelet. Ved hjelp av RNA in situ hybridisering, uttrykk for stamcellebiomarkører (Leucine-Rich Repeat Containing G Protein-Coupled Receptor 5 - LGR5 og SRY-Box Transcription Factor 9 - SOX9), Paneth Cell Biomarker (Ephrin type-B reseptor 2 - EPHB2), absorptive epitelformede cellemarkører (alkalisk fosfatase - ALP) og enterokendokrine markør (Neurogenin-3 - Neuro G3)12 ble bekreftet. Alcian Blue farging ble utført på parafin-innebygde lysbilder for å bekrefte tilstedeværelsen av Begerceller. I tillegg ble funksjonelle analyser som optisk metabolsk avbildning (OMI) eller cystisk fibrosetransmembrane konduktansregulator (CFTR) hevelsesanalyse utført for å bekrefte organoidenes metabolske aktivitet. Canine organoider fra hunder diagnostisert med inflammatorisk tarmsykdom, gastrointestinale stromale svulster (GIST) eller kolorektalt adenokarsinom ble også isolert ved hjelp av denne protokollen12.
Etter stamcelleisolasjon starter leverhundorganoider sin livssyklus som ekspanderende sfæroider, og etter ~ 7 dager blir de til spirende og differensierende organoider. Leversfæroider isolert og dyrket i henhold til denne protokollen ble målt for å kvantifisere veksten og bestemme den ideelle tiden for passasje. Sfæroider avledet fra laparoskopisk leverbiopsier av friske voksne hunder (n = 7) ble målt i løpet av de første 7 dagene av kulturen. Representative bilder ble tatt, og den langsgående (a) og diagonale (b) radiusen til sfæroidene (n = 845) ble målt gjennom hele kulturen. Volumet (V), overflatearealet (P), 2D-ellipseområdet (A) og omkretsen (C) av sfæroidene ble beregnet. Beregningene og resultatene av eksperimentet er oppsummert i figur 7. 2D ellipseområde og omkrets ble brukt til å vurdere organoidkulturens helse ved hjelp av lett mikroskopi. Disse verdiene kan fungere som en veiledning for kulturvedlikeholdsbeslutninger.
Kort sagt utvidet sfæroider raskt i volum, overflateareal, 2D-ellipseområde og omkrets. Måledataene fra de syv beagles ble gjennomsnittet for følgende beregninger. Volumet økte med 479% (±6%) fra dag 2 til 3. Samtidig økte sfæroidoverflateareal og 2D-ellipseareal med henholdsvis 211 % (±208 %) og 209 % (±198 %). 2D-ellipseomkretsen økte fra dag 2 til 3 med 73 % (±57 %). Økningen i det totale volumet av leverorganoider fra dag 2-7 var mer enn 365 ganger, overflateareal og 2D ellipseområde økte 49 ganger, og 2D ellipseomkrets økte seks ganger.
Deretter ble sfæroider avledet fra to voksne hundeprøver videre dyrket etter passasje og samlet hver dag (dag 2-7) for RNA in situ hybridisering (RNA ISH). Hundesonder ble designet (sondeliste er gitt som supplerende tabell 2), og mRNA-uttrykk ble evaluert for stamcellemarkører (LGR5), markører som er spesifikke for cholangiocytter (cytokeratin 7 - KRT-7, og aquaporin 1 - AQP1), samt hepatocyttmarkører (gaffeltr halshuggeboksprotein A1 - FOXA1; og cytokrom P450 3A12 - CYP3A12). Uttrykket av markørene ble vurdert på en semi-kvantitativ måte (representative bilder i figur 8). Sfæroider uttrykte fortrinnsvis cholangiocyttmarkøren KRT-7 fra 1% til 26% i signalområde / totalt celleområde. AQP1 ble ikke uttrykt i organoidprøvene, uten tvil fordi tilstedeværelsen i hundepatiske prøver er sparsom. Stamcellemarkøruttrykket (LGR5) varierte mellom 0,17 % og 0,78 %, mens hepatocyttmarkører i lavere grad ble uttrykt til 0,05 %-0,34 % for FOXA1 og 0,03 %-0,28 % for CYP3A12.
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63515/63515fig07.jpg"> Figur 7: Leversfæroidmålinger. (A) Leversfæroidvekst ble observert hver dag i kulturer fra dag 2-7. Sfæroider ble først dannet på dag 2, og de siste sfæroidene startet den spirende prosessen på dag 7. Et påfølgende eksperiment brukte to organoidlinjer for hunder etter passasje for å høste sfæroider hver dag for parafin-innebygging for å utføre RNA ISH (dag 2 bilde ble tatt på 40x, dag 6 bilde på 10x, og resten av bildene ble tatt ved 20x forstørrelse). (B) En leversfæroid klynge er vist festet til en vevsbit innebygd i solubilisert ECM 4 dager etter isolasjon. Langsgående og diagonale radier av sfæroidene ble målt (bilde tatt ved 10x). Panel (C) viser formelen som brukes til beregninger for å utlede volum (V), overflateareal (P), 2D ellipseområde (A) og omkrets (C). For disse beregningene ble det antatt at leversfæroider av hunder er ideelle sfæroider. Resultater av målinger av leversfæroiders volum, overflateareal, 2D-ellipseområde og 2D ellipseomkrets for individuelle vekstdager er avbildet i panelet (D). Feilfelt representerer standardfeilen for gjennomsnittet (SEM). (E) mRNA-uttrykk for KRT-7, LGR5, FOXA1 og CYP3A12 ble målt i prøver av leversfæroider av hunder etter at dag 2 til dag 7 ble vedtatt. AQP1 ble ikke uttrykt i disse eksemplene. En skalastang (5x: 500 μm; 10x: 200 μm; 20x: 100 μm; 40x: 50 μm) er til stede øverst til venstre i hvert bilde. Objektiv forstørrelse notert. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63515/63515fig07large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
Organoider ville sjelden ikke bryte opp under passiviseringsprosessen etter denne standardiserte teknikken. Hvis dissosiasjon ikke oppstår, kan passasjetidene justeres for å oppnå optimal celleklynge oppløsning. Imidlertid kan langvarig eksponering for trypsinlignende protease påvirke veksten av organoidene negativt. Leverorganoider ble brukt i et påfølgende eksperiment for å undersøke optimal dissosiasjonstid og etablere en riktig passivitetsmetode. Kort sagt ble leverorganoider fra to friske hunder (6 godt replikerer hver) passert med trypsinlignende protease i 12 min og 24 min. Prøver ble opphisset hvert 6. På slutten av dissosiasjonstidspunktet ble 6 ml iskald Avansert DMEM/F12 lagt til løsningen, og prøver ble spunnet (700 x g i 5 minutter ved 4 °C). Supernatanten (Advanced DMEM/F12 med fortynnet trypsinlignende protease) ble fjernet, og pelletsene ble innebygd i solubilisert ECM som beskrevet ovenfor (trinn 4.4-4.5). Etter 12 timers kultur i solubilisert ECM og CMGF+ R/G ble det observert forskjeller i begge prøvene. En 12 min inkubasjon med trypsinlignende protease hemmte ikke organoid vekst. Veksten av organoider ble imidlertid negativt påvirket (se figur 9) ved hjelp av en 24 min inkubasjon.
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63515/63515fig09.jpg"> Figur 9: Forsøk på leverorganoidpassasje hos hunder. Representative bilder av organoider avledet fra to hunder (D_1 og D_2) passert ved hjelp av trypsinlignende protease inkubasjonsmetode i 12 min eller 24 min. Kontrollprøver ble passeret med trypsinlignende protease i 10 minutter. En skalalinje (μm) er til stede øverst til venstre i hvert bilde og representerer 500 μm (5x objektiv forstørrelse). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63515/63515fig09large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
Deretter ble undersøkelsen av overlevelsesevnen til hundehvisortapoloider avledet fra denne protokollen i et ugunstig miljø (deprivasjon av strukturell støtte og ernæring) utført. Undersøkelsen fokuserte på å bestemme volumet av organoide medier og kjellermatrise som trengs for leverorganoidens vellykkede vekst og overlevelse, og også etablere slike forholds innflytelse på organoidkulturen. Overlevelse ble målt i en 96-brønnsplate med et begrenset antall organoider. Organoider fra to hunder ble passert som beskrevet ovenfor og innebygd (12 replikerer) i forskjellige mengder solubilisert ECM (10 μL eller 15 μL). Cellene ble belagt i en konsentrasjon på 400 celler / 10 μL brønn og 600 celler / 15 μL brønn tilsvarende 40.000 celler / ml. To medietyper (CMGF+, eller CMGF+ R/G) ble lagt til i forskjellige volumer (25 μL, 30 μL eller 35 μL). Mediet ble aldri endret, og ingen vedlikeholdsprosedyrer ble utført. Overlevelsen av organoidene ble overvåket hver dag. Organoid død ble definert som oppløsning av mer enn 50% av organoide strukturer. Overlevelsesraten for organoider under disse forholdene varierte fra 12,9 (±2,3) dager til 18 (±1,5) dager, og resultatene er oppsummert i tabell 3. De to prøvene som overlevde lengst var organoider avledet fra hunder innebygd i 15 μL solubilisert ECM og 30 μL CMGF + media. Begge prøvene ble innebygd i solubilisert ECM (30 μL) og ferske medier (500 μL) i en standard 24-brønnsplate etter 18 dagers deprivasjon for å sikre at organoid ekspansjon fortsatt var mulig (figur 10).
<table border="1" fo:font-size="6px" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td></td>
			<td>Medietype</td>
			<td>Middel (dager overlevd)</td>
			<td>Median</td>
			<td>CV%</td>
			<td>Middel (dager overlevd)</td>
			<td>Median</td>
			<td>CV%</td>
			<td>Middel (dager overlevd)</td>
			<td>Median</td>
			<td>CV%</td>
			<td>Middel (dager overlevd)</td>
			<td>Median</td>
			<td>CV%</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Medier (μL)</td>
			<td colspan="3">30</td>
			<td colspan="3">25</td>
			<td colspan="3">35</td>
			<td colspan="3">30</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">ECM (μL)</td>
			<td colspan="3">10</td>
			<td colspan="3">10</td>
			<td colspan="3">10</td>
			<td colspan="3">15</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="2">D_1</td>
			<td>CMGF+ R/G</td>
			<td>12.50</td>
			<td>13</td>
			<td>11.57</td>
			<td>12.83</td>
			<td>13</td>
			<td>4.50</td>
			<td>11.83</td>
			<td>11.5</td>
			<td>12.91</td>
			<td>12.08</td>
			<td>13</td>
			<td>12.46</td>
		</tr>
<tr>
<td>CMGF+</td>
			<td>17.08</td>
			<td>17</td>
			<td>16.26</td>
			<td>18.50</td>
			<td>19</td>
			<td>4.89</td>
			<td>18.42</td>
			<td>19</td>
			<td>14.54</td>
			<td>17.82</td>
			<td>19</td>
			<td>8.99</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="2">D_2</td>
			<td>CMGF+ R/G</td>
			<td>13.67</td>
			<td>14</td>
			<td>13.36</td>
			<td>13.00</td>
			<td>13</td>
			<td>12.70</td>
			<td>14.00</td>
			<td>14.5</td>
			<td>17.23</td>
			<td>13.08</td>
			<td>13</td>
			<td>8.90</td>
		</tr>
<tr>
<td>CMGF+</td>
			<td>15.50</td>
			<td>15</td>
			<td>18.56</td>
			<td>17.50</td>
			<td>18</td>
			<td>10.48</td>
			<td>17.50</td>
			<td>19</td>
			<td>20.89</td>
			<td>17.00</td>
			<td>17</td>
			<td>14.41</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="2">TOTAL</td>
			<td>CMGF+ R/G</td>
			<td>13.08</td>
			<td>13</td>
			<td>13.13</td>
			<td>12.92</td>
			<td>13</td>
			<td>9.39</td>
			<td>12.92</td>
			<td>13</td>
			<td>17.52</td>
			<td>12.58</td>
			<td>13</td>
			<td>11.22</td>
		</tr>
<tr>
<td>CMGF+</td>
			<td>16.29</td>
			<td>16.5</td>
			<td>17.69</td>
			<td>18.00</td>
			<td>18.5</td>
			<td>8.35</td>
			<td>17.96</td>
			<td>19</td>
			<td>17.65</td>
			<td>17.43</td>
			<td>17</td>
			<td>11.70</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td colspan="13">død = mer enn 50 % av organoidmassen er uunngåelige</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabell 3: Resultater av survivabilitetseksperimenter. Eksperimentet var basert på deprivasjon av strukturell støtte eller ernæring av to organoidkulturer. Resultatene inkluderer gjennomsnitt, median og standardavvik (CV%) av individuelle konsentrasjoner av solubilisert ECM og media hos individuelle hunder.
<img alt="Figure 10" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63515/63515fig10.jpg"> Figur 10: Organoider ernæringsmessig og strukturell deprivasjon. Organoider ble reskilt i 24-brønnsplater for å bekrefte muligheten for ekspansjon etter deprivasjon (A). Representative bilder fra dag 4 og dag 7 etter replating viser utvidelsen av organoidene, som bekrefter evnen til å identifisere levedyktige organoider visuelt (bilder er tatt ved 5x objektiv forstørrelse). Representative bilder av organoider som anses levende, eller døde, ses i (B). Bilder er tatt med 5x objektiv forstørrelse. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63515/63515fig10large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63515/63515fig8v2.jpg"> Figur 8: Leversfæroider RNA in situ hybridisering representative bilder. Representative bilder av LGR5-, KRT7-, FOXA1- og CYP3A12-markører ble tatt ved 60x objektiv forstørrelse av prøver fra dag 2-7 etter passering. Positive mRNA-molekyler flekker rødt. AQP1 ble ikke uttrykt i eksemplene. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63515/63515fig8v2large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Ufullstendig chelating løsning (ICS) sammensetning</td>
			<td>Endelig konsentrasjon</td>
		</tr>
<tr>
<td>500 ml H2O</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
<tr>
<td>2,49 g Na2HPO4-2H2O</td>
			<td>4,98 mg/ml</td>
		</tr>
<tr>
<td>2,7 g KH2PO4
</td>
			<td>5,4 mg/ml</td>
		</tr>
<tr>
<td>14 g NaCl</td>
			<td>28 mg/ml</td>
		</tr>
<tr>
<td>0,3 g KCl</td>
			<td>0,6 mg/ml</td>
		</tr>
<tr>
<td>37,5 g Sukrose</td>
			<td>75 mg/ml</td>
		</tr>
<tr>
<td>25 g D-Sorbitol</td>
			<td>50 mg/ml</td>
		</tr>
<tr>
<td>Fullstendig chelating løsning (CCS) sammensetning</td>
			<td>V/V % eller endelig konsentrasjon</td>
		</tr>
<tr>
<td>Ufullstendig chelateringsløsning</td>
			<td>20%</td>
		</tr>
<tr>
<td>Steril H2O</td>
			<td>80%</td>
		</tr>
<tr>
<td>DTT</td>
			<td>520 μM</td>
		</tr>
<tr>
<td>Penn strep</td>
			<td>Penn: 196 U/ml; Strep 196 ug/ml</td>
		</tr>
<tr>
<td>Organoid mediesammensetning</td>
			<td>Endelig konsentrasjon</td>
		</tr>
<tr>
<td>Avansert DMEM/F12</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
<tr>
<td>FBS</td>
			<td>8%</td>
		</tr>
<tr>
<td>Glutamax</td>
			<td>2 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>HEPES</td>
			<td>10 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>Primocin</td>
			<td>100 μg/ml</td>
		</tr>
<tr>
<td>B27 tillegg</td>
			<td>1x</td>
		</tr>
<tr>
<td>N2 tillegg</td>
			<td>1x</td>
		</tr>
<tr>
<td>N-Acetyl-L-cystein</td>
			<td>1 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>Murine EGF</td>
			<td>50 ng/ml</td>
		</tr>
<tr>
<td>Murine Noggin</td>
			<td>100 ng/ml</td>
		</tr>
<tr>
<td>Menneskelig R-Spondin-1</td>
			<td>500 ng/ml</td>
		</tr>
<tr>
<td>Murine Wnt-3a</td>
			<td>100 ng/ml</td>
		</tr>
<tr>
<td>[Leu15]-Gastrin I menneske</td>
			<td>10 nM</td>
		</tr>
<tr>
<td>Nikotinamid</td>
			<td>10 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>A-83-01</td>
			<td>500 nM</td>
		</tr>
<tr>
<td>SB202190 (P38-hemmer)</td>
			<td>10 μM</td>
		</tr>
<tr>
<td>TMS (trimetoprim sulfametoksazol)</td>
			<td>10 μg/ml</td>
		</tr>
<tr>
<td>Flere komponenter</td>
			<td>Endelig konsentrasjon</td>
		</tr>
<tr>
<td>ROCK-hemmer (Y-27632)</td>
			<td>10 μM</td>
		</tr>
<tr>
<td>Stemolecule CHIR99021 (GSK3β)</td>
			<td>2,5 μM</td>
		</tr>
<tr>
<td>Frysing av mediesammensetning</td>
			<td>V/V prosent</td>
		</tr>
<tr>
<td>Organoide medier og ROCK-hemmere</td>
			<td>50%</td>
		</tr>
<tr>
<td>FBS</td>
			<td>40%</td>
		</tr>
<tr>
<td>Dimetylsulfoksid (DMSO)</td>
			<td>10%</td>
		</tr>
<tr>
<td>FAA-sammensetning</td>
			<td>V/V prosent</td>
		</tr>
<tr>
<td>Etanol (100%)</td>
			<td>50%</td>
		</tr>
<tr>
<td>Eddiksyre, Isbre</td>
			<td>5%</td>
		</tr>
<tr>
<td>Formaldehyd (37%)</td>
			<td>10%</td>
		</tr>
<tr>
<td>Destillert vann</td>
			<td>35%</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabell 1: Sammensetning av løsninger og medier. En liste over komponenter og konsentrasjoner av ufullstendige og komplette chelateringsløsninger, CMGF+ (organoidmedier), frysemedier og FAA.
Supplerende tabell 1: Organoid pleie mal. Denne malen gir mulighet for nøyaktig og reproduserbar organoid notering for hver dag. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63515/Supplementary%20Table%201.xlsx" target="_blank">Klikk her for å laste ned denne tabellen.</a>
Supplerende tabell 2: RNA in situ hybridiseringssonder. Liste over sonder spesielt designet for hundemRNA-mål av en produsent av teknologien for å utføre RNA in situ hybridiseringsteknikk . Informasjon om betydningen av individuelle markører, navnet på en sonde, referansenummeret og målområdet er oppført. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63515/Supplementary%20Table%202.xlsx" target="_blank">Klikk her for å laste ned denne tabellen.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Standardization and Maintenance of 3D Canine Hepatic and Intestinal Organoid Cultures for Use in Biomedical Research at JoVE.com

Standardization and Maintenance of 3D Canine Hepatic and Intestinal Organoid Cultures for Use in Biomedical Research

Eksperimentelle metoder for å høste voksne stamceller fra hundens tarm- og levervev for å etablere 3D organoidkulturer beskrives. Videre diskuteres laboratorieteknikkene for å sikre konsistent vekst og gi standard driftsprosedyrer for høsting, biobank og gjenopplive hundens tarm- og leverorganoidkulturer.

Standardisering og vedlikehold av 3D-hundeorpatiske og intestinale organoidkulturer for bruk i biomedisinsk forskning

Dogs develop complex multifactorial diseases analogous to humans, including inflammatory diseases, metabolic diseases, and cancer. Therefore, they ...

Protokollene for kulturen av hundepatiske og intestinale organoider er viktige for å standardisere denne nye teknologien. Denne teknikken tillater pålitelig og reproduserbar etablering av hundens organoidkultur, inkludert organoidisolasjon, vedlikehold, høsting og etterfølgende biobanking av prøver. Canine organoider kan gi en utmerket modell for mange applikasjoner som spenner fra biologi, smittsom sykdomsutvikling, narkotikatesting og oppdagelse, og også overføringsmedisin.Til å begynne med, lag fem 15 milliliter sentrifugerør med fem milliliter 1X komplett chelateringsløsning, ett rør med tre milliliter 1X komplett chelateringsløsning, ett tomt rør og ett rør med fem milliliter 1X komplett chelateringsløsning og to milliliter foster bovint serum. På isolasjonsdagen legger du en steril Petri-tallerken, skalpell, isbøtte og kald avansert DMEM næringsblanding F12 i biosikkerhetsskapet. Plasser det nødvendige antallet 24-brønns cellekulturplate i karbondioksidinkubatoren for å forvarme.Plasser den oppslående ekstracellulære membranmatrisen på isen for opptining. Forkjøl sentrifugen til fire grader Celsius. Flytt komplette medier med vekstfaktorer fra fryseren til et 37 graders Celsius vannbad for å unngå direkte lyseksponering.Rist vevsprøver i transportrøret i 30 sekunder. Fjern overdreven supernatant uten å kaste noe vev ved langsom pipettering nær væskeoverflaten til 0,5 milliliter er igjen i røret. Overfør vev og gjenværende supernatant til en steril Petri-tallerken.Bruk en engangs skalpell, kutt og hakk vevet i mindre biter som ligner en moskonsistens i omtrent fem minutter. Pipette hakket vev med væske fra Petri-parabolen til det første komplette chelateringsoppløsningsrøret, og tilsett deretter to milliliter avansert DMEM næringsblanding F12 til Petri-parabolen. Skyll det gjenværende vevet og overfør til det første komplette chelateringsoppløsningsrøret.Virvel 1X komplett chelatering løsningsrør omtrent fem ganger i fem sekunder. La biopsier slå seg ned på bunnen av røret i ett minutt og fjern supernatanten til fem milliliter er igjen. Overfør 1X komplett chelateringsløsning fra det nye røret til prøverøret.Gjenta det forrige trinnet for følgende to rør. Og på de to siste vaskene, fjern supernatanten ned til tre milliliter igjen i røret. Overfør biopsiene og 1X komplett chelateringsløsning fra prøverøret til en brønn på en seksbrønnsplate.Tilsett tre milliliter 1X komplett chelateringsløsning i prøverøret. Virvle forsiktig for å samle gjenværende vev og overføre til samme brønn av platen. Tilsett 150 mikroliter 0,5 molar etylendiamintetraeddiksyre i en brønn og legg seksbrønnsplaten på en 20 graders 24 RPM rocker ved fire grader Celsius.Inkuber leverprøvene i 10 minutter og tarmprøvene i en time på den bevegelige rockeren. Transporter seksbrønnsplaten tilbake til biosikkerhetsskapet og overfør hakket vev og væske til et rør som inneholder 1X komplett chelateringsløsning med fosterbovint serum. La vevet slå seg ned og transportere supernatanten med 0,2 milliliter av den øvre delen av vevet til et tomt rør.Snurr ned røret som inneholder prøven ved 700 XG i fem minutter ved fire grader Celsius. Stamceller er nå pelletert sammen med hakket vev. Fjern og kast supernatanten forsiktig for ikke å forstyrre pelletsen.Resuspend pellets i avansert DMEM F12. Snurr røret igjen og aspirer supernatanten uten å forstyrre pelletsen. Tilsett det beregnede volumet av solubilisert ekstracellulær membranmatrise i prøverøret.Vær forsiktig når du fjerner medier for ikke å miste cellepellet. Når du legger til en ekstracellulær membranmatrise, pipette sakte for ikke å skape overdreven bobler i organoid suspensjon. Oppbevar prøven med den oppslående ekstracellulære membranmatrisen på is og frø suspensjonen midt i brønnene slik at den solubiliserte ekstracellulære membranmatrisen danner en kuppellignende struktur.Transporter platen til en inkubator og la den solubiliserte ekstracellulære membranmatrisen størkne i 30 minutter. Bland ROCK-hemmer og GSK3 beta i komplette medier med vekstfaktorer og tilsett 500 mikroliter av denne løsningen til hver brønn. Plasser platen i inkubatoren.Hundens organoidprotokoll genererer vanligvis ca. 50 000 til 150 000 tarm- eller leverceller per brønn. Etter stamcelleisolasjon starter leverhundorganoider livssyklusen som ekspanderende sfæroider, og etter syv dager blir de til spirende og differensierende organoider. Volumet, overflatearealet, 2D-ellipseområdet og omkretsen av sfæroidene ble beregnet.2D ellipseområde og omkrets ble brukt til å vurdere organoidkulturens helse. Vurdering av uttrykket av markørene på en semi-kvantitativ måte viste at sfæroidene fortrinnsvis uttrykte cholangiocyttmarkøren KRT7 fra en til 26%Stamcellemarkøren LGR5-uttrykket varierte mellom 0,17 og 0,78 %mens hepatocyttmarkører ble uttrykt i lavere grad ved 0,05 til 0,34 % for Gaffeltrøyeboks 1A og 0,03 til 0,28 % for cytokrom-P450. En 12-minutters inkubasjon med trypsinlignende protease hemmet ikke organoid vekst.Veksten av organoider ble imidlertid negativt påvirket ved hjelp av en 24-minutters inkubasjon. Overlevelsen av leverorganoider av hunder i et ugunstig miljø ble analysert for å bestemme volumet av organoidmedier og kjellermatrise som trengs for leverorganoiders vellykkede vekst og overlevelse. Overlevelsesraten for organoider varierte fra 12,9 dager til 18 dager.Grunnleggende cellekulturteknikker og aseptiske tilnærminger er de viktigste forutsetningene for riktig organoidisolasjon og vedlikehold.

Research

JoVE Journal

Medicine

In Vivo Canine Muscle Function Assay

In Vivo Canine Muscle Function Assay

We describe a minimally-invasive and reproducible method to measure canine pelvic limb muscle strength and muscle response to repeated eccentric 
...

Generation of Alginate Microspheres for Biomedical Applications

Generering av Alginat Mikrokuler for biomedisinske applikasjoner

Alginate-based materials have received considerable attention for biomedical applications because of their hydrophilic nature, biocompatibility, and ...

The Bovine Lung in Biomedical Research: Visually Guided Bronchoscopy, Intrabronchial Inoculation and In Vivo Sampling Techniques

The Bovine Lung in Biomedical Research: Visually Guided Bronchoscopy, Intrabronchial Inoculation and In Vivo Sampling Techniques

Den Bovine Lung i biomedisinsk forskning: Visuelt Guidet Bronkoskopi, intrabronkial Pode og<em&gt; I Vivo</em&gt; sampling teknikker

There is an ongoing search for alternative animal models in research of respiratory medicine. Depending on the goal of the research, large animals as ...

Use of a Low-flow Digital Anesthesia System for Mice and Rats

Bruk av en lav-flow Digital Anestesi System for mus og rotter

A traditional vaporizer depends on flowing gas and atmospheric pressure for passive anesthetic vaporization. Newly developed direct injection vaporizers ...

Forskolin-induced Swelling in Intestinal Organoids: An In Vitro Assay for Assessing Drug Response in Cystic Fibrosis Patients

Forskolin-induced Swelling in Intestinal Organoids: An In Vitro Assay for Assessing Drug Response in Cystic Fibrosis Patients

Forskolin-indusert Hevelse i tarmen Organoids: An<em&gt; In Vitro</em&gt; Analyse for å vurdere Drug Response i pasienter med cystisk fibrose

Recently-developed cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR)-modulating drugs correct surface expression and/or function of the mutant ...

Optimized Analysis of In Vivo and In Vitro Hepatic Steatosis

Optimized Analysis of In Vivo and In Vitro Hepatic Steatosis

Optimalisert Analyse av<em&gt; I Vivo</em&gt; og<em&gt; In Vitro</em&gt; Leversteatose

Establishing a system of procedures to qualitatively and quantitatively characterize in vivo and in vitro hepatic steatosis is important for metabolic ...

Improvement of a Closed Chest Porcine Myocardial Infarction Model by Standardization of Tissue and Blood Sampling Procedures

Forbedring av en lukket kiste svin hjerteinfarkt modell av standardisering av vev og blod utvalgstrekking

Myocardial ischemia reperfusion (I/R) injury contributes to almost half of the necrotic area after myocardial infarction. To date there is no approved ...

Generation of Human 3D Lung Tissue Cultures (3D-LTCs) for Disease Modeling

Generation of Human 3D Lung Tissue Cultures 3D-LTCs for Disease Modeling

Generasjon av menneskelig 3D lungevev kulturer (3D-LTCs) for sykdom modellering

Translation of novel discoveries to human disease is limited by the availability of human tissue-based models of disease. Precision-cut lung slices (PCLS) ...

Use of 3D Robotic Ultrasound for In Vivo Analysis of Mouse Kidneys

Use of 3D Robotic Ultrasound for In Vivo Analysis of Mouse Kidneys

Bruk av 3D robot ultralyd for in vivo analyse av mus nyrer

Common modalities for in vivo imaging of rodents include positron emission tomography (PET), computed tomography (CT), magnetic resonance imaging (MRI), ...

Standardizing the Responses to Platelet Agonist Collagen-Related Peptide

Reproducibility and Harmonization in Research Using Biological Standards: The Example of Platelet Agonist Collagen-Related Peptide

Biological Standardization to Ensure Reproducibility and Harmonization in Research (Video) | JoVE

Reproduserbarhet og harmonisering i forskning ved hjelp av biologiske standarder: eksemplet på blodplateagonist kollagenrelatert peptid

Metrology - the science of measure - is a subject few biological scientists are taught about in their training to their detriment; the application of ...