Name: standardization and maintenance of 3d canine hepatic and intestinal organoid cultures for use in biomedical research
Uploaded: 2022-01-31T15:00:00
Duration: 8 min 39 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Standardization and Maintenance of 3D Canine Hepatic and Intestinal Organoid Cultures for Use in Biomedical Research at JoVE.com

Авторы хотят выразить благодарность сотрудникам Ветеринарно-диагностической лаборатории Университета штата Айова, а именно Хейли М. Ламберт, Эмили Рахе, Розалин М. Бранаман, Виктории Дж. Авторы хотели бы отметить поддержку со стороны Faculty Startup, ISU VPR Miller Award, ISU VPR Miller Award и NSF SBIR sub-award ISU # 1912948.

<ol>
	<li>Hickman, D. L., Johnson, J., Vemulapalli, T. H., Crisler, J. R., Shepherd, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Commonly+used+animal+models.">Commonly used animal models.</a> Principles of Animal Research for Graduate and Undergraduate Students. , 117-175 (2017).</li><li>De Jong, M., Maina, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Of+mice+and+humans:+Are+they+the+same?+-+Implications+in+cancer+translational+research.">Of mice and humans: Are they the same? - Implications in cancer translational research.</a> Journal of Nuclear Medicine. 51 (4), 501-504 (2010).</li><li>Cannarozzi, G., Schneider, A., Gonnet, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+phylogenomic+study+of+human,+dog,+and+mouse.">A phylogenomic study of human, dog, and mouse.</a> PLoS Computational Biology. 3 (1), 0009-0014 (2007).</li><li>Jacob, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Researchers+turn+to+canine+clinical+trials+to+advance+cancer+therapies.">Researchers turn to canine clinical trials to advance cancer therapies.</a> JAMA - Journal of the American Medical Association. 315 (15), 1550-1552 (2016).</li><li>Ziegler, A., Gonzalez, L., Blikslager, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large+animal+models:+The+key+to+translational+discovery+in+digestive+disease+research.">Large animal models: The key to translational discovery in digestive disease research.</a> Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 2 (6), 716-724 (2016).</li><li>Swanson, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phylogenetic+and+gene-centric+metagenomics+of+the+canine+intestinal+microbiome+reveals+similarities+with+humans+and+mice.">Phylogenetic and gene-centric metagenomics of the canine intestinal microbiome reveals similarities with humans and mice.</a> ISME Journal. 5 (4), 639-649 (2011).</li><li>Coelho, L. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Similarity+of+the+dog+and+human+gut+microbiomes+in+gene+content+and+response+to+diet.">Similarity of the dog and human gut microbiomes in gene content and response to diet.</a> Microbiome. 6 (1), 72 (2018).</li><li>Nguyen, T. L. A., Vieira-Silva, S., Liston, A., Raes, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+informative+is+the+mouse+for+human+gut+microbiota+research.">How informative is the mouse for human gut microbiota research.</a> DMM Disease Models and Mechanisms. 8 (1), 1-16 (2015).</li><li>Bontempo, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nutrition+and+health+of+dogs+and+cats:+Evolution+of+petfood.">Nutrition and health of dogs and cats: Evolution of petfood.</a> Veterinary Research Communications. 29, 45-50 (2005).</li><li>Allenspach, K., Gaschen, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Canine+chronic+enteropathies:+A+review.">Canine chronic enteropathies: A review.</a> Schweizer Archiv fur Tierheilkunde. 145 (5), 209-222 (2003).</li><li>Tribuddharatana, T., Kongpiromchean, Y., Sribhen, K., Sribhen, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biochemical+alterations+and+their+relationships+with+the+metabolic+syndrome+components+in+canine+obesity.">Biochemical alterations and their relationships with the metabolic syndrome components in canine obesity.</a> Kasetsart Journal - Natural Science. 45 (4), 622-628 (2011).</li><li>Chandra, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derivation+of+adult+canine+intestinal+organoids+for+translational+research+in+gastroenterology.">Derivation of adult canine intestinal organoids for translational research in gastroenterology.</a> BMC Biology. 17 (1), 33 (2019).</li><li>Schaefer, K., Rensing, S., Hillen, H., Burkhardt, J. E., Germann, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Is+Science+the+only+driver+in+species+selection?+An+internal+study+to+evaluate+compound+requirements+in+the+minipig+compared+to+the+dog+in+preclinical+studies.">Is Science the only driver in species selection? An internal study to evaluate compound requirements in the minipig compared to the dog in preclinical studies.</a> Toxicologic Pathology. 44 (3), 474-479 (2016).</li><li>MacArthur Clark, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+3Rs+in+research:+A+contemporary+approach+to+replacement,+reduction+and+refinement.">The 3Rs in research: A contemporary approach to replacement, reduction and refinement.</a> British Journal of Nutrition. 120, 1-7 (2018).</li><li>Schneider, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Model-based+reverse+translation+between+veterinary+and+human+medicine:+The+one+health+initiative.">Model-based reverse translation between veterinary and human medicine: The one health initiative.</a> CPT: Pharmacometrics and Systems Pharmacology. 7 (2), 65-68 (2018).</li><li>Lehmann, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+organoids:+A+new+dimension+in+cell+biology.">Human organoids: A new dimension in cell biology.</a> Molecular Biology of the Cell. 30 (10), 1129-1137 (2019).</li><li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+Lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche.">Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).</li><li>Kim, J., Koo, B. K., Knoblich, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+organoids:+model+systems+for+human+biology+and+medicine.">Human organoids: model systems for human biology and medicine.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 21 (10), 571-584 (2020).</li><li>Jensen, C., Teng, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Is+it+time+to+start+transitioning+from+2D+to+3D+cell+culture.">Is it time to start transitioning from 2D to 3D cell culture.</a> Frontiers in Molecular Biosciences. 7, 33 (2020).</li><li>Ho, B. X., Pek, N. M. Q., Soh, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disease+modeling+using+3D+organoids+derived+from+human+induced+pluripotent+stem+cells.">Disease modeling using 3D organoids derived from human induced pluripotent stem cells.</a> International Journal of Molecular Sciences. 19 (4), 936 (2018).</li><li>Truskey, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+microphysiological+systems+and+organoids+as+in+vitro+models+for+toxicological+studies.">Human microphysiological systems and organoids as in vitro models for toxicological studies.</a> Frontiers in Public Health. 6, 185 (2018).</li><li>Caipa Garcia, A. L., Arlt, V. M., Phillips, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoids+for+toxicology+and+genetic+toxicology:+applications+with+drugs+and+prospects+for+environmental+carcinogenesis.">Organoids for toxicology and genetic toxicology: applications with drugs and prospects for environmental carcinogenesis.</a> Mutagenesis. , (2021).</li><li>Augustyniak, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoids+are+promising+tools+for+species-specific+in+vitro+toxicological+studies.">Organoids are promising tools for species-specific in vitro toxicological studies.</a> Journal of Applied Toxicology. 39 (12), 1610-1622 (2019).</li><li>Zietek, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoids+to+study+intestinal+nutrient+transport,+drug+uptake+and+metabolism+-+Update+to+the+human+model+and+expansion+of+applications.">Organoids to study intestinal nutrient transport, drug uptake and metabolism - Update to the human model and expansion of applications.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 577656 (2020).</li><li>Zietek, T., Rath, E., Haller, D., Daniel, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+organoids+for+assessing+nutrient+transport,+sensing+and+incretin+secretion.">Intestinal organoids for assessing nutrient transport, sensing and incretin secretion.</a> Scientific Reports. 5 (1), 1-10 (2015).</li><li>Kar, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoids:+a+promising+new+in+vitro+platform+in+livestock+and+veterinary+research.">Organoids: a promising new in vitro platform in livestock and veterinary research.</a> Veterinary Research. 52 (1), 1-17 (2021).</li><li>Borcherding, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sa1976+polyphenols+reverse+the+pathologic+effects+of+palmitic+acid+and+high+fat+diet+in+canine+enteroids.">Sa1976 polyphenols reverse the pathologic effects of palmitic acid and high fat diet in canine enteroids.</a> Gastroenterology. 158 (6), 486 (2020).</li><li>Ambrosini, Y. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recapitulation+of+the+accessible+interface+of+biopsy-derived+canine+intestinal+organoids+to+study+epithelial-luminal+interactions.">Recapitulation of the accessible interface of biopsy-derived canine intestinal organoids to study epithelial-luminal interactions.</a> PLoS ONE. 15 (4), 0231423 (2020).</li><li>Zdyrski, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Su124+homology+directed+repair+in+canine+duodenal+enteroids+to+mimic+the+wild-type+P-glycoprotein+mutation.">Su124 homology directed repair in canine duodenal enteroids to mimic the wild-type P-glycoprotein mutation.</a> Gastroenterology. 160 (6), 625 (2021).</li><li>Li, Y., Tang, P., Cai, S., Peng, J., Hua, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoid+based+personalized+medicine:+from+bench+to+bedside.">Organoid based personalized medicine: from bench to bedside.</a> Cell Regeneration. 9 (1), 21 (2020).</li><li>Kurr, L. A., Allenspach, K., Jergens, A., Mochel, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Harnessing+the+biology+of+intestinal+organoids+to+accelerate+drug+discovery+in+inflammatory+bowel+disease:+A+one+health+approach.">Harnessing the biology of intestinal organoids to accelerate drug discovery in inflammatory bowel disease: A one health approach.</a> The FASEB Journal. 34, 1 (2020).</li><li>Nantasanti, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disease+modeling+and+gene+therapy+of+copper+storage+disease+in+canine+hepatic+organoids.">Disease modeling and gene therapy of copper storage disease in canine hepatic organoids.</a> Stem Cell Reports. 5 (5), 895-907 (2015).</li><li>Favier, R. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=COMMD1-Deficient+dogs+accumulate+copper+in+hepatocytes+and+provide+a+good+model+for+chronic+hepatitis+and+fibrosis.">COMMD1-Deficient dogs accumulate copper in hepatocytes and provide a good model for chronic hepatitis and fibrosis.</a> PLoS ONE. 7 (8), 42158 (2012).</li><li>Kruitwagen, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+survival+of+transplanted+autologous+canine+liver+organoids+in+a+COMMD1-deficient+dog+model+of+metabolic+liver+disease.">Long-term survival of transplanted autologous canine liver organoids in a COMMD1-deficient dog model of metabolic liver disease.</a> Cells. 9 (2), 410 (2020).</li><li>Vilgelm, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fine-needle+aspiration-based+patient-derived+cancer+organoids.">Fine-needle aspiration-based patient-derived cancer organoids.</a> iScience. 23 (8), 101408 (2020).</li><li>Saxena, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+intestinal+enteroids:+A+new+model+to+study+human+rotavirus+infection,+host+restriction,+and+pathophysiology.">Human intestinal enteroids: A new model to study human rotavirus infection, host restriction, and pathophysiology.</a> Journal of Virology. 90 (1), 43-56 (2016).</li><li>VanDussen, K. L., Sonnek, N. M., Stappenbeck, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=L-WRN+conditioned+medium+for+gastrointestinal+epithelial+stem+cell+culture+shows+replicable+batch-to-batch+activity+levels+across+multiple+research+teams.">L-WRN conditioned medium for gastrointestinal epithelial stem cell culture shows replicable batch-to-batch activity levels across multiple research teams.</a> Stem Cell Research. 37, 101430 (2019).</li><li>Powell, R. H., Behnke, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=WRN+conditioned+media+is+sufficient+for+in+vitro+propagation+of+intestinal+organoids+from+large+farm+and+small+companion+animals.">WRN conditioned media is sufficient for in vitro propagation of intestinal organoids from large farm and small companion animals.</a> Biology Open. 6 (5), 698-705 (2017).</li><li>Mackenzie, J. S., Jeggo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+one+health+approach-why+is+it+so+important.">The one health approach-why is it so important.</a> Tropical Medicine and Infectious Disease. 4 (2), 88 (2019).</li><li>Artegiani, B., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+and+application+of+3D-organoid+technology.">Use and application of 3D-organoid technology.</a> Human Molecular Genetics. 27 (2), 99-107 (2018).</li></ol>

К. Алленспах является соучредителем LifEngine Animal Health и 3D Health Solutions. Она является консультантом Ceva Animal Health, Bioiberica, LifeDiagnostics, Antech Diagnostics, Deerland Probiotics и Mars. J. P. Mochel является соучредителем LifEngine Animal Health и 3D Health Solutions. Д-р Мочел является консультантом Ceva Animal Health и Ethos Animal Health. Другие авторы не имеют каких-либо конфликтов интересов, чтобы заявить.

В настоящее время отсутствуют стандартизированные протоколы для выделения и поддержания собачьих печеночных и кишечных органоидов. Установление стандартных операционных процедур для органоидных культур является оправданным для того, чтобы эта модель была применима в различных лабораторных условиях. В частности, предоставление стандартизированных рабочих протоколов для культивирования этих собачьих органоидных моделей является ключом к характеристике нормального роста органоидов во время культивирования и прохождения для получения оптимальных временных точек для расширения и поддержания. Органоиды кишечника собак, культивируемые с использованием протокола, ранее характеризовались Chandra et al.12.
Одним из наиболее важных шагов протокола является прохождение органоидов. Оптимальное время для первого прохождения печеночных сфероидов было определено на 7 день после выделения на основе измерений печеночных сфероидов. Максимальный объем сфероидов был достигнут к 7 дню, и в это же время сфероиды начали бутонироваться и образовали печеночные органоиды. Увеличение общего объема органоидов со 2-7 дня после выделения составило более 365 раз, что говорит о том, что оптимальное время прохождения дольше, чем у кишечных органоидных культур. После 7 дней в культуре не наблюдалось грубых признаков клеточного апоптоза в печеночном сфероиде даже без очистки или пассирования (рисунок 7). Прохождение кишечных и печеночных органоидов может быть сложной задачей, поскольку процедура может привести к потере клеток и изменению жизнеспособности. Результаты свидетельствуют о том, что длительная инкубация печеночных органоидов трипсин-подобной протеазой (до 12 мин) не оказывает негативного влияния на субкультуру. Инкубация органоидов в трипсин-подобной протеазе в течение более 24 мин может нанести ущерб последующей субкультуре органоидов.
В случае субоптимального разрушения в клеточных кластерах с органоидным проходом, механическая диссоциация вместо длительной инкубации с трипсин-подобной протеазой может быть более полезной. Если возникают проблемы с надлежащей диссоциацией органоидов, может быть предпринята попытка кратковременного вихря образцов для повышения выхода прохода. С другой стороны, вихрь может разрушить культуру и повредить клетки, поэтому его следует использовать только тогда, когда другие процедуры неоднократно терпели неудачу. Разрушение печеночных органоидов на отдельные клетки снижает скорость роста органоидов, в то время как разбивание их на кластеры клеток может значительно улучшить их жизнеспособность. Десять минут было выбрано в качестве инкубационного времени для органоидного протокола. 12-минутная инкубационная точка считалась нецитотоксичной по сравнению с 24-минутной инкубацией в эксперименте с трипсин-подобной протеазой.
Эксперимент по живучести подтвердил, что собачьи печеночные органоиды могут выживать до 19,5 дней в неблагоприятных условиях (структурное и пищевое истощение). Органоиды, которые пережили эти условия дольше всего, культивировались средой CMGF+. Это наблюдение, возможно, было вызвано более медленным ростом печеночных органоидов в средах, не дополненных ингибитором Rock и GSK3β. Органоидные культуры с CMGF + R / G росли быстрее и, возможно, быстрее истощали свои ресурсы. Этот эксперимент открывает возможности миниатюризации собачьей органоидной культуры для достижения высокопроизводительного преобразования системы. Такая технология показывает потенциал для облегчения открытия лекарств или токсикологических исследований при значительно сниженных затратах.
Некоторые распространенные проблемы, возникающие во время поддержания культуры органоидов собак, - это неправильное затвердевание образца при покрытии, загрязнение культуры и установление надлежащей плотности и размера органоидов. Если солюбилизированный ECM преждевременно затвердевает во время покрытия, немедленно поместите его на лед на 10 минут. Если солюбилизированный ECM не образует куполообразных структур, вполне вероятно, что из образца было удалено недостаточно сред. Если это так, разбавьте образец более солюбилизированным ECM до тех пор, пока не образуются купола.
Когда грибковое или бактериальное загрязнение обнаружено во всей пластине (см. Рисунок 4), лучшим решением является выброс пластины. Лечение противогрибковыми или антибиотическими препаратами можно попробовать, но успех такой попытки крайне низок. Если одна скважина загрязнена плитой, жизнеспособные и незатронутые скважины могут быть очищены (выполните шаги 4.1-4.5) на новой плите и тщательно контролироваться. Если образец уже был заморожен в экстренном порядке, рекомендуется выбросить весь образец, так как размораживание образца подвергает инкубатор дополнительному риску загрязнения.
Здоровая органоидная культура должна быть, по крайней мере, в категории среднего размера и средней плотности или больше. Оптимальная плотность имеет решающее значение для роста органоидной культуры. Более низкая плотность должна быть скорректирована путем очистки органоидов до средней плотности. Если возникает ситуация экстремальной плотности (перенаселенность), органоиды следует расширить до большего количества скважин. Грубые признаки клеточного апоптоза часто сопровождают как перенаселенность, так и низкую плотность органоидной культуры. Если эти проблемы не будут исправлены вовремя, вся органоидная культура превратится в апоптотическую в течение нескольких дней. Если органоиды достигают очень большого размера или очень высокой плотности, культуру следует использовать для эксперимента, замораживания или фиксации.
Органоидная среда в настоящее время содержит 17 компонентов, и поэтому добавление факторов роста, необходимых для поддержания и расширения органоидов, может быть дорогостоящим. Эта проблема может быть решена путем выращивания 2D-клеточных культур, которые синтезируют факторы роста для получения условного CMGF+. Клеточная культура L-WRN продуцирует факторы роста Wnt-3a, R-Spondin-3 и Noggin37. Клеточная колония использует 90% DMEM/F12 и 10% питательных сред FBS. Когда культура достигает 90-процентного слияния, среду собирают каждый день в течение 1 недели. Собранную среду затем смешивают с 2x CMGF+ (без этих факторов роста). В то время как 2D-культуры могут производить необходимые факторы роста за небольшую часть стоимости, необходимо ожидать дополнительного времени и подготовки к производству среды. Концентрации факторов роста между партиями условных сред также могут различаться37,38.
Органоидные культуры взрослых собак, полученные из стволовых клеток, являются уникальной биомедицинской моделью, которая может помочь в достижении целей инициативы «Единое здоровье»39. Органоидная технология может быть использована во многих областях фундаментальных и биомедицинских исследований, охватывающих от биологии развития, патофизиологии, открытия и тестирования лекарств, токсикологии до изучения инфекционных заболеваний и регенеративной медицины40. Трансляционные и обратные трансляционные исследования являются областями, в которых применимы собачьи органоиды15. Собаки веками использовались в трансляционных экспериментальных условиях, и их статус животного-компаньона также облегчил их положение как одного из наиболее изученных видов в ветеринарии.
В заключение, эта рукопись содержит стандартизированные операционные протоколы для выделения, обслуживания, сбора и биобанкинга собачьих печеночных и кишечных органоидов, чтобы облегчить применение этой модели в различных биомедицинских областях. Эта модель уникально подходит для содействия обратным трансляционным исследованиям в качестве инструмента инициативы «Единое здоровье» для содействия меж- и внутридисциплинарному обмену знаниями.

Грызуны являются наиболее часто используемой животной моделью для биомедицинских и трансляционных исследований1. Они исключительно полезны для исследования основного молекулярного патогенеза заболеваний, хотя их клиническая значимость для хронических многофакторных заболеваний недавно была поставлена под сомнение2. Собачья модель демонстрирует ряд преимуществ по сравнению с грызунами3,4. Собаки и люди имеют сходство в метаболомике и кишечном микробиоме, которые развивались из-за потребления рациона человека в течение различных периодов их одомашнивания5,6,7. Сходство между анатомией и физиологией желудочно-кишечного тракта собак и человека является еще одним из примеров8.
Кроме того, собаки часто разделяют схожую среду и образ жизни со своими владельцами9. Более длительная продолжительность жизни собак по сравнению с грызунами позволяет естественным образом развивать многочисленные хронические состояния10. Воспалительные заболевания кишечника или метаболический синдром являются примерами многофакторных хронических заболеваний, которые имеют важное сходство между людьми и собаками11,12. Доклинические испытания собак, в которых участвуют собаки с естественными заболеваниями, могут генерировать более надежные данные, чем те, которые получены от моделей грызунов13. Однако, чтобы свести к минимуму использование исследований на живых животных и соответствовать принципам 3R (Reduce, Refine, Replace)14, появились альтернативы тестированию in vivo с использованием 3D-органоидов собак in vitro15.
Органоиды представляют собой самосборные 3D-структуры, полученные из стволовых клеток, которые повторяют физиологию и микроанатомию своих исходных органов16,17. Эта технология была впервые описана Sato et al. в 200917 году и позволила проводить более транслируемые исследования in vitro в эпителиальных клеточных линиях, чем это было ранее возможно с использованием 2D-культур раковых клеток18,19,20. Органоиды являются полезными моделями in vitro во многих биомедицинских дисциплинах, таких как доклинические токсикологические21,22,23, исследования абсорбции или метаболизма24,25,26,27,28, а также в персонализированных медицинских подходах29,30,31 . Успешная культура органоидов кишечника собак была впервые описана в 201912 году, в то время как печеночные органоиды, полученные от собаки, были впервые зарегистрированы Nantasanti et al. в 201532 году. С тех пор органоиды собак успешно используются в исследованиях, изучающих хронические энтеропатии собак, стромальные опухоли желудочно-кишечного тракта, колоректальную аденокарциному12 и болезнь Вильсона33,34.
В то время как взрослые стволовые клетки могут быть собраны с помощью некропсии, органоидная технология не всегда требует жертвоприношения животных. Эндоскопические и лапароскопические биопсии или даже тонкоигольные аспираты органов35 являются жизнеспособным источником взрослых стволовых клеток для выделения эпителиальных органоидов12. Широкое использование таких неинвазивных методов в ветеринарной практике облегчает варианты обратных трансляционных исследований (перевод информации из ветеринарной клинической практики в клиническую практику человека и наоборот)15. Дальнейшее развитие органоидной технологии может быть обеспечено стандартизацией органоидной культуры и методов поддержания. Представленный здесь органоидный протокол частично основан на ранее опубликованной работе Saxena et al. от 201536 года, и методы были адаптированы к специфике кишечной и печеночной органоидной культуры. Общий рабочий процесс протоколов органоидов собак показан на рисунке 1.
Протокол изоляции органоидов собак вводит методы получения образцов из эндоскопических, лапароскопических и хирургических биопсий, а также некропсий. В нем описывается первоначальная предварительная обработка образцов тканей и методологии, используемые для транспортировки в лабораторию. Материалы и реагенты, необходимые для выделения органоидов, обобщены в разделе «Подготовка к изоляции». Далее подробно описан процесс выделения взрослых стволовых клеток из образцов тканей. Наконец, обсуждается процесс обшивки органоидов в куполообразные структуры с использованием солюбилизированного внеклеточного мембранного матрикса.
Второй протокол, Протокол поддержания органоидов собак, описывает методы документирования и культивирования органоидов. Изменения в СМИ и их частота обсуждаются в этом разделе. Кроме того, описаны лабораторные процедуры, такие как прохождение и очистка клеточных культур, которые необходимы для обеспечения успешного поддержания 3D-органоидов собак. Соответствующая проходка является критическим этапом протокола, и возможные корректировки и устранение неполадок этого шага обсуждаются далее в рукописи.
Последний протокол - это протокол извлечения органоидов собак и протокол биобанкинга, содержащий методы подготовки полноценных органоидов для встраивания парафина и сохранения РНК. Здесь также описаны способы биобанковских органоидных образцов в хранилище жидкого азота. Наконец, обсуждаются способы размораживания замороженных образцов и поддержки их роста.
В заключение, эта статья направлена на обеспечение последовательных процедур культивирования органоидов собак путем стандартизации межлабораторных протоколов. При этом рукопись направлена на облегчение воспроизводимости данных, полученных из собачьих органоидных моделей, чтобы повысить их актуальность в трансляционных биомедицинских исследованиях.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63515/63515fig01.jpg"> Рисунок 1: Рабочий процесс протоколов органоидов собак. Протокол изоляции органоидов собак описывает подготовку материалов, необходимых для выделения органоидов, извлечение образца ткани (с помощью некропсии, эндоскопической, лапароскопической и хирургической биопсии) и руководство по диссоциации клеток и покрытию клеточной популяции. Протокол поддержания органоидов собак обсуждает очистку и прохождение культуры органоидов. В Протоколе извлечения органоидов и биобанкинга обсуждается подготовка образцов органоидов для встраивания парафина и дальнейшая характеристика органоидов. Также обсуждаются способы биобанка органоидных культур и восстановления их из хранения в жидком азоте. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63515/63515fig01large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Chelating solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Sorbitol</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>BP439-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT</td>
			<td>Promega</td>
			<td>V3151</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>P217-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P5655-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4-2H2O</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S5136-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>S271-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen Strep</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>S5-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Organoid media</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>[Leu15]-Gastrin I human</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G9145-.5MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A-83-01</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>9094360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Advanced DMEM/F12</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12634-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17504-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Corning</td>
			<td>35-010-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamax</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>VWR Life Science</td>
			<td>J848-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human R-Spondin-1</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>120-38-500UG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Murine EGF</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>315-09-1MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Murine Noggin</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>250-38-250UG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Murine Wnt-3a</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>315-20-10UG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2 supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17502-048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-Acetyl-L-cysteine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9165-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nicotinamide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>N0636-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primocin</td>
			<td>InvivoGen</td>
			<td>ant-pm-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ROCK inhibitor (Y-27632)</td>
			<td>EMD Millipore Corp.</td>
			<td>SCM 075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SB202190 (P38 inhibitor)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S7067-25MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stemolecule CHIR99021 (GSK3&#946;)</td>
			<td>Reprocell</td>
			<td>04-0004-base</td>
			<td></td>
		</tr>
		
		<tr>
			<td>Trimethoprim</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T7883-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfamethoxazole</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7507-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic Acid, Glacial</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>A38-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl Sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Fisher Chemicals</td>
			<td>D128-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA, pH 8.0, 0.5 M</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15575-038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde (37%)</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>F79P-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G5882</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel Matrix For Organoid Culture</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356255</td>
			<td>Extracellular Membrane Matrix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde, 97%</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>A11313</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS, 1X (Phosphate-Buffered Saline)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-040-CM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS, 1X (Phosphate-Buffered Saline)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-040-CM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAlater Soln.</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM7021</td>
			<td>RNA Storage Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Express</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12604-021</td>
			<td>Trypsin-like Protease</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Other</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 Well Cell Culture Plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ACD Hybez II Hybridization System</td>
			<td>ACD a biotechne brand</td>
			<td>321710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge Tube, 15 mL</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430766</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CoolCell LX</td>
			<td>Corning</td>
			<td>BCS-405MC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryogenic Vials</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430488</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Centrifuge Tube (50 mL)</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>05-539-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GyroMini Nutating mixer (Rocker)</td>
			<td>Labnet</td>
			<td>S0500-230V-EU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat Bath</td>
			<td>Lab-Line Instruments</td>
			<td>3000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mr. Frosty Freezing Container</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>5100-0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop 2000</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>ND2000CLAPTOP</td>
			<td>SpectrophotometerAnalysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Panasonic incubator</td>
			<td>Panasonic</td>
			<td>MCO-170ML-PA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm M Wrapping Film</td>
			<td>Bemis Company Inc</td>
			<td>PM996/EMD</td>
			<td>Laboratory Flexible Film Tape</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protected Disposable Scalpels</td>
			<td>Bard-Parker</td>
			<td>239844</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAscope 2.5 HD Assay &#8211; RED</td>
			<td>ACD a biotechne brand</td>
			<td>322350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAscope H2O2 &#38; Protease Plus Reagents</td>
			<td>ACD a biotechne brand</td>
			<td>322330</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAscope Target Retrieval Reagents</td>
			<td>ACD a biotechne brand</td>
			<td>322000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAscope Wash Buffer Reagents</td>
			<td>ACD a biotechne brand</td>
			<td>310091</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Culture Dish</td>
			<td>Dot Scientific</td>
			<td>6676621</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Culture Plate 24 wells</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>FB012929</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

standardization and maintenance of 3d canine hepatic and intestinal organoid cultures for use in biomedical research

У собак развиваются сложные многофакторные заболевания, аналогичные человеческим, включая воспалительные заболевания, метаболические заболевания и рак. Поэтому они представляют собой актуальные модели крупных животных с трансляционным потенциалом для медицины человека. Органоиды представляют собой 3-мерные (3D), самосборные структуры, полученные из стволовых клеток, которые имитируют микроанатомию и физиологию их органа происхождения. Эти трансляционные модели in vitro могут быть использованы для применения проницаемости лекарств и обнаружения, токсикологической оценки, а также для обеспечения механистического понимания патофизиологии многофакторных хронических заболеваний. Кроме того, собачьи органоиды могут улучшить жизнь собак-компаньонов, обеспечивая вклад в различные области ветеринарных исследований и облегчая персонализированное применение лечения в ветеринарии. Небольшая группа доноров может создать биобанк образцов органоидов, уменьшая потребность в непрерывном извлечении тканей, поскольку линии органоидных клеток могут быть субкультурированы бесконечно. Здесь представлены три протокола, которые фокусируются на культуре кишечных и печеночных собачьих органоидов, полученных из взрослых стволовых клеток. Протокол изоляции органоидов собак описывает методы обработки ткани и встраивания клеточного изолята в поддерживающий матрикс (солюбилизированный внеклеточный мембранный матрикс). Протокол поддержания органоидов собак описывает рост и поддержание органоидов, включая очистку и пассаж, а также соответствующее время для расширения. Протокол извлечения органоидов и биобанкинга описывает способы извлечения, замораживания и сохранения органоидов для дальнейшего анализа.

Watch this Scientific Journal Video about Standardization and Maintenance of 3D Canine Hepatic and Intestinal Organoid Cultures for Use in Biomedical Research at JoVE.com

Standardization and Maintenance of 3D Canine Hepatic and Intestinal Organoid Cultures for Use in Biomedical Research

Описаны экспериментальные методы извлечения взрослых стволовых клеток из тканей кишечника и печени собак для создания 3D органоидных культур. Кроме того, обсуждаются лабораторные методы для обеспечения последовательного роста и обеспечения стандартных операционных процедур для сбора, биобанка и возрождения кишечных и печеночных органоидных культур.

Стандартизация и поддержание 3D-культур печеночных и кишечных органоидов собак для использования в биомедицинских исследованиях

Dogs develop complex multifactorial diseases analogous to humans, including inflammatory diseases, metabolic diseases, and cancer. Therefore, they ...

Протоколы культивирования собачьих печеночных и кишечных органоидов важны для стандартизации этой новой технологии. Этот метод позволяет надежно и воспроизводимо создавать органоидную культуру собак, включая выделение органоидов, поддержание, сбор и последующее биобанкование образцов. Органоиды собак могут обеспечить отличную модель для многочисленных применений, охватывающих биологию, развитие инфекционных заболеваний, тестирование и открытие лекарств, а также медицину передачи.Для начала приготовьте пять 15-миллилитров центрифужных трубок с пятью миллилитрами 1X полного хелатирующего раствора, одну трубку с тремя миллилитрами 1X полного хелатирующего раствора, одну пустую трубку и одну трубку с пятью миллилитрами 1X полного хелатирующего раствора и двумя миллилитрами фетальной бычьей сыворотки. В день изоляции поместите в шкаф биобезопасности стерильную чашку Петри, скальпель, ведро со льдом и холодную питательную смесь DMEM F12. Поместите необходимое количество 24-луночной пластины для культивирования клеток в углекислый инкубатор для предварительного нагрева.Поместите солюбилизированный внеклеточный мембранный матрикс на лед для оттаивания. Предварительно охладите центрифугу до четырех градусов Цельсия. Переместите полную среду с факторами роста из морозильной камеры на водяную баню 37 градусов цельсия, избегая прямого воздействия света.Встряхните образцы тканей в транспортной трубке в течение 30 секунд. Удалите избыток супернатанта, не отбрасывая какую-либо ткань, путем медленного пипетирования вблизи поверхности жидкости до тех пор, пока в трубке не останется 0,5 миллилитра. Перенесите ткань и оставшийся супернатант в стерильную чашку Петри.Используя одноразовый скальпель, разрежьте и измельчите ткань на более мелкие кусочки, напоминающие консистенцию пюре, в течение примерно пяти минут. Пипетка измельченной ткани жидкостью из чашки Петри в первую полную пробирку с хелатирующим раствором, затем добавьте два миллилитра усовершенствованной питательной смеси DMEM F12 в чашку Петри. Промыть оставшуюся ткань и перенести в первый полный хелатирующий раствор трубку.Вихрь 1X полный хелатирующий раствор трубки примерно пять раз в течение пяти секунд. Дайте биопсии осесть на дне трубки в течение одной минуты и удалите супернатант до тех пор, пока не останется пять миллилитров. Перенесите 1X полный хелатирующий раствор из новой трубки в пробирку.Повторите предыдущий шаг для следующих двух трубок. И на последних двух смывах удалите супернатант до трех миллилитров, оставшихся в трубке. Перенесите биопсию и 1X полный хелатирующий раствор из пробирки в одну лунку из шестилуночной пластины.Добавьте три миллилитра 1X полного хелатирующего раствора в пробирку. Аккуратно закрутите, чтобы собрать оставшуюся ткань и перенести в тот же колодец пластины. Добавьте 150 микролитров 0,5 молярной тетрауксусной кислоты этилендиамина в лунку и поместите шестилуночную пластину на коромысл 20 градусов 24 об/мин при четырех градусах Цельсия.Инкубируйте образцы печени в течение 10 минут и образцы кишечника в течение одного часа на движущейся коромысле. Транспортируйте шестилуночную пластину обратно в шкаф биобезопасности и перенесите измельченную ткань и жидкость в трубку, содержащую 1X полный хелатирующий раствор с фетальной бычьей сывороткой. Дайте тканям осесть и транспортировать супернатант с 0,2 миллилитрами верхней части ткани в пустую трубку.Вращайте трубку, содержащую образец, при 700 XG в течение пяти минут при четырех градусах Цельсия. Стволовые клетки теперь гранулируются вместе с измельченной тканью. Осторожно удалите и выбросьте супернатант, чтобы не потревожить гранулу.Повторное суспендирование гранул в усовершенствованном DMEM F12. Снова раскрутите трубку и аспирируйте супернатант, не нарушая гранулу. Добавьте расчетный объем солюбилизированного внеклеточного мембранного матрикса в пробирку.Будьте осторожны при удалении среды, чтобы не потерять ячейку гранулы. При добавлении внеклеточного мембранного матрикса пипетка медленно не создает избыточных пузырьков в органоидной суспензии. Держите образец с солюбилизированным внеклеточным мембранным матриксом на льду и засевайте суспензию в середине лунок так, чтобы солюбилизированный внеклеточный мембранный матрикс образовывал куполообразную структуру.Транспортируйте пластину в инкубатор и дайте солюбилизированному внеклеточному мембранному матриксу затвердеть в течение 30 минут. Смешайте ингибитор ROCK и бета GSK3 в полной среде с факторами роста и добавьте 500 микролитров этого раствора в каждую лунку. Поместите тарелку в инкубатор.Протокол органоидов собак обычно генерирует приблизительно от 50 000 до 150 000 клеток кишечника или печени на лунку. После выделения стволовых клеток печеночные собачьи органоиды начинают свой жизненный цикл как расширяющиеся сфероиды, а через семь дней превращаются в почковые и дифференцирующие органоиды. Были рассчитаны объем, площадь поверхности, площадь 2D-эллипса и окружность сфероидов.Площадь и окружность эллипса 2D использовались для оценки здоровья органоидной культуры. Оценка экспрессии маркеров полуколичественным способом показала, что сфероиды преимущественно экспрессировали холангиоцитарный маркер KRT7 в диапазоне от одного до 26%Экспрессия маркера стволовых клеток LGR5 варьировалась от 0,17 до 0,78%, в то время как маркеры гепатоцитов экспрессировались в меньшей степени на 0,05-0,34% для Forkhead box 1A и от 0,03 до 0,28% для цитохрома-P450. 12-минутная инкубация с трипсин-подобной протеазой не ингибировала рост органоидов.Однако на рост органоидов негативно повлияли с помощью 24-минутной инкубации. Проанализирована живучесть собачьих печеночных органоидов в неблагоприятной среде для определения объема органоидных сред и фундаментного матрикса, необходимого для успешного роста и выживания печеночных органоидов. Выживаемость органоидов варьировалась от 12,9 дней до 18 дней.Основные методы культивирования клеток и асептические подходы являются необходимыми предпосылками для правильной изоляции и поддержания органоидов.

Research

JoVE Journal

Medicine

In Vivo Canine Muscle Function Assay

In Vivo Canine Muscle Function Assay

В Vivo собак Пробирной функции мышц

We describe a minimally-invasive and reproducible method to measure canine pelvic limb muscle strength and muscle response to repeated eccentric 
...

Generation of Alginate Microspheres for Biomedical Applications

Генерация альгинат микросфер для биомедицинских применений

Alginate-based materials have received considerable attention for biomedical applications because of their hydrophilic nature, biocompatibility, and ...

The Bovine Lung in Biomedical Research: Visually Guided Bronchoscopy, Intrabronchial Inoculation and In Vivo Sampling Techniques

The Bovine Lung in Biomedical Research: Visually Guided Bronchoscopy, Intrabronchial Inoculation and In Vivo Sampling Techniques

Легких крупного рогатого скота в биомедицинских исследований: Визуально Руководствуясь Бронхоскопия, внутрибронхиального Прививка и<em&gt; В Vivo</em&gt; Методы отбора проб

There is an ongoing search for alternative animal models in research of respiratory medicine. Depending on the goal of the research, large animals as ...

Use of a Low-flow Digital Anesthesia System for Mice and Rats

Использование низкого потока цифровой Анестезия системы для мышей и крыс

A traditional vaporizer depends on flowing gas and atmospheric pressure for passive anesthetic vaporization. Newly developed direct injection vaporizers ...

Forskolin-induced Swelling in Intestinal Organoids: An In Vitro Assay for Assessing Drug Response in Cystic Fibrosis Patients

Forskolin-induced Swelling in Intestinal Organoids: An In Vitro Assay for Assessing Drug Response in Cystic Fibrosis Patients

Форсколин-индуцированной Отек в кишечном органоидов:<em&gt; In Vitro</em&gt; Анализ для оценки ответа на наркотики в больных муковисцидозом

Recently-developed cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR)-modulating drugs correct surface expression and/or function of the mutant ...

Optimized Analysis of In Vivo and In Vitro Hepatic Steatosis

Optimized Analysis of In Vivo and In Vitro Hepatic Steatosis

Оптимизированный анализ<em&gt; В Vivo</em&gt; и<em&gt; In Vitro</em&gt; Стеатоз печени

Establishing a system of procedures to qualitatively and quantitatively characterize in vivo and in vitro hepatic steatosis is important for metabolic ...

Improvement of a Closed Chest Porcine Myocardial Infarction Model by Standardization of Tissue and Blood Sampling Procedures

Улучшение модели свинину инфаркт миокарда закрытой груди путем стандартизации процедур отбора проб крови и тканей

Myocardial ischemia reperfusion (I/R) injury contributes to almost half of the necrotic area after myocardial infarction. To date there is no approved ...

Generation of Human 3D Lung Tissue Cultures (3D-LTCs) for Disease Modeling

Generation of Human 3D Lung Tissue Cultures 3D-LTCs for Disease Modeling

Поколение 3D легкое человека тканевых культур (3D-LTCs) для моделирования заболевания

Translation of novel discoveries to human disease is limited by the availability of human tissue-based models of disease. Precision-cut lung slices (PCLS) ...

Use of 3D Robotic Ultrasound for In Vivo Analysis of Mouse Kidneys

Use of 3D Robotic Ultrasound for In Vivo Analysis of Mouse Kidneys

Использование 3D роботизированного ультразвука для анализа почек мыши in vivo

Common modalities for in vivo imaging of rodents include positron emission tomography (PET), computed tomography (CT), magnetic resonance imaging (MRI), ...

Standardizing the Responses to Platelet Agonist Collagen-Related Peptide

Reproducibility and Harmonization in Research Using Biological Standards: The Example of Platelet Agonist Collagen-Related Peptide

Biological Standardization to Ensure Reproducibility and Harmonization in Research (Video) | JoVE

Воспроизводимость и гармонизация в исследованиях с использованием биологических стандартов: на примере агониста тромбоцитов коллаген-связанного пептида

Metrology - the science of measure - is a subject few biological scientists are taught about in their training to their detriment; the application of ...