Name: standardization and maintenance of 3d canine hepatic and intestinal organoid cultures for use in biomedical research
Uploaded: 2022-01-31T15:00:00
Duration: 8 min 39 s
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Los autores quieren expresar su gratitud a los empleados del Laboratorio de Diagnóstico Veterinario de la Universidad Estatal de Iowa, a saber, Haley M. Lambert, Emily Rahe, Rosalyn M. Branaman, Victoria J. Green y Jennifer M. Groeltz-Thrush, por el procesamiento oportuno de las muestras proporcionadas. Los autores desean agradecer el apoyo de la Startup de la Facultad, el Premio ISU VPR Miller, el Premio ISU VPR Miller y el subpremio NSF SBIR a ISU # 1912948.

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K. Allenspach es cofundador de LifEngine Animal Health y 3D Health Solutions. Se desempeña como consultora para Ceva Animal Health, Bioibérica, LifeDiagnostics, Antech Diagnostics, Deerland Probiotics y Mars. J. P. Mochel es cofundador de LifEngine Animal Health y 3D Health Solutions. El Dr. Mochel se desempeña como consultor para Ceva Animal Health y Ethos Animal Health. Otros autores no tienen ningún conflicto de intereses que declarar.

Actualmente hay una falta de protocolos estandarizados disponibles para el aislamiento y mantenimiento de organoides hepáticos e intestinales caninos. Se justifica el establecimiento de procedimientos operativos estándar para cultivos de organoides para que este modelo sea aplicable en diferentes entornos de laboratorio. Específicamente, proporcionar protocolos operativos estandarizados para el cultivo de estos modelos organoides caninos es clave para caracterizar el crecimiento normal de los organoides durante el cultivo y el pasaje para derivar puntos de tiempo óptimos para la expansión y el mantenimiento. Los organoides intestinales caninos cultivados mediante el protocolo han sido previamente caracterizados por Chandra et al.12.
Uno de los pasos más críticos del protocolo es la transmisión de organoides. Se determinó que el momento óptimo para el primer paso de los esferoides hepáticos era el día 7 después del aislamiento en función de las mediciones de esferoides hepáticos. El volumen máximo de esferoides se alcanzó en el día 7, y al mismo tiempo, los esferoides comenzaron a brotar y formaron organoides hepáticos. El aumento en el volumen total de organoides desde el día 2-7 después del aislamiento fue de más de 365 veces, lo que sugiere que el tiempo de paso óptimo es más largo que el cultivo de organoides intestinales caninos. Después de 7 días en cultivo, no se observaron signos gruesos de apoptosis celular en el esferoide hepático, incluso sin limpieza ni paso (Figura 7). Pasar los organoides intestinales y hepáticos puede ser un desafío, ya que el procedimiento puede conducir a la pérdida de células y la viabilidad alterada. Los resultados indican que la incubación prolongada de organoides hepáticos con proteasa similar a la tripsina (hasta 12 min) no influye negativamente en el subcultivo. La incubación de los organoides en proteasa similar a la tripsina durante más de 24 minutos puede ser perjudicial para el subcultivo posterior de los organoides.
En caso de rotura subóptima en los grupos celulares con el paso organoide, la disociación mecánica en lugar de la incubación prolongada con proteasa similar a la tripsina podría ser más beneficiosa. Si se encuentran problemas con la disociación adecuada de los organoides, se puede intentar un breve vórtice de las muestras para mejorar el rendimiento del pasaje. Por otro lado, el vórtice tiene el potencial de arruinar un cultivo y dañar las células, por lo que solo debe usarse cuando otros procedimientos han fallado repetidamente. La ruptura de organoides hepáticos en células individuales reduce la tasa de crecimiento de los organoides, mientras que dividirlos en grupos de células puede mejorar en gran medida su viabilidad. Se eligieron diez minutos como tiempo de incubación para el protocolo de organoides. Se consideró que un punto de tiempo de incubación de 12 minutos no era citotóxico en comparación con una incubación de 24 minutos en el experimento de proteasa similar a la tripsina.
El experimento de supervivencia confirmó que los organoides hepáticos caninos podrían sobrevivir hasta 19,5 días en condiciones desfavorables (agotamiento estructural y nutricional). Los organoides que sobrevivieron a estas condiciones por más tiempo se cultivaron con medios CMGF +. Esta observación podría haber sido causada por el crecimiento más lento de organoides hepáticos en medios no suplementados con inhibidor de Rock y GSK3β. Los cultivos de organoides con CMGF+ R/G crecieron más rápido y pueden haber agotado sus recursos más rápido. Este experimento abre posibilidades de miniaturizar el cultivo de organoides caninos para lograr una conversión del sistema de alto rendimiento. Tal tecnología muestra el potencial de facilitar el descubrimiento de fármacos o estudios toxicológicos a un costo sustancialmente reducido.
Algunos problemas comunes que se encuentran durante el mantenimiento del cultivo de organoides caninos son la solidificación inadecuada de la muestra durante el revestimiento, la contaminación del cultivo y el establecimiento de la densidad y el tamaño adecuados de los organoides. Si el ECM solubilizado se solidifica prematuramente durante el recubrimiento, colóquelo inmediatamente en hielo durante 10 min. Si la ECM solubilizada no forma estructuras en forma de cúpula, es probable que no se hayan eliminado suficientes medios de la muestra. Si este es el caso, diluya la muestra con un ECM más solubilizado hasta que se formen cúpulas.
Cuando se encuentra contaminación fúngica o bacteriana en una placa entera (ver Figura 4), la mejor solución es desechar la placa. Se puede intentar el tratamiento con medicamentos antimicóticos o antibióticos, pero el éxito de tal intento es extremadamente bajo. Si un solo pozo está contaminado en una placa, los pozos viables y no afectados pueden limpiarse (siga los pasos 4.1 a 4.5) en una placa nueva y monitorearse de cerca. Si la muestra ya ha sido congelada de emergencia, es aconsejable desechar toda la muestra, ya que la descongelación de la muestra expone a la incubadora a un riesgo de contaminación adicional.
El cultivo de organoides sanos debe estar al menos en la categoría de tamaño mediano y densidad media o mayor. La densidad óptima es crucial para el crecimiento del cultivo de organoides. La densidad más baja debe corregirse limpiando los organoides a densidad media. Si se produce la situación de densidad extrema (hacinamiento), los organoides deben ampliarse a más pozos. Los signos gruesos de apoptosis celular a menudo acompañan tanto al hacinamiento como a la baja densidad del cultivo de organoides. Si estos problemas no se corrigen a tiempo, todo el cultivo de organoides se volverá apoptótico en cuestión de días. Si los organoides alcanzan un tamaño extra grande o una densidad muy alta, el cultivo debe usarse para un experimento, congelación o fijación.
El medio organoide actualmente contiene 17 componentes, y la adición de factores de crecimiento necesarios para el mantenimiento y la expansión de los organoides puede ser costosa. Este problema se puede resolver mediante el cultivo de cultivos celulares 2D que sintetizan los factores de crecimiento para producir CMGF+ condicionado. El cultivo celular L-WRN produce factores de crecimiento Wnt-3a, R-Spondin-3 y Noggin37. La colonia celular utiliza un 90% de DMEM/F12 y un 10% de medios de cultivo FBS. Cuando el cultivo alcanza el 90 por ciento de confluencia, los medios se cosechan todos los días durante 1 semana. El medio cosechado se mezcla con 2x CMGF + (sin estos factores de crecimiento). Si bien los cultivos 2D pueden producir los factores de crecimiento necesarios a una fracción del costo, se debe esperar el tiempo y la preparación adicionales para producir los medios. Las concentraciones de factores de crecimiento entre lotes de medios condicionados también pueden diferir37,38.
Los cultivos de organoides derivados de células madre adultas caninas son un modelo biomédico único que puede ayudar a alcanzar los objetivos de la Iniciativa Una Salud39. La tecnología organoide se puede utilizar en muchas áreas de investigación básica y biomédica, que abarcan desde la biología del desarrollo, la fisiopatología, el descubrimiento y las pruebas de fármacos, la toxicología hasta el estudio de las enfermedades infecciosas y la medicina regenerativa40. La investigación traslacional y la traslacional inversa son áreas en las que los organoides caninos son aplicables15. Los perros se han utilizado durante siglos en entornos experimentales traslacionales, y su condición de animales de compañía también ha facilitado su posición como una de las especies más exploradas en medicina veterinaria.
En conclusión, este manuscrito proporciona protocolos operativos estandarizados para el aislamiento, mantenimiento, recolección y biobanco de organoides hepáticos e intestinales caninos para facilitar la aplicación de este modelo en diversos campos biomédicos. Este modelo es especialmente adecuado para promover la investigación traslacional inversa como herramienta de la Iniciativa Una Salud para promover el intercambio inter e intradisciplinar de conocimientos.

Los roedores son el modelo animal más utilizado para la investigación biomédica y traslacional1. Son excepcionalmente útiles para investigar la patogénesis molecular básica de las enfermedades, aunque recientemente se ha cuestionado su relevancia clínica para las enfermedades multifactoriales crónicas2. El modelo canino exhibe varias ventajas en comparación con los roedores3,4. Perros y humanos comparten similitudes en metabolómica y microbioma intestinal que se desarrolló debido al consumo de dieta humana a lo largo de varios períodos de su domesticación5,6,7. Las similitudes entre la anatomía y fisiología gastrointestinal canina y humana es otro de los ejemplos8.
Además, los perros a menudo comparten entornos y estilos de vida similares con sus dueños9. La mayor esperanza de vida de los perros en comparación con los roedores permite el desarrollo natural de numerosas afecciones crónicas10. La enfermedad inflamatoria intestinal o el síndrome metabólico son ejemplos de enfermedades crónicas multifactoriales que comparten importantes similitudes entre humanos y perros11,12. Los ensayos preclínicos caninos que involucran a perros con enfermedades naturales pueden generar datos más confiables que los obtenidos de modelos de roedores13. Sin embargo, para minimizar el uso de la investigación con animales vivos y cumplir con los principios de las 3R (Reduce, Refine, Replace)14, han surgido alternativas a las pruebas in vivo utilizando organoides caninos 3D in vitro15.
Los organoides son estructuras derivadas de células madre 3D autoensambladas que recapitulan la fisiología y la microanatomía de sus órganos originales16,17. Esta tecnología fue descrita por primera vez por Sato et al. en 200917 y permitió realizar más estudios in vitro traducibles en líneas celulares epiteliales de lo que era posible anteriormente utilizando cultivos de células cancerosas 2D18,19,20. Los organoides son modelos in vitro útiles en muchas disciplinas biomédicas como en estudios toxicológicos preclínicos21,22,23, de absorción o metabolismo24,25,26,27,28, así como en enfoques médicos personalizados29,30,31 . El cultivo exitoso de organoides intestinales caninos se ha descrito por primera vez en 201912, mientras que los organoides hepáticos derivados de un perro fueron reportados por primera vez por Nantasanti et al. en 201532. Desde entonces, los organoides caninos se han utilizado con éxito en estudios que investigan enteropatías crónicas caninas, tumores del estroma gastrointestinal, adenocarcinoma colorrectal12 y enfermedad de Wilson33,34.
Si bien las células madre adultas se pueden cosechar a través de necropsias, la tecnología organoide no siempre requiere el sacrificio de los animales. Las biopsias endoscópicas y laparoscópicas, o incluso los aspirados con aguja fina de órganos35, son una fuente viable de células madre adultas para el aislamiento de organoides epiteliales12. El uso generalizado de estas técnicas no invasivas en la práctica veterinaria facilita las opciones para la investigación traslacional inversa (traducción de la información de la práctica clínica veterinaria a la práctica clínica humana y viceversa)15. Se puede garantizar un mayor avance de la tecnología de organoides mediante la estandarización de los métodos de cultivo y mantenimiento de organoides. El protocolo organoide presentado aquí se basa parcialmente en el trabajo publicado previamente de Saxena et al. de 201536, y los métodos se adaptaron para adaptarse a los detalles del cultivo de organoides intestinales y hepáticos caninos. El flujo de trabajo general de los protocolos de organoides caninos se representa en la Figura 1.
El Protocolo de Aislamiento de Organoides Caninos introduce métodos para obtener muestras de biopsias endoscópicas, laparoscópicas y quirúrgicas, así como necropsias. Describe el pretratamiento inicial de las muestras de tejido y las metodologías utilizadas para el transporte al laboratorio. Los materiales y reactivos necesarios para el aislamiento de organoides se resumen en la sección "Preparación para el aislamiento". El proceso de aislamiento de células madre adultas a partir de muestras de tejido se describe con más detalle. Finalmente, se discute el proceso de recubrimiento de organoides en estructuras en forma de cúpula utilizando una matriz de membrana extracelular solubilizada.
El segundo protocolo, el Protocolo de Mantenimiento de Organoides Caninos, describe los métodos de documentación y cultivo de organoides. Los cambios en los medios y su frecuencia se analizan en esta sección. Además, se describen los procedimientos de laboratorio como el pasaje y la limpieza de los cultivos celulares, que son esenciales para garantizar el mantenimiento exitoso de los organoides caninos 3D. El paso apropiado es un paso crítico del protocolo, y los posibles ajustes y la solución de problemas de este paso se discuten más a fondo en el manuscrito.
El último protocolo es el Protocolo de Sustracción y Biobanco de Organoides Caninos que contiene métodos para preparar organoides adultos para la incrustación de parafina y la preservación del ARN. Los métodos de biobanco de muestras de organoides en el almacenamiento de nitrógeno líquido también se describen aquí. Finalmente, se discuten las formas de descongelar las muestras congeladas y apoyar su crecimiento.
En conclusión, este artículo tiene como objetivo proporcionar procedimientos consistentes de cultivo de organoides caninos a través de la estandarización de protocolos entre laboratorios. Al hacerlo, el manuscrito tiene como objetivo facilitar la reproducibilidad de los datos derivados de modelos organoides caninos para aumentar su relevancia en la investigación biomédica traslacional.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63515/63515fig01.jpg"> Figura 1: Flujo de trabajo de protocolos organoides caninos. El Protocolo de Aislamiento de Organoides Caninos describe la preparación de los materiales necesarios para el aislamiento de organoides, la recolección de una muestra de tejido (a través de necropsias, biopsias endoscópicas, laparoscópicas y quirúrgicas) y la orientación sobre la disociación celular y el recubrimiento de la población celular. El Protocolo de Mantenimiento de Organoides Caninos discute la limpieza y el pasaje del cultivo de organoides. El Protocolo de Sustracción y Biobanco de Organoides discute la preparación de muestras de organoides para la incrustación de parafina y la caracterización adicional de organoides. También se discuten los métodos para biobancar cultivos de organoides y revivirlos del almacenamiento en nitrógeno líquido. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63515/63515fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Chelating solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Sorbitol</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>BP439-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT</td>
			<td>Promega</td>
			<td>V3151</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>P217-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P5655-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4-2H2O</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S5136-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>S271-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen Strep</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>S5-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Organoid media</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>[Leu15]-Gastrin I human</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G9145-.5MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A-83-01</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>9094360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Advanced DMEM/F12</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12634-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17504-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Corning</td>
			<td>35-010-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamax</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>VWR Life Science</td>
			<td>J848-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human R-Spondin-1</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>120-38-500UG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Murine EGF</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>315-09-1MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Murine Noggin</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>250-38-250UG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Murine Wnt-3a</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>315-20-10UG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2 supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17502-048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-Acetyl-L-cysteine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9165-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nicotinamide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>N0636-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primocin</td>
			<td>InvivoGen</td>
			<td>ant-pm-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ROCK inhibitor (Y-27632)</td>
			<td>EMD Millipore Corp.</td>
			<td>SCM 075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SB202190 (P38 inhibitor)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S7067-25MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stemolecule CHIR99021 (GSK3&#946;)</td>
			<td>Reprocell</td>
			<td>04-0004-base</td>
			<td></td>
		</tr>
		
		<tr>
			<td>Trimethoprim</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T7883-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfamethoxazole</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7507-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic Acid, Glacial</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>A38-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl Sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Fisher Chemicals</td>
			<td>D128-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA, pH 8.0, 0.5 M</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15575-038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde (37%)</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>F79P-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G5882</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel Matrix For Organoid Culture</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356255</td>
			<td>Extracellular Membrane Matrix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde, 97%</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>A11313</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS, 1X (Phosphate-Buffered Saline)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-040-CM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS, 1X (Phosphate-Buffered Saline)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-040-CM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAlater Soln.</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM7021</td>
			<td>RNA Storage Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Express</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12604-021</td>
			<td>Trypsin-like Protease</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Other</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 Well Cell Culture Plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ACD Hybez II Hybridization System</td>
			<td>ACD a biotechne brand</td>
			<td>321710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge Tube, 15 mL</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430766</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CoolCell LX</td>
			<td>Corning</td>
			<td>BCS-405MC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryogenic Vials</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430488</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Centrifuge Tube (50 mL)</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>05-539-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GyroMini Nutating mixer (Rocker)</td>
			<td>Labnet</td>
			<td>S0500-230V-EU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat Bath</td>
			<td>Lab-Line Instruments</td>
			<td>3000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mr. Frosty Freezing Container</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>5100-0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop 2000</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>ND2000CLAPTOP</td>
			<td>SpectrophotometerAnalysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Panasonic incubator</td>
			<td>Panasonic</td>
			<td>MCO-170ML-PA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm M Wrapping Film</td>
			<td>Bemis Company Inc</td>
			<td>PM996/EMD</td>
			<td>Laboratory Flexible Film Tape</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protected Disposable Scalpels</td>
			<td>Bard-Parker</td>
			<td>239844</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAscope 2.5 HD Assay &#8211; RED</td>
			<td>ACD a biotechne brand</td>
			<td>322350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAscope H2O2 &#38; Protease Plus Reagents</td>
			<td>ACD a biotechne brand</td>
			<td>322330</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAscope Target Retrieval Reagents</td>
			<td>ACD a biotechne brand</td>
			<td>322000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAscope Wash Buffer Reagents</td>
			<td>ACD a biotechne brand</td>
			<td>310091</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Culture Dish</td>
			<td>Dot Scientific</td>
			<td>6676621</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Culture Plate 24 wells</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>FB012929</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

standardization and maintenance of 3d canine hepatic and intestinal organoid cultures for use in biomedical research

Los perros desarrollan enfermedades multifactoriales complejas análogas a los humanos, incluidas las enfermedades inflamatorias, las enfermedades metabólicas y el cáncer. Por lo tanto, representan modelos animales grandes relevantes con el potencial de traslación a la medicina humana. Los organoides son estructuras 3-dimensionales (3D), autoensambladas derivadas de células madre que imitan la microanatomía y la fisiología de su órgano de origen. Estos modelos traslacionales in vitro se pueden utilizar para aplicaciones de permeabilidad y descubrimiento de fármacos, evaluación toxicológica y para proporcionar una comprensión mecanicista de la fisiopatología de las enfermedades crónicas multifactoriales. Además, los organoides caninos pueden mejorar la vida de los perros de compañía, proporcionando información en diversas áreas de la investigación veterinaria y facilitando aplicaciones de tratamiento personalizado en medicina veterinaria. Un pequeño grupo de donantes puede crear un biobanco de muestras de organoides, reduciendo la necesidad de una recolección continua de tejido, ya que las líneas celulares organoides se pueden subcultivar indefinidamente. A continuación, se presentan tres protocolos que se centran en el cultivo de organoides caninos intestinales y hepáticos derivados de células madre adultas. El Protocolo de Aislamiento de Organoides Caninos describe métodos para procesar el tejido y la incrustación del aislado celular en una matriz de soporte (matriz de membrana extracelular solubilizada). El Protocolo de Mantenimiento de Organoides Caninos describe el crecimiento y mantenimiento de organoides, incluida la limpieza y el paso junto con el momento adecuado para la expansión. El Protocolo de Sustracción y Biobanco de Organoides describe formas de extraer, congelar y preservar organoides para su posterior análisis.

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Standardization and Maintenance of 3D Canine Hepatic and Intestinal Organoid Cultures for Use in Biomedical Research

Se describen métodos experimentales para cosechar células madre adultas de tejidos intestinales y hepáticos caninos para establecer cultivos de organoides en 3D. Además, se discuten las técnicas de laboratorio para garantizar un crecimiento constante y proporcionar procedimientos operativos estándar para cosechar, biobancar y revivir cultivos de organoides intestinales y hepáticos caninos.

Estandarización y mantenimiento de cultivos de organoides hepáticos e intestinales caninos en 3D para su uso en investigación biomédica

Dogs develop complex multifactorial diseases analogous to humans, including inflammatory diseases, metabolic diseases, and cancer. Therefore, they ...

Los protocolos para el cultivo de organoides hepáticos e intestinales caninos son importantes para estandarizar esta novedosa tecnología. Esta técnica permite el establecimiento fiable y reproducible del cultivo de organoides caninos incluyendo el aislamiento de organoides, mantenimiento, recolección y posterior biobanco de muestras. Los organoides caninos pueden proporcionar un excelente modelo para numerosas aplicaciones que abarcan desde la biología, el desarrollo de enfermedades infecciosas, las pruebas y el descubrimiento de fármacos, y también la medicina de transmisión.Para comenzar, prepare cinco tubos centrífugos de 15 mililitros con cinco mililitros de solución quelante completa 1X, un tubo con tres mililitros de solución quelante completa 1X, un tubo vacío y un tubo con cinco mililitros de solución quelante completa 1X y dos mililitros de suero bovino fetal. El día del aislamiento, coloque una placa de Petri estéril, un bisturí, un cubo de hielo y una mezcla de nutrientes DMEM avanzada fría F12 en el gabinete de bioseguridad. Coloque el número requerido de placa de cultivo celular de 24 pocillos en la incubadora de dióxido de carbono para precalentarse.Coloque la matriz de membrana extracelular solubilizada sobre hielo para descongelar. Pre-enfriar la centrífuga a cuatro grados centígrados. Mueva los medios completos con factores de crecimiento del congelador a un baño de agua de 37 grados Celsius evitando la exposición directa a la luz.Agite las muestras de tejido en el tubo de transporte durante 30 segundos. Retire el sobrenadante excesivo sin desechar ningún tejido mediante pipeteo lento cerca de la superficie del fluido hasta que queden 0,5 mililitros en el tubo. Transfiera el tejido y el sobrenadante restante a una placa de Petri estéril.Usando un bisturí desechable, corte y pica el tejido en trozos más pequeños que se asemejen a una consistencia de puré durante aproximadamente cinco minutos. Pipetee el tejido picado con líquido de la placa de Petri al primer tubo de solución quelante completo, luego agregue dos mililitros de mezcla avanzada de nutrientes DMEM F12 a la placa de Petri. Enjuague el tejido restante y transfiéralo al primer tubo de solución quelante completa.Vórtice el tubo de solución quelante completa 1X aproximadamente cinco veces durante cinco segundos. Permita que las biopsias se asienten en la parte inferior del tubo durante un minuto y retire el sobrenadante hasta que queden cinco mililitros. Transfiera la solución quelante completa 1X del tubo nuevo al tubo de muestra.Repita el paso anterior para los dos tubos siguientes. Y en los dos últimos lavados, retire el sobrenadante hasta tres mililitros que queden en el tubo. Transfiera las biopsias y la solución quelante completa 1X del tubo de muestra a un pocillo de una placa de seis pocillos.Agregue tres mililitros de solución quelante completa 1X al tubo de muestra. Gire suavemente para recoger cualquier tejido restante y transfiéralo al mismo pozo de la placa. Agregue 150 microlitros de ácido tetraacético de etileno diamina 0.5 molares en un pozo y coloque la placa de seis pocillos en un balancín de 20 grados a 24 RPM a cuatro grados Celsius.Incubar las muestras de hígado durante 10 minutos y las muestras intestinales durante una hora en el balancín en movimiento. Transporte la placa de seis pocillos de vuelta al gabinete de bioseguridad y transfiera el tejido picado y el líquido a un tubo que contiene 1X solución quelante completa con suero fetal bovino. Permita que los tejidos se asienten y transporte el sobrenadante con 0,2 mililitros de la parte superior del tejido a un tubo vacío.Gire hacia abajo el tubo que contiene la muestra a 700 XG durante cinco minutos a cuatro grados centígrados. Las células madre ahora se peletizan junto con el tejido picado. Retire y deseche el sobrenadante con cuidado para no molestar el pellet.Resuspend el pellet en DMEM F12 avanzado. Gire el tubo de nuevo y aspire el sobrenadante sin molestar el pellet. Agregue el volumen calculado de matriz de membrana extracelular solubilizada al tubo de muestra.Tenga cuidado al retirar los medios para no perder el pellet celular. Al agregar una matriz de membrana extracelular, pipetee lentamente para no crear burbujas excesivas en la suspensión organoide. Mantenga la muestra con la matriz de membrana extracelular solubilizada sobre hielo y siembre la suspensión en el medio de los pocillos para que la matriz de membrana extracelular solubilizada forme una estructura en forma de cúpula.Transporta la placa a una incubadora y deja que la matriz de membrana extracelular solubilizada se solidifique durante 30 minutos. Mezcle el inhibidor de ROCK y GSK3 beta en medios completos con factores de crecimiento y agregue 500 microlitros de esta solución a cada pocillo. Coloque la placa en la incubadora.El protocolo organoide canino generalmente genera aproximadamente 50, 000 a 150, 000 células intestinales o hepáticas por pozo. Después del aislamiento de células madre, los organoides caninos hepáticos comienzan su ciclo de vida como esferoides en expansión, y después de siete días, se convierten en organoides en ciernes y diferenciadores. Se calculó el volumen, el área de superficie, el área de elipse 2D y la circunferencia de los esferoides.Se utilizó el área de elipse 2D y la circunferencia para evaluar la salud del cultivo de organoides. La evaluación de la expresión de los marcadores de manera semicuantitativa mostró que los esferoides expresaron preferentemente el marcador de colangiocitos KRT7 variando de uno a 26%La expresión del marcador de células madre LGR5 osciló entre 0,17 y 0,78%, mientras que los marcadores de hepatocitos se expresaron en menor medida en 0,05 a 0,34% para forkhead box 1A y 0,03 a 0,28% para citocromo-P450. Una incubación de 12 minutos con proteasa similar a la tripsina no inhibió el crecimiento de organoides.Sin embargo, el crecimiento de los organoides se vio afectado negativamente mediante una incubación de 24 minutos. Se analizó la capacidad de supervivencia de los organoides hepáticos caninos en un ambiente desfavorable para determinar el volumen de medios organoides y la matriz del sótano necesarios para el crecimiento y la supervivencia exitosos de los organoides hepáticos. La tasa de supervivencia de los organoides varió de 12,9 días a 18 días.Las técnicas básicas de cultivo celular y los enfoques asépticos son los requisitos previos esenciales para el aislamiento y mantenimiento adecuado de los organoides.

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