Name: standardization and maintenance of 3d canine hepatic and intestinal organoid cultures for use in biomedical research
Uploaded: 2022-01-31T15:00:00
Duration: 8 min 39 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Standardization and Maintenance of 3D Canine Hepatic and Intestinal Organoid Cultures for Use in Biomedical Research at JoVE.com

Yazarlar, Iowa Eyalet Üniversitesi çalışanlarının Veteriner Teşhis Laboratuvarı'na, yani Haley M. Lambert, Emily Rahe, Rosalyn M. Branaman, Victoria J. Green ve Jennifer M. Groeltz-Pamukçuk'a, sağlanan örneklerin zamanında işlenmesi için şükranlarını ifade etmek istiyorlar. Yazarlar, Fakülte Başlangıcı, ISU VPR Miller Ödülü, ISU VPR Miller Ödülü ve ISU # 1912948'ye NSF SBIR alt ödülünün desteğini kabul etmek istiyor.

<ol>
	<li>Hickman, D. L., Johnson, J., Vemulapalli, T. H., Crisler, J. R., Shepherd, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Commonly+used+animal+models.">Commonly used animal models.</a> Principles of Animal Research for Graduate and Undergraduate Students. , 117-175 (2017).</li><li>De Jong, M., Maina, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Of+mice+and+humans:+Are+they+the+same?+-+Implications+in+cancer+translational+research.">Of mice and humans: Are they the same? - Implications in cancer translational research.</a> Journal of Nuclear Medicine. 51 (4), 501-504 (2010).</li><li>Cannarozzi, G., Schneider, A., Gonnet, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+phylogenomic+study+of+human,+dog,+and+mouse.">A phylogenomic study of human, dog, and mouse.</a> PLoS Computational Biology. 3 (1), 0009-0014 (2007).</li><li>Jacob, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Researchers+turn+to+canine+clinical+trials+to+advance+cancer+therapies.">Researchers turn to canine clinical trials to advance cancer therapies.</a> JAMA - Journal of the American Medical Association. 315 (15), 1550-1552 (2016).</li><li>Ziegler, A., Gonzalez, L., Blikslager, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large+animal+models:+The+key+to+translational+discovery+in+digestive+disease+research.">Large animal models: The key to translational discovery in digestive disease research.</a> Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 2 (6), 716-724 (2016).</li><li>Swanson, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phylogenetic+and+gene-centric+metagenomics+of+the+canine+intestinal+microbiome+reveals+similarities+with+humans+and+mice.">Phylogenetic and gene-centric metagenomics of the canine intestinal microbiome reveals similarities with humans and mice.</a> ISME Journal. 5 (4), 639-649 (2011).</li><li>Coelho, L. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Similarity+of+the+dog+and+human+gut+microbiomes+in+gene+content+and+response+to+diet.">Similarity of the dog and human gut microbiomes in gene content and response to diet.</a> Microbiome. 6 (1), 72 (2018).</li><li>Nguyen, T. L. A., Vieira-Silva, S., Liston, A., Raes, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+informative+is+the+mouse+for+human+gut+microbiota+research.">How informative is the mouse for human gut microbiota research.</a> DMM Disease Models and Mechanisms. 8 (1), 1-16 (2015).</li><li>Bontempo, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nutrition+and+health+of+dogs+and+cats:+Evolution+of+petfood.">Nutrition and health of dogs and cats: Evolution of petfood.</a> Veterinary Research Communications. 29, 45-50 (2005).</li><li>Allenspach, K., Gaschen, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Canine+chronic+enteropathies:+A+review.">Canine chronic enteropathies: A review.</a> Schweizer Archiv fur Tierheilkunde. 145 (5), 209-222 (2003).</li><li>Tribuddharatana, T., Kongpiromchean, Y., Sribhen, K., Sribhen, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biochemical+alterations+and+their+relationships+with+the+metabolic+syndrome+components+in+canine+obesity.">Biochemical alterations and their relationships with the metabolic syndrome components in canine obesity.</a> Kasetsart Journal - Natural Science. 45 (4), 622-628 (2011).</li><li>Chandra, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derivation+of+adult+canine+intestinal+organoids+for+translational+research+in+gastroenterology.">Derivation of adult canine intestinal organoids for translational research in gastroenterology.</a> BMC Biology. 17 (1), 33 (2019).</li><li>Schaefer, K., Rensing, S., Hillen, H., Burkhardt, J. E., Germann, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Is+Science+the+only+driver+in+species+selection?+An+internal+study+to+evaluate+compound+requirements+in+the+minipig+compared+to+the+dog+in+preclinical+studies.">Is Science the only driver in species selection? An internal study to evaluate compound requirements in the minipig compared to the dog in preclinical studies.</a> Toxicologic Pathology. 44 (3), 474-479 (2016).</li><li>MacArthur Clark, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+3Rs+in+research:+A+contemporary+approach+to+replacement,+reduction+and+refinement.">The 3Rs in research: A contemporary approach to replacement, reduction and refinement.</a> British Journal of Nutrition. 120, 1-7 (2018).</li><li>Schneider, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Model-based+reverse+translation+between+veterinary+and+human+medicine:+The+one+health+initiative.">Model-based reverse translation between veterinary and human medicine: The one health initiative.</a> CPT: Pharmacometrics and Systems Pharmacology. 7 (2), 65-68 (2018).</li><li>Lehmann, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+organoids:+A+new+dimension+in+cell+biology.">Human organoids: A new dimension in cell biology.</a> Molecular Biology of the Cell. 30 (10), 1129-1137 (2019).</li><li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+Lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche.">Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).</li><li>Kim, J., Koo, B. K., Knoblich, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+organoids:+model+systems+for+human+biology+and+medicine.">Human organoids: model systems for human biology and medicine.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 21 (10), 571-584 (2020).</li><li>Jensen, C., Teng, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Is+it+time+to+start+transitioning+from+2D+to+3D+cell+culture.">Is it time to start transitioning from 2D to 3D cell culture.</a> Frontiers in Molecular Biosciences. 7, 33 (2020).</li><li>Ho, B. X., Pek, N. M. Q., Soh, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disease+modeling+using+3D+organoids+derived+from+human+induced+pluripotent+stem+cells.">Disease modeling using 3D organoids derived from human induced pluripotent stem cells.</a> International Journal of Molecular Sciences. 19 (4), 936 (2018).</li><li>Truskey, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+microphysiological+systems+and+organoids+as+in+vitro+models+for+toxicological+studies.">Human microphysiological systems and organoids as in vitro models for toxicological studies.</a> Frontiers in Public Health. 6, 185 (2018).</li><li>Caipa Garcia, A. L., Arlt, V. M., Phillips, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoids+for+toxicology+and+genetic+toxicology:+applications+with+drugs+and+prospects+for+environmental+carcinogenesis.">Organoids for toxicology and genetic toxicology: applications with drugs and prospects for environmental carcinogenesis.</a> Mutagenesis. , (2021).</li><li>Augustyniak, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoids+are+promising+tools+for+species-specific+in+vitro+toxicological+studies.">Organoids are promising tools for species-specific in vitro toxicological studies.</a> Journal of Applied Toxicology. 39 (12), 1610-1622 (2019).</li><li>Zietek, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoids+to+study+intestinal+nutrient+transport,+drug+uptake+and+metabolism+-+Update+to+the+human+model+and+expansion+of+applications.">Organoids to study intestinal nutrient transport, drug uptake and metabolism - Update to the human model and expansion of applications.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 577656 (2020).</li><li>Zietek, T., Rath, E., Haller, D., Daniel, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+organoids+for+assessing+nutrient+transport,+sensing+and+incretin+secretion.">Intestinal organoids for assessing nutrient transport, sensing and incretin secretion.</a> Scientific Reports. 5 (1), 1-10 (2015).</li><li>Kar, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoids:+a+promising+new+in+vitro+platform+in+livestock+and+veterinary+research.">Organoids: a promising new in vitro platform in livestock and veterinary research.</a> Veterinary Research. 52 (1), 1-17 (2021).</li><li>Borcherding, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sa1976+polyphenols+reverse+the+pathologic+effects+of+palmitic+acid+and+high+fat+diet+in+canine+enteroids.">Sa1976 polyphenols reverse the pathologic effects of palmitic acid and high fat diet in canine enteroids.</a> Gastroenterology. 158 (6), 486 (2020).</li><li>Ambrosini, Y. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recapitulation+of+the+accessible+interface+of+biopsy-derived+canine+intestinal+organoids+to+study+epithelial-luminal+interactions.">Recapitulation of the accessible interface of biopsy-derived canine intestinal organoids to study epithelial-luminal interactions.</a> PLoS ONE. 15 (4), 0231423 (2020).</li><li>Zdyrski, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Su124+homology+directed+repair+in+canine+duodenal+enteroids+to+mimic+the+wild-type+P-glycoprotein+mutation.">Su124 homology directed repair in canine duodenal enteroids to mimic the wild-type P-glycoprotein mutation.</a> Gastroenterology. 160 (6), 625 (2021).</li><li>Li, Y., Tang, P., Cai, S., Peng, J., Hua, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoid+based+personalized+medicine:+from+bench+to+bedside.">Organoid based personalized medicine: from bench to bedside.</a> Cell Regeneration. 9 (1), 21 (2020).</li><li>Kurr, L. A., Allenspach, K., Jergens, A., Mochel, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Harnessing+the+biology+of+intestinal+organoids+to+accelerate+drug+discovery+in+inflammatory+bowel+disease:+A+one+health+approach.">Harnessing the biology of intestinal organoids to accelerate drug discovery in inflammatory bowel disease: A one health approach.</a> The FASEB Journal. 34, 1 (2020).</li><li>Nantasanti, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disease+modeling+and+gene+therapy+of+copper+storage+disease+in+canine+hepatic+organoids.">Disease modeling and gene therapy of copper storage disease in canine hepatic organoids.</a> Stem Cell Reports. 5 (5), 895-907 (2015).</li><li>Favier, R. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=COMMD1-Deficient+dogs+accumulate+copper+in+hepatocytes+and+provide+a+good+model+for+chronic+hepatitis+and+fibrosis.">COMMD1-Deficient dogs accumulate copper in hepatocytes and provide a good model for chronic hepatitis and fibrosis.</a> PLoS ONE. 7 (8), 42158 (2012).</li><li>Kruitwagen, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+survival+of+transplanted+autologous+canine+liver+organoids+in+a+COMMD1-deficient+dog+model+of+metabolic+liver+disease.">Long-term survival of transplanted autologous canine liver organoids in a COMMD1-deficient dog model of metabolic liver disease.</a> Cells. 9 (2), 410 (2020).</li><li>Vilgelm, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fine-needle+aspiration-based+patient-derived+cancer+organoids.">Fine-needle aspiration-based patient-derived cancer organoids.</a> iScience. 23 (8), 101408 (2020).</li><li>Saxena, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+intestinal+enteroids:+A+new+model+to+study+human+rotavirus+infection,+host+restriction,+and+pathophysiology.">Human intestinal enteroids: A new model to study human rotavirus infection, host restriction, and pathophysiology.</a> Journal of Virology. 90 (1), 43-56 (2016).</li><li>VanDussen, K. L., Sonnek, N. M., Stappenbeck, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=L-WRN+conditioned+medium+for+gastrointestinal+epithelial+stem+cell+culture+shows+replicable+batch-to-batch+activity+levels+across+multiple+research+teams.">L-WRN conditioned medium for gastrointestinal epithelial stem cell culture shows replicable batch-to-batch activity levels across multiple research teams.</a> Stem Cell Research. 37, 101430 (2019).</li><li>Powell, R. H., Behnke, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=WRN+conditioned+media+is+sufficient+for+in+vitro+propagation+of+intestinal+organoids+from+large+farm+and+small+companion+animals.">WRN conditioned media is sufficient for in vitro propagation of intestinal organoids from large farm and small companion animals.</a> Biology Open. 6 (5), 698-705 (2017).</li><li>Mackenzie, J. S., Jeggo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+one+health+approach-why+is+it+so+important.">The one health approach-why is it so important.</a> Tropical Medicine and Infectious Disease. 4 (2), 88 (2019).</li><li>Artegiani, B., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+and+application+of+3D-organoid+technology.">Use and application of 3D-organoid technology.</a> Human Molecular Genetics. 27 (2), 99-107 (2018).</li></ol>

K. Allensach, LifEngine Hayvan Sağlığı ve 3D Sağlık Çözümleri'nin kurucu ortağıdır. Ceva Animal Health, Bioiberica, LifeDiagnostics, Antech Diagnostics, Deerland Probiotics ve Mars için danışman olarak hizmet vermektedir. J. P. Mochel, LifEngine Hayvan Sağlığı ve 3D Sağlık Çözümleri'nin kurucu ortağıdır. Dr. Mochel, Ceva Hayvan Sağlığı ve Ethos Hayvan Sağlığı için danışman olarak hizmet vermektedir. Diğer yazarların beyan edecekleri herhangi bir çıkar çatışması yoktur.

Şu anda köpek hepatik ve bağırsak organoidlerinin izolasyonu ve bakımı için standartlaştırılmış protokollerin eksikliği vardır. Bu modelin farklı laboratuvar ortamlarında uygulanabilmesi için organoid kültürler için standart çalışma prosedürlerinin oluşturulması gerekmektedir. Spesifik olarak, bu köpek organoid modellerinin kültürü için standartlaştırılmış çalışma protokolleri sağlamak, organoidlerin kültür sırasında normal büyümesini karakterize etmenin ve genişleme ve bakım için en uygun zaman noktalarını elde etmek için pasajın anahtarıdır. Protokol kullanılarak kültürlenen köpek bağırsak organoidleri daha önce Chandra ve ark.12 ile karakterize edilmiştir.
Protokolün en kritik adımlarından biri organoidlerin geçişidir. Hepatik sferoidlerin ilk geçişi için en uygun zaman, hepatik sferoid ölçümlerine dayanarak izolasyondan sonraki 7. günde olarak belirlenmiştir. Maksimum sferoidlerin hacmine 7. günde ulaşıldı ve aynı zamanda sferoidler tomurcuklanmaya başladı ve hepatik organoidler oluşturdu. İzolasyondan sonraki 2-7. günden itibaren genel organoid hacmindeki artış 365 kattan fazlaydı, bu da optimal geçiş süresinin köpek bağırsak organoid kültüründen daha uzun olduğunu düşündürmektedir. Kültürde 7 gün sonra, hepatik sferoidde brüt hücresel apoptoz bulguları, temizlik veya pasaj olmadan bile gözlenmedi (Şekil 7). Bağırsak ve hepatik organoidlerin paslanması zor olabilir, çünkü prosedür hücre kaybına ve canlılığın değişmesine neden olabilir. Sonuçlar, hepatik organoidlerin tripsin benzeri proteaz (12 dakikaya kadar) ile uzun süreli inkübasyonunun alt kültürü olumsuz yönde etkilemediğini göstermektedir. Organoidlerin tripsin benzeri proteazda 24 dakikadan daha uzun süre inkübe edilmesi, organoidlerin sonraki alt kültürüne zararlı olabilir.
Organoid geçişli hücre kümelerinde suboptimal kırılma durumunda, tripsin benzeri proteaz ile uzun süreli inkübasyon yerine mekanik ayrışma daha faydalı olabilir. Organoidlerin uygun şekilde ayrışması ile ilgili sorunlarla karşılaşılırsa, geçiş verimini arttırmak için numunelerin kısa girdabı denenebilir. Öte yandan, vorteksleme bir kültürü mahvetme ve hücrelere zarar verme potansiyeline sahiptir, bu nedenle yalnızca diğer prosedürler tekrar tekrar başarısız olduğunda kullanılmalıdır. Hepatik organoidleri tek hücrelere ayırmak, organoidlerin büyüme hızını düşürürken, onları hücre kümelerine bölmek canlılıklarını büyük ölçüde artırabilir. Organoid protokol için kuluçka süresi olarak on dakika seçildi. 12 dakikalık bir inkübasyon zaman noktası, tripsin benzeri proteaz deneyinde 24 dakikalık bir inkübasyona kıyasla sitotoksik olarak kabul edilmedi.
Hayatta kalma deneyi, köpek hepatik organoidlerinin olumsuz koşullarda (yapısal ve beslenme tükenmesi) 19.5 güne kadar hayatta kalabileceğini doğruladı. Bu koşullardan en uzun süre kurtulan organoidler CMGF + ortamı ile kültürlendi. Bu gözlem, Kaya inhibitörü ve GSK3β ile desteklenmeyen ortamlarda hepatik organoidlerin daha yavaş büyümesinden kaynaklanmış olabilir. CMGF + R / G ile organoid kültürler daha hızlı büyüdü ve kaynaklarını daha hızlı tüketmiş olabilir. Bu deney, yüksek verimli bir sistem dönüşümü elde etmek için köpek organoid kültürünü minyatürleştirme olanaklarını ortaya çıkarmaktadır. Böyle bir teknoloji, ilaç keşfini veya toksikoloji çalışmalarını önemli ölçüde azaltılmış bir maliyetle kolaylaştırma potansiyelini göstermektedir.
Köpek organoid kültürünün bakımı sırasında karşılaşılan bazı yaygın sorunlar, kaplama sırasında yanlış numune katılaşması, kültür kontaminasyonu ve organoidlerin uygun yoğunluğunu ve boyutunu belirlemektir. Çözünür ECM, kaplama sırasında erken katılaşarsa, derhal 10 dakika boyunca buzun üzerine yerleştirin. Çözünür ECM kubbe benzeri yapılar oluşturmuyorsa, numuneden yeterli ortamın çıkarılmamış olması muhtemeldir. Bu durumda, kubbeler oluşana kadar numuneyi daha çözünür bir ECM ile seyreltin.
Bir plakanın tamamında mantar veya bakteriyel kontaminasyon bulunduğunda (bkz. Şekil 4), en iyi çözüm plakayı atmaktır. Antifungal veya antibiyotik ilaçlarla tedavi denenebilir, ancak böyle bir girişimin başarısı son derece düşüktür. Tek bir kuyu bir plakada kirlenmişse, canlı ve etkilenmemiş kuyular yeni bir plakaya temizlenebilir (4.1 ila 4.5 arasındaki adımları izleyin) ve yakından izlenebilir. Numune zaten Acil Durum Dondurulmuşsa, numunenin çözülmesi inkübatörü ek kontaminasyon riskine maruz bıraktığından, numunenin tamamının atılması önerilir.
Sağlıklı organoid kültür en azından orta büyüklükte ve orta yoğunluklu kategoride veya daha büyük olmalıdır. Optimal yoğunluk, organoid kültür büyümesi için çok önemlidir. Düşük yoğunluk, organoidleri orta yoğunluğa kadar temizleyerek düzeltilmelidir. Aşırı yoğunluk durumu ortaya çıkarsa (aşırı kalabalık), organoidler daha fazla kuyuya genişletilmelidir. Hücresel apoptozun brüt belirtileri genellikle organoid kültürün hem aşırı kalabalıklaşmasına hem de düşük yoğunluğuna eşlik eder. Bu sorunlar zamanla düzeltilmezse, tüm organoid kültür birkaç gün içinde apoptotik hale gelecektir. Organoidler ekstra büyük boyuta veya çok yüksek yoğunluğa ulaşırsa, kültür bir deney, donma veya sabitleme için kullanılmalıdır.
Organoid ortam şu anda 17 bileşen içermektedir ve bu nedenle organoid bakım ve genişleme için gereken büyüme faktörlerinin eklenmesi pahalı olabilir. Bu problem, şartlandırılmış CMGF + üretmek için büyüme faktörlerini sentezleyen 2D hücre kültürlerinin büyütülmesiyle çözülebilir. Hücre kültürü L-WRN, Wnt-3a, R-Spondin-3 ve Noggin büyüme faktörlerini37 üretir. Hücre kolonisi% 90 DMEM / F12 ve% 10 FBS kültür medyası kullanır. Kültür yüzde 90 akıcılığa ulaştığında, medya 1 hafta boyunca her gün hasat edilir. Hasat edilen ortam daha sonra 2x CMGF + ile karıştırılır (bu büyüme faktörleri olmadan). 2D kültürler gerekli büyüme faktörlerini maliyetin bir kısmıyla üretebilirken, medyayı üretmek için eklenen zaman ve hazırlık beklenmelidir. Şartlandırılmış ortam partileri arasındaki büyüme faktörlerinin konsantrasyonları da farklılık gösterebilir37,38.
Köpek yetişkin kök hücre kaynaklı organoid kültürleri, Tek Sağlık Girişimi'nin hedeflerine ulaşmaya yardımcı olabilecek benzersiz bir biyomedikal modeldir39. Organoid teknolojisi, gelişim biyolojisi, patofizyoloji, ilaç keşfi ve testi, toksikolojiden bulaşıcı hastalıkların ve rejeneratif tıbbın incelenmesine kadar birçok temel ve biyomedikal araştırma alanında kullanılabilir40. Translasyonel ve ters translasyonel araştırma, köpek organoidlerinin uygulanabilir olduğu alanlardır15. Köpekler yüzyıllardır translasyonel deneysel ortamlarda kullanılmıştır ve eşlik eden hayvan statüleri de veteriner hekimlikte en çok araştırılan türlerden biri olarak konumlarını kolaylaştırmıştır.
Sonuç olarak, bu makale bu modelin çeşitli biyomedikal alanlarda uygulanmasını kolaylaştırmak için köpek hepatik ve intestinal organoidlerinin izolasyonu, bakımı, toplanması ve biyobankacılığı için standartlaştırılmış çalışma protokolleri sunmaktadır. Bu model, bilginin disiplinler arası ve disiplinler arası paylaşımını teşvik etmek için Tek Sağlık Girişimi'nin bir aracı olarak ters çeviri araştırmasını teşvik etmek için benzersiz bir şekilde uygundur.

Kemirgenler, biyomedikal ve translasyonel araştırmalar için en yaygın kullanılan hayvan modelidir1. Kronik multifaktöriyel hastalıklarla klinik ilgileri son zamanlarda sorgulanmasına rağmen, hastalıkların temel moleküler patogenezini araştırmak için son derece yararlıdırlar2. Köpek modeli, kemirgenlere kıyasla çeşitli avantajlar sergiler3,4. Köpekler ve insanlar, evcilleştirmelerinin çeşitli dönemlerinde insan diyetinin tüketilmesi nedeniyle gelişen metabolomikler ve bağırsak mikrobiyomundaki benzerlikleri paylaşırlar5,6,7. Köpek ve insan gastrointestinal anatomisi ve fizyolojisi arasındaki benzerlikler örneklerden bir diğeridir8.
Ek olarak, köpekler genellikle sahipleriyle benzer ortamları ve yaşam tarzlarını paylaşırlar9. Kemirgenlere kıyasla köpeklerin daha uzun ömrü, çok sayıda kronik durumun doğal gelişimine izin verir10. İnflamatuar bağırsak hastalığı veya metabolik sendrom, insanlar ve köpekler arasında önemli benzerlikler paylaşan multifaktöriyel kronik hastalıklara örnektir11,12. Doğal olarak ortaya çıkan hastalıkları olan köpekleri içeren köpek preklinik çalışmaları, kemirgen modellerinden elde edilenlerden daha güvenilir veriler üretebilir13. Bununla birlikte, canlı hayvan araştırmalarının kullanımını en aza indirmek ve 3R'lerin (Azalt, Rafine Et, Değiştir)14 ilkelerine uymak için, 3D in vitro köpek organoidleri kullanılarak yapılan in vivo testlere alternatifler ortaya çıkmıştır15.
Organoidler, orijinal organlarının fizyolojisini ve mikroanatomisini özetleyen, kendi kendine monte edilmiş 3D kök hücre türevi yapılardır16,17. Bu teknoloji ilk olarak 200917 yılında Sato ve ark. tarafından tanımlanmış ve epitel hücre hatlarında 2D kanser hücre kültürleri kullanılarak daha önce mümkün olandan daha fazla translaable in vitro çalışmalara izin vermiştir18,19,20. Organoidler, klinik öncesi toksikolojik21,22,23, emilim veya metabolizma çalışmaları24,25,26,27,28 gibi birçok biyomedikal disiplinde ve kişiselleştirilmiş tıbbi yaklaşımlarda29,30,31 gibi birçok biyomedikal disiplinde in vitro modellerde yararlıdır. . Köpek bağırsak organoidlerinin başarılı kültürü ilk kez 201912'de tanımlanmışken, bir köpekten türetilen hepatik organoidler ilk olarak Nantasanti ve ark. tarafından 201532'de bildirilmiştir. Köpek organoidleri o zamandan beri köpek kronik enteropatilerini, gastrointestinal stromal tümörleri, kolorektal adenokarsinom12 ve Wilson Hastalığını33,34 araştıran çalışmalarda başarıyla kullanılmaktadır.
Yetişkin kök hücreler nekropsiler yoluyla toplanabilirken, organoid teknoloji her zaman hayvanların kurban edilmesini gerektirmez. Endoskopik ve laparoskopik biyopsiler, hatta organların ince iğneli aspiratları35, epitelyal organoid izolasyonu için uygun bir yetişkin kök hücre kaynağıdır12. Bu tür invaziv olmayan tekniklerin veterinerlik pratiğinde yaygın kullanımı, tersine translasyonel araştırma seçeneklerini kolaylaştırır (bilgilerin veteriner klinik uygulamasından insan klinik uygulamasına çevirisi ve bunun tersi de geçerlidir)15. Organoid kültürünün ve bakım yöntemlerinin standardizasyonu ile organoid teknolojisinin daha da ilerlemesi sağlanabilir. Burada sunulan organoid protokol kısmen Saxena ve ark.'nın 201536'dan itibaren daha önce yayınlanmış çalışmalarına dayanmaktadır ve yöntemler köpek bağırsak ve hepatik organoid kültürünün özelliklerine uyacak şekilde uyarlanmıştır. Köpek organoid protokollerinin genel iş akışı Şekil 1'de gösterilmiştir.
Köpek Organoid İzolasyon Protokolü, endoskopik, laparoskopik ve cerrahi biyopsilerin yanı sıra nekropsilerden örnekler elde etme yöntemlerini sunar. Doku örneklerinin ilk ön muamelesini ve laboratuvara nakli için kullanılan metodolojileri özetlemektedir. Organoid izolasyonu için gerekli malzeme ve reaktifler 'İzolasyona Hazırlık' bölümünde özetlenmiştir. Doku örneklerinden yetişkin kök hücre izolasyonu süreci ayrıntılı olarak açıklanmaktadır. Son olarak, organoidlerin çözünür bir hücre dışı membran matrisi kullanılarak kubbe benzeri yapılara kaplanması işlemi tartışılmıştır.
İkinci protokol olan Köpek Organoid Bakım Protokolü, organoidleri belgeleme ve kültürleme yöntemlerini açıklar. Medya değişiklikleri ve sıklıkları bu bölümde tartışılmıştır. Ayrıca, 3D köpek organoidlerinin başarılı bir şekilde bakımını sağlamak için gerekli olan hücre kültürlerinin geçiştirilmesi ve temizlenmesi gibi laboratuvar prosedürleri açıklanmaktadır. Uygun pasaj, protokolün kritik bir adımıdır ve bu adımın olası ayarlamaları ve sorun giderme işlemleri makalede daha ayrıntılı olarak tartışılmıştır.
Son protokol, parafin gömme ve RNA koruması için tam yetişkin organoidleri hazırlama yöntemlerini içeren Köpek Organoid Toplama ve Biyobankacılık Protokolüdür. Sıvı azot depolamadaki biyobankacılık organoid numunelerinin yöntemleri de burada açıklanmaktadır. Son olarak, dondurulmuş numuneleri çözmenin ve büyümelerini desteklemenin yolları tartışılmaktadır.
Sonuç olarak, bu makale laboratuvarlar arası protokollerin standardizasyonu yoluyla tutarlı köpek organoid kültürü prosedürleri sağlamayı amaçlamaktadır. Bunu yaparken, makale, köpek organoid modellerinden türetilen verilerin çoğaltılabilirliğini kolaylaştırmayı ve translasyonel biyomedikal araştırmalardaki alaka düzeylerini arttırmayı amaçlamaktadır.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63515/63515fig01.jpg"> Şekil 1: Köpek organoid protokollerinin iş akışı. Köpek Organoid İzolasyon Protokolü, organoid izolasyon için gerekli malzemelerin hazırlanmasını, bir doku örneğinin toplanmasını (nekropsiler, endoskopik, laparoskopik ve cerrahi biyopsiler yoluyla) ve hücre ayrışması ve hücresel popülasyonun kaplanması konusunda rehberliği açıklar. Köpek Organoid Bakım Protokolü, organoid kültürünün temizlenmesini ve geçirilmesini tartışır. Organoid Hasat ve Biyobankacılık Protokolü, parafin gömme ve daha ileri organoid karakterizasyonu için organoid numunelerin hazırlanmasını tartışmaktadır. Organoid kültürleri biyobankaya yatırma ve sıvı azotta depolamadan canlandırma yöntemleri de tartışılmaktadır. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63515/63515fig01large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Chelating solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Sorbitol</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>BP439-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT</td>
			<td>Promega</td>
			<td>V3151</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>P217-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P5655-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4-2H2O</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S5136-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>S271-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen Strep</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>S5-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Organoid media</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>[Leu15]-Gastrin I human</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G9145-.5MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A-83-01</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>9094360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Advanced DMEM/F12</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12634-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17504-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Corning</td>
			<td>35-010-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamax</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>VWR Life Science</td>
			<td>J848-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human R-Spondin-1</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>120-38-500UG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Murine EGF</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>315-09-1MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Murine Noggin</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>250-38-250UG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Murine Wnt-3a</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>315-20-10UG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2 supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17502-048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-Acetyl-L-cysteine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9165-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nicotinamide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>N0636-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primocin</td>
			<td>InvivoGen</td>
			<td>ant-pm-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ROCK inhibitor (Y-27632)</td>
			<td>EMD Millipore Corp.</td>
			<td>SCM 075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SB202190 (P38 inhibitor)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S7067-25MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stemolecule CHIR99021 (GSK3&#946;)</td>
			<td>Reprocell</td>
			<td>04-0004-base</td>
			<td></td>
		</tr>
		
		<tr>
			<td>Trimethoprim</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T7883-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfamethoxazole</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7507-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic Acid, Glacial</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>A38-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl Sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Fisher Chemicals</td>
			<td>D128-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA, pH 8.0, 0.5 M</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15575-038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde (37%)</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>F79P-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G5882</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel Matrix For Organoid Culture</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356255</td>
			<td>Extracellular Membrane Matrix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde, 97%</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>A11313</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS, 1X (Phosphate-Buffered Saline)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-040-CM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS, 1X (Phosphate-Buffered Saline)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-040-CM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAlater Soln.</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM7021</td>
			<td>RNA Storage Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Express</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12604-021</td>
			<td>Trypsin-like Protease</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Other</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 Well Cell Culture Plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ACD Hybez II Hybridization System</td>
			<td>ACD a biotechne brand</td>
			<td>321710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge Tube, 15 mL</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430766</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CoolCell LX</td>
			<td>Corning</td>
			<td>BCS-405MC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryogenic Vials</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430488</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Centrifuge Tube (50 mL)</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>05-539-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GyroMini Nutating mixer (Rocker)</td>
			<td>Labnet</td>
			<td>S0500-230V-EU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat Bath</td>
			<td>Lab-Line Instruments</td>
			<td>3000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mr. Frosty Freezing Container</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>5100-0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop 2000</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>ND2000CLAPTOP</td>
			<td>SpectrophotometerAnalysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Panasonic incubator</td>
			<td>Panasonic</td>
			<td>MCO-170ML-PA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm M Wrapping Film</td>
			<td>Bemis Company Inc</td>
			<td>PM996/EMD</td>
			<td>Laboratory Flexible Film Tape</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protected Disposable Scalpels</td>
			<td>Bard-Parker</td>
			<td>239844</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAscope 2.5 HD Assay &#8211; RED</td>
			<td>ACD a biotechne brand</td>
			<td>322350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAscope H2O2 &#38; Protease Plus Reagents</td>
			<td>ACD a biotechne brand</td>
			<td>322330</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAscope Target Retrieval Reagents</td>
			<td>ACD a biotechne brand</td>
			<td>322000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAscope Wash Buffer Reagents</td>
			<td>ACD a biotechne brand</td>
			<td>310091</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Culture Dish</td>
			<td>Dot Scientific</td>
			<td>6676621</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Culture Plate 24 wells</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>FB012929</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

standardization and maintenance of 3d canine hepatic and intestinal organoid cultures for use in biomedical research

Köpekler, enflamatuar hastalıklar, metabolik hastalıklar ve kanser dahil olmak üzere insanlara benzer karmaşık multifaktöriyel hastalıklar geliştirir. Bu nedenle, insan tıbbına çeviri potansiyeline sahip ilgili büyük hayvan modellerini temsil ederler. Organoidler, menşe organlarının mikroanatomisini ve fizyolojisini taklit eden kök hücrelerden türetilen 3 boyutlu (3D), kendiliğinden monte edilmiş yapılardır. Bu translasyonel in vitro modeller, ilaç geçirgenliği ve keşif uygulamaları, toksikoloji değerlendirmesi ve multifaktöriyel kronik hastalıkların patofizyolojisinin mekanik bir şekilde anlaşılmasını sağlamak için kullanılabilir. Ayrıca, köpek organoidleri refakatçi köpeklerin yaşamlarını iyileştirebilir, veterinerlik araştırmalarının çeşitli alanlarında girdi sağlayabilir ve veteriner hekimlikte kişiselleştirilmiş tedavi uygulamalarını kolaylaştırabilir. Küçük bir donör grubu, organoid hücre hatları süresiz olarak alt kültürlenebildiğinden, sürekli doku toplama ihtiyacını azaltan bir organoid numune biyobankası oluşturabilir. Burada, yetişkin kök hücrelerden elde edilen bağırsak ve hepatik köpek organoidlerinin kültürüne odaklanan üç protokol sunulmaktadır. Köpek Organoid İzolasyon Protokolü, dokuyu işlemek ve hücre izolatının destekleyici bir matrise (çözünmüş hücre dışı membran matrisi) gömülmesi için yöntemleri özetlemektedir. Köpek Organoid Bakım Protokolü, genişleme için uygun zamanlama ile birlikte temizlik ve pasaj dahil olmak üzere organoid büyüme ve bakımı tanımlar. Organoid Hasat ve Biyobankacılık Protokolü, daha fazla analiz için organoidleri çıkarmanın, dondurmanın ve korumanın yollarını açıklar.

Watch this Scientific Journal Video about Standardization and Maintenance of 3D Canine Hepatic and Intestinal Organoid Cultures for Use in Biomedical Research at JoVE.com

Standardization and Maintenance of 3D Canine Hepatic and Intestinal Organoid Cultures for Use in Biomedical Research

3D organoid kültürler oluşturmak için köpek bağırsak ve hepatik dokularından yetişkin kök hücrelerin toplanması için deneysel yöntemler açıklanmaktadır. Ayrıca, tutarlı büyümeyi sağlamak ve köpek bağırsak ve hepatik organoid kültürlerini toplamak, biyobanka yapmak ve canlandırmak için standart çalışma prosedürleri sağlamak için laboratuvar teknikleri tartışılmaktadır.

Biyomedikal Araştırmalarda Kullanılmak Üzere 3D Köpek Hepatik ve Bağırsak Organoid Kültürlerinin Standardizasyonu ve Bakımı

Dogs develop complex multifactorial diseases analogous to humans, including inflammatory diseases, metabolic diseases, and cancer. Therefore, they ...

Köpek hepatik ve bağırsak organoidlerinin kültürü için protokoller bu yeni teknolojiyi standartlaştırmak için önemlidir. Bu teknik, numunelerin organoid izolasyonu, bakımı, toplanması ve daha sonra biyobankacılığı dahil olmak üzere köpek organoid kültürünün güvenilir ve tekrarlanabilir bir şekilde kurulmasını sağlar. Köpek organoidleri, biyoloji, bulaşıcı hastalık geliştirme, ilaç testi ve keşfi ve ayrıca bulaşma tıbbından çok sayıda uygulama için mükemmel bir model sağlayabilir.Başlamak için, beş mililitre 1X komple şelatlama çözeltisi, üç mililitre 1X komple şelatlama çözeltisine sahip bir tüp, bir boş tüp ve beş mililitre 1X komple şelatlama çözeltisine sahip bir tüp ve iki mililitre fetal sığır serumu içeren beş adet 15 mililitrelik santrifüj tüpü hazırlayın. İzolasyon gününde, biyogüvenlik kabinine steril bir Petri kabı, neşter, buz kovası ve soğuk gelişmiş DMEM besin karışımı F12 yerleştirin. Ön ısıtmak için gerekli sayıda 24 kuyucuklu hücre kültürü plakasını karbondioksit inkübatörüne yerleştirin.Çözünür hücre dışı membran matrisini çözülmesi için buz üzerine yerleştirin. Santrifüjü dört santigrat dereceye kadar önceden soğutun. Büyüme faktörlerine sahip tüm ortamları dondurucudan 37 santigrat derecelik bir su banyosuna taşıyın ve doğrudan ışığa maruz kalmaktan kaçının.Doku örneklerini taşıma tüpünde 30 saniye çalkalayın. Tüpte 0,5 mililitre kalana kadar sıvı yüzeyinin yakınında yavaş pipetleme yaparak herhangi bir dokuyu atmadan aşırı süpernatantı çıkarın. Dokuyu ve kalan süpernatantı steril bir Petri kabına aktarın.Tek kullanımlık bir neşter kullanarak, dokuyu yaklaşık beş dakika boyunca püre kıvamına benzeyen daha küçük parçalara kesin ve doğrayın. Kıyılmış dokuyu Petri kabından sıvı ile ilk komple şelatlama çözeltisi tüpüne pipetleyin, ardından Petri kabına iki mililitre gelişmiş DMEM besin karışımı F12 ekleyin. Kalan dokuyu yıkayın ve ilk komple şelatlama çözeltisi tüpüne aktarın.1X komple şelatlama çözeltisi tüpünü beş saniye boyunca yaklaşık beş kez vorteksleyin. Biyopsilerin tüpün dibine bir dakika yerleşmesine izin verin ve beş mililitre kalana kadar süpernatantı çıkarın. 1X komple şelatlama çözeltisini yeni tüpten numune tüpüne aktarın.Aşağıdaki iki tüp için önceki adımı tekrarlayın. Ve son iki yıkamada, süpernatantı tüpte kalan üç mililitreye kadar çıkarın. Biyopsileri ve 1X komple şelatlama çözeltisini numune tüpünden altı delikli bir plakanın bir kuyucuğuna aktarın.Numune tüpüne üç mililitre 1X komple şelatlama çözeltisi ekleyin. Kalan dokuları toplamak ve plakanın aynı kuyusuna aktarmak için yavaşça döndürün. Bir kuyuya 150 mikrolitre 0.5 molar etilen diamin tetraasetik asit ekleyin ve altı kuyucuklu plakayı dört santigrat derecede 20 derece 24 RPM rocker üzerine yerleştirin.Karaciğer örneklerini 10 dakika boyunca ve bağırsak örneklerini hareketli rocker üzerinde bir saat boyunca inkübe edin. Altı delikli plakayı biyogüvenlik kabinine geri taşıyın ve kıyılmış dokuyu ve sıvıyı fetal sığır serumu ile 1X komple şelatlama çözeltisi içeren bir tüpe aktarın. Dokuların süpernatantı çökelmesine ve dokunun üst kısmının 0.2 mililitresi ile boş bir tüpe taşımasına izin verin.Numuneyi içeren tüpü 700 XG'de dört santigrat derecede beş dakika boyunca döndürün. Kök hücreler artık kıyılmış doku ile birlikte peletlenmektedir. Pelet'i rahatsız etmemek için süpernatantı dikkatlice çıkarın ve atın.Peletin gelişmiş DMEM F12'de yeniden askıya alınması. Tüpü tekrar döndürün ve peleti rahatsız etmeden süpernatantı aspire edin. Hesaplanan çözünür hücre dışı membran matrisi hacmini numune tüpüne ekleyin.Hücre peletini kaybetmemek için ortamı çıkarırken dikkatli olun. Hücre dışı membran matrisi eklerken, organoid süspansiyonda aşırı kabarcıklar oluşturmamak için yavaşça pipetleyin. Numuneyi çözünür hücre dışı membran matrisi ile buz üzerinde tutun ve süspansiyonu kuyucukların ortasına tohumlayın, böylece çözünürleştirilmiş hücre dışı membran matrisi kubbe benzeri bir yapı oluşturur.Plakayı bir inkübatöre taşıyın ve çözünür hücre dışı membran matrisinin 30 dakika boyunca katılaşmasına izin verin. ROCK inhibitörü ve GSK3 beta'yı büyüme faktörleriyle birlikte tam ortamda karıştırın ve bu çözeltinin 500 mikrolitresini her bir kuyucuğa ekleyin. Plakayı inkübatöre yerleştirin.Köpek organoid protokolü tipik olarak kuyu başına yaklaşık 50.000 ila 150.000 bağırsak veya hepatik hücre üretir. Kök hücre izolasyonundan sonra, hepatik köpek organoidleri yaşam döngülerine genişleyen sferoidler olarak başlar ve yedi gün sonra tomurcuklanan ve farklılaşan organoidlere dönüşürler. Sferoidlerin hacmi, yüzey alanı, 2D elips alanı ve çevresi hesaplandı.Organoid kültürün sağlığını değerlendirmek için 2D elips alanı ve çevresi kullanıldı. Belirteçlerin ekspresyonunun yarı kantitatif bir şekilde değerlendirilmesi, sferoidlerin tercihen kolanjiyosit belirteci KRT7'yi bir ila %26 arasında ifade ettiğini göstermiştirKök hücre belirteci LGR5 ekspresyonu %0,17 ila %0,78 arasında değişirken, hepatosit belirteçleri Forkhead box 1A için %0,05 ila %0,34 ve sitokrom-P450 için %0,03 ila %0,28 arasında daha düşük bir oranda eksprese edilmiştir. Tripsin benzeri proteaz ile 12 dakikalık bir inkübasyon, organoid büyümesini inhibe etmedi.Bununla birlikte, organoidlerin büyümesi 24 dakikalık bir inkübasyon kullanılarak olumsuz etkilenmiştir. Köpek hepatik organoidlerinin elverişsiz bir ortamda hayatta kalma kabiliyeti, hepatik organoidlerin başarılı büyümesi ve hayatta kalması için gereken organoid ortam ve bodrum matriksinin hacmini belirlemek için analiz edildi. Organoidlerin sağkalım oranı 12.9 gün ile 18 gün arasında değişmekteydi.Temel hücre kültürü teknikleri ve aseptik yaklaşımlar, uygun organoid izolasyonu ve bakımı için temel ön koşullardır.

Research

JoVE Journal

Medicine

In Vivo Canine Muscle Function Assay

In Vivo Canine Muscle Function Assay

Vivo Köpek Kas Fonksiyon Testi

We describe a minimally-invasive and reproducible method to measure canine pelvic limb muscle strength and muscle response to repeated eccentric 
...

Generation of Alginate Microspheres for Biomedical Applications

Biyomedikal Uygulamalar için Aljinatta Mikrokürelerin Üretimi

Alginate-based materials have received considerable attention for biomedical applications because of their hydrophilic nature, biocompatibility, and ...

The Bovine Lung in Biomedical Research: Visually Guided Bronchoscopy, Intrabronchial Inoculation and In Vivo Sampling Techniques

The Bovine Lung in Biomedical Research: Visually Guided Bronchoscopy, Intrabronchial Inoculation and In Vivo Sampling Techniques

Biyomedikal Araştırma Sığır Akciğer: Görme Kılavuzlu Bronkoskopi, intrabronşiyal Aşılama ve<em&gt; In Vivo</em&gt; Örnekleme Teknikleri

There is an ongoing search for alternative animal models in research of respiratory medicine. Depending on the goal of the research, large animals as ...

Use of a Low-flow Digital Anesthesia System for Mice and Rats

Fare ve Sıçanlarda için düşük akış Dijital Anestezi Sistemi Kullanımı

A traditional vaporizer depends on flowing gas and atmospheric pressure for passive anesthetic vaporization. Newly developed direct injection vaporizers ...

Forskolin-induced Swelling in Intestinal Organoids: An In Vitro Assay for Assessing Drug Response in Cystic Fibrosis Patients

Forskolin-induced Swelling in Intestinal Organoids: An In Vitro Assay for Assessing Drug Response in Cystic Fibrosis Patients

Forskolin kaynaklı bağırsak Organoids şişme: Bir<em&gt; İn Vitro</em&gt; Deney Kistik Fibrozis Hastalarında İlaç Tepki değerlendirilmesi için

Recently-developed cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR)-modulating drugs correct surface expression and/or function of the mutant ...

Optimized Analysis of In Vivo and In Vitro Hepatic Steatosis

Optimized Analysis of In Vivo and In Vitro Hepatic Steatosis

Optimize Analizi<em&gt; İn Vivo</em&gt; ve<em&gt; İn Vitro</em&gt; Karaciğer Steatoz

Establishing a system of procedures to qualitatively and quantitatively characterize in vivo and in vitro hepatic steatosis is important for metabolic ...

Improvement of a Closed Chest Porcine Myocardial Infarction Model by Standardization of Tissue and Blood Sampling Procedures

Kapalı göğüs domuz miyokard infarktüsü manken standardizasyon doku ve kan örnekleme prosedürleri tarafından geliştirilmesi

Myocardial ischemia reperfusion (I/R) injury contributes to almost half of the necrotic area after myocardial infarction. To date there is no approved ...

Generation of Human 3D Lung Tissue Cultures (3D-LTCs) for Disease Modeling

Generation of Human 3D Lung Tissue Cultures 3D-LTCs for Disease Modeling

Hastalık modelleme için insan 3D akciğer doku kültürleri (3D-LTCs) nesil

Translation of novel discoveries to human disease is limited by the availability of human tissue-based models of disease. Precision-cut lung slices (PCLS) ...

Use of 3D Robotic Ultrasound for In Vivo Analysis of Mouse Kidneys

Use of 3D Robotic Ultrasound for In Vivo Analysis of Mouse Kidneys

Fare Böbreklerinin In Vivo Analizi için 3D Robotik Ultrason Kullanımı

Common modalities for in vivo imaging of rodents include positron emission tomography (PET), computed tomography (CT), magnetic resonance imaging (MRI), ...

Standardizing the Responses to Platelet Agonist Collagen-Related Peptide

Reproducibility and Harmonization in Research Using Biological Standards: The Example of Platelet Agonist Collagen-Related Peptide

Biological Standardization to Ensure Reproducibility and Harmonization in Research (Video) | JoVE

Biyolojik Standartlar Kullanılarak Yapılan Araştırmalarda Tekrarlanabilirlik ve Uyum: Trombosit Agonisti Kollajen İlişkili Peptit Örneği

Metrology - the science of measure - is a subject few biological scientists are taught about in their training to their detriment; the application of ...