Name: routine collection of high-resolution cryo-em datasets using 200 kv transmission electron microscope
Uploaded: 2022-03-16T14:00:00
Duration: 9 min 49 s
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	<li>Wang, J., Hua, T., Liu, Z. -. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+features+of+activated+GPCR+signaling+complexes.">Structural features of activated GPCR signaling complexes.</a> Current Opinions in Structural Biology. 63, 82-89 (2020).</li><li>Chen, S., Gouaux, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+mechanism+of+AMPA+receptor+-+auxiliary+protein+complexes.">Structure and mechanism of AMPA receptor - auxiliary protein complexes.</a> Current Opinions in Structural Biology. 54, 104-111 (2019).</li><li>K&#252;hlbrandt, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+mechanisms+of+F-Type+ATP+synthases.">Structure and mechanisms of F-Type ATP synthases.</a> Annual Review of Biochemistry. 88, 515-549 (2019).</li><li>Laverty, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo-EM+structure+of+the+human+&#945;1&#946;3&#947;2+GABA+A+receptor+in+a+lipid+bilayer.">Cryo-EM structure of the human &#945;1&#946;3&#947;2 GABA A receptor in a lipid bilayer.</a> Nature. 565 (7740), 516-520 (2019).</li><li>Liu, F., Zhang, Z., Csan&#225;dy, L., Gadsby, D. 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Sagar Khavnekar ne signale aucun conflit d’intérêts. Les autres auteurs sont des employés de Thermo Fisher Scientific, la division MSD-EM.

Le protocole décrit suppose que l’optique du microscope TEM utilisé est dans un état bien aligné. Pour la GDT de 200 kV utilisée dans ce protocole, ces alignements de colonnes sont effectués, vérifiés et enregistrés par un technicien de service expérimenté après l’installation du microscope ou toute intervention de service importante. Ces paramètres d’alignement peuvent être rappelés à tout moment dans l’interface utilisateur du microscope. Les utilisateurs peuvent utiliser les procédures d’alignement direct dans l’interface utilisateur du microscope pour modifier à nouveau les paramètres critiques. Certains alignements, tels que l’inclinaison et le changement de canon, sont stables et n’ont pas besoin d’être ajustés quotidiennement par les utilisateurs. Les vérifications et les réalignements (si nécessaire) de l’inclinaison et du décalage du pistolet par le superviseur du microscope sont conseillés deux fois par an. D’autre part, certains alignements sont critiques et doivent être alignés avant chaque collecte de données comme décrit dans le protocole ci-dessus (comme l’astigmatisme objectif et l’alignement sans coma). Si la fonction Autocoma du logiciel d’analyse ne parvient pas à converger, l’alignement des points de pivot d’inclinaison du faisceau et/ou du centre de rotation doit être vérifié et ajusté, et le centrage correct de l’ouverture C2 doit être confirmé. Par la suite, la fonction Autostigmate doit être exécutée car des stigmates objectifs sont également utilisés pour la correction du coma. Ces alignements doivent être itérés jusqu’à ce que les fonctions Autostigmate et Autocomactions réussissent leur première itération. Si nécessaire, une autre zone peut être sélectionnée (par exemple, une feuille de carbone de support sans glace), une mise au point imagée ajustée ou un temps d’acquisition d’image augmenté pour optimiser le rapport signal/bruit dans les images acquises et la visibilité de plusieurs anneaux de Thon dans la transformée de Fourier des images acquises.
Les microscopes cryo-EM modernes génèrent de grandes quantités de données qui dépassent souvent 1 To par ensemble de données pour réaliser des reconstructions 3D haute résolution, en particulier pour les protéines à faible symétrie. Les données et les résultats de cryo-EM sont également généralement complétés par des données et des résultats de méthodes orthogonales permettant de bien comprendre les relations structure-fonction dans chaque projet scientifique. L’organisation des données collectées, leur transfert dans un pipeline de traitement d’images et le partage d’une reconstruction cryo-EM résultante entre collaborateurs imposent des exigences supplémentaires aux nouveaux utilisateurs de la méthodologie cryo-EM pour mettre en place leur infrastructure informatique locale. Les logiciels de gestion de données, tels qu’Athena, facilitent le stockage centralisé des données acquises par tout instrument connecté ou logiciel exploité par un utilisateur enregistré. Les données et métadonnées stockées sont accessibles à l’aide d’une interface de navigateur Web simple par plusieurs utilisateurs, qui peuvent avoir différents rôles dans le projet avec des droits d’accès différents (en tant que propriétaire, collaborateur ou visualiseur) en fonction de leurs informations de connexion et de leur définition de partage de données dans la configuration de l’expérience. Cette numérisation des flux de travail expérimentaux fournit des moyens de partage de données et de métadonnées entre collaborateurs sans duplication inutile et augmente la productivité et la traçabilité des flux de travail utilisés. La mise en œuvre d’une structure générale et personnalisable de projets, d’expériences et de flux de travail dans un logiciel de gestion de données est universelle et permet la personnalisation et l’intégration d’expériences orthogonales à l’aide de méthodes complémentaires dans une base de données de projet unique.
La sélection des zones pour la collecte de données sur une grille cryo-EM est essentielle pour l’acquisition réussie d’ensembles de données à haute résolution. Les grilles cryo-EM produites avec des dispositifs traditionnels de congélation par immersion, tels que le Vitrobot (un système de vitrification entièrement automatisé), affichent généralement un gradient d’épaisseur de glace sur la surface de la grille (Figure 4). Cela peut être bénéfique car la grille contient des zones avec différentes épaisseurs de glace; toutefois, les zones ayant l’épaisseur de glace idéale pour la collecte de données doivent être identifiées comme décrit dans le protocole ci-dessus. Une grille cryo-EM optimale doit contenir le moins de contamination de glace de transfert possible et contenir suffisamment de carrés de grille avec une feuille de support trouée intacte. La collecte de données sur les carrés de grille qui ont des fissures ou des zones cassées n’est pas recommandée car les images collectées seront affectées par une dérive globale beaucoup plus forte lors de l’éclairage par un faisceau d’électrons par rapport aux carrés de grille avec une feuille de support intacte. L’excès de glace cristalline peut obstruer la majorité des trous de feuille et / ou interférer avec la mise au point automatique et de tels carrés de grille doivent également être évités. Les carrés de grille avec de la glace mince présentent généralement de grandes zones vitrées et de nombreux trous de feuille brillants qui sont visibles dans une image prise à l’aide du préréglage Atlas. L’apparition de glace plus épaisse à proximité des barres de grille est à prévoir et non critique car les trous de feuille dans ces zones du carré de la grille sont exclus pendant la procédure de sélection des trous. La présence de plusieurs trous vides dans un carré de grille peut signifier que la glace vitrée dans les trous environnants est extrêmement mince et peut contenir des particules endommagées ou pas de particules du tout. En règle générale, il est sage de choisir des carrés de grille avec une variété d’épaisseurs de glace à différentes régions de la grille pour le dépistage et l’évaluation initiaux afin de comprendre quelles zones ont les meilleures conditions pour la collecte de données à haute résolution et présentent la densité de particules et la distribution d’orientation idéales. Pour les échantillons de protéasomes apoF et 20S utilisés dans cette étude, les zones avec la glace observable la plus mince contiennent les meilleures conditions pour l’imagerie à haute résolution de ces échantillons.
Lors de la sélection automatique de trous dans tous les carrés de grille sélectionnés à l’aide du logiciel de collecte de données, il est conseillé d’effectuer une tâche d’exécution de modèle sur un trou représentatif dans chaque carré de grille pour vérifier et s’assurer que ni les carrés trop épais, trop minces ou inattendus non vitreux n’ont été choisis pour la collecte de données. Lors de l’acquisition des données, les indicateurs de qualité clés des images collectées, tels que la dérive de l’image et l’ajustement CTF, peuvent être surveillés à l’aide de l’EQM. La collecte de données peut ensuite être optimisée en sautant des zones qui produisent des images de mauvaise qualité. Cependant, les images avec des ajustements CTF haute résolution peuvent toujours contenir des images avec des particules dans quelques orientations préférées ou des particules dénaturées dans une couche de glace trop mince. La sélection de particules en temps réel et la classification 2D à partir d’images collectées fourniraient des informations supplémentaires sur la qualité des données structurelles dans les particules imagées et révéleraient à la fois les orientations préférées des particules intactes dans la glace ou la structure incohérente des particules (partiellement) dénaturées. Le calcul des moyennes de classe peut donc aider à affiner davantage les régions appropriées pour la collecte de données, comme cela a déjà été mis en œuvre et montré dans d’autres progiciels23,28.
La sélection des paramètres d’imagerie pour l’acquisition de données, tels que le grossissement, le débit de dose d’électrons et la plage de mise au point, dépend de plusieurs critères, tels que la résolution cible, la taille de la protéine, la concentration de l’échantillon, le débit souhaité du microscope, etc. Pour la caméra à détecteur d’électrons direct utilisée dans ces expériences, le débit de dose d’électrons a été choisi dans la gamme de 4-5 e-/pix/s en sélectionnant une taille et une intensité SPOT appropriées pour maintenir un éclairage parallèle. Comme le montre le tableau 1, une taille SPOT différente peut être utilisée dans le préréglage Trou/Hauteur eucentrique pour assurer un rapport signal/bruit suffisant dans l’image pour le centrage des trous pendant la collecte des données. Le grossissement doit être choisi de telle sorte que la taille des pixels soit au moins 2 à 3 fois inférieure à la résolution cible pour la reconstruction cryo-EM. Cependant, plus le grossissement est élevé (c’est-à-dire une taille de pixel plus petite), plus le champ de vision est capturé dans les images et il y a moins de particules par image, ce qui entraîne finalement un temps de collecte de données plus long pour collecter des images avec suffisamment de particules pour reconstruire des cartes 3D à haute résolution. Pour l’échantillon apoF, nous avons utilisé la taille de pixel de 0,43 Å car nous avions une concentration d’échantillon suffisante pour une densité élevée de particules dans les images et une résolution inférieure à 2 Å de la reconstruction. Pour l’échantillon de protéasome 20S, nous avons utilisé la taille de pixel de 0,68 Å pour couvrir un champ de vision plus large dans les images acquises. Généralement, pour les microscopes TEM de 200 kV, les images cryo-EM sont acquises dans la plage de mise au point de 0,8 à 2,0 μm. Cependant, grâce à l’amélioration du contraste et du rapport signal/bruit à l’aide du filtre d’énergie, les acquisitions de données peuvent être effectuées beaucoup plus près de la mise au point pour mieux préserver les informations haute résolution dans les images acquises en raison de plus petites aberrations et de la réduction correspondante de la fonction d’enveloppe CTF. Nous n’utilisons pas non plus d’ouverture objective car l’ouverture peut introduire des aberrations d’image supplémentaires alors que le contraste de l’image est déjà suffisamment amélioré en utilisant le filtre d’énergie. Pour les échantillons de protéasome apoF et 20S, nous avons utilisé les paramètres de mise au point de 0,5 μm, 0,7 μm et 0,9 μm. Pour les protéines plus petites (<200 kDa), nous avons utilisé des paramètres de mise au point de -0,5 μm, -0,7 μm et -0,9 μm pour améliorer le contraste des particules et faciliter la sélection des particules et l’alignement grossier initial dans l’étape de raffinement 3D de la reconstruction 3D, ce qui a conduit à des cartes 3D de résolution ~ 2,5 Å (résultats non publiés).
Nous avons déjà montré que l’imagerie avec un filtre à énergie améliore le rapport signal/bruit (SNR) dans les images cryo-EM collectées sur les microscopes TEM 300 kV haut de gamme11. En fait, lorsque les électrons traversent un échantillon, deux principaux types d’interactions se produisent: i) les électrons dispersés de manière élastique maintiennent leur énergie et contribuent à la formation d’images en interférant avec le faisceau incident non diffusé via le mécanisme de contraste de phase ii) les électrons diffusés de manière inélastique perdent de l’énergie dans l’échantillon et contribuent principalement au bruit dans les images. Par conséquent, le SNR peut être considérablement amélioré en filtrant les électrons dispersés de manière inélastique, qui ont une énergie inférieure à celle du faisceau incident et des électrons diffusés de manière élastique, à l’aide d’une fente d’énergie étroite. Cependant, il est essentiel d’utiliser un filtre d’énergie suffisamment stable, tel que le Selectris ou le Selectris-X, pour pouvoir utiliser des fentes très étroites (10 eV ou moins) sur de longues (plus de 12 heures) d’acquisition automatisée de données cryoEM haute résolution.
Les images cryo-EM acquises avec des microscopes TEM de 200 kV dans les mêmes conditions qu’avec des microscopes TEM de 300 kV présentent un SNR plus petit à haute résolution (en particulier <4 Å) en raison de la désintégration plus rapide des fonctions de l’enveloppe CTF. Par conséquent, un plus grand nombre de particules (et donc un nombre plus élevé d’images collectées) est nécessaire pour atteindre une certaine résolution lors de l’utilisation de TEM de 200 kV. En outre, la profondeur de champ (10-25 nm dans la plage de résolution 2-3 Å) est également environ 20% plus petite dans les images 200 kV35, ce qui signifie que moins de particules dans la couche de glace (généralement 20-50 nm d’épaisseur) seront entièrement mises au point et contribueront de manière constructive à toutes les caractéristiques haute résolution d’une reconstruction 3D calculée, à moins que les valeurs de défocalisation ne soient affinées pour chaque particule indépendamment dans les étapes ultérieures de la procédure de reconstruction 3D. Pour les particules plus grosses (telles que les virions icosaédriques ou d’autres assemblages macromoléculaires), la taille des particules peut dépasser la profondeur de champ à haute résolution et introduire des erreurs de phase dues à l’approximation planaire de la sphère d’Ewald dans les algorithmes de reconstruction 3D standard36. Ces erreurs peuvent être affinées par des algorithmes avancés qui sont déjà implémentés dans les packages de traitement d’image cryo-EM courants 37,28,39. Comme la sphère d’Ewald a une courbure plus grande dans les données de 200 kV que dans les données de 300 kV, la correction de la sphère d’Ewald est nécessaire à des résolutions relativement plus faibles et/ou pour des assemblages macromoléculaires relativement plus petits lors de l’utilisation de TEM de 200 kV. D’autre part, les images de 200 kV présentent un contraste plus élevé de particules dans la glace mince (20-50 nm) qui est significativement plus mince que le chemin libre moyen de l’électron de 200-300 keV (220-280 nm). Le contraste plus élevé contribue à améliorer l’alignement global correct des particules individuelles, en particulier pour la diffusion faible de protéines plus petites dont la structure n’est pas encore connue, et le modèle de référence 3D n’est pas encore bien établi.
Ici, nous avons démontré sur l’exemple d’un protéasome 20S que le contraste et la qualité de l’image pouvaient être améliorés de la même manière avec un filtre à énergie lors de l’utilisation d’un microscope TEM 200 kV. En utilisant le même nombre de particules, les données collectées à l’aide de la fente de 20 eV ont été reconstruites à une résolution de 2,26 Å par rapport aux données collectées avec la fente d’énergie entièrement ouverte qui n’a été reconstruite qu’à une résolution de 2,34 Å. La meilleure reconstruction a été obtenue à partir des données collectées à l’aide de la fente de 10 eV qui a été reconstruite à une résolution de 2,14 Å. Ces résultats concordent avec la prédiction théorique selon laquelle le filtrage des électrons diffusés de manière inélastique augmente le SNR dans les images collectées et facilite une résolution plus élevée dans les reconstructions cryo-EM à partir du nombre donné de particules, comme résumé dans le tableau 4. Ces résultats ont été confirmés par les facteurs B calculés à partir de ces ensembles de données qui indiquent une meilleure qualité d’images dans les ensembles de données filtrés par l’énergie.
Nous pouvons donc conclure que si les microscopes TEM 300 kV offrent le débit le plus élevé et la résolution la plus élevée possible dans les reconstructions cryo-EM, les microscopes TEM 200 kV fournissent également des ensembles de données de haute qualité pour les reconstructions cryo-EM à haute résolution. Nous avons montré ici que la qualité des images acquises, et donc le temps global de structure, peut être encore améliorée en utilisant le TEM 200 kV équipé d’un filtre d’énergie et d’un détecteur d’électrons direct. Le protocole présenté décrit toutes les étapes nécessaires pour obtenir régulièrement des données cryo-EM à haute résolution à l’aide de cette configuration et révéler de fins détails structurels des structures 3D macromoléculaires, qui sont essentiels pour comprendre les relations structure-fonction clés en biologie structurale et en conception de médicaments basés sur la structure.

La détermination de la structure des protéines est essentielle pour comprendre l’architecture moléculaire, la fonction et la régulation des complexes protéiques impliqués dans les processus cellulaires clés, tels que le métabolisme cellulaire, la transduction du signal ou les interactions hôte-pathogène. La cryo-microscopie électronique (cryo-EM) est apparue comme une technique puissante capable de résoudre la structure 3D de nombreuses protéines et de leurs complexes qui étaient trop difficiles pour les techniques structurelles traditionnelles, telles que la diffraction des rayons X et la spectroscopie RMN. En particulier, la cryo-EM a été prouvée comme la méthode de choix pour les protéines membranaires, qui ne peuvent pas être facilement cristallisées ou préparées en quantités suffisantes pour les techniques structurelles traditionnelles, et a fourni de nouvelles informations sur la structure et la fonction des récepteurs cellulaires importants et des canaux ioniques 1,2,3,4,5 . Plus récemment, cryo-EM a joué un rôle important dans la lutte contre la pandémie de Covid-19 en déterminant le mécanisme de l’infection par le SARS-CoV-2 au niveau moléculaire, ce qui a élucidé les origines de la maladie Covid-19 et a fourni la base pour le développement rapide de vaccins et de thérapies efficaces 6,7,8,9,10.
En règle générale, les microscopes électroniques à transmission (TEM) haut de gamme de 300 kV sont utilisés pour la détermination de la structure à haute résolution des biomolécules par analyse monoparticulaire (SPA) cryo-EM afin de révéler leur conformation et leurs interactions. Récemment, la technique SPA a atteint une nouvelle frontière lorsque l’échantillon de référence commun cryo-EM apo-ferritine a été reconstruit à une résolution atomique (1,2 Å)11,12 à l’aide d’un TEM de 300 kV équipé du pistolet d’émission de champ froid (E-CFEG), d’un détecteur d’électrons direct et d’un filtre à énergie. Lors de cette résolution, il a été possible de résoudre sans ambiguïté les positions des atomes individuels dans la structure, la conformation des chaînes latérales d’acides aminés individuelles ainsi que la liaison hydrogène et d’autres interactions, ce qui ouvre de nouvelles possibilités pour la découverte de nouvelles cibles par des médicaments basés sur la structure et l’optimisation de candidats médicaments existants.
Les microscopes TEM de milieu de gamme de 200 kV sont souvent utilisés pour le criblage des échantillons et l’optimisation des échantillons avant la collecte finale de données à haute résolution à l’aide des microscopes TEM haut de gamme, en particulier dans les grandes installations cryo-EM. En règle générale, les échantillons imagés peuvent être résolus dans la plage de résolution 3-4 Å qui est suffisante pour passer à un TEM haut de gamme de 300 kV pour la collecte finale des données. Par conséquent, la collecte de données à l’aide du TEM 200 kV n’est souvent pas optimisée davantage pour obtenir les résultats de résolution les plus élevés possibles. De plus, de nombreuses questions biologiques intéressantes peuvent déjà être répondues et publiées à ces résolutions, car toutes les chaînes latérales d’acides aminés sont déjà résolues et l’occupation des sites de liaison des ligands peut également être déterminée de manière fiable13. Il a déjà été démontré que les TEM 200 kV peuvent atteindre des résolutions supérieures à 3 Å pour de nombreux échantillons 14,15,16,17,18. Les images prises à 200 kV présentent un contraste intrinsèquement plus élevé des particules imagées, ce qui peut même faciliter un alignement initial plus précis des particules malgré un signal plus atténué à haute résolution par rapport aux images TEM de 300 kV. Il est important de noter que la résolution obtenue des cartes cryo-EM reconstruites est également limitée par la flexibilité structurelle et l’hétérogénéité conformationnelle des échantillons imagés, ce qui a un impact sur les reconstructions de 200 kV et de 300 kV. En fait, beaucoup plus de reconstructions cryo-EM obtenues à l’aide des systèmes 300 kV ont été résolues dans la plage de résolution 3-4 Å qu’à des résolutions plus élevées19. Comme les microscopes TEM de 200 kV sont moins complexes et s’intègrent dans des pièces plus petites, ces microscopes représentent une bonne option moins coûteuse pour la détermination de la structure des macromolécules biologiques par cryo-EM tout en préservant l’automatisation de longues collections de données à partir de plusieurs échantillons stockés dans le système de chargeur automatique de microscope.
La collecte d’ensembles de données cryo-EM pour la détermination de la structure à haute résolution nécessite un alignement précis de l’optique du microscope. Les alignements de colonnes vont systématiquement de la source d’électrons jusqu’au système de lentilles du condensateur, à la lentille de l’objectif et au filtre d’énergie avec un détecteur d’électrons. La séquence complète des alignements n’est généralement pas requise. En cas de besoin, l’utilisateur est guidé via des procédures semi-automatisées avec une description appropriée de chaque étape dans une fenêtre d’aide contextuelle tout au long de la procédure d’alignement dans l’interface utilisateur du microscope (panneau de commande Alignements directs). Une fois que le microscope est complètement aligné, l’optique électronique reste stable et les alignements n’ont pas besoin d’être modifiés pendant au moins quelques mois. Seuls les alignements les plus sensibles, tels que l’éclairage parallèle du plan de l’échantillon, l’astigmatisme objectif et l’alignement sans coma, doivent être affinés juste avant de commencer la collecte de chaque ensemble de données. La qualité des données collectées peut ensuite être surveillée lors de la collecte de données à l’aide de différents logiciels, tels que EPU Quality Monitor, cryoSPARC Live20, Relion21, Scipion22, WARP23 ou Appion24.
Outre les alignements précis du microscope, la haute qualité d’échantillons bien purifiés avec une hétérogénéité conformationnelle et compositionnelle minimale est également une condition préalable à la collecte d’ensembles de données à haute résolution et à la résolution de structures à haute résolution. Plus de détails sur les protocoles typiques, les défis fréquents et les remèdes possibles peuvent être trouvés dans d’autres revues consacrées à ce sujet 25,26,27. Essentiellement, il est essentiel de trouver des zones sur une grille cryo-EM donnée qui a une glace suffisamment mince pour préserver les informations à haute résolution, et les particules individuelles sont densément réparties à des orientations aléatoires sans chevauchement. Cependant, les grilles cryo-EM typiques ont une épaisseur de glace non uniforme, et il est donc important de trouver et de sélectionner les zones optimales pour l’imagerie. Différents moyens d’estimation de l’épaisseur de glace sur la grille sont disponibles dans des progiciels dédiés à la collecte automatisée d’ensembles de données cryo-EM, tels que EPU 2, Leginon28 ou SerialEM29.
L’avènement des détecteurs d’électrons directs rapides et sensibles a permis la collecte d’images en de nombreuses fractions sous forme de films qui ont permis la compensation des mouvements induits par le faisceau et ont entraîné une augmentation substantielle de la qualité et de la quantité de données utilisées dans le traitement d’images et la reconstruction 3D finale30. Dans le même temps, l’automatisation et la collecte de données à haut débit fournissent d’énormes ensembles de données avec des milliers d’images / films qui représentent des défis pour le stockage et l’accès aux données. Le modèle adopté avec de grandes installations cryo-EM desservant des dizaines à des centaines d’utilisateurs nécessite en particulier une gestion organisée des données avec un suivi et un partage appropriés des données dans les pipelines cryo-EM établis31,32.
Cette étude décrit un protocole de collecte de routine d’ensembles de données cryo-EM à haute résolution à l’aide du microscope TEM Glacios de 200 kV. Les alignements nécessaires de l’optique du microscope sont décrits ainsi que les procédures d’évaluation des échantillons cryo-EM et la sélection des zones appropriées pour la collecte de données à haute résolution. L’organisation des données collectées et des métadonnées connexes avec des exemples d’informations est démontrée dans Athena - une plate-forme de gestion des données qui facilite l’examen des informations sur les échantillons et des données collectées. En utilisant l’échantillon d’apo-ferritine de souris, il a été possible de réaliser une reconstruction 3D à une résolution de 1,6 Å13. En utilisant le protocole décrit, nous avons également reconstruit la carte de densité 3D du protéasome 20S de Thermoplasma acidophilum à une résolution de 2,1 Å.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>AutoGrid rings</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>1036173</td>
			<td>Package of 100x AutoGrid rings for the standard EM grids.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C-Clip</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>1036171</td>
			<td>Package of 100 clips that secure 
			the standard EM grids inside the AutoGrid rings.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Data Management Platform</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>1160939</td>
			<td>Part of the Glacios base configuraiton; includes Athena Software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EPU Quality Monitor</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>1179770</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EPU Software</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>1025080</td>
			<td>Part of the Glacios base configuration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethane 3.5</td>
			<td>Westfalen</td>
			<td>A06010110</td>
			<td>Ethane gas used for making liquid ethane (puritiy at least N35, i.e. 99.95% vol)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 4 200kV</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>1166936</td>
			<td>Direct electron detector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glacios</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>1149551</td>
			<td>200 kV TEM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GloQube Plus Glow Discharge System for TEM Grids and surface modification</td>
			<td>Quorum</td>
			<td>N/A</td>
			<td>also available via Thermo Fisher Scientific (PN 1160602)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuantiFoil grids</td>
			<td>Quantifoil</td>
			<td>N/A</td>
			<td>R-2/1, 300 mesh; carbon foil grid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Relion</td>
			<td>MRC Laboratory of Molecular Biology</td>
			<td>N/A</td>
			<td>open source software: 
			https://relion.readthedocs.io/en/release-3.1/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Selectris with Falcon 
			4 for 200 kV</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>1191753</td>
			<td>Energy filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Selectris X with Falcon 
			4 for 200 kV</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>1191755</td>
			<td>Energy filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltrAuFoil grids</td>
			<td>Quantifoil</td>
			<td>N/A</td>
			<td>R-1.2/1.2, 300 mesh; gold foil grids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vitrobot Mk. IV</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>1086439</td>
			<td>Automated vitrification system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman 595 filter paper</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AA00420S</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

routine collection of high-resolution cryo-em datasets using 200 kv transmission electron microscope

La cryo-microscopie électronique (cryo-EM) a été établie comme une méthode de routine pour la détermination de la structure des protéines au cours de la dernière décennie, prenant une part toujours croissante des données structurelles publiées. Les progrès récents de la technologie TEM et de l’automatisation ont augmenté à la fois la vitesse de collecte des données et la qualité des images acquises tout en diminuant simultanément le niveau d’expertise requis pour obtenir des cartes cryo-EM à des résolutions inférieures à 3 Å. Alors que la plupart de ces structures à haute résolution ont été obtenues à l’aide de systèmes cryo-TEM de 300 kV à la pointe de la technologie, des structures à haute résolution peuvent également être obtenues avec des systèmes cryo-TEM de 200 kV, en particulier lorsqu’elles sont équipées d’un filtre à énergie. De plus, l’automatisation des alignements de microscopes et de la collecte de données avec une évaluation de la qualité d’image en temps réel réduit la complexité du système et assure des réglages optimaux du microscope, ce qui se traduit par un rendement accru d’images de haute qualité et un débit global de collecte de données. Ce protocole démontre la mise en œuvre des avancées technologiques récentes et des fonctionnalités d’automatisation sur un microscope électronique à cryo-transmission de 200 kV et montre comment collecter des données pour la reconstruction de cartes 3D suffisantes pour la construction de modèles atomiques de novo . Nous nous concentrons sur les meilleures pratiques, les variables critiques et les problèmes courants qui doivent être pris en compte pour permettre la collecte de routine de tels ensembles de données cryo-EM à haute résolution. En particulier, les sujets essentiels suivants sont examinés en détail: i) automatisation des alignements de microscopes, ii) sélection de zones appropriées pour l’acquisition de données, iii) paramètres optiques optimaux pour la collecte de données de haute qualité et à haut débit, iv) réglage du filtre d’énergie pour l’imagerie sans perte, et v) gestion des données et évaluation de la qualité. L’application des meilleures pratiques et l’amélioration de la résolution réalisable à l’aide d’un filtre à énergie seront démontrées sur l’exemple de l’apo-ferritine qui a été reconstruite à 1,6 Å, et du protéasome Thermoplasma acidophilum 20S reconstruit à une résolution de 2,1-Å à l’aide d’un TEM de 200 kV équipé d’un filtre d’énergie et d’un détecteur d’électrons direct.

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Routine Collection of High-Resolution cryo-EM Datasets Using 200 KV Transmission Electron Microscope

Des cartes cryo-EM à haute résolution de macromolécules peuvent également être obtenues à l’aide de microscopes TEM de 200 kV. Ce protocole montre les meilleures pratiques pour définir des alignements optiques précis, des schémas d’acquisition de données et la sélection de zones d’imagerie qui sont tous essentiels à la collecte réussie d’ensembles de données haute résolution à l’aide d’un TEM de 200 kV.

Collecte de routine d’ensembles de données cryo-EM haute résolution à l’aide d’un microscope électronique à transmission de 200 KV

Cryo-electron microscopy (cryo-EM) has been established as a routine method for protein structure determination during the past decade, taking an ...

La cryo-EM est devenue une technique standard pour la détermination de la structure des protéines et de leurs complexes. Ce protocole décrit les meilleures pratiques pour obtenir des ensembles de données Cryo-EM haute résolution à partir des microscopes TEM 200 kV de milieu de gamme. Cryo-EM peut déterminer la structure des protéines dans des conditions quasi natives en solution pour plusieurs états conformationnels et états fonctionnels simultanément, ce qui est insaisissable pour d’autres techniques structurelles.Les informations structurelles obtenues peuvent être utilisées pour élucider les mécanismes moléculaires de la fonction des protéines, ainsi que pour la conception de médicaments basés sur la structure. Par exemple, une publication récente dans la structure des fibrilles amyloïdes a révélé de multiples sites de liaison d’un ligand vital. Cependant, dans ce protocole, nous utilisons les échantillons standard d’apoferritine et de protéasome pour démontrer les étapes critiques de l’obtention de données Cryo-EM à haute résolution.L’utilisation d’un Cryo-TEM est devenue plus facile au cours des dernières années, notamment grâce à l’introduction de fonctionnalités d’automatisation avancées. Cependant, pour la première session, nous vous conseillons d’avoir une formation avec des utilisateurs plus expérimentés. À partir de là, la progression de la technique est relativement rapide.La démonstration de la procédure sera assurée par Adrian Koh, scientifique principal en application chez Thermo Fisher Scientific. Insérez des grilles automatiques dans la cassette du chargeur automatique dans des conditions d’azote liquide. Insérez la cassette avec des grilles automatiques dans une capsule de transfert refroidie à l’azote liquide.Insérez ensuite la capsule dans le microscope et cliquez sur le bouton Dock dans l’interface utilisateur du microscope pour charger la cassette de la capsule dans le chargeur automatique du microscope. Cliquez sur le bouton Inventaire pour vérifier la présence de grilles automatiques dans la cassette chargée. Cliquez ensuite sur les boutons Charger et Décharger pour insérer les grilles automatiques dans la colonne pour l’imagerie TEM.Sélectionnez l’onglet Atlas et cliquez sur le bouton Nouvelle session pour ouvrir une nouvelle session. Remplissez des détails tels que le nom de la session et l’emplacement de stockage des données et cliquez sur le bouton Appliquer. Sélectionnez les grilles d’intérêt en cochant une case en regard du numéro de grille correspondant.Cliquez sur le bouton Démarrer pour démarrer une collection entièrement automatisée d’atlas de toutes les grilles sélectionnées. Une fois la collection terminée, cliquez sur les étiquettes de grille pour consulter les atlas acquis. Sélectionnez l’onglet EPU et accédez à Nouvelle session pour créer une nouvelle session dans le panneau de gauche.Sélectionnez l’option Nouvelle session pour utiliser les préréglages optiques définis actuellement. Renseignez le nom de la session. Sélectionnez le type manuel de la session pour contrôler la sélection des trous individuels et des carrés de grille sélectionnés pour la collecte de données plus tard dans le protocole.Sélectionnez le mode d’acquisition plus rapide pour utiliser le décalage d’image sans aberration pour la collecte de données. Entrez ensuite l’emplacement pour enregistrer les métadonnées. Cliquez sur le bouton Appliquer pour créer une nouvelle session.Sélectionnez la tâche de sélection carrée dans le panneau de gauche pour afficher l’atlas collecté de la grille. Identifiez les carrés de la grille avec une feuille de support intacte sans dommage, de la glace vitreuse mince et des trous de feuille, une contamination négligeable de la glace cristalline dans le carré de la grille et un gradient de luminosité minimal à travers le carré de la grille et dans les trous de feuille individuels. Sélectionnez les carrés de grille pour la collecte de données, soit dans l’atlas complet, soit dans des images de tuiles de haute qualité.Cliquez avec le bouton droit de la souris sur un carré de grille d’intérêt et choisissez l’ensemble de la tâche de sélection. Cliquez sur le bouton Auto Eucentric pour passer automatiquement au premier carré de grille sélectionné. Ajustez la hauteur eucentrique et acquérez une image carrée de grille pour trouver des trous de feuille.Cliquez sur le bouton Trouver des trous pour trouver des trous de feuille dans l’image. Cliquez sur le bouton Supprimer les trous pour fermer le bouton de la barre de grille afin de désélectionner les trous près des barres de grille. Ajustez les limites dans l’histogramme de luminosité du filtre à glace pour éliminer tous les trous avec de la glace trop épaisse et tous les trous vides.Cliquez avec le bouton droit de la souris sur un trou dans l’image carrée de la grille et sélectionnez Déplacer l’étape vers l’emplacement déplacer l’étape ici. Sélectionnez la tâche de définition de modèle dans le panneau de gauche. Cliquez sur le bouton Acquérir pour acquérir une image entière.Définissez les valeurs de délai après le décalage de l’image à 0,5 seconde et de délai après le décalage de l’étape à cinq secondes. Cliquez sur le bouton Rechercher et centrer le trou pour centrer un trou dans l’image. Sélectionnez le bouton Ajouter une zone d’acquisition et cliquez sur l’image pour sélectionner l’emplacement dans le trou centré où l’acquisition d’image à fort grossissement sera prise.Sélectionnez le bouton Ajouter une zone de mise au point automatique et cliquez sur l’image pour sélectionner l’emplacement sur la feuille de support à côté du trou centré où la mise au point automatique de l’image sera effectuée. Cliquez sur la zone d’acquisition verte pour définir une séquence de valeurs de défocalisation dans la liste de mise au point dans la section supérieure de la fenêtre du logiciel. Après avoir défini les paramètres spécifiques de mise au point automatique, choisissez l’option Après le centrage pour faire le focus automatique au début de chaque cluster AFIS.Choisissez l’option Objectif objectif pour une mise au point automatique plus rapide et une dérive de scène réduite. Cliquez sur le bouton Préparer tous les carrés dans la tâche de sélection des trous pour définir automatiquement la collecte de données et tous les autres carrés de grille sélectionnés en fonction des paramètres utilisés dans ce premier carré de grille. Sélectionnez la tâche de définition du modèle, acquérez une nouvelle image, déplacez la scène vers une zone propre sur une feuille de carbone en cliquant avec le bouton droit de la souris et sélectionnez l’option de menu Déplacer l’étape ici.Sélectionnez l’onglet Fonctions automatiques. Après avoir réglé la mise au point et l’itération souhaitées, passez au préréglage de mise au point automatique et cliquez sur le bouton de démarrage pour exécuter la fonction de mise au point automatique. Sélectionnez la tâche Autostigmate, passez au préréglage Thon Ring et appuyez sur le bouton Démarrer.Sélectionnez la tâche Autocoma et appuyez sur le bouton Démarrer. Déplacez la scène vers une zone avec un carré de grille cassé. Confirmez la transparence de la zone en prenant une seule image de mise au point automatique.Ouvrez l’interface utilisateur Sherpa et sélectionnez l’application Filtre d’énergie. Cliquez sur le bouton Centre et sur l’option zéro perte pour centrer la fente du filtre à énergie zéro perte. Cliquez sur le bouton Tune dans l’option isochromaticité.Cliquez sur l’option Tune Magnification et Tune Distortions dans les distorsions géométriques et chromatiques. Accédez à l’onglet EPU, sélectionnez la tâche Acquisition automatisée et cliquez sur le bouton Démarrer l’exécution pour commencer la collecte de données entièrement automatisée. La figure montre des grilles Cryo-EM affichant un gradient d’épaisseur de glace sur la surface de la grille.Les grilles exclues de l’enquête plus approfondie sont une mauvaise grille avec de la glace épaisse et une grille courbée avec une mauvaise glace et une contamination, tandis que les grilles acceptables sont celles avec un bon gradient de glace et une grille typique avec une bonne glace mince et un petit gradient de glace. La figure montre le rendu 3D final de la carte Cryo-EM de l’apoferritine reconstruite. La stabilité et la symétrie élevées en font un échantillon de référence optimal pour l’imagerie cryo-EM haute résolution et le traitement d’images.Le polissage bayésien, le raffinement CTF et la correction de la sphère d’Ewald ont abouti à une carte de résolution d’angstrom de 1,63. La figure montre une vue détaillée de la carte Cryo-EM de l’apoferritine reconstruite au niveau de la chaîne latérale des acides aminés individuels. La densité des chaînes latérales d’acides aminés est bien résolue et le modèle atomique peut être construit sans ambiguïté dans la carte.L’image ici montre deux ensembles de données différents à des valeurs de défocalisation différentes collectées à partir de la même grille Cryo-EM avec des carrés de grille similaires avec une fente entièrement ouverte et une fente de 10 électronvolts qui indique que la fente de 10 électrons-volt améliore considérablement le contraste de l’image. La figure ci-dessous montre un aperçu de la carte Cryo-EM du protéasome 20S avec des sous-unités segmentées utilisées comme échantillon Cryo-EM standard. Et sa vue zoomée avec un modèle atomique ajusté représente le noyau catalytique stable du complexe de protéasomes avec la symétrie D7.Le protocole contient deux étapes critiques. Premièrement, la recherche de zones avec de la glace vitreuse mince contenant des particules homogènes. Et deuxièmement, la mise en place d’un éclairage parallèle pour l’acquisition de données.Avec des reconstructions à haute résolution de protéines atteignant deux à trois angströms en résolution, vous êtes mieux en mesure de comprendre les mécanismes moléculaires de la maladie et d’améliorer les pistes de médicaments. Auparavant, la cristallisation était nécessaire si vous vouliez étudier la base structurelle des phénomènes biologiques. Aujourd’hui, avec Cryo-EM, ce n’est plus nécessaire.Ainsi, avec Cryo-EM, nous permettons aux scientifiques d’étudier un plus large éventail de phénomènes biologiques au niveau structurel.

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Cryo-EM and Single-Particle Analysis with Scipion

Cryo-EM et analyse monoparticule avec Scipion

Cryo-electron microscopy has become one of the most important tools in biological research to reveal the structural information of macromolecules at ...

Preparation of Sample Support Films in Transmission Electron Microscopy using a Support Floatation Block

Préparation de films de support d’échantillons en microscopie électronique à transmission à l’aide d’un bloc de flottaison de support

Structure determination by cryo-electron microscopy (cryo-EM) has rapidly grown in the last decade; however, sample preparation remains a significant ...

Preparing Lamellae from Vitreous Biological Samples Using a Dual-Beam Scanning Electron Microscope for Cryo-Electron Tomography

Préparation de lamelles à partir d’échantillons biologiques vitreux à l’aide d’un microscope électronique à balayage à double faisceau pour la cryotomographie électronique

Presented here is a protocol for preparing cryo-lamellae from plunge-frozen grids of Plasmodium falciparum-infected&#160;human erythrocytes, which could ...

Preparation of High-Temperature Sample Grids for Cryo-EM

Préparation de grilles d’échantillons à haute température pour Cryo-EM

The sample grids for cryo-electron microscopy (cryo-EM) experiments are usually prepared at a temperature optimal for the storage of biological samples, ...

Micropatterning Transmission Electron Microscopy Grids to Direct Cell Positioning within Whole-Cell Cryo-Electron Tomography Workflows

Micromodélisation de microscopie électronique à transmission pour diriger le positionnement des cellules dans les flux de travail de cryo-tomographie électronique à cellules entières

Whole-cell cryo-electron tomography (cryo-ET) is a powerful technology that is used to produce nanometer-level resolution structures of macromolecules ...

Quantification of Subcellular Glycogen Distribution in Skeletal Muscle Fibers using Transmission Electron Microscopy

Quantification de la distribution subcellulaire du glycogène dans les fibres musculaires squelettiques à l’aide de la microscopie électronique à transmission

With the use of transmission electron microscopy, high-resolution images of fixed samples containing individual muscle fibers can be obtained. This ...

A Robust Single-Particle Cryo-Electron Microscopy (cryo-EM) Processing Workflow with cryoSPARC, RELION, and Scipion

A Robust Single-Particle Cryo-Electron Microscopy cryo-EM Processing Workflow with cryoSPARC, RELION, and Scipion

Un flux de travail robuste de traitement par cryo-microscopie électronique (cryo-EM) à particule unique avec cryoSPARC, RELION et Scipion

Recent advances in both instrumentation and image processing software have made single-particle cryo-electron microscopy (cryo-EM) the preferred method ...

Advancing High-Resolution Imaging of Virus Assemblies in Liquid and Ice

Faire progresser l’imagerie haute résolution des assemblages de virus dans le liquide et la glace

Interest in liquid-electron microscopy (liquid-EM) has skyrocketed in recent years as scientists can now observe real-time processes at the nanoscale. It ...