Name: routine collection of high-resolution cryo-em datasets using 200 kv transmission electron microscope
Uploaded: 2022-03-16T14:00:00
Duration: 9 min 49 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Routine Collection of High-Resolution cryo-EM Datasets Using 200 KV Transmission Electron Microscope at JoVE.com

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	<li>Wang, J., Hua, T., Liu, Z. -. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+features+of+activated+GPCR+signaling+complexes.">Structural features of activated GPCR signaling complexes.</a> Current Opinions in Structural Biology. 63, 82-89 (2020).</li><li>Chen, S., Gouaux, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+mechanism+of+AMPA+receptor+-+auxiliary+protein+complexes.">Structure and mechanism of AMPA receptor - auxiliary protein complexes.</a> Current Opinions in Structural Biology. 54, 104-111 (2019).</li><li>K&#252;hlbrandt, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+mechanisms+of+F-Type+ATP+synthases.">Structure and mechanisms of F-Type ATP synthases.</a> Annual Review of Biochemistry. 88, 515-549 (2019).</li><li>Laverty, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo-EM+structure+of+the+human+&#945;1&#946;3&#947;2+GABA+A+receptor+in+a+lipid+bilayer.">Cryo-EM structure of the human &#945;1&#946;3&#947;2 GABA A receptor in a lipid bilayer.</a> Nature. 565 (7740), 516-520 (2019).</li><li>Liu, F., Zhang, Z., Csan&#225;dy, L., Gadsby, D. 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Sagar Khavnekar non segnala conflitti di interesse. Gli altri autori sono dipendenti di Thermo Fisher Scientific, la divisione MSD-EM.

Il protocollo descritto presuppone che l'ottica del microscopio TEM utilizzato sia in uno stato ben allineato. Per il TEM da 200 kV utilizzato in questo protocollo, tali allineamenti di colonne vengono eseguiti, verificati e salvati da un tecnico dell'assistenza esperto dopo l'installazione del microscopio o qualsiasi intervento di assistenza significativo. Queste impostazioni di allineamento possono essere richiamate in qualsiasi momento nell'interfaccia utente del microscopio. Gli utenti possono utilizzare le procedure di allineamento diretto nell'interfaccia utente del microscopio per modificare nuovamente i parametri critici. Alcuni allineamenti, come l'inclinazione della pistola e lo spostamento della pistola, sono stabili e non devono essere regolati dagli utenti su base giornaliera. I controlli e i riallineamenti (se necessario) dell'inclinazione e dello spostamento della pistola da parte del supervisore del microscopio sono consigliati due volte l'anno. D'altra parte, alcuni allineamenti sono critici e devono essere allineati prima di ogni raccolta di dati come descritto nel protocollo sopra (come l'astigmatismo oggettivo e l'allineamento senza coma). Se la funzione Autocoma nel software di analisi non riesce a convergere, l'allineamento dei punti di rotazione dell'inclinazione del fascio e/o del centro di rotazione deve essere verificato e regolato e deve essere confermato il corretto centraggio dell'apertura C2. Successivamente, la funzione Autostigmate dovrebbe essere eseguita poiché gli stigmatizzatori oggettivi vengono utilizzati anche per la correzione del coma. Questi allineamenti devono essere ripetuti fino a quando sia Autostigmate che Autocomafunctions non hanno esito positivo alla loro prima iterazione. Se necessario, è possibile selezionare un'altra area (ad esempio, supportare la lamina di carbonio senza ghiaccio), regolare la sfocatura dell'immagine o aumentare il tempo di acquisizione dell'immagine per ottimizzare il rapporto segnale-rumore nelle immagini acquisite e la visibilità di più anelli Thon nella trasformata di Fourier delle immagini acquisite.
I moderni microscopi crio-EM generano grandi quantità di dati che spesso superano 1 TB per set di dati per ottenere ricostruzioni 3D ad alta risoluzione, in particolare per proteine con bassa simmetria. I dati e i risultati di Cryo-EM sono anche tipicamente integrati da dati e risultati di metodi ortogonali per comprendere appieno le relazioni struttura-funzione in ciascun progetto scientifico. L'organizzazione dei dati raccolti, il loro trasferimento in una pipeline di elaborazione delle immagini e la condivisione di una ricostruzione crio-EM risultante tra i collaboratori pongono requisiti aggiuntivi ai nuovi utenti della metodologia cryo-EM per configurare la loro infrastruttura IT locale. I software di gestione dei dati, come Athena, facilitano l'archiviazione centralizzata dei dati acquisiti da qualsiasi strumento o software collegato gestito da un utente registrato. I dati e i metadati archiviati sono accessibili tramite una semplice interfaccia del browser Web da più utenti, che possono avere ruoli diversi nel progetto con diritti di accesso diversi (come proprietario, collaboratore o visualizzatore) in base alle credenziali di accesso e alla definizione di condivisione dei dati nella configurazione dell'esperimento. Questa digitalizzazione dei flussi di lavoro sperimentali fornisce mezzi per la condivisione di dati e metadati tra i collaboratori senza inutili duplicazioni e aumenta la produttività e la tracciabilità dei flussi di lavoro utilizzati. L'implementazione di una struttura generale e personalizzabile di progetti, esperimenti e flussi di lavoro nel software di gestione dei dati è universale e consente la personalizzazione e l'integrazione di esperimenti ortogonali utilizzando metodi complementari in un unico database di progetto.
La selezione delle aree per la raccolta dei dati su una griglia crio-EM è fondamentale per il successo dell'acquisizione di set di dati ad alta risoluzione. Le griglie Cryo-EM prodotte con i tradizionali dispositivi di congelamento a immersione, come il Vitrobot (un sistema di vetrificazione completamente automatizzato), in genere mostrano un gradiente di spessore del ghiaccio sulla superficie della griglia (Figura 4). Questo può essere utile in quanto la griglia contiene aree con diversi spessori di ghiaccio; tuttavia, le aree con lo spessore di ghiaccio ideale per la raccolta dei dati devono essere identificate come descritto nel protocollo di cui sopra. Una griglia crio-EM ottimale dovrebbe contenere il minor numero possibile di contaminazione da ghiaccio di trasferimento e contenere abbastanza quadrati di griglia con una lamina di supporto bucata intatta. La raccolta di dati su quadrati di griglia che presentano crepe o aree rotte non è raccomandata in quanto le immagini raccolte saranno influenzate da una deriva complessiva significativamente più forte sull'illuminazione da parte di un fascio di elettroni rispetto ai quadrati della griglia con lamina di supporto intatta. L'eccesso di ghiaccio cristallino può occludere la maggior parte dei fori di alluminio e / o interferire con l'autofocus e anche tali quadrati della griglia dovrebbero essere evitati. I quadrati della griglia con ghiaccio sottile di solito mostrano grandi aree vitree e molti fori luminosi che sono visibili in un'immagine scattata utilizzando il preset Atlas. Il verificarsi di ghiaccio più spesso vicino alle barre della griglia è prevedibile e acritico poiché i fori di alluminio in queste aree del quadrato della griglia sono esclusi durante la procedura di selezione del foro. La presenza di diversi fori vuoti in un quadrato della griglia può significare che il ghiaccio vitreo nei fori circostanti è estremamente sottile e può contenere particelle danneggiate o nessuna particella. In generale, è consigliabile scegliere quadrati di griglia con una varietà di spessori di ghiaccio in diverse regioni della griglia per lo screening iniziale e la valutazione per capire quali aree hanno le migliori condizioni per la raccolta di dati ad alta risoluzione e mostrano la densità delle particelle ideale e la distribuzione dell'orientamento. Per i campioni di proteasoma apoF e 20S utilizzati in questo studio, le aree con il ghiaccio osservabile più sottile contengono le migliori condizioni per l'imaging ad alta risoluzione di questi campioni.
Quando si selezionano automaticamente i fori in tutti i quadrati della griglia selezionati utilizzando il software di raccolta dati, si consiglia di eseguire l'attività di esecuzione del modello su un foro rappresentativo in ciascun quadrato della griglia per verificare e assicurarsi che per la raccolta dei dati non siano stati scelti quadrati eccessivamente spessi né eccessivamente sottili o inaspettatamente non vitrei. Durante l'acquisizione dei dati, gli indicatori chiave di qualità delle immagini raccolte, come la deriva dell'immagine e il raccordo CTF, possono essere monitorati utilizzando EQM. La raccolta dei dati può quindi essere ottimizzata saltando le aree che producono immagini di scarsa qualità. Tuttavia, le immagini con adattamenti CTF ad alta risoluzione possono ancora contenere immagini con particelle in alcuni orientamenti preferiti o particelle denaturate in uno strato di ghiaccio troppo sottile. Il prelievo di particelle in tempo reale e la classificazione 2D dalle immagini raccolte fornirebbero ulteriori informazioni sulla qualità dei dati strutturali nelle particelle fotografate e rivelerebbero sia gli orientamenti preferiti delle particelle intatte nel ghiaccio che la struttura incoerente delle particelle (parzialmente) denaturate. Il calcolo delle medie di classe può quindi aiutare a perfezionare ulteriormente le regioni appropriate per la raccolta dei dati, come è già stato implementato e mostrato in altri pacchetti software23,28.
La selezione delle impostazioni di imaging per l'acquisizione dei dati, come l'ingrandimento, la dose di elettroni e l'intervallo di sfocatura, dipende da diversi criteri, come la risoluzione target, le dimensioni della proteina, la concentrazione del campione, la produttività desiderata del microscopio, ecc. Per la telecamera del rivelatore di elettroni diretto utilizzata in questi esperimenti, la dose di elettroni è stata scelta nell'intervallo di 4-5 e-/pix/s selezionando una dimensione e un'intensità SPOT appropriate per mantenere l'illuminazione parallela. Come mostrato nella Tabella 1, è possibile utilizzare una dimensione SPOT diversa nel preset Foro/Altezza eucentrica per garantire un rapporto segnale-rumore sufficiente nell'immagine per centrare i fori durante la raccolta dei dati. L'ingrandimento deve essere scelto in modo tale che la dimensione dei pixel sia almeno 2-3 volte inferiore alla risoluzione target per la ricostruzione crio-EM. Tuttavia, l'ingrandimento più elevato (cioè la dimensione dei pixel più piccola) viene utilizzato, il campo visivo più piccolo viene catturato nelle immagini e ci sono meno particelle per immagine, il che alla fine porta a tempi di raccolta dati più lunghi per raccogliere immagini con abbastanza particelle per ricostruire mappe 3D ad alta risoluzione. Per il campione apoF, abbiamo usato la dimensione dei pixel di 0,43 Å poiché avevamo una concentrazione di campione sufficiente per un'alta densità di particelle nelle immagini e una risoluzione inferiore a 2 Å della ricostruzione. Per il campione di proteasoma 20S, abbiamo utilizzato la dimensione in pixel di 0,68 Å per coprire un campo visivo più ampio nelle immagini acquisite. Tipicamente per i microscopi TEM da 200 kV, le immagini crio-EM vengono acquisite nell'intervallo di sfocatura da 0,8 a 2,0 μm. Tuttavia, con il contrasto migliorato e il rapporto segnale-rumore utilizzando il filtro energetico, le acquisizioni di dati possono essere eseguite molto più vicino alla messa a fuoco per preservare meglio le informazioni ad alta risoluzione nelle immagini acquisite a causa di aberrazioni più piccole e decadimento corrispondentemente ridotto della funzione di inviluppo CTF. Inoltre, non utilizziamo un'apertura oggettiva in quanto l'apertura potrebbe introdurre ulteriori aberrazioni dell'immagine mentre il contrasto dell'immagine è già sufficientemente migliorato utilizzando il filtro dell'energia. Per i campioni di proteasoma apoF e 20S, abbiamo utilizzato le impostazioni di sfocatura di 0,5 μm, 0,7 μm e 0,9 μm. Per le proteine più piccole (<200 kDa), abbiamo utilizzato impostazioni di sfocatura di -0,5 μm, -0,7 μm e -0,9 μm per migliorare il contrasto delle particelle e facilitare il prelievo delle particelle e l'allineamento grossolano iniziale nella fase di raffinamento 3D della ricostruzione 3D, che ha portato a mappe 3D con risoluzione ~ 2,5 Å (risultati non pubblicati).
Abbiamo già dimostrato che l'imaging con un filtro energetico migliora il rapporto segnale-rumore (SNR) nelle immagini crio-EM raccolte sui microscopi TEM da 300 kV di fascia alta11. Infatti, quando gli elettroni passano attraverso un campione, si verificano due tipi principali di interazioni: i) Gli elettroni sparsi elasticamente mantengono la loro energia e contribuiscono alla formazione dell'immagine interferendo con il fascio incidente non disperso tramite il meccanismo di contrasto di fase ii) gli elettroni sparsi inelasticamente perdono una certa energia nel campione e contribuiscono principalmente al rumore nelle immagini. Pertanto, l'SNR può essere significativamente migliorato filtrando gli elettroni dispersi inelasticamente, che hanno un'energia inferiore rispetto al fascio incidente e agli elettroni sparsi elasticamente, utilizzando una fessura di energia stretta. Tuttavia, è fondamentale utilizzare un filtro di energia sufficientemente stabile, come Selectris o Selectris-X, per poter utilizzare fessure molto strette (10 eV o più piccole) su lunghe (12+ ore) acquisizione dati automatizzata di set di dati crioEM ad alta risoluzione.
Le immagini Cryo-EM acquisite con microscopi TEM da 200 kV nelle stesse condizioni dei microscopi TEM da 300 kV mostrano un SNR più piccolo ad alta risoluzione (in particolare <4 Å) a causa del decadimento più rapido delle funzioni di inviluppo CTF. Di conseguenza, è necessario un numero maggiore di particelle (e quindi un numero maggiore di immagini raccolte) per ottenere una certa risoluzione quando si utilizzano TEM a 200 kV. Inoltre, la profondità di campo (10-25 nm nell'intervallo di risoluzione 2-3 Å) è anche circa il 20% più piccola nelle immagini da 200 kV35, il che significa che meno particelle nello strato di ghiaccio (in genere 20-50 nm di spessore) saranno completamente a fuoco e contribuiranno costruttivamente a tutte le caratteristiche ad alta risoluzione di una ricostruzione 3D calcolata a meno che i valori di sfocatura non vengano perfezionati per ciascuna particella in modo indipendente nelle fasi successive della procedura di ricostruzione 3D. Per le particelle più grandi (come i virioni icosaedrici o altri gruppi macromolecolari), la dimensione delle particelle può superare la profondità di campo ad alta risoluzione e introdurre errori di fase dovuti all'approssimazione planare della sfera di Ewald negli algoritmi di ricostruzione 3D standard36. Questi errori possono essere perfezionati da algoritmi avanzati che sono già implementati nei comuni pacchetti di elaborazione delle immagini crio-EM 37,28,39. Poiché la sfera di Ewald ha una curvatura maggiore nei dati a 200 kV rispetto ai dati a 300 kV, la correzione della sfera di Ewald è necessaria a risoluzioni relativamente più basse e/o per assemblaggi macromolecolari relativamente più piccoli quando si utilizzano TEM da 200 kV. D'altra parte, le immagini a 200 kV mostrano un maggiore contrasto di particelle nel ghiaccio sottile (20-50 nm) che è significativamente più sottile del percorso libero medio dell'elettrone 200-300 keV (220-280 nm). Il contrasto più elevato aiuta a migliorare il corretto allineamento globale delle singole particelle, in particolare per le proteine più piccole a dispersione debole la cui struttura non è ancora nota e il modello di riferimento 3D non è ancora ben consolidato.
Qui, abbiamo dimostrato sull'esempio di un proteasoma 20S che il contrasto e la qualità dell'immagine potrebbero essere migliorati in modo simile con un filtro di energia quando si utilizza un microscopio TEM da 200 kV. Utilizzando lo stesso numero di particelle, i dati raccolti utilizzando la fessura da 20 eV sono stati ricostruiti con una risoluzione di 2,26 Å rispetto ai dati raccolti con la fessura di energia completamente aperta che è stata ricostruita solo con una risoluzione di 2,34 Å. La migliore ricostruzione è stata ottenuta dai dati raccolti utilizzando la fessura da 10 eV che è stata ricostruita con una risoluzione di 2,14 Å. Questi risultati sono in accordo con la previsione teorica che il filtraggio degli elettroni sparsi in modo inelastico aumenta l'SNR nelle immagini raccolte e facilita una risoluzione più elevata nelle ricostruzioni crio-EM dal dato numero di particelle, come riassunto nella Tabella 4. Questi risultati sono stati ulteriormente confermati dai fattori B calcolati da questi set di dati che indicano una maggiore qualità delle immagini nei set di dati filtrati dall'energia.
Possiamo quindi concludere che mentre i microscopi TEM da 300 kV offrono la massima produttività e la più alta risoluzione possibile nelle ricostruzioni crio-EM, i microscopi TEM da 200 kV forniscono anche set di dati di alta qualità per ricostruzioni crio-EM ad alta risoluzione. Abbiamo dimostrato qui che la qualità delle immagini acquisite, e quindi il tempo complessivo di struttura, può essere ulteriormente migliorata utilizzando il TEM da 200 kV dotato di un filtro di energia e di un rivelatore di elettroni diretto. Il protocollo presentato descrive tutti i passaggi necessari su come ottenere regolarmente dati crio-EM ad alta risoluzione utilizzando questa configurazione e rivelare dettagli strutturali fini delle strutture 3D macromolecolari, che sono essenziali per comprendere le relazioni chiave struttura-funzione nella biologia strutturale e nella progettazione di farmaci basata sulla struttura.

La determinazione della struttura proteica è fondamentale per comprendere l'architettura molecolare, la funzione e la regolazione dei complessi proteici coinvolti nei processi cellulari chiave, come il metabolismo cellulare, la trasduzione del segnale o le interazioni ospite-patogeno. La crio-microscopia elettronica (cryo-EM) è emersa come una potente tecnica in grado di risolvere la struttura 3D di molte proteine e dei loro complessi che erano troppo impegnativi per le tecniche strutturali tradizionali, come la diffrazione a raggi X e la spettroscopia NMR. In particolare, la crio-EM è stata dimostrata come il metodo di scelta per le proteine di membrana, che non possono essere facilmente cristallizzate o preparate in quantità sufficienti per le tecniche strutturali tradizionali, e ha fornito nuove informazioni sulla struttura e la funzione di importanti recettori cellulari e canali ionici 1,2,3,4,5 . Più recentemente, la crio-EM ha svolto un ruolo importante nella lotta contro la pandemia di Covid-19 determinando il meccanismo dell'infezione da SARS-CoV-2 a livello molecolare, che ha chiarito le origini della malattia Covid-19 e ha fornito la base per il rapido sviluppo di vaccini e terapie efficienti 6,7,8,9,10.
Tipicamente, i microscopi elettronici a trasmissione da 300 kV di fascia alta (TEM) vengono utilizzati per la determinazione della struttura ad alta risoluzione delle biomolecole mediante analisi crio-EM a singola particella (SPA) per rivelare la loro conformazione e interazioni. Recentemente, la tecnica SPA ha raggiunto una nuova frontiera quando il campione comune di riferimento crio-EM apo-ferritina è stato ricostruito a risoluzione atomica (1,2 Å)11,12 utilizzando un TEM da 300 kV dotato della pistola a emissione di campo freddo (E-CFEG), un rivelatore di elettroni diretti e un filtro di energia. A questa risoluzione, è stato possibile risolvere in modo inequivocabile le posizioni dei singoli atomi nella struttura, la conformazione delle singole catene laterali di amminoacidi, nonché il legame idrogeno e altre interazioni, che aprono nuove possibilità per la scoperta di farmaci basati sulla struttura di nuovi bersagli e l'ottimizzazione dei farmaci candidati esistenti.
I microscopi TEM da 200 kV di fascia media sono spesso utilizzati per lo screening dei campioni e l'ottimizzazione dei campioni prima della raccolta finale dei dati ad alta risoluzione utilizzando i microscopi TEM di fascia alta, in particolare nelle strutture crio-EM più grandi. In genere, i campioni ripresi possono essere risolti nell'intervallo di risoluzione 3-4 Å che è sufficiente per passare a un TEM a 300 kV di fascia alta per la raccolta finale dei dati. Di conseguenza, la raccolta dei dati utilizzando il TEM da 200 kV spesso non viene ulteriormente ottimizzata per ottenere i risultati con la massima risoluzione possibile. Inoltre, molte interessanti domande biologiche possono già essere risolte e pubblicate a queste risoluzioni poiché tutte le catene laterali degli amminoacidi sono già risolte e l'occupazione dei siti di legame del ligando può anche essere determinata in modo affidabile13. È già stato dimostrato che i TEM a 200 kV possono raggiungere risoluzioni superiori a 3 Å per numerosi campioni 14,15,16,17,18. Le immagini scattate a 200 kV mostrano un contrasto intrinsecamente più elevato delle particelle fotografate, che può anche facilitare un allineamento iniziale più accurato delle particelle nonostante un segnale più attenuato ad alta risoluzione rispetto alle immagini TEM da 300 kV. È importante notare che la risoluzione raggiunta delle mappe crio-EM ricostruite è anche limitata dalla flessibilità strutturale e dall'eterogeneità conformazionale dei campioni ripresi, che influisce sia sulle ricostruzioni a 200 kV che a 300 kV. In effetti, molte più ricostruzioni crio-EM ottenute utilizzando i sistemi a 300 kV sono state risolte nell'intervallo di risoluzione 3-4 Å rispetto a risoluzioni più elevate19. Poiché i microscopi TEM da 200 kV sono meno complessi e si adattano a stanze più piccole, questi microscopi rappresentano una buona opzione a basso costo per la determinazione della struttura delle macromolecole biologiche mediante crio-EM, preservando l'automazione di lunghe raccolte di dati da più campioni memorizzati all'interno del sistema Autoloader del microscopio.
La raccolta di set di dati crio-EM per la determinazione della struttura ad alta risoluzione richiede un allineamento accurato dell'ottica del microscopio. Gli allineamenti delle colonne procedono sistematicamente dalla sorgente di elettroni fino al sistema di lenti del condensatore, alla lente dell'obiettivo e al filtro di energia con un rilevatore di elettroni. La sequenza completa di allineamenti non è in genere richiesta. Quando necessario, l'utente viene guidato tramite procedure semi-automatizzate con una descrizione corretta di ogni passaggio in una finestra di aiuto sensibile al contesto durante la procedura di allineamento nell'interfaccia utente del microscopio (pannello di controllo Direct Alignments). Una volta che il microscopio è completamente allineato, l'ottica elettronica rimane stabile e gli allineamenti non devono essere modificati per almeno alcuni mesi. Solo gli allineamenti più sensibili, come l'illuminazione parallela del piano campione, l'astigmatismo oggettivo e l'allineamento senza coma, devono essere perfezionati poco prima di iniziare la raccolta di ciascun set di dati. La qualità dei dati raccolti può quindi essere monitorata durante la raccolta dei dati utilizzando diversi pacchetti software, come EPU Quality Monitor, cryoSPARC Live20, Relion21, Scipion22, WARP23 o Appion24.
Oltre agli allineamenti accurati del microscopio, l'alta qualità di campioni ben purificati con una minima eterogeneità conformazionale e compositiva è anche un prerequisito per la raccolta di set di dati ad alta risoluzione e la risoluzione di strutture ad alta risoluzione. Maggiori dettagli sui protocolli tipici, le sfide frequenti e i possibili rimedi possono essere trovati in altre recensioni dedicate a questo argomento 25,26,27. In sostanza, è fondamentale trovare aree su una data griglia crio-EM che abbia ghiaccio sufficientemente sottile per preservare informazioni ad alta risoluzione e le singole particelle siano densamente distribuite con orientamenti casuali senza sovrapposizioni. Tuttavia, le tipiche griglie crio-EM hanno uno spessore di ghiaccio non uniforme ed è quindi importante trovare e selezionare le aree ottimali per l'imaging. Diversi mezzi per la stima dello spessore del ghiaccio sulla griglia sono disponibili in pacchetti software dedicati alla raccolta automatizzata di set di dati crio-EM, come EPU 2, Leginon28 o SerialEM29.
L'avvento di rivelatori di elettroni diretti veloci e sensibili ha permesso la raccolta di immagini in molte frazioni come filmati che hanno permesso la compensazione dei movimenti indotti dal fascio e ha comportato un sostanziale aumento della qualità e della quantità di dati utilizzati nell'elaborazione delle immagini e nella ricostruzione 3D finale30. Allo stesso tempo, l'automazione e la raccolta di dati ad alto throughput forniscono enormi set di dati con migliaia di immagini / filmati che rappresentano sfide per l'archiviazione e l'accesso ai dati. Il modello adottato con grandi strutture crio-EM che servono decine a centinaia di utenti richiede in particolare una gestione organizzata dei dati con un corretto tracciamento e condivisione dei dati in pipeline cryo-EM stabilite31,32.
Questo studio descrive un protocollo per la raccolta di routine di set di dati crio-EM ad alta risoluzione utilizzando il microscopio Glacios TEM da 200 kV. Vengono descritti gli allineamenti necessari dell'ottica del microscopio insieme alle procedure per la valutazione dei campioni crio-EM e la selezione delle aree idonee per la raccolta dei dati ad alta risoluzione. L'organizzazione dei dati raccolti e dei relativi metadati con informazioni di esempio è dimostrata in Athena, una piattaforma di gestione dei dati che facilita la revisione delle informazioni di esempio e dei dati raccolti. Utilizzando il campione di apo-ferritina del topo, è stato possibile ottenere una ricostruzione 3D con risoluzione 1,6 Å13. Utilizzando il protocollo descritto, abbiamo anche ricostruito la mappa di densità 3D del proteasoma 20S da Thermoplasma acidophilum a risoluzione 2.1 Å.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>AutoGrid rings</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>1036173</td>
			<td>Package of 100x AutoGrid rings for the standard EM grids.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C-Clip</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>1036171</td>
			<td>Package of 100 clips that secure 
			the standard EM grids inside the AutoGrid rings.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Data Management Platform</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>1160939</td>
			<td>Part of the Glacios base configuraiton; includes Athena Software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EPU Quality Monitor</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>1179770</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EPU Software</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>1025080</td>
			<td>Part of the Glacios base configuration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethane 3.5</td>
			<td>Westfalen</td>
			<td>A06010110</td>
			<td>Ethane gas used for making liquid ethane (puritiy at least N35, i.e. 99.95% vol)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 4 200kV</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>1166936</td>
			<td>Direct electron detector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glacios</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>1149551</td>
			<td>200 kV TEM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GloQube Plus Glow Discharge System for TEM Grids and surface modification</td>
			<td>Quorum</td>
			<td>N/A</td>
			<td>also available via Thermo Fisher Scientific (PN 1160602)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuantiFoil grids</td>
			<td>Quantifoil</td>
			<td>N/A</td>
			<td>R-2/1, 300 mesh; carbon foil grid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Relion</td>
			<td>MRC Laboratory of Molecular Biology</td>
			<td>N/A</td>
			<td>open source software: 
			https://relion.readthedocs.io/en/release-3.1/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Selectris with Falcon 
			4 for 200 kV</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>1191753</td>
			<td>Energy filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Selectris X with Falcon 
			4 for 200 kV</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>1191755</td>
			<td>Energy filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltrAuFoil grids</td>
			<td>Quantifoil</td>
			<td>N/A</td>
			<td>R-1.2/1.2, 300 mesh; gold foil grids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vitrobot Mk. IV</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>1086439</td>
			<td>Automated vitrification system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman 595 filter paper</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AA00420S</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

routine collection of high-resolution cryo-em datasets using 200 kv transmission electron microscope

La microscopia crioelettronica (cryo-EM) è stata stabilita come metodo di routine per la determinazione della struttura proteica negli ultimi dieci anni, prendendo una quota sempre crescente di dati strutturali pubblicati. I recenti progressi nella tecnologia e nell'automazione TEM hanno aumentato sia la velocità di raccolta dei dati che la qualità delle immagini acquisite, riducendo contemporaneamente il livello di competenza richiesto per ottenere mappe crio-EM a risoluzioni inferiori a 3 Å. Mentre la maggior parte di tali strutture ad alta risoluzione sono state ottenute utilizzando sistemi crio-TEM a 300 kV all'avanguardia, le strutture ad alta risoluzione possono essere ottenute anche con sistemi crio-TEM da 200 kV, specialmente se dotati di un filtro di energia. Inoltre, l'automazione degli allineamenti dei microscopi e della raccolta dei dati con valutazione della qualità delle immagini in tempo reale riduce la complessità del sistema e assicura impostazioni ottimali del microscopio, con conseguente aumento della resa di immagini di alta qualità e throughput complessivo della raccolta dei dati. Questo protocollo dimostra l'implementazione dei recenti progressi tecnologici e delle funzionalità di automazione su un microscopio elettronico a criotrasmissione da 200 kV e mostra come raccogliere dati per la ricostruzione di mappe 3D sufficienti per la costruzione di modelli atomici de novo . Ci concentriamo sulle best practice, sulle variabili critiche e sui problemi comuni che devono essere considerati per consentire la raccolta di routine di tali set di dati crio-EM ad alta risoluzione. In particolare, vengono esaminati in dettaglio i seguenti argomenti essenziali: i) automazione degli allineamenti del microscopio, ii) selezione delle aree adatte per l'acquisizione dei dati, iii) parametri ottici ottimali per la raccolta di dati di alta qualità e ad alta produttività, iv) sintonizzazione del filtro energetico per l'imaging a perdita zero e v) gestione dei dati e valutazione della qualità. L'applicazione delle migliori pratiche e il miglioramento della risoluzione raggiungibile utilizzando un filtro energetico saranno dimostrati sull'esempio di apo-ferritina che è stata ricostruita a 1,6 Å e del proteasoma Thermoplasma acidophilum 20S ricostruito a risoluzione 2,1-Å utilizzando un TEM da 200 kV dotato di un filtro energetico e di un rivelatore di elettroni diretto.

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Routine Collection of High-Resolution cryo-EM Datasets Using 200 KV Transmission Electron Microscope

Le mappe crio-EM ad alta risoluzione delle macromolecole possono essere ottenute anche utilizzando microscopi TEM da 200 kV. Questo protocollo mostra le best practice per l'impostazione di allineamenti ottici accurati, schemi di acquisizione dati e selezione di aree di imaging che sono tutti essenziali per la raccolta di set di dati ad alta risoluzione utilizzando un TEM da 200 kV.

Raccolta di routine di set di dati crio-EM ad alta risoluzione utilizzando un microscopio elettronico a trasmissione da 200 KV

Cryo-electron microscopy (cryo-EM) has been established as a routine method for protein structure determination during the past decade, taking an ...

Cryo-EM è diventata una tecnica standard per la determinazione della struttura delle proteine e dei loro complessi. Questo protocollo descrive le best practice per ottenere set di dati Cryo-EM ad alta risoluzione dai microscopi TEM da 200 kV di fascia media. Cryo-EM può determinare la struttura proteica in condizioni quasi native in soluzione per più stati conformazionali e stati funzionali contemporaneamente, il che è sfuggente per altre tecniche strutturali.Le informazioni strutturali ottenute possono essere utilizzate per chiarire i meccanismi molecolari della funzione proteica, nonché per la progettazione di farmaci basati sulla struttura. Ad esempio, una recente pubblicazione nella struttura delle fibrille amiloidi ha rivelato più siti di legame di un ligando vitale. Tuttavia, in questo protocollo, utilizziamo i campioni standard di apofertitina e proteasoma per dimostrare i passaggi critici per ottenere dati Cryo-EM ad alta risoluzione.Il funzionamento di un Cryo-TEM è diventato più facile negli ultimi anni, soprattutto grazie all'introduzione di funzionalità di automazione avanzate. Tuttavia, per la prima sessione, ti consigliamo di avere una formazione con utenti più esperti. Da lì, la progressione nella tecnica è relativamente veloce.A dimostrare la procedura sarà Adrian Koh, che è uno scienziato senior delle applicazioni presso Thermo Fisher Scientific. Inserire griglie automatiche nella cassetta del caricatore automatico in condizioni di azoto liquido. Inserire la cassetta con griglie automatiche in una capsula di trasferimento raffreddata ad azoto liquido.Inserire ulteriormente la capsula nel microscopio e fare clic sul pulsante Dock nell'interfaccia utente del microscopio per caricare la cassetta dalla capsula nel caricatore automatico del microscopio. Fare clic sul pulsante Inventario per verificare la presenza di griglie automatiche nella cassetta caricata. Quindi fare clic sui pulsanti Carica e Scarica per inserire le griglie automatiche nella colonna per l'imaging TEM.Selezionare la scheda Atlante e fare clic sul pulsante Nuova sessione per aprire una nuova sessione. Inserisci dettagli come il nome della sessione e la posizione di archiviazione dei dati e fai clic sul pulsante Applica. Selezionare le griglie di interesse selezionando una casella di controllo accanto al numero di griglia corrispondente.Fare clic sul pulsante Start per avviare una raccolta completamente automatizzata di atlanti di tutte le griglie selezionate. Una volta completata la raccolta, fare clic sulle etichette della griglia per rivedere gli atlanti acquisiti. Seleziona la scheda EPU e vai a Nuova sessione per creare una nuova sessione nel pannello di sinistra.Selezionare l'opzione Nuova sessione per utilizzare i predefiniti ottici impostati correntemente. Inserisci il nome della sessione. Selezionare il tipo manuale della sessione per avere il controllo sulla selezione dei singoli fori e quadrati della griglia selezionati per la raccolta dei dati in un secondo momento nel protocollo.Selezionare la modalità di acquisizione più veloce per utilizzare lo spostamento dell'immagine senza aberrazione per la raccolta dei dati. Quindi inserisci la posizione in cui salvare i metadati. Fare clic sul pulsante Applica per creare una nuova sessione.Selezionare l'attività di selezione quadrata nel pannello di sinistra per visualizzare l'atlante raccolto della griglia. Identificare i quadrati della griglia con lamina di supporto intatta senza danni, sottili fori di ghiaccio vitreo e lamina, contaminazione trascurabile del ghiaccio cristallino nel quadrato della griglia e gradiente di luminosità minimo attraverso il quadrato della griglia e all'interno dei singoli fori della lamina. Selezionare i quadrati della griglia per la raccolta dei dati, nell'atlante completo o nelle immagini dei riquadri di alta qualità.Fare clic con il pulsante destro del mouse su un quadrato della griglia di interesse e scegliere l'intera attività di selezione. Fare clic sul pulsante Auto Eucentric per spostarsi automaticamente nel primo quadrato della griglia selezionato. Regola l'altezza eucentrica e acquisisci un'immagine quadrata della griglia per trovare i fori della lamina.Fare clic sul pulsante Trova fori per trovare i fori di alluminio nell'immagine. Fate clic sul pulsante Rimuovi fori (Remove Holes) per chiudere il pulsante della barra della griglia e deselezionare i fori vicino alle barre della griglia. Regolare i limiti nell'istogramma di luminosità del filtro del ghiaccio per rimuovere tutti i fori con ghiaccio troppo spesso e tutti i fori vuoti.Fare clic con il pulsante destro del mouse su un foro nell'immagine quadrata della griglia e selezionare sposta lo stage nella fase di spostamento della posizione qui. Selezionare l'attività di definizione del modello nel pannello di sinistra. Fare clic sul pulsante Acquisisci per acquisire un'intera immagine.Impostate i valori per il ritardo dopo lo spostamento dell'immagine a 0,5 secondi e il ritardo dopo lo spostamento dello stage a cinque secondi. Fate clic sul pulsante Trova (Find and Center Hole) per centrare un foro nell'immagine. Seleziona il pulsante Aggiungi area di acquisizione e fai clic sull'immagine per selezionare la posizione nel foro centrato in cui verrà eseguita l'acquisizione di immagini ad alto ingrandimento.Selezionare il pulsante Aggiungi area di messa a fuoco automatica e fare clic sull'immagine per selezionare la posizione sulla lamina di supporto accanto al foro centrato in cui verrà eseguita la messa a fuoco automatica dell'immagine. Fare clic sull'area di acquisizione verde per impostare una sequenza di valori di sfocatura nell'elenco di sfocatura nella sezione superiore della finestra del software. Dopo aver impostato le impostazioni specifiche della messa a fuoco automatica, scegliere l'opzione Dopo la centratura per la messa a fuoco automatica all'inizio di ogni cluster AFIS.Scegli l'opzione Obiettivo obiettivo per una messa a fuoco automatica più veloce e una deriva dello stadio ridotta. Fare clic sul pulsante Prepara tutti i quadrati nell'attività di selezione dei fori per impostare automaticamente la raccolta dei dati e tutti gli altri quadrati della griglia selezionati in base alle impostazioni utilizzate in questo primo quadrato della griglia. Seleziona l'attività di definizione del modello, acquisisci una nuova immagine, sposta lo stage in un'area pulita su carbon foil facendo clic con il pulsante destro del mouse e seleziona l'opzione di menu sposta stage qui.Selezionare la scheda Funzioni automatiche. Dopo aver impostato la sfocatura e l'iterazione desiderate, passare al preset di messa a fuoco automatica e fare clic sul pulsante di avvio per eseguire la funzione di messa a fuoco automatica. Selezionare l'attività Autostigmate, passare al preset Thon Ring e premere il pulsante Start.Selezionare l'attività Autocoma e premere il pulsante Start. Spostare lo stage in un'area con un quadrato a griglia spezzato. Conferma la trasparenza dell'area scattando una singola immagine con messa a fuoco automatica.Apri Sherpa UI e seleziona l'applicazione Energy Filter. Fare clic sul pulsante Centro e sull'opzione zero perdita per centrare la fessura del filtro a perdita zero energia. Fare clic sul pulsante Sintonizzazione nell'opzione isocromaticità.Fare clic sull'opzione Ingrandimento sintonizzazione e Distorsioni sintonizzazione nelle distorsioni geometriche e cromatiche. Vai alla scheda EPU, seleziona l'attività acquisizione automatica e fai clic sul pulsante Avvia esecuzione per iniziare la raccolta dati completamente automatizzata. La figura mostra le griglie Cryo-EM che mostrano un gradiente di spessore del ghiaccio sulla superficie della griglia.Le griglie escluse dall'ulteriore indagine sono una griglia cattiva con ghiaccio spesso e una griglia piegata con ghiaccio cattivo e contaminazione, mentre le griglie accettabili sono quelle con un buon gradiente di ghiaccio e una griglia tipica con ghiaccio sottile buono e piccolo gradiente di ghiaccio. La figura mostra il rendering 3D finale della mappa Cryo-EM di apoferritina ricostruita. L'elevata stabilità e simmetria lo rendono un campione di riferimento ottimale per l'imaging Cryo-EM ad alta risoluzione e l'elaborazione delle immagini.La lucidatura bayesiana, il perfezionamento CTF e la correzione della sfera di Ewald hanno portato a una mappa di risoluzione di 1,63 angstrom. La figura mostra una vista dettagliata della mappa cryo-EM dell'apoferritina ricostruita a livello della catena laterale dei singoli amminoacidi. La densità delle catene laterali di amminoacidi è ben risolta e il modello atomico può essere costruito in modo inequivocabile all'interno della mappa.L'immagine qui mostra due diversi set di dati a diversi valori di sfocatura raccolti dalla stessa griglia Cryo-EM con quadrati di griglia simili con una fessura completamente aperta e una fessura a 10 elettronvolt che indica che la fessura a 10 elettronvolt migliora significativamente il contrasto dell'immagine. La figura qui mostra una panoramica della mappa Cryo-EM del proteasoma 20S con subunità segmentate utilizzate come campione Cryo-EM standard. E la sua vista ingrandita con un modello atomico adattato rappresenta il nucleo catalitico stabile del complesso del proteasoma con la simmetria D7.Il protocollo contiene due passaggi critici. Uno, alla ricerca di aree con ghiaccio vitreo sottile contenente particelle omogenee. E due, l'impostazione dell'illuminazione parallela per l'acquisizione dei dati.Con ricostruzioni ad alta risoluzione di proteine che raggiungono due o tre angstrom in risoluzione, sei in grado di comprendere meglio i meccanismi molecolari della malattia e migliorare i lead farmacologici. In precedenza, la cristallizzazione era necessaria se si voleva studiare le basi strutturali dei fenomeni biologici. Oggi con Cryo-EM, questo non è più necessario.E così con Cryo-EM, consentiamo agli scienziati di studiare una gamma più ampia di fenomeni biologici a livello strutturale.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Method to Visualize and Analyze Membrane Interacting Proteins by Transmission Electron Microscopy

Metodo per visualizzare e analizzare membrana proteine ​​interagenti con microscopia elettronica a trasmissione

Monotopic proteins exert their function when attached to a membrane surface, and such interactions depend on the specific lipid composition and on the ...

Ricerca

Biochimica

High-resolution Single Particle Analysis from Electron Cryo-microscopy Images Using SPHIRE

Analisi di particelle singole ad alta risoluzione da immagini elettroniche a cryo-microscopia usando SPHIRE

SPHIRE (SPARX for High-Resolution Electron Microscopy) is a novel open-source, user-friendly software suite for the semi-automated processing of single ...

Cryo-EM and Single-Particle Analysis with Scipion

Crio-EM e analisi a singola particella con Scipion

Cryo-electron microscopy has become one of the most important tools in biological research to reveal the structural information of macromolecules at ...

Preparation of Sample Support Films in Transmission Electron Microscopy using a Support Floatation Block

Preparazione di film di supporto campione in microscopia elettronica a trasmissione utilizzando un blocco di galleggiamento di supporto

Structure determination by cryo-electron microscopy (cryo-EM) has rapidly grown in the last decade; however, sample preparation remains a significant ...

Preparing Lamellae from Vitreous Biological Samples Using a Dual-Beam Scanning Electron Microscope for Cryo-Electron Tomography

Preparazione di lamelle da campioni biologici vitreali utilizzando un microscopio elettronico a scansione a doppio raggio per la tomografia crioelettronica

Presented here is a protocol for preparing cryo-lamellae from plunge-frozen grids of Plasmodium falciparum-infected&#160;human erythrocytes, which could ...

Preparation of High-Temperature Sample Grids for Cryo-EM

Preparazione di griglie di campionamento ad alta temperatura per crio-EM

The sample grids for cryo-electron microscopy (cryo-EM) experiments are usually prepared at a temperature optimal for the storage of biological samples, ...

Micropatterning Transmission Electron Microscopy Grids to Direct Cell Positioning within Whole-Cell Cryo-Electron Tomography Workflows

Micropatterning Transmission Electron Microscopy Griglie per dirigere il posizionamento delle cellule all'interno dei flussi di lavoro della tomografia crioelettronica a cellule intere

Whole-cell cryo-electron tomography (cryo-ET) is a powerful technology that is used to produce nanometer-level resolution structures of macromolecules ...

Quantification of Subcellular Glycogen Distribution in Skeletal Muscle Fibers using Transmission Electron Microscopy

Quantificazione della distribuzione subcellulare del glicogeno nelle fibre muscolari scheletriche mediante microscopia elettronica a trasmissione

With the use of transmission electron microscopy, high-resolution images of fixed samples containing individual muscle fibers can be obtained. This ...

A Robust Single-Particle Cryo-Electron Microscopy (cryo-EM) Processing Workflow with cryoSPARC, RELION, and Scipion

A Robust Single-Particle Cryo-Electron Microscopy cryo-EM Processing Workflow with cryoSPARC, RELION, and Scipion

Un robusto flusso di lavoro di elaborazione crioelettronica a particella singola (cryo-EM) con crioSPARC, RELION e Scipion

Recent advances in both instrumentation and image processing software have made single-particle cryo-electron microscopy (cryo-EM) the preferred method ...

Advancing High-Resolution Imaging of Virus Assemblies in Liquid and Ice

Miglioramento dell'imaging ad alta risoluzione di assemblaggi di virus in liquidi e ghiaccio

Interest in liquid-electron microscopy (liquid-EM) has skyrocketed in recent years as scientists can now observe real-time processes at the nanoscale. It ...