Name: routine collection of high-resolution cryo-em datasets using 200 kv transmission electron microscope
Uploaded: 2022-03-16T14:00:00
Duration: 9 min 49 s
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	<li>Wang, J., Hua, T., Liu, Z. -. 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サガル・ハヴネカールは利益相反はないと報告している。他の著者は、MSD-EM部門であるサーモフィッシャーサイエンティフィックの従業員です。

記載されたプロトコルは、使用されるTEM顕微鏡の光学系が良好に整列した状態にあることを前提としている。このプロトコルで使用される 200 kV TEM の場合、このようなカラム位置合わせは、顕微鏡の設置または重要なサービス介入後に経験豊富なサービスエンジニアによって行われ、検証され、保存されます。これらのアライメント設定は、顕微鏡UIでいつでも呼び出すことができます。ユーザーは、顕微鏡UIのダイレクトアライメント手順を使用して、重要なパラメータを再調整できます。銃の傾きや銃のシフトなど、一部のアライメントは安定しており、ユーザーが日常的に調整する必要はありません。顕微鏡監督者による銃の傾きとシフトのチェックと再調整(必要に応じて)は、年に2回アドバイスされます。一方、一部のアライメントは重要であり、上記のプロトコルで説明したように、各データ収集の前にアライメントする必要があります(客観的な乱視や昏睡状態のないアライメントなど)。解析ソフトウェアのオートコマ機能が収束しない場合は、ビーム傾斜ピボットポイントや回転中心の位置合わせを検証・調整し、C2アパーチャの正しいセンタリングを確認する必要があります。その後、客観的なスティグメータが昏睡状態の修正にも使用されるため、自動設定機能を実行する必要があります。これらの配置は、自動関数と自動昏睡関数の両方が最初の反復で成功するまで繰り返す必要があります。必要に応じて、別の領域(例えば、氷のないカーボン箔を支持する)、画像化された焦点ずれの調整、または画像取得時間の増大、取得された画像における信号対雑音比の最適化、および取得された画像のフーリエ変換における複数のThonリングの可視性が選択され得る。
最新のクライオEM顕微鏡は、データセットあたり1TBを超える大量のデータを生成し、特に対称性の低いタンパク質に対して高解像度の3D再構成を実現します。クライオEMのデータと結果は、通常、各科学プロジェクトにおける構造と機能の関係を完全に理解するために、直交法からのデータと結果によって補完されます。収集されたデータの編成、画像処理パイプラインへの転送、および結果として生じるクライオEM再構成の共有をコラボレーター間で行うことで、クライオEM方法論の新規採用者がローカルITインフラストラクチャをセットアップするための追加の要件が課せられます。Athenaなどのデータ管理ソフトウェアは、接続された機器または登録ユーザーが操作するソフトウェアによって取得されたデータの集中保存を容易にします。保存されたデータとメタデータには、ログイン資格情報と実験設定のデータ共有定義に基づいて、異なるアクセス権 (所有者、共同作業者、または閲覧者として) を持つプロジェクト内で異なるロールを持つことができる複数のユーザーが、シンプルな Web ブラウザー インターフェイスを使用してアクセスできます。この実験ワークフローのデジタル化は、不必要な重複なしにコラボレーター間でデータとメタデータを共有する手段を提供し、使用されるワークフローの生産性とトレーサビリティを向上させます。データ管理ソフトウェアにおけるプロジェクト、実験、およびワークフローの一般的でカスタマイズ可能な構造の実装は普遍的であり、補完的な方法を使用して直交実験のカスタマイズと単一のプロジェクトデータベースへの統合を可能にします。
クライオEMグリッド上のデータ収集領域の選択は、高解像度データセットの取得を成功させるために不可欠です。Vitrobot(完全自動ガラス化保存システム)などの従来のプランジ凍結装置で製造されたクライオEMグリッドは、通常、グリッド表面上の氷厚の勾配を表示します(図4)。グリッドには氷の厚さが異なる領域が含まれているため、これは有益です。ただし、データ収集に理想的な氷厚のエリアは、上記のプロトコルで説明されているように識別する必要があります。最適なクライオEMグリッドは、転写氷の汚染をできるだけ少なくし、無傷の穴あいた支持箔を備えた十分なグリッド正方形を含む必要があります。亀裂や壊れた領域を持つグリッド正方形に関するデータの収集は、収集された画像が、無傷の支持箔を有するグリッド正方形と比較して、電子ビームによる照明時に有意に強い全体的なドリフトの影響を受けるため、推奨されない。過剰な結晶氷は、箔穴の大部分を閉塞し、および/またはオートフォーカスを妨げる可能性があり、そのようなグリッド正方形も避けるべきである。薄い氷のあるグリッド正方形は、通常、大きなガラス質領域と、アトラスプリセットを使用して撮影された画像に見える多くの明るい箔穴を示します。グリッドバーの近くに厚い氷が発生することは、グリッド正方形のこれらの領域の箔穴が穴の選択手順中に除外されるため、予想され、重要ではありません。グリッドの正方形にいくつかの空の穴が存在することは、周囲の穴のガラス質の氷が非常に薄く、損傷した粒子または粒子がまったく含まれていない可能性があることを示している可能性があります。一般に、どの領域が高解像度データ収集に最適な条件を持ち、理想的な粒子密度と配向分布を示すかを理解するために、最初のスクリーニングと評価のためにグリッド上のさまざまな領域でさまざまな氷の厚さを持つグリッド正方形を選択することが賢明です。この研究で使用したapoFおよび20Sプロテアソームサンプルの場合、観察可能な氷が最も薄い領域には、これらのサンプルの高解像度イメージングに最適な条件が含まれています。
データ収集ソフトウェアを使用して選択したすべてのグリッド正方形の穴を自動的に選択する場合は、各グリッド正方形の代表的な穴に対してテンプレート実行タスクを実行して、過度に厚いか、過度に薄くないか、または予期せず非ガラス質の正方形がデータ収集のために選択されていないことを確認することをお勧めします。データ集録中に、EQMを使用して、画像ドリフトやCTFフィッティングなど、収集された画像の主要な品質指標を監視できます。データ収集は、低品質の画像を生成する領域をスキップすることによって最適化できます。ただし、高解像度のCTF適合画像には、いくつかの好ましい向きの粒子または薄すぎる氷層で変性した粒子を含む画像が含まれることがあります。収集された画像からのリアルタイムの粒子ピッキングと2D分類は、画像化された粒子の構造データの品質に関する追加情報を提供し、氷中の無傷の粒子の好ましい配向または(部分的に)変性した粒子の不整合な構造の両方を明らかにする。したがって、クラス平均の計算は、他のソフトウェアパッケージ23、28で既に実装および示されているように、データ収集のための適切な領域をさらに洗練させるのに役立つ可能性がある。
倍率、電子線量率、デフォーカス範囲などのデータ取得用のイメージング設定の選択は、ターゲット解像度、タンパク質のサイズ、サンプル濃度、所望の顕微鏡スループットなど、いくつかの基準に依存します。これらの実験で使用した直接電子検出器カメラでは、平行照明を維持するために適切なSPOTサイズと強度を選択することにより、電子線量率を4〜5e-/pix/sの範囲で選択した。 表1に示すように、穴/ユーセントリック高さプリセットで異なるSPOTサイズを使用して、データ収集中に穴をセンタリングするための十分な信号対雑音比を画像内で保証することができます。倍率は、ピクセルサイズがクライオEM再構成のターゲット解像度よりも少なくとも2〜3倍小さくなるように選択する必要があります。しかし、より高い倍率(すなわち、より小さいピクセルサイズ)が使用されるほど、画像にキャプチャされる視野が小さくなり、画像あたりの粒子が少なくなり、最終的に3Dマップを高解像度に再構築するのに十分な粒子を含む画像を収集するためのデータ収集時間が長くなる。apoFサンプルでは、画像内の粒子の高密度に十分なサンプル濃度があり、再構成の解像度が2 Å未満を目指したため、0.43 Åのピクセルサイズを使用しました。20Sプロテアソームサンプルでは、0.68 Åのピクセルサイズを使用して、取得した画像でより大きな視野をカバーしました。通常、200 kV TEM 顕微鏡では、クライオ EM 画像は 0.8 ~ 2.0 μm のデフォーカス範囲で取得されます。しかし、エネルギーフィルタを使用したコントラストと信号対雑音比の向上により、収差が小さくなり、CTFエンベロープ関数の減衰が低減されるため、データ取得を焦点に近づけて、取得した画像の高解像度情報をより適切に保存できます。また、対物絞りは、エネルギーフィルタを使用して画像コントラストがすでに十分に強化されている間、追加の画像収差を導入する可能性があるため、使用しません。apoFおよび20Sプロテアソームサンプルについては、0.5μm、0.7μm、および0.9μmのデフォーカス設定を使用しました。より小さなタンパク質(<200 kDa)の場合、-0.5 μm、-0.7 μm、および-0.9 μmのデフォーカス設定を使用して粒子のコントラストを改善し、3D再構成の3D微細化ステップで粒子の選択と初期の粗いアライメントを容易にし、約2.5 Åの解像度の3Dマップ(未発表の結果)をもたらしました。
エネルギーフィルタによるイメージングは、ハイエンドの300kV TEM顕微鏡11で収集されたクライオEM画像における信号対雑音比(SNR)を改善することをすでに示しました。実際、電子が試料を通過すると、主に2種類の相互作用が起こります:i)弾性散乱電子は、位相コントラスト機構を介して非散乱入射ビームとの干渉によってエネルギーを維持し、画像形成に寄与するii)非弾性散乱電子は試料中のエネルギーをいくらか失い、主に画像内のノイズに寄与する。したがって、入射ビームよりもエネルギーの低い非弾性散乱電子や弾性散乱電子を狭いエネルギースリットを用いてフィルタリングすることにより、SNRを大幅に向上させることができる。ただし、高解像度クライオEMデータセットの自動データ取得に長時間(12時間以上)にわたって非常に狭い(10eV以下)スリットを使用できるようにするには、SelectrisやSelectris-Xなどの十分に安定したエネルギーフィルタを使用することが重要です。
300 kV TEM顕微鏡と同じ条件で200 kV TEM顕微鏡で取得したクライオEM画像は、CTFエンベロープ機能の減衰が速いため、高解像度(特に<4 Å)でSNRが小さくなります。したがって、200 kV TEMを使用する場合、特定の解像度を達成するためには、より多くの粒子(したがって、より多くの収集された画像)が必要です。さらに、被写界深度(2-3 Å Å の解像度範囲で 10-25 nm)も 200 kV 画像 35 で約 20% 小さくなり、氷層内のより少ない粒子 (通常は厚さ 20 ~ 50 nm ) が完全に焦点を合わせ、3D 再構成手順の後期段階で各粒子に対して個別にデフォーカス値が調整されない限り、計算された3D 再構成のすべての高解像度特性に建設的に貢献します。より大きな粒子(二十面体ビリオンまたは他の高分子集合体など)の場合、粒径は、高解像度で被写界深度を超え、標準的な3D再構成アルゴリズム36におけるエワルド球の平面近似に起因する位相誤差を導入する可能性がある。これらの誤差は、共通のクライオEM画像処理パッケージ37、28、39に既に実装されている高度なアルゴリズムによって精緻化することができる。エワルド球は300kVデータよりも200kVデータにおける曲率が大きいため、200kV TEMを使用する場合、エワルド球補正は比較的低い分解能および/または比較的小さな高分子集合体に必要である。一方、200kVの画像は、200-300keVの電子平均自由行程(220-280nm)よりも著しく薄い、薄氷(20-50nm)中の粒子のより高いコントラストを示す。コントラストが高いほど、個々の粒子の正しいグローバルアライメント、特に構造がまだ不明で、3D参照モデルがまだ十分に確立されていない小さなタンパク質を弱く散乱させる場合に改善するのに役立ちます。
ここでは、200kV TEM顕微鏡を使用した場合、エネルギーフィルターで画像のコントラストと品質を同様に改善できることを、20Sプロテアソームの例で実証しました。同じ数の粒子を使用して、20eVスリットを使用して収集されたデータは、2.34Å分解能のみに再構築された完全に開いたエネルギースリットで収集されたデータと比較して、2.26Åの分解能に再構築された。最良の再構成は、2.14 Å の分解能に再構築された 10 eV スリットを使用して収集されたデータから達成されました。これらの結果は、 表4に要約されているように、非弾性散乱電子のフィルタリングが収集された画像のSNRを増加させ、所定の数の粒子からのクライオEM再構成におけるより高い分解能を促進するという理論的予測と一致している。これらの結果は、これらのデータセットから計算されたB因子によってさらに確認され、エネルギーフィルタリングされたデータセット内の画像の高品質を示す。
したがって、300 kV TEM顕微鏡はクライオEM再構成において最高のスループットと最高の分解能を提供する一方で、200 kV TEM顕微鏡は高解像度クライオEM再構成のための高品質のデータセットも提供すると結論付けることができます。我々はここで、エネルギーフィルターと直接電子検出器を備えた200kV TEMを使用することにより、取得した画像の品質、したがって構造までの全体的な時間をさらに改善できることを示した。提示されたプロトコルは、このセットアップを使用して高分解能クライオEMデータを日常的に取得し、構造生物学および構造ベースの薬物設計における重要な構造機能関係を理解するために不可欠な高分子3D構造の微細構造の詳細を明らかにする方法に必要なすべての手順を説明しています。

タンパク質構造の決定は、細胞代謝、シグナル伝達、宿主-病原体相互作用などの重要な細胞プロセスに関与するタンパク質複合体の分子構造、機能、および調節を理解するために重要です。クライオ電子顕微鏡(クライオEM)は、X線回折やNMR分光法などの従来の構造技術には難しすぎた多くのタンパク質とその複合体の3D構造を解くことができる強力な技術として浮上してきました。特に、クライオEMは、従来の構造技術では容易に結晶化または十分な量で調製することができない膜タンパク質に最適な方法として証明されており、重要な細胞受容体およびイオンチャネルの構造および機能に関する新しい洞察を提供しました1、2、3、4、5.最近では、クライオEMは、SARS-CoV-2感染のメカニズムを分子レベルで決定することにより、Covid-19パンデミックと戦う上で重要な役割を果たしており、Covid-19疾患の起源を解明し、効率的なワクチンと治療法の迅速な開発の基礎を提供しました6,7,8,9,10。
通常、ハイエンドの300kV透過型電子顕微鏡(TEM)は、クライオEM単粒子分析(SPA)による生体分子の高分解能構造決定に使用され、その立体構造と相互作用を明らかにします。最近、SPA技術は、冷電界放出ガン(E-CFEG)、直接電子検出器、およびエネルギーフィルタを備えた300kV TEMを使用して、共通のベンチマーククライオEMサンプルアポフェリチンが原子分解能(1.2Å)11,12で再構築されたときに新しいフロンティアに達しました。この分解能により、構造中の個々の原子の位置、個々のアミノ酸側鎖の立体構造、水素結合などの相互作用を明確に解き明かすことができ、構造に基づく新規標的の創薬や既存医薬品候補の最適化に新たな可能性が開かれました。
ミッドレンジの200kV TEM顕微鏡は、特に大規模なクライオEM施設で、ハイエンドTEM顕微鏡を使用した最終的な高解像度データ収集の前に、サンプルスクリーニングとサンプル最適化によく使用されます。通常、画像化されたサンプルは、最終的なデータ収集のためにハイエンドの300kV TEMに移行するのに十分な3~4Åの解像度範囲で解決できます。その結果、200kV TEMを使用したデータ収集は、可能な限り高い分解能の結果を得るためにさらに最適化されないことがよくあります。さらに、すべてのアミノ酸側鎖がすでに解決されているため、多くの興味深い生物学的疑問にすでに回答し、これらの分解能で公開することができ、リガンド結合部位の占有率も確実に決定することができる13。200kV TEMは、多数のサンプル14、15、16、17、18に対して3 Åを超える分解能に達することがすでに示されています。200 kV で撮影された画像は、画像化された粒子の本質的に高いコントラストを示し、300 kV TEM 画像と比較して高解像度でより減衰した信号にもかかわらず、粒子のより正確な初期アライメントを容易にすることさえあります。再構成されたクライ-EMマップの達成された分解能は、画像化されたサンプルの構造的柔軟性と立体配座の不均一性によっても制限され、200kVと300kVの両方の再構成に影響を与えることに注意することが重要です。実際、300kVシステムを使用して得られたクライオEM再構成は、高解像度19よりもはるかに多くのクライオEM再構成が3~4Åの分解能範囲で解決されました。200 kV TEM顕微鏡はそれほど複雑ではなく、小さな部屋に収まるため、これらの顕微鏡は、顕微鏡オートローダーシステム内に保存されている複数のサンプルからの長いデータ収集の自動化を維持しながら、クライオEMによる生物学的高分子の構造決定のための優れた低コストのオプションを表します。
高解像度の構造決定のためのクライオEMデータセットの収集には、顕微鏡光学系の正確な位置合わせが必要です。列の整列は、電子源から集光レンズ系、対物レンズ、電子検出器を備えたエネルギーフィルターまで体系的に進行します。通常、アライメントの完全なシーケンスは必要ありません。必要に応じて、顕微鏡ユーザーインターフェイス(ダイレクトアライメントコントロールパネル)のアライメント手順全体を通して、コンテキスト認識ヘルプウィンドウに各ステップの適切な説明とともに、半自動化された手順を介してユーザーに案内されます。顕微鏡が完全に整列すると、電子光学系は安定したままであり、少なくとも数ヶ月間は位置合わせを変更する必要はありません。サンプル平面の平行照明、客観的乱視、昏睡状態のない配置など、最も感度の高い配置のみを、各データセットのコレクションを開始する直前に調整する必要があります。収集されたデータの品質は、EPU Quality Monitor、cryoSPARC Live 20、Relion 21、Scipion22、WARP23、Appion 24などのさまざまなソフトウェアパッケージを使用して、データ収集中に監視できます。
顕微鏡の正確なアライメントに加えて、立体構造および組成の不均一性を最小限に抑えた高品質のよく精製されたサンプルも、高解像度データセットの収集と高解像度構造の解決の前提条件です。典型的なプロトコル、頻繁な課題、および可能な救済策の詳細については、このトピック専用の他のレビュー25,26,27を参照してください。基本的に、高解像度の情報を保存するのに十分な薄い氷があり、個々の粒子が重複することなくランダムな向きで密集して分布している特定のクライオEMグリッド上の領域を見つけることが不可欠です。しかし、一般的なクライオEMグリッドは氷の厚さが不均一であるため、イメージングに最適な領域を見つけて選択することが重要です。グリッド上の氷厚を推定するさまざまな手段は、EPU 2、Leginon28、SerialEM29などのクライオEMデータセットの自動収集専用のソフトウェアパッケージで利用できます。
高速で高感度な直接電子検出器の出現により、ビーム誘発運動の補償を可能にし、画像処理および最終的な3D再構成に使用されるデータの品質および量の大幅な増加をもたらしたムービーとして、多くの画分の画像の収集を可能にした30。同時に、自動化と高スループットのデータ収集は、データの保存とアクセスの課題を表す何千もの画像/ムービーを含む巨大なデータセットを提供します。数十から数百人のユーザーにサービスを提供する大規模なクライオEM施設を備えた採用モデルは、特に確立されたクライオEMパイプライン31、32において、適切な追跡とデータ共有を伴う組織的なデータ管理を必要とする。
この研究は、200kV Glacios TEM顕微鏡を用いた高解像度クライオEMデータセットの日常的な収集のためのプロトコルを記述している。顕微鏡光学系の必要なアライメントは、クライオEMサンプルの評価手順と、高解像度データ収集に適した領域の選択とともに説明されています。収集されたデータとサンプル情報を使用した関連メタデータの編成は、サンプル情報と収集されたデータのレビューを容易にするデータ管理プラットフォームであるAthenaで示されています。マウスアポフェリチンサンプルを用いて、1.6Å解像度13で3D再構成を達成することができた。記載されたプロトコルを使用して、我々はまた、2.1Åの解像度で サーモプラズマアシドフィラム からの20Sプロテアソームの3D密度マップを再構築した。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>AutoGrid rings</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>1036173</td>
			<td>Package of 100x AutoGrid rings for the standard EM grids.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C-Clip</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>1036171</td>
			<td>Package of 100 clips that secure 
			the standard EM grids inside the AutoGrid rings.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Data Management Platform</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>1160939</td>
			<td>Part of the Glacios base configuraiton; includes Athena Software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EPU Quality Monitor</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>1179770</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EPU Software</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>1025080</td>
			<td>Part of the Glacios base configuration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethane 3.5</td>
			<td>Westfalen</td>
			<td>A06010110</td>
			<td>Ethane gas used for making liquid ethane (puritiy at least N35, i.e. 99.95% vol)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 4 200kV</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>1166936</td>
			<td>Direct electron detector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glacios</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>1149551</td>
			<td>200 kV TEM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GloQube Plus Glow Discharge System for TEM Grids and surface modification</td>
			<td>Quorum</td>
			<td>N/A</td>
			<td>also available via Thermo Fisher Scientific (PN 1160602)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuantiFoil grids</td>
			<td>Quantifoil</td>
			<td>N/A</td>
			<td>R-2/1, 300 mesh; carbon foil grid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Relion</td>
			<td>MRC Laboratory of Molecular Biology</td>
			<td>N/A</td>
			<td>open source software: 
			https://relion.readthedocs.io/en/release-3.1/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Selectris with Falcon 
			4 for 200 kV</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>1191753</td>
			<td>Energy filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Selectris X with Falcon 
			4 for 200 kV</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>1191755</td>
			<td>Energy filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltrAuFoil grids</td>
			<td>Quantifoil</td>
			<td>N/A</td>
			<td>R-1.2/1.2, 300 mesh; gold foil grids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vitrobot Mk. IV</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>1086439</td>
			<td>Automated vitrification system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman 595 filter paper</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AA00420S</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

routine collection of high-resolution cryo-em datasets using 200 kv transmission electron microscope

クライオ電子顕微鏡(クライオEM)は、過去10年間にタンパク質構造決定の日常的な方法として確立され、公表された構造データのシェアは増え続けています。TEM技術と自動化の最近の進歩により、データ収集の速度と取得した画像の品質の両方が向上すると同時に、3 Å未満の解像度でクライオEMマップを取得するために必要な専門知識レベルが低下しています。このような高分解能構造のほとんどは、最先端の300kVクライオTEMシステムを使用して得られていますが、特にエネルギーフィルタを装備している場合、200kVクライオTEMシステムでも高分解能構造を得ることができます。さらに、リアルタイムの画質評価による顕微鏡アライメントとデータ収集の自動化により、システムの複雑さが軽減され、最適な顕微鏡設定が保証されるため、高品質の画像の収率とデータ収集の全体的なスループットが向上します。このプロトコルは、200kVのクライオ透過型電子顕微鏡に最近の技術的進歩と自動化機能を実装することを示し、 de novo 原子モデルの構築に十分な3Dマップの再構築のためのデータを収集する方法を示しています。このような高解像度のクライオEMデータセットの日常的な収集を可能にするために考慮する必要があるベストプラクティス、重要な変数、および一般的な問題に焦点を当てています。特に、i)顕微鏡アライメントの自動化、ii)データ収集に適した領域の選択、iii)高品質で高スループットのデータ収集に最適な光学パラメータ、iv)ゼロロスイメージングのためのエネルギーフィルタチューニング、v)データ管理と品質評価。エネルギーフィルターと直接電子検出器を備えた200kV TEMを使用して2.1-Åの分解能に再構築されたアポフェリチンと、エネルギーフィルターと直接電子検出器を備えた2.1-Åの分解能に再構築された サーモプラズマアシドフィラム 20Sプロテアソームの例で、エネルギーフィルターを使用して達成可能な分解能のベストプラクティスの適用と改善が実証されます。

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Routine Collection of High-Resolution cryo-EM Datasets Using 200 KV Transmission Electron Microscope

高分子の高解像度クライオEMマップは、200kV TEM顕微鏡を使用することによっても達成できます。このプロトコルは、200kV TEMを使用して高解像度データセットを正常に収集するために不可欠な、正確な光学系アライメント、データ収集スキーム、およびイメージング領域の選択を設定するためのベストプラクティスを示しています。

200KV透過型電子顕微鏡を用いた高分解能クライオEMデータセットのルーチンコレクション

Cryo-electron microscopy (cryo-EM) has been established as a routine method for protein structure determination during the past decade, taking an ...

クライオEMは、タンパク質およびその複合体の構造決定のための標準的な技術となっている。このプロトコルでは、ミッドレンジの200kV TEM顕微鏡から高解像度のCryo-EMデータセットを取得する方法のベストプラクティスについて説明します。Cryo-EMは、複数の立体構造状態および機能状態を同時に解決するために、ほぼ天然条件下でタンパク質構造を決定することができるが、これは他の構造技術ではとらえどころのないものである。得られた構造情報は、タンパク質機能の分子機構の解明や構造に基づく創薬に役立てることができます。例えば、アミロイド線維の構造に関する最近の刊行物は、重要なリガンドの複数の結合部位を明らかにした。しかし、このプロトコルでは、アポフェリチンとプロテアソームの標準サンプルを使用して、高解像度のCryo-EMデータを取得するための重要なステップを実証します。Cryo-TEMの操作は、特に高度な自動化機能の導入により、ここ数年でより簡単になりました。ただし、最初のセッションでは、より経験豊富なユーザーとのトレーニングを行うことをお勧めします。そこから、技術の進歩は比較的速いです。この手順を実演するのは、サーモフィッシャーサイエンティフィックのシニアアプリケーションサイエンティストであるエイドリアン・コーです。液体窒素条件下でオートローダーカセットにオートグリッドを挿入します。オートグリッド付きのカセットを液体窒素冷却移送カプセルに挿入します。さらにカプセルを顕微鏡に挿入し、顕微鏡UIのDockボタンをクリックして、カプセルから顕微鏡のオートローダーにカセットをロードします。[インベントリ]ボタンをクリックして、ロードされたカセット内の自動グリッドの存在を確認します。次に、[ロード]ボタンと[アンロード]ボタンをクリックして、TEMイメージング用の列に自動グリッドを挿入します。[アトラス]タブを選択し、[新しいセッション]ボタンをクリックして新しいセッションを開きます。セッション名やデータ保存場所などの詳細を入力し、[適用]ボタンをクリックします。対応するグリッド番号の横にあるチェックボックスをオンにして、目的のグリッドを選択します。[スタート] ボタンをクリックすると、選択したすべてのグリッドのアトラスの完全自動コレクションが開始されます。収集が完了したら、グリッドラベルをクリックして、取得したアトラスを確認します。[EPU]タブを選択し、[新しいセッション]に移動して、左側のパネルに新しいセッションを作成します。「新規セッション」オプションを選択して、現在の光学式プリセットを使用します。セッション名を入力します。セッションの手動タイプを選択すると、プロトコルの後半でデータ収集用に選択された個々の穴とグリッドの正方形の選択を制御できます。高速集録モードを選択すると、収差のない画像シフトを使用してデータ収集が行われます。次に、メタデータを保存する場所を入力します。「適用」ボタンをクリックして、新しいセッションを作成します。左側のパネルで正方形の選択タスクを選択して、収集されたグリッドのアトラスを表示します。損傷のない無傷のサポートホイル、薄いガラス質の氷とホイルの穴、グリッド正方形のごくわずかな結晶氷汚染、グリッド正方形全体および個々のホイル穴内の最小の輝度勾配を持つグリッド正方形を特定します。データ収集用のグリッドの四角形を、完全なアトラスまたは高品質のタイル画像で選択します。目的のグリッドの正方形を右クリックし、選択タスク全体を選択します。自動ユーセントリックボタンをクリックすると、最初に選択したグリッドの正方形に自動的に移動します。ユーセントリックの高さを調整し、箔穴を見つけるためのグリッド正方形画像を取得します。[穴を探す]ボタンをクリックして、画像内の箔穴を見つけます。「穴を削除」ボタンをクリックしてグリッドバーボタンを閉じ、グリッドバーの近くの穴の選択を解除します。アイスフィルターの明るさヒストグラムの制限を調整して、氷が厚すぎるすべての穴と空の穴をすべて削除します。グリッド正方形画像の穴を右クリックし、[ステージを移動] を選択して、ここでステージを移動場所に移動します。左側のパネルでテンプレート定義タスクを選択します。[取得]ボタンをクリックして、画像全体を取得します。画像シフト後の遅延の値を 0.5 秒、ステージシフト後の遅延の値を 5 秒に設定します。「穴を見つけて中央揃え」ボタンをクリックして、画像内の穴を中央に配置します。[取得領域の追加]ボタンを選択し、画像をクリックして、中央の穴で高倍率の画像取得が行われる位置を選択します。[オートフォーカスエリアの追加]ボタンを選択し、画像をクリックして、画像オートフォーカスが実行される中央の穴の横にあるサポートホイル上の位置を選択します。緑色の取得領域をクリックして、ソフトウェアウィンドウの上部セクションにあるデフォーカスリストに一連のデフォーカス値を設定します。オートフォーカス固有の設定を設定した後、各AFISクラスタの開始時にオートフォーカスにセンタリングした後のオプションを選択します。オプションを選択すると、対物レンズを選択すると、オートフォーカスが速くなり、ステージドリフトが減少します。穴選択タスクの「すべての正方形を準備」ボタンをクリックすると、この最初のグリッド正方形で使用されている設定に従って、データ収集と他のすべての選択したグリッド正方形が自動的に設定されます。テンプレート定義タスクを選択し、新しい画像を取得し、右クリックでステージをカーボンホイル上のクリーンな領域に移動し、メニューオプション[ステージをここに移動]を選択します。「自動機能」タブを選択します。目的のデフォーカスを設定して反復処理した後、オートフォーカスプリセットに切り替えてスタートボタンをクリックしてオートフォーカス機能を実行します。自動タスクを選択し、トーンリングプリセットに切り替えてスタートボタンを押します。自動昏睡タスクを選択し、[スタート]ボタンを押します。ステージをグリッドの正方形が壊れている領域に移動します。オートフォーカス画像を1枚撮影して領域の透明度を確認します。シェルパ UI を開き、エネルギー フィルター アプリケーションを選択します。[中央]ボタンと[ゼロ損失]オプションをクリックして、ゼロ損失エネルギーフィルタスリットを中央に配置します。アイソクロマチシティオプションの[調整]ボタンをクリックします。幾何学的歪みと色歪みの「倍率を調整」オプションをクリックします。EPUタブに移動し、自動取得タスクを選択し、[実行開始]ボタンをクリックして、完全に自動化されたデータ収集を開始します。この図は、グリッド表面上の氷厚の勾配を表示するクライオEMグリッドを示しています。さらなる調査から除外されたグリッドは、厚い氷を持つ悪いグリッドと悪い氷と汚染のある曲がったグリッドですが、許容可能なグリッドは、良好な氷勾配を有するグリッドと、良好な薄氷および小さな氷勾配を有する典型的なグリッドである。この図は、再構築されたアポフェリチンCryo-EMマップの最終的な3Dレンダリングを示しています。高い安定性と対称性により、高解像度のCryo-EMイメージングと画像処理に最適なベンチマークサンプルとなります。ベイズ研磨、CTF 精緻化、およびエワルド球補正により、1.63 オングストローム解像度のマップが得られました。図は、個々のアミノ酸側鎖レベルで再構成されたアポフェリチンCryo−EMマップの詳細図を示す。アミノ酸側鎖の密度はよく分解されており、原子モデルはマップ内で明確に構築することができます。この画像は、同じCryo-EMグリッドから収集された異なるデフォーカス値の2つの異なるデータセットを示しており、スリットが完全に開いたグリッド正方形と10電子ボルトのスリットがあり、10電子ボルトのスリットが画像コントラストを大幅に改善することを示しています。本明細書の図は、標準的なCryo−EMサンプルとして使用されるセグメント化されたサブユニットを有する20SプロテアソームCryo−EMマップの概要を示す。そして、適合した原子モデルによるズームビューは、D7対称性を持つプロテアソーム複合体の安定した触媒コアを表しています。このプロトコルには、2 つの重要なステップが含まれています。1つは、均質な粒子を含む薄いガラス質の氷がある領域を探すことです。そして2つ目は、データ集録用の並列照明の設定です。タンパク質の高解像度再構成により、分解能が2~3オングストロームに達すると、疾患の分子メカニズムをよりよく理解し、薬物リードを改善することができます。以前は、生命現象の構造的基盤を研究したい場合、結晶化が必要でした。今日、Cryo-EMでは、それはもはや必要ありません。Cryo-EMにより、科学者はより広い範囲の生命現象を構造レベルで研究することができます。

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Method to Visualize and Analyze Membrane Interacting Proteins by Transmission Electron Microscopy

透過型電子顕微鏡により膜相互作用タンパク質を視覚化し、分析するための方法

Monotopic proteins exert their function when attached to a membrane surface, and such interactions depend on the specific lipid composition and on the ...

High-resolution Single Particle Analysis from Electron Cryo-microscopy Images Using SPHIRE

SPHIREを用いた電子冷凍顕微鏡画像からの高分解能単一粒子解析

SPHIRE (SPARX for High-Resolution Electron Microscopy) is a novel open-source, user-friendly software suite for the semi-automated processing of single ...

Cryo-EM and Single-Particle Analysis with Scipion

クリオEMとシピオンによる単粒子分析

Cryo-electron microscopy has become one of the most important tools in biological research to reveal the structural information of macromolecules at ...

Preparation of Sample Support Films in Transmission Electron Microscopy using a Support Floatation Block

支持浮遊ブロックを用いた透過電子顕微鏡におけるサンプル支持膜の作製

Structure determination by cryo-electron microscopy (cryo-EM) has rapidly grown in the last decade; however, sample preparation remains a significant ...

Preparing Lamellae from Vitreous Biological Samples Using a Dual-Beam Scanning Electron Microscope for Cryo-Electron Tomography

クライオ電子線トモグラフィー用デュアルビーム走査電子顕微鏡を用いたガラス質生体試料からのラメラの調製(英語)

Presented here is a protocol for preparing cryo-lamellae from plunge-frozen grids of Plasmodium falciparum-infected&#160;human erythrocytes, which could ...

Preparation of High-Temperature Sample Grids for Cryo-EM

クライオ電子顕微鏡用高温サンプルグリッドの作製

The sample grids for cryo-electron microscopy (cryo-EM) experiments are usually prepared at a temperature optimal for the storage of biological samples, ...

Micropatterning Transmission Electron Microscopy Grids to Direct Cell Positioning within Whole-Cell Cryo-Electron Tomography Workflows

全細胞クライオ電子断層撮影ワークフロー内での細胞位置のダイレクト位置を測定するマイクロパターン化透過電子顕微鏡グリッド

Whole-cell cryo-electron tomography (cryo-ET) is a powerful technology that is used to produce nanometer-level resolution structures of macromolecules ...

Quantification of Subcellular Glycogen Distribution in Skeletal Muscle Fibers using Transmission Electron Microscopy

透過型電子顕微鏡による骨格筋線維の細胞内グリコーゲン分布の定量化

With the use of transmission electron microscopy, high-resolution images of fixed samples containing individual muscle fibers can be obtained. This ...

A Robust Single-Particle Cryo-Electron Microscopy (cryo-EM) Processing Workflow with cryoSPARC, RELION, and Scipion

A Robust Single-Particle Cryo-Electron Microscopy cryo-EM Processing Workflow with cryoSPARC, RELION, and Scipion

クライオスパーク、リオン、サイピオンによる堅牢な単一粒子クライオ電子顕微鏡(クライオEM)処理ワークフロー

Recent advances in both instrumentation and image processing software have made single-particle cryo-electron microscopy (cryo-EM) the preferred method ...

Advancing High-Resolution Imaging of Virus Assemblies in Liquid and Ice

液体および氷中のウイルス集合体の高解像度イメージングの進歩

Interest in liquid-electron microscopy (liquid-EM) has skyrocketed in recent years as scientists can now observe real-time processes at the nanoscale. It ...