Name: routine collection of high-resolution cryo-em datasets using 200 kv transmission electron microscope
Uploaded: 2022-03-16T14:00:00
Duration: 9 min 49 s
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	<li>Wang, J., Hua, T., Liu, Z. -. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+features+of+activated+GPCR+signaling+complexes.">Structural features of activated GPCR signaling complexes.</a> Current Opinions in Structural Biology. 63, 82-89 (2020).</li><li>Chen, S., Gouaux, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+mechanism+of+AMPA+receptor+-+auxiliary+protein+complexes.">Structure and mechanism of AMPA receptor - auxiliary protein complexes.</a> Current Opinions in Structural Biology. 54, 104-111 (2019).</li><li>K&#252;hlbrandt, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+mechanisms+of+F-Type+ATP+synthases.">Structure and mechanisms of F-Type ATP synthases.</a> Annual Review of Biochemistry. 88, 515-549 (2019).</li><li>Laverty, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo-EM+structure+of+the+human+&#945;1&#946;3&#947;2+GABA+A+receptor+in+a+lipid+bilayer.">Cryo-EM structure of the human &#945;1&#946;3&#947;2 GABA A receptor in a lipid bilayer.</a> Nature. 565 (7740), 516-520 (2019).</li><li>Liu, F., Zhang, Z., Csan&#225;dy, L., Gadsby, D. 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Sagar Khavnekar는 이해 상충을보고하지 않습니다. 다른 저자는 MSD-EM 부서 인 Thermo Fisher Scientific의 직원입니다.

기술된 프로토콜은 사용된 TEM 현미경의 광학이 잘 정렬된 상태에 있다고 가정한다. 이 프로토콜에 사용된 200kV TEM의 경우, 이러한 컬럼 정렬은 현미경 설치 또는 중요한 서비스 개입 후 숙련된 서비스 엔지니어에 의해 수행, 검증 및 저장됩니다. 이러한 정렬 설정은 현미경 UI에서 언제든지 불러올 수 있습니다. 사용자는 현미경 UI의 직접 정렬 절차를 사용하여 중요한 매개 변수를 다시 조정할 수 있습니다. 총 기울기 및 총 이동과 같은 일부 정렬은 안정적이며 사용자가 매일 조정할 필요가 없습니다. 현미경 감독관에 의한 총 기울기 및 교대의 점검 및 재 정렬 (필요한 경우)은 일년에 두 번 권장됩니다. 반면에 일부 정렬은 중요하며 위의 프로토콜에 설명 된대로 각 데이터 수집 전에 정렬되어야합니다 (예 : 객관적인 난시 및 혼수 상태가없는 정렬). 분석 소프트웨어의 Autocoma 기능이 수렴되지 않으면 빔 틸트 피벗 포인트 및/또는 회전 중심의 정렬을 확인 및 조정하고 C2 조리개의 올바른 중심을 확인해야 합니다. 그 후, 자동 낙인 찍기 기능은 객관적인 낙인이 혼수 상태 교정에도 사용되기 때문에 실행되어야합니다. 이러한 정렬은 Autostigmate와 Autocomafunctions가 첫 번째 반복에서 성공할 때까지 반복되어야합니다. 필요하다면, 획득된 이미지들에서의 신호-대-잡음비를 최적화하기 위해 다른 영역(예를 들어, 얼음 없이 탄소 호일 지지), 영상화된 디포커스 조정, 또는 이미지 획득 시간 증가, 및 획득된 이미지들의 푸리에 변환에서 다수의 톤 링들의 가시성이 선택될 수 있다.
최신 cryo-EM 현미경은 특히 대칭성이 낮은 단백질에 대해 고해상도 3D 재구성을 달성하기 위해 데이터 세트당 1TB를 초과하는 방대한 양의 데이터를 생성합니다. Cryo-EM 데이터 및 결과는 일반적으로 각 과학 프로젝트의 구조 - 기능 관계를 완전히 이해하기 위해 직교 방법의 데이터 및 결과로 보완됩니다. 수집된 데이터의 조직, 이미지 처리 파이프라인으로의 전송, 공동 작업자 간의 결과 cryo-EM 재구성 공유는 cryo-EM 방법론의 새로운 채택자에게 로컬 IT 인프라를 설정하는 데 추가적인 요구 사항을 적용합니다. Athena와 같은 데이터 관리 소프트웨어는 등록된 사용자가 운영하는 연결된 기기 또는 소프트웨어에 의해 획득된 데이터의 중앙 집중식 저장을 용이하게 합니다. 저장된 데이터 및 메타데이터는 실험 설정의 로그인 자격 증명 및 데이터 공유 정의에 따라 서로 다른 액세스 권한(소유자, 공동 작업자 또는 뷰어)을 사용하여 프로젝트에서 서로 다른 역할을 수행할 수 있는 여러 사용자가 간단한 웹 브라우저 인터페이스를 사용하여 액세스할 수 있습니다. 이러한 실험 워크플로의 디지털화는 불필요한 중복 없이 공동 작업자 간에 데이터 및 메타데이터를 공유할 수 있는 수단을 제공하고 사용된 워크플로의 생산성과 추적성을 향상시킵니다. 데이터 관리 소프트웨어에서 프로젝트, 실험 및 워크플로의 일반적이고 사용자 정의 가능한 구조를 구현하는 것은 보편적이며 보완적인 방법을 사용하여 직교 실험을 단일 프로젝트 데이터베이스에 사용자 정의하고 통합할 수 있습니다.
cryo-EM 그리드에서 데이터 수집을 위한 영역을 선택하는 것은 고해상도 데이터 세트를 성공적으로 획득하는 데 매우 중요합니다. Vitrobot(완전 자동화된 유리화 시스템)과 같은 기존의 급락 냉동 장치로 생산된 Cryo-EM 그리드는 일반적으로 그리드 표면에 얼음 두께의 기울기를 표시합니다(그림 4). 이것은 그리드에 얼음 두께가 다른 영역이 포함되어 있기 때문에 유용 할 수 있습니다. 그러나 데이터 수집에 이상적인 얼음 두께를 가진 영역은 위의 프로토콜에 설명 된대로 식별되어야합니다. 최적의 cryo-EM 그리드는 가능한 한 적은 이송 얼음 오염을 포함해야하며 구멍이 뚫린 지지 호일이있는 충분한 그리드 사각형을 포함해야합니다. 균열이나 깨진 영역이있는 그리드 사각형에 대한 데이터 수집은 수집 된 이미지가 손상되지 않은지지 호일을 가진 그리드 사각형과 비교하여 전자 빔에 의한 조명시 훨씬 강한 전반적인 드리프트의 영향을받기 때문에 권장되지 않습니다. 과도한 결정질 얼음은 대부분의 호일 구멍을 막거나 자동 초점을 방해 할 수 있으며 이러한 그리드 사각형도 피해야합니다. 얇은 얼음이 있는 격자 사각형은 일반적으로 큰 유리체 영역과 아틀라스 사전 설정을 사용하여 촬영한 이미지에서 볼 수 있는 많은 밝은 호일 구멍을 나타냅니다. 그리드 막대에 가까운 더 두꺼운 얼음의 발생은 구멍 선택 절차 중에 그리드 사각형의 이러한 영역에 있는 호일 구멍이 제외되므로 중요하지 않을 것으로 예상됩니다. 그리드 사각형에 여러 개의 빈 구멍이 있다는 것은 주변 구멍의 유리체 얼음이 매우 얇고 손상된 입자를 포함하거나 입자가 전혀 없을 수 있음을 나타낼 수 있습니다. 일반적으로 초기 스크리닝 및 평가를 위해 그리드의 여러 영역에서 다양한 얼음 두께를 가진 그리드 사각형을 선택하여 고해상도 데이터 수집에 가장 적합한 조건을 가진 영역을 이해하고 이상적인 입자 밀도 및 방향 분포를 나타내는 것이 좋습니다. 이 연구에 사용된 apoF 및 20S 프로테아좀 샘플의 경우, 관찰 가능한 얼음이 가장 얇은 영역에는 이러한 샘플의 고해상도 이미징을 위한 최상의 조건이 포함되어 있습니다.
데이터 수집 소프트웨어를 사용하여 선택된 모든 격자 사각형에서 자동으로 구멍을 선택할 때는 각 격자 사각형의 대표 구멍에 대해 템플릿 실행 작업을 수행하여 데이터 수집을 위해 지나치게 두껍거나 지나치게 얇거나 예기치 않게 비유리체 사각형이 선택되지 않았는지 확인하는 것이 좋습니다. 데이터 수집 중에 EQM을 사용하여 이미지 드리프트 및 CTF 피팅과 같은 수집된 이미지의 주요 품질 지표를 모니터링할 수 있습니다. 그런 다음 품질이 좋지 않은 이미지를 생성하는 영역을 건너 뛰면 데이터 수집을 최적화 할 수 있습니다. 그러나 고해상도 CTF 핏을 가진 이미지는 여전히 몇 가지 바람직한 방향의 입자 또는 너무 얇은 얼음 층에서 변성 된 입자가있는 이미지를 포함 할 수 있습니다. 수집된 이미지로부터의 실시간 입자 채집 및 2D 분류는 이미지화된 입자의 구조 데이터의 품질에 대한 추가 정보를 제공할 것이고, 얼음에서 손상되지 않은 입자의 선호되는 배향 또는 (부분적으로) 변성된 입자의 일관성 없는 구조를 모두 드러낼 것이다. 따라서 클래스 평균의 계산은 다른 소프트웨어 패키지(23,28)에 이미 구현되고 도시된 바와 같이, 데이터 수집을 위한 적절한 영역을 더욱 구체화하는 데 도움이 될 수 있다.
배율, 전자 선량 비율 및 디포커스 범위와 같은 데이터 수집을 위한 이미징 설정의 선택은 표적 분해능, 단백질의 크기, 샘플 농도, 원하는 현미경 처리량 등과 같은 몇 가지 기준에 따라 달라집니다. 이 실험에 사용 된 직접 전자 검출기 카메라의 경우 병렬 조명을 유지하기 위해 적절한 SPOT 크기와 강도를 선택하여 전자 선량 속도를 4-5 e / pix / s 범위에서 선택했습니다. 표 1에 도시된 바와 같이, 홀/유센트릭 높이 프리셋에서 상이한 SPOT 사이즈를 사용하여 데이터 수집 동안 홀을 센터링하기 위한 이미지에서 충분한 신호-잡음비를 보장할 수 있다. 배율은 픽셀 크기가 cryo-EM 재구성을위한 목표 해상도보다 적어도 2-3 배 작도록 선택해야합니다. 그러나, 더 높은 배율(즉, 더 작은 픽셀 크기)이 사용되고, 더 작은 시야각이 이미지에서 캡처되고, 이미지당 더 적은 입자들이 존재하며, 이는 궁극적으로 3D 맵을 고해상도로 재구성하기에 충분한 입자를 갖는 이미지를 수집하기 위해 더 긴 데이터 수집 시간을 유도한다. apoF 샘플의 경우, 이미지에서 고밀도의 입자에 대한 충분한 샘플 농도를 가지며 재구성의 하위 2 Å 해상도를 목표로 삼았 기 때문에 0.43 Å의 픽셀 크기를 사용했습니다. 20S 프로테아좀 샘플의 경우, 0.68 Å의 픽셀 크기를 사용하여 획득한 이미지에서 더 큰 시야각을 커버했습니다. 일반적으로 200kV TEM 현미경의 경우 cryo-EM 이미지는 0.8 ~ 2.0μm의 디포커스 범위에서 수집됩니다. 그러나 에너지 필터를 사용하여 향상된 명암비 및 신호 대 잡음비를 통해 데이터 수집은 더 작은 수차와 그에 따라 CTF 엔벨로프 기능의 감쇠를 줄임으로써 획득 된 이미지에서 고해상도 정보를보다 잘 보존하기 위해 초점을 맞추기 위해 훨씬 더 가깝게 수행 될 수 있습니다. 또한 조리개가 추가 이미지 수차를 발생시킬 수 있지만 이미지 대비는 이미 에너지 필터를 사용하여 충분히 향상될 수 있으므로 대물 조리개를 사용하지 않습니다. apoF 및 20S 프로테아좀 샘플의 경우 0.5μm, 0.7μm 및 0.9μm의 디포커스 설정을 사용했습니다. 더 작은 단백질 (<200 kDa)의 경우 -0.5 μm, -0.7 μm 및 -0.9 μm의 디포커스 설정을 사용하여 입자의 대비를 개선하고 3D 재구성의 3D 정제 단계에서 입자 채취 및 초기 거친 정렬을 용이하게하여 ~ 2.5 Å 해상도 3D 맵 (게시되지 않은 결과)을 이끌어 냈습니다.
우리는 이미 에너지 필터로 이미징하면 하이엔드 300kV TEM 현미경(11)에서 수집된 cryo-EM 이미지에서 신호 대 잡음비(SNR)가 향상된다는 것을 보여주었습니다. 사실, 전자가 샘플을 통과 할 때, 두 가지 주요 유형의 상호 작용이 발생합니다 : i) 탄력적으로 산란 된 전자는 에너지를 유지하고 위상 대비 메커니즘을 통해 비 산란 입사 빔과의 간섭에 의해 이미지 형성에 기여합니다 ii) 비탄력적으로 산란 된 전자는 샘플에서 일부 에너지를 잃고 주로 이미지의 노이즈에 기여합니다. 따라서, SNR은 좁은 에너지 슬릿을 사용하여 입사 빔 및 탄성적으로 산란된 전자보다 낮은 에너지를 갖는 비탄성적으로 산란된 전자를 필터링함으로써 상당히 개선될 수 있다. 그러나 Selectris 또는 Selectris-X와 같이 충분히 안정적인 에너지 필터를 사용하여 고해상도 cryoEM 데이터 세트의 장기간(12시간 이상)에 걸쳐 매우 좁은(10eV 이하) 슬릿을 사용할 수 있어야 합니다.
300kV TEM 현미경과 동일한 조건에서 200kV TEM 현미경으로 획득한 Cryo-EM 이미지는 CTF 엔벨로프 기능의 빠른 감쇠로 인해 고해상도(특히 <4Å)에서 더 작은 SNR을 나타냅니다. 결과적으로, 200kV TEM을 사용할 때 특정 분해능을 달성하기 위해서는 더 많은 수의 입자(따라서 더 많은 수의 수집된 이미지)가 요구된다. 추가적으로, 피사계 심도(2-3 Å 해상도 범위에서 10-25nm)도 200kV 이미지(35)에서 약 20% 더 작으며, 이는 얼음층 내의 더 적은 입자(전형적으로 20-50nm 두께)가 완전히 초점이 맞춰지고 3D 재구성 절차의 후반 단계에서 각 입자에 대해 디포커스 값이 독립적으로 정제되지 않는 한 계산된3D 재구성의 모든 고해상도 특징에 건설적으로 기여한다는 것을 의미한다. 더 큰 입자(예를 들어 이코사헤드랄 비리온 또는 다른 거대분자 어셈블리)의 경우, 입자 크기는 고해상도에서 피사계 심도를 초과할 수 있고, 표준 3D 재구성 알고리즘(36)에서 Ewald 구체의 평면 근사화로 인한 위상 에러를 도입할 수 있다. 이러한 오류는 일반적인 cryo-EM 이미지 처리 패키지(37,28,39)에서 이미 구현된 고급 알고리즘에 의해 개선될 수 있다. Ewald 구는 300kV 데이터보다 200kV 데이터에서 더 큰 곡률을 가지므로 Ewald 구 보정은 200kV TEM을 사용할 때 상대적으로 낮은 분해능 및/또는 상대적으로 작은 거대분자 어셈블리에서 필요합니다. 한편, 200kV 이미지는 200-300keV 전자 평균 자유 경로(220-280nm)보다 상당히 얇은 얇은 얼음(20-50nm)에서 입자의 콘트라스트가 더 높음을 나타냅니다. 콘트라스트가 높을수록 개별 입자의 올바른 전역 정렬을 개선하는 데 도움이되며, 특히 구조가 아직 알려지지 않은 작은 단백질을 약하게 산란시키는 경우 3D 참조 모델이 아직 잘 확립되지 않았습니다.
여기에서는 20S 프로테아좀의 예에서 200kV TEM 현미경을 사용할 때 에너지 필터로 이미지 대비와 품질을 유사하게 향상시킬 수 있음을 시연했습니다. 동일한 수의 입자를 사용하여 20eV 슬릿을 사용하여 수집된 데이터는 완전히 개방된 에너지 슬릿으로 수집된 데이터와 비교하여 2.34 Å 분해능으로만 재구성되었습니다. 최상의 재구성은 2.14 Å 분해능으로 재구성된 10eV 슬릿을 사용하여 수집된 데이터로부터 달성되었습니다. 이러한 결과는 비탄성적으로 산란된 전자의 필터링이 수집된 이미지에서 SNR을 증가시키고 표 4에 요약된 바와 같이 주어진 입자 수로부터 cryo-EM 재구성에서 더 높은 분해능을 촉진한다는 이론적 예측과 일치한다. 이러한 결과는 에너지 필터링된 데이터 세트에서 더 높은 이미지 품질을 나타내는 이러한 데이터 세트에서 계산된 B-요인에 의해 추가로 확인되었습니다.
따라서 300kV TEM 현미경은 cryo-EM 재구성에서 가장 높은 처리량과 가능한 가장 높은 분해능을 제공하지만 200kV TEM 현미경은 고해상도 cryo-EM 재구성을 위한 고품질 데이터 세트를 제공한다는 결론을 내릴 수 있습니다. 우리는 여기서 획득 한 이미지의 품질, 따라서 전반적인 구조 시간이 에너지 필터와 직접 전자 검출기가 장착 된 200kV TEM을 사용하여 더욱 향상 될 수 있음을 보여주었습니다. 제시된 프로토콜은이 설정을 사용하여 고해상도 cryo-EM 데이터를 일상적으로 얻는 방법에 대한 모든 필요한 단계를 설명하고 구조 생물학 및 구조 기반 약물 설계의 주요 구조 - 기능 관계를 이해하는 데 필수적인 거대 분자 3D 구조의 미세한 구조적 세부 사항을 공개합니다.

단백질 구조의 결정은 세포 대사, 신호 전달 또는 숙주-병원체 상호작용과 같은 주요 세포 과정에 관여하는 단백질 복합체의 분자 구조, 기능 및 조절을 이해하는 데 매우 중요하다. Cryo-electron microscopy (cryo-EM)는 X선 회절 및 NMR 분광법과 같은 전통적인 구조 기술에 비해 너무 어려웠던 많은 단백질과 그 복합체의 3D 구조를 해결할 수있는 강력한 기술로 부상했습니다. 특히, cryo-EM은 전통적인 구조 기술을 위해 충분한 양으로 쉽게 결정화되거나 제조 될 수없는 막 단백질의 선택 방법으로 입증되었으며 중요한 세포 수용체 및 이온 채널 1,2,3,4,5의 구조와 기능에 대한 새로운 통찰력을 제공했습니다. . 가장 최근에, cryo-EM은 분자 수준에서 SARS-CoV-2 감염의 메커니즘을 결정함으로써 Covid-19 전염병과 싸우는 데 중요한 역할을했으며, 이는 Covid-19 질병의 기원을 밝히고 효율적인 백신 및 치료제 6,7,8,9,10의 신속한 개발을위한 토대를 제공했습니다.
일반적으로 하이 엔드 300kV 투과 전자 현미경 (TEM)은 cryo-EM 단일 입자 분석 (SPA)에 의한 생체 분자의 고분해능 구조 결정에 사용되어 형태와 상호 작용을 나타냅니다. 최근에, SPA 기술은 공통 벤치마크 cryo-EM 샘플 아포페리틴이 냉장 방출 건(E-CFEG), 직접 전자 검출기 및 에너지 필터가 장착된 300-kV TEM을 사용하여 원자 분해능(1.2 Å)11,12로 재구성되었을 때 새로운 개척지에 도달했습니다. 이 결의안에서, 구조에서 개별 원자의 위치, 개별 아미노산 측쇄의 형태, 수소 결합 및 기타 상호 작용을 명확하게 해결할 수 있었으며, 이는 새로운 표적의 구조 기반 약물 발견 및 기존 약물 후보의 최적화에 대한 새로운 가능성을 열어줍니다.
중급 200kV TEM 현미경은 특히 대형 cryo-EM 시설에서 하이엔드 TEM 현미경을 사용하여 최종 고해상도 데이터를 수집하기 전에 샘플 스크리닝 및 샘플 최적화에 자주 사용됩니다. 일반적으로 이미지화된 샘플은 최종 데이터 수집을 위해 하이엔드 300kV TEM으로 이동하기에 충분한 3-4Å 분해능 범위에서 분해될 수 있습니다. 결과적으로, 200kV TEM을 사용한 데이터 수집은 가능한 가장 높은 분해능 결과를 위해 더 이상 최적화되지 않는 경우가 많습니다. 더욱이, 모든 아미노산 측쇄가 이미 해결됨에 따라 많은 흥미로운 생물학적 질문들이 이미 이러한 해상도에서 대답되고 발표될 수 있고, 리간드 결합 부위의 점유도 또한 신뢰성 있게 결정될 수 있다13. 200kV TEM은 수많은 샘플 14,15,16,17,18에 대해 3Å 이상의 분해능에 도달할 수 있음이 이미 입증되었습니다. 200kV에서 촬영된 이미지는 본질적으로 더 높은 이미지 입자의 콘트라스트를 나타내므로, 300kV TEM 이미지와 비교하여 고해상도에서 더 감쇠된 신호에도 불구하고 입자의 초기 정렬을 더욱 정확하게 할 수 있습니다. 재구성된 cryo-EM 맵의 달성된 해상도는 또한 200kV 및 300kV 재구성 모두에 영향을 미치는 이미지화된 샘플의 구조적 유연성과 형태적 이질성에 의해 제한된다는 점에 유의해야 합니다. 사실, 300kV 시스템을 사용하여 얻은 훨씬 더 많은 cryo-EM 재구성이 더 높은 해상도19에서보다 3-4 Å 분해능 범위에서 해결되었습니다. 200kV TEM 현미경은 덜 복잡하고 작은 방에 적합하기 때문에 이 현미경은 cryo-EM에 의한 생물학적 거대분자의 구조 결정을 위한 우수하고 저렴한 옵션을 제공하면서 현미경 오토로더 시스템에 저장된 여러 샘플에서 긴 데이터 수집을 자동화할 수 있습니다.
고분해능 구조 결정을 위한 cryo-EM 데이터 세트를 수집하려면 현미경 광학의 정확한 정렬이 필요합니다. 컬럼 정렬은 전자원에서 응축기 렌즈 시스템, 대물 렌즈 및 전자 검출기를 사용하는 에너지 필터까지 체계적으로 진행됩니다. 정렬의 전체 시퀀스는 일반적으로 필요하지 않습니다. 필요한 경우, 사용자는 현미경 사용자 인터페이스(Direct Alignments 제어판)의 정렬 절차 전반에 걸쳐 컨텍스트 인식 도움말 창에서 각 단계에 대한 적절한 설명과 함께 반자동 절차를 통해 안내됩니다. 현미경이 완전히 정렬되면 전자 광학은 안정적으로 유지되며 적어도 몇 달 동안 정렬을 변경할 필요가 없습니다. 샘플 평면의 병렬 조명, 객관적인 난시 및 혼수 상태 없는 정렬과 같은 가장 민감한 정렬만 각 데이터 집합의 수집을 시작하기 직전에 개선해야 합니다. 수집된 데이터의 품질은 EPU 품질 모니터, cryoSPARC Live 20, Relion 21, Scipion22, WARP23 또는 Appion 24와 같은 다양한 소프트웨어 패키지를 사용하여 데이터 수집 중에 모니터링할 수 있습니다.
현미경의 정확한 정렬 외에도 최소한의 형태 및 구성 이질성을 가진 잘 정제 된 샘플의 높은 품질은 고해상도 데이터 세트를 수집하고 고해상도 구조를 해결하기위한 전제 조건이기도합니다. 일반적인 프로토콜, 빈번한 도전 및 가능한 치료법에 대한 자세한 내용은이 주제25,26,27에 전념하는 다른 리뷰에서 찾을 수 있습니다. 본질적으로, 고해상도 정보를 보존하기에 충분히 얇은 얼음을 가진 주어진 cryo-EM 그리드에서 영역을 찾는 것이 중요하며, 개별 입자는 겹치지 않고 임의의 방향으로 조밀하게 분포되어 있습니다. 그러나 일반적인 cryo-EM 그리드는 균일하지 않은 얼음 두께를 가지므로 이미징을위한 최적의 영역을 찾아 선택하는 것이 중요합니다. 그리드의 얼음 두께를 추정하기 위한 다양한 수단은 EPU 2, Leginon28 또는 SerialEM29와 같은 cryo-EM 데이터 세트의 자동 수집을 위한 소프트웨어 패키지에서 사용할 수 있습니다.
빠르고 민감한 직접 전자 검출기의 출현은 빔으로 인한 움직임의 보상을 가능하게 하는 영화로서 많은 분파에서 이미지의 수집을 가능하게 하였고, 이미지 처리 및 최종 3D 재구성(30)에 사용되는 데이터의 질과 양을 상당히 증가시켰다. 동시에 자동화 및 고처리량 데이터 수집은 데이터 저장 및 액세스에 대한 문제를 나타내는 수천 개의 이미지 / 영화가있는 거대한 데이터 세트를 제공합니다. 수십에서 수백 명의 사용자에게 서비스를 제공하는 대형 cryo-EM 시설을 갖춘 채택 된 모델은 특히 확립 된 cryo-EM 파이프 라인31,32에서 적절한 추적 및 데이터 공유를 통해 체계적인 데이터 관리를 요구합니다.
이 연구는 200kV Glacios TEM 현미경을 사용하여 고해상도 cryo-EM 데이터 세트의 일상적인 수집을위한 프로토콜을 설명합니다. 현미경 광학의 필요한 정렬은 cryo-EM 샘플의 평가 절차 및 고해상도 데이터 수집에 적합한 영역의 선택과 함께 설명됩니다. 샘플 정보를 사용하여 수집 된 데이터 및 관련 메타 데이터의 구성은 샘플 정보 및 수집 된 데이터의 검토를 용이하게하는 데이터 관리 플랫폼 인 Athena에서 시연됩니다. 마우스 아포페리틴 샘플을 사용하여, 1.6 Å 분해능 13에서3D 재구성을 달성할 수 있었다. 설명된 프로토콜을 사용하여, 우리는 또한 2.1 Å 해상도에서 Thermoplasma acidophilum으로부터 20S 프로테아좀의 3D 밀도 맵을 재구성하였다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>AutoGrid rings</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>1036173</td>
			<td>Package of 100x AutoGrid rings for the standard EM grids.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C-Clip</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>1036171</td>
			<td>Package of 100 clips that secure 
			the standard EM grids inside the AutoGrid rings.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Data Management Platform</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>1160939</td>
			<td>Part of the Glacios base configuraiton; includes Athena Software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EPU Quality Monitor</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>1179770</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EPU Software</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>1025080</td>
			<td>Part of the Glacios base configuration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethane 3.5</td>
			<td>Westfalen</td>
			<td>A06010110</td>
			<td>Ethane gas used for making liquid ethane (puritiy at least N35, i.e. 99.95% vol)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 4 200kV</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>1166936</td>
			<td>Direct electron detector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glacios</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>1149551</td>
			<td>200 kV TEM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GloQube Plus Glow Discharge System for TEM Grids and surface modification</td>
			<td>Quorum</td>
			<td>N/A</td>
			<td>also available via Thermo Fisher Scientific (PN 1160602)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuantiFoil grids</td>
			<td>Quantifoil</td>
			<td>N/A</td>
			<td>R-2/1, 300 mesh; carbon foil grid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Relion</td>
			<td>MRC Laboratory of Molecular Biology</td>
			<td>N/A</td>
			<td>open source software: 
			https://relion.readthedocs.io/en/release-3.1/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Selectris with Falcon 
			4 for 200 kV</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>1191753</td>
			<td>Energy filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Selectris X with Falcon 
			4 for 200 kV</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>1191755</td>
			<td>Energy filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltrAuFoil grids</td>
			<td>Quantifoil</td>
			<td>N/A</td>
			<td>R-1.2/1.2, 300 mesh; gold foil grids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vitrobot Mk. IV</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>1086439</td>
			<td>Automated vitrification system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman 595 filter paper</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AA00420S</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

routine collection of high-resolution cryo-em datasets using 200 kv transmission electron microscope

Cryo-electron microscopy (cryo-EM)는 지난 십 년 동안 단백질 구조 결정을위한 일상적인 방법으로 확립되어 출판 된 구조 데이터의 점유율이 계속 증가하고 있습니다. TEM 기술 및 자동화의 최근 발전으로 데이터 수집 속도와 획득 이미지의 품질이 향상되는 동시에 하위 3 Å 해상도에서 cryo-EM 맵을 얻는 데 필요한 전문 지식 수준이 감소했습니다. 이러한 고해상도 구조의 대부분은 최첨단 300kV cryo-TEM 시스템을 사용하여 얻어졌지만 특히 에너지 필터가 장착 된 경우 200kV cryo-TEM 시스템으로 고해상도 구조를 얻을 수 있습니다. 또한 실시간 이미지 품질 평가를 통해 현미경 정렬 및 데이터 수집을 자동화하면 시스템의 복잡성이 줄어들고 최적의 현미경 설정이 보장되므로 고품질 이미지의 수율과 데이터 수집의 전반적인 처리량이 증가합니다. 이 프로토콜은 200kV 냉동 투과 전자 현미경에서 최근의 기술 진보 및 자동화 기능의 구현을 시연하고 de novo 원자 모델 구축에 충분한 3D 맵의 재구성을 위한 데이터를 수집하는 방법을 보여줍니다. 우리는 모범 사례, 중요한 변수 및 이러한 고해상도 cryo-EM 데이터 세트의 일상적인 수집을 가능하게하기 위해 고려해야 할 일반적인 문제에 중점을 둡니다. 특히 i) 현미경 정렬 자동화, ii) 데이터 수집에 적합한 영역 선택, iii) 고품질의 고처리량 데이터 수집을 위한 최적의 광학 파라미터, iv) 제로 손실 이미징을 위한 에너지 필터 튜닝, v) 데이터 관리 및 품질 평가와 같은 필수 주제가 자세히 검토됩니다. 에너지 필터를 이용한 모범 사례의 적용 및 달성 가능한 분해능의 개선은 에너지 필터 및 직접 전자 검출기가 장착된 200kV TEM을 사용하여 2.1-Å 분해능으로 재구성된 1.6 Å 및 2.1-Å 분해능으로 재구성된 Thermoplasma acidophilum 20S 프로테아좀의 예에서 입증될 것이다.

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Routine Collection of High-Resolution cryo-EM Datasets Using 200 KV Transmission Electron Microscope

거대분자의 고분해능 cryo-EM 맵은 또한 200kV TEM 현미경을 사용하여 달성할 수 있다. 이 프로토콜은 200kV TEM을 사용하여 고해상도 데이터 세트를 성공적으로 수집하는 데 필수적인 정확한 광학 정렬, 데이터 수집 체계 및 이미징 영역 선택을 설정하는 모범 사례를 보여줍니다.

200KV 투과 전자 현미경을 사용한 고해상도 cryo-EM 데이터 세트의 일상적인 수집

Cryo-electron microscopy (cryo-EM) has been established as a routine method for protein structure determination during the past decade, taking an ...

Cryo-EM은 단백질과 그 복합체의 구조 결정을위한 표준 기술이되었습니다. 이 프로토콜은 중급 200kV TEM 현미경에서 고해상도 Cryo-EM 데이터 세트를 얻는 모범 사례를 설명합니다. Cryo-EM은 여러 형태 상태 및 기능 상태에 대한 솔루션에서 거의 기본 조건에서 단백질 구조를 동시에 결정할 수 있으며, 이는 다른 구조 기술에서는 어렵습니다.획득 된 구조 정보는 단백질 기능의 분자 메커니즘의 해명뿐만 아니라 구조 기반 약물 설계에 사용될 수 있습니다. 예를 들어, 아밀로이드 피브릴의 구조에 관한 최근의 간행물은 중요한 리간드의 다중 결합 부위를 밝혀냈다. 그러나이 프로토콜에서는 아포페리틴과 프로테아좀의 표준 샘플을 사용하여 고해상도 Cryo-EM 데이터를 얻는 데 중요한 단계를 보여줍니다.Cryo-TEM의 작동은 특히 고급 자동화 기능의 도입으로 인해 지난 몇 년 동안 더욱 쉬워졌습니다. 그러나 첫 번째 세션에서는 경험이 풍부한 사용자와 함께 교육을받는 것이 좋습니다. 거기에서 기술의 진행은 상대적으로 빠릅니다.이 절차를 시연하는 것은 Thermo Fisher Scientific의 수석 응용 과학자 인 Adrian Koh입니다. 액체 질소 조건에서 자동 로더 카세트에 자동 그리드를 삽입하십시오. 자동 격자가있는 카세트를 액체 질소 냉각 이송 캡슐에 넣으십시오.캡슐을 현미경에 더 넣고 현미경 UI의 Dock 버튼을 클릭하여 캡슐에서 현미경의 자동 로더로로드로로드하십시오. 인벤토리 버튼을 클릭하여 로드된 카세트에 자동 그리드가 있는지 확인합니다. 그런 다음 로드 및 언로드 버튼을 클릭하여 TEM 이미징을 위해 자동 격자를 컬럼에 삽입합니다.Atlas 탭을 선택하고 새 세션 버튼을 클릭하여 새 세션을 엽니다. 세션 이름 및 데이터 저장 위치와 같은 세부 정보를 입력하고 적용 버튼을 클릭하십시오. 해당 격자선 번호 옆에 있는 확인란을 선택하여 관심 격자를 선택합니다.시작 단추를 클릭하여 선택한 모든 격자의 완전히 자동화된 아틀라스 컬렉션을 시작합니다. 컬렉션이 완료되면 그리드 레이블을 클릭하여 획득한 아틀라스를 검토합니다. EPU 탭을 선택하고 새 세션으로 이동하여 왼쪽 패널에 새 세션을 만듭니다.새 세션 옵션을 선택하여 현재 설정된 광학 사전 설정을 사용합니다. 세션 이름을 입력합니다. 세션의 수동 유형을 선택하여 프로토콜의 뒷부분에 있는 데이터 수집을 위해 선택된 개별 구멍 및 격자 사각형의 선택을 제어할 수 있습니다.더 빠른 수집 모드를 선택하여 데이터 수집에 수차 없는 이미지 시프팅을 사용합니다. 그런 다음 메타데이터를 저장할 위치를 입력합니다. 적용 버튼을 클릭하여 새 세션을 만듭니다.왼쪽 패널에서 사각형 선택 작업을 선택하여 격자의 수집된 아틀라스를 표시합니다. 손상없이 손상되지 않은 지지 호일, 얇은 유리체 얼음 및 호일 구멍, 그리드 사각형의 무시할 수있는 결정질 얼음 오염 및 그리드 사각형과 개별 호일 구멍 내에서 최소한의 밝기 구배로 그리드 사각형을 식별하십시오. 전체 아틀라스 또는 고품질 타일 이미지에서 데이터 수집을 위한 격자 사각형을 선택합니다.관심있는 격자 사각형을 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고 전체 선택 작업을 선택하십시오. Auto Eucentric 버튼을 클릭하여 첫 번째로 선택한 격자선 사각형으로 자동으로 이동합니다. eucentric 높이를 조정하고 호일 구멍을 찾기 위한 그리드 사각형 이미지를 획득합니다.구멍 찾기 버튼을 클릭하여 이미지에서 호일 구멍을 찾으십시오. 구멍 제거 단추를 클릭하여 격자 막대 단추를 닫아 격자선 막대 근처의 구멍을 선택 취소합니다. 얼음 필터의 밝기 히스토그램의 한계를 조정하여 너무 두꺼운 얼음과 모든 빈 구멍이있는 모든 구멍을 제거하십시오.격자 사각형 이미지의 구멍을 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고 스테이지 이동을 선택하여 스테이지 이동 위치를 선택합니다. 왼쪽 패널에서 템플릿 정의 작업을 선택합니다. 획득 버튼을 클릭하여 전체 이미지를 획득하십시오.이미지 시프트 후 지연 값을 0.5초로 설정하고 스테이지 시프트 후 지연 값을 5초로 설정합니다. 구멍 찾기 및 중앙(Center Hole) 단추를 클릭하여 이미지의 구멍 중앙에 배치합니다. 획득 영역 추가 버튼을 선택하고 이미지를 클릭하여 고배율 이미지 획득을 수행할 중앙 구멍의 위치를 선택합니다.자동 초점 영역 추가 단추를 선택하고 이미지를 클릭하여 이미지 자동 초점이 수행될 중앙 구멍 옆의 지지 호일의 위치를 선택합니다. 녹색 획득 영역을 클릭하여 소프트웨어 창의 위쪽 섹션에 있는 디포커스 목록에서 디포커스 값의 시퀀스를 설정합니다. 자동 초점 특정 설정을 설정한 후 각 AFIS 클러스터의 시작 부분에서 자동 초점을 맞추려면 센터링 후 옵션을 선택합니다.더 빠른 자동 초점 조정과 스테이지 드리프트 감소를 위한 대물 렌즈 옵션을 선택하십시오. 구멍 선택 작업에서 모든 사각형 준비 단추를 클릭하여 이 첫 번째 격자선 사각형에서 사용된 설정에 따라 데이터 수집 및 선택한 다른 모든 격자선 사각형을 자동으로 설정합니다. 템플릿 정의 작업을 선택하고, 새 이미지를 획득하고, 마우스 오른쪽 버튼을 클릭하여 스테이지를 탄소 호일의 깨끗한 영역으로 이동하고, 메뉴 옵션을 선택하여 스테이지를 여기에서 이동합니다.자동 기능 탭을 선택합니다. 원하는 초점 해제 및 반복을 설정 한 후 자동 초점 사전 설정으로 전환하고 시작 버튼을 클릭하여 자동 초점 기능을 실행하십시오. 자동 낙인 찍기 작업을 선택하고 Thon Ring 사전 설정으로 전환한 다음 시작 단추를 누릅니다.Autocoma 작업을 선택하고 시작 단추를 누릅니다. 스테이지를 깨진 격자 사각형이 있는 영역으로 이동합니다. 하나의 자동 초점 이미지를 촬영하여 영역의 투명도를 확인합니다.Sherpa UI를 열고 에너지 필터 응용 프로그램을 선택합니다. 중심 버튼과 제로 손실 옵션을 클릭하여 제로 손실 에너지 필터 슬릿을 중앙에 맞춥니다. 등색성 옵션에서 조정 버튼을 클릭하십시오.기하학적 왜곡 및 색채 왜곡에서 배율 조정 및 왜곡 조정 옵션을 클릭합니다. EPU 탭으로 이동하여 자동 수집 작업을 선택한 다음 실행 시작 단추를 클릭하여 완전 자동화된 데이터 수집을 시작합니다. 그림은 그리드 표면에 얼음 두께의 기울기를 표시하는 Cryo-EM 그리드를 보여줍니다.추가 조사에서 제외 된 그리드는 두꺼운 얼음이있는 불량 그리드와 나쁜 얼음과 오염이있는 구부러진 그리드이며, 허용 가능한 그리드는 좋은 얼음 구배와 좋은 얇은 얼음과 작은 얼음 구배를 가진 전형적인 그리드입니다. 그림은 재구성된 아포페리틴 Cryo-EM 맵의 최종 3D 렌더링을 보여줍니다. 높은 안정성과 대칭성으로 고해상도 Cryo-EM 이미징 및 이미지 처리를 위한 최적의 벤치마크 샘플입니다.베이지안 연마, CTF 미세화 및 Ewald 구 보정은 1.63 옹스트롬 해상도 맵을 생성했습니다. 도면은 개별 아미노산 측쇄 수준에서 재구성된 아포페리틴 Cryo-EM 맵의 상세한 뷰를 보여준다. 아미노산 측쇄의 밀도는 잘 해결되며 원자 모델은지도 내에서 명확하게 구축 될 수 있습니다.여기의 이미지는 슬릿이 완전히 열린 유사한 그리드 사각형과 10개의 전자 볼트 슬릿이 이미지 대비를 크게 향상시킨다는 것을 나타내는 10개의 전자 볼트 슬릿을 갖는 동일한 Cryo-EM 그리드에서 수집된 서로 다른 디포커스 값에서 두 개의 서로 다른 데이터 세트를 보여줍니다. 본 명세서의 도면은 표준 Cryo-EM 샘플로서 사용되는 세그먼트화된 서브유닛을 갖는 20S 프로테아좀 Cryo-EM 맵의 개요를 보여준다. 그리고 장착 된 원자 모델을 사용한 확대 된 뷰는 D7 대칭을 가진 프로테아 좀 복합체의 안정적인 촉매 코어를 나타냅니다.프로토콜에는 두 가지 중요한 단계가 포함되어 있습니다. 하나는 균질 한 입자를 포함하는 얇은 유리체 얼음이있는 지역을 찾는 것입니다. 둘째, 데이터 수집을 위한 병렬 조명을 설정합니다.단백질의 고해상도 재구성으로 두 세 개의 옹스트롬을 달성하면 질병의 분자 메커니즘을 더 잘 이해하고 약물 리드를 개선 할 수 있습니다. 이전에는 생물학적 현상의 구조적 기초를 연구하려는 경우 결정화가 필요했습니다. 오늘날 Cryo-EM에서는 더 이상 필요하지 않습니다.그래서 Cryo-EM을 통해 과학자들은 구조적 수준에서 더 넓은 범위의 생물학적 현상을 연구 할 수 있습니다.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Method to Visualize and Analyze Membrane Interacting Proteins by Transmission Electron Microscopy

방법은 시각화 및 투과 전자 현미경에 의해 막 상호 작용하는 단백질을 분석하는

Monotopic proteins exert their function when attached to a membrane surface, and such interactions depend on the specific lipid composition and on the ...

연구

생화학

High-resolution Single Particle Analysis from Electron Cryo-microscopy Images Using SPHIRE

SPHIRE를 사용한 전자 저온 현미경 이미지의 고해상도 단일 입자 분석

SPHIRE (SPARX for High-Resolution Electron Microscopy) is a novel open-source, user-friendly software suite for the semi-automated processing of single ...

Cryo-EM and Single-Particle Analysis with Scipion

Scipion을 가진 극저온 EM 및 단일 입자 분석

Cryo-electron microscopy has become one of the most important tools in biological research to reveal the structural information of macromolecules at ...

Preparation of Sample Support Films in Transmission Electron Microscopy using a Support Floatation Block

지원 부동 블록을 사용하여 전송 전자 현미경 검사법에서 샘플 지원 필름의 준비

Structure determination by cryo-electron microscopy (cryo-EM) has rapidly grown in the last decade; however, sample preparation remains a significant ...

Preparing Lamellae from Vitreous Biological Samples Using a Dual-Beam Scanning Electron Microscope for Cryo-Electron Tomography

극저온 전자 단층 촬영을 위한 이중 빔 주사 전자 현미경을 사용하여 유리체 생물학적 샘플에서 라멜라 준비

Presented here is a protocol for preparing cryo-lamellae from plunge-frozen grids of Plasmodium falciparum-infected&#160;human erythrocytes, which could ...

Preparation of High-Temperature Sample Grids for Cryo-EM

Cryo-EM용 고온 시료 그리드 준비

The sample grids for cryo-electron microscopy (cryo-EM) experiments are usually prepared at a temperature optimal for the storage of biological samples, ...

Micropatterning Transmission Electron Microscopy Grids to Direct Cell Positioning within Whole-Cell Cryo-Electron Tomography Workflows

전세포 극저온-전자 단층 촬영 워크플로우 내의 직접 세포 위치지정에 마이크로패턴 전송 전자 현미경 검사기 그리드

Whole-cell cryo-electron tomography (cryo-ET) is a powerful technology that is used to produce nanometer-level resolution structures of macromolecules ...

Quantification of Subcellular Glycogen Distribution in Skeletal Muscle Fibers using Transmission Electron Microscopy

투과 전자 현미경을 이용한 골격근섬유의 세포하 글리코겐 분포의 정량화

With the use of transmission electron microscopy, high-resolution images of fixed samples containing individual muscle fibers can be obtained. This ...

A Robust Single-Particle Cryo-Electron Microscopy (cryo-EM) Processing Workflow with cryoSPARC, RELION, and Scipion

A Robust Single-Particle Cryo-Electron Microscopy cryo-EM Processing Workflow with cryoSPARC, RELION, and Scipion

cryoSPARC, RELION 및 Scipion을 사용한 견고한 단일 입자 Cryo-Electron Microscopy (cryo-EM) 처리 워크플로우

Recent advances in both instrumentation and image processing software have made single-particle cryo-electron microscopy (cryo-EM) the preferred method ...

Advancing High-Resolution Imaging of Virus Assemblies in Liquid and Ice

액체와 얼음에서 바이러스 어셈블리의 고해상도 이미징 향상

Interest in liquid-electron microscopy (liquid-EM) has skyrocketed in recent years as scientists can now observe real-time processes at the nanoscale. It ...