Name: routine collection of high-resolution cryo-em datasets using 200 kv transmission electron microscope
Uploaded: 2022-03-16T14:00:00
Duration: 9 min 49 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Routine Collection of High-Resolution cryo-EM Datasets Using 200 KV Transmission Electron Microscope at JoVE.com

<ol>
	<li>Wang, J., Hua, T., Liu, Z. -. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+features+of+activated+GPCR+signaling+complexes.">Structural features of activated GPCR signaling complexes.</a> Current Opinions in Structural Biology. 63, 82-89 (2020).</li><li>Chen, S., Gouaux, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+mechanism+of+AMPA+receptor+-+auxiliary+protein+complexes.">Structure and mechanism of AMPA receptor - auxiliary protein complexes.</a> Current Opinions in Structural Biology. 54, 104-111 (2019).</li><li>K&#252;hlbrandt, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+mechanisms+of+F-Type+ATP+synthases.">Structure and mechanisms of F-Type ATP synthases.</a> Annual Review of Biochemistry. 88, 515-549 (2019).</li><li>Laverty, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo-EM+structure+of+the+human+&#945;1&#946;3&#947;2+GABA+A+receptor+in+a+lipid+bilayer.">Cryo-EM structure of the human &#945;1&#946;3&#947;2 GABA A receptor in a lipid bilayer.</a> Nature. 565 (7740), 516-520 (2019).</li><li>Liu, F., Zhang, Z., Csan&#225;dy, L., Gadsby, D. C., Chen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+structure+of+the+Human+CFTR+ion+channel.">Molecular structure of the Human CFTR ion channel.</a> Cell. 169 (1), 85-95 (2017).</li><li>Wrapp, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo-EM+structure+of+the+2019-nCoV+spike+in+the+prefusion+conformation.">Cryo-EM structure of the 2019-nCoV spike in the prefusion conformation.</a> Science. 367 (6483), 1260-1263 (2020).</li><li>Ke, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structures+and+distributions+of+SARS-CoV-2+spike+proteins+on+intact+virions.">Structures and distributions of SARS-CoV-2 spike proteins on intact virions.</a> Nature. 588, 498-502 (2020).</li><li>Yan, R., Zhang, Y., Li, Y., Xia, L., Guo, Y., Zhou, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+for+the+recognition+of+SARS-CoV-2+by+full-length+human+ACE2.">Structural basis for the recognition of SARS-CoV-2 by full-length human ACE2.</a> Science. 367 (6485), 1444-1448 (2020).</li><li>Walls, A. C., Park, Y. -. J., Tortorici, M. A., Wall, A., McGuire, A. T., Veesler, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure,+function,+and+antigenicity+of+the+SARS-CoV-2+spike+glycoprotein.">Structure, function, and antigenicity of the SARS-CoV-2 spike glycoprotein.</a> Cell. 180, 281-292 (2020).</li><li>Chiba, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multivalent+nanoparticle-based+vaccines+protect+hamsters+against+SARS-CoV-2+after+a+single+immunization.">Multivalent nanoparticle-based vaccines protect hamsters against SARS-CoV-2 after a single immunization.</a> Communications Biology. 4 (1), 597 (2021).</li><li>Nakane, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-particle+cryo-EM+at+atomic+resolution.">Single-particle cryo-EM at atomic resolution.</a> Nature. 587, 152-156 (2020).</li><li>Bai, X. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Seeing+atoms+by+single-particle+Cryo-EM.">Seeing atoms by single-particle Cryo-EM.</a> Trends in Biochemical Sciences. 46 (4), 253-254 (2021).</li><li>Koh, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+cryo-EM+at+200kV+enabled+by+Selectris-X+and+Falcon+4.">High-resolution cryo-EM at 200kV enabled by Selectris-X and Falcon 4.</a> Microscience Microscopy Congress 2021. , (2021).</li><li>Herzik, M. A., Wu, M., Lander, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Achieving+better-than-3-&#197;+resolution+by+single-particle+cryo-EM+at+200+keV.">Achieving better-than-3-&#197; resolution by single-particle cryo-EM at 200 keV.</a> Nature Methods. 14 (11), 1075-1078 (2017).</li><li>Herzik, M. A., Wu, M., Lander, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+structure+determination+of+sub-100+kDa+complexes+using+conventional+cryo-EM.">High-resolution structure determination of sub-100 kDa complexes using conventional cryo-EM.</a> Nature Communications. 10 (1), 1032 (2019).</li><li>Wu, M., Lander, G. C., Herzik, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sub-2+Angstrom+resolution+structure+determination+using+single-particle+cryo-EM+at+200+keV.">Sub-2 Angstrom resolution structure determination using single-particle cryo-EM at 200 keV.</a> Journal of Structural Biology X. 4, 100020-100029 (2020).</li><li>Mori, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=C-Glycoside+metabolism+in+the+gut+and+in+nature:+Identification,+characterization,+structural+analyses+and+distribution+of+C-C+bond-cleaving+enzymes.">C-Glycoside metabolism in the gut and in nature: Identification, characterization, structural analyses and distribution of C-C bond-cleaving enzymes.</a> Nature Communications. 12 (1), 6294 (2021).</li><li>Hamdi, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=2.7+&#197;+cryo-EM+structure+of+vitrified+M.+musculus+H-chain+apoferritin+from+a+compact+200+keV+cryo-microscope.">2.7 &#197; cryo-EM structure of vitrified M. musculus H-chain apoferritin from a compact 200 keV cryo-microscope.</a> PLoS One. 15 (5), 0232540 (2020).</li><li>Abbott, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EMDB+web+resources.">EMDB web resources.</a> Current Protocols in Bioinformatics. 61 (1), 1-12 (2018).</li><li>Punjani, A., Rubinstein, J. L., Fleet, D. J., Brubaker, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CryoSPARC:+algorithms+for+rapid+unsupervised+cryo-EM+structure+determination.">CryoSPARC: algorithms for rapid unsupervised cryo-EM structure determination.</a> Nature Methods. 14 (3), 290-296 (2017).</li><li>Scheres, S. H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RELION:+Implementation+of+a+Bayesian+approach+to+cryo-EM+structure+determination.">RELION: Implementation of a Bayesian approach to cryo-EM structure determination.</a> Journal of Structural Biology. 180 (3), 519-530 (2012).</li><li>G&#243;mez-Blanco, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+Scipion+for+stream+image+processing+at+Cryo-EM+facilities.">Using Scipion for stream image processing at Cryo-EM facilities.</a> Journal of Structural Biology. 204 (3), 457-463 (2018).</li><li>Tegunov, D., Cramer, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+cryo-electron+microscopy+data+preprocessing+with+Warp.">Real-time cryo-electron microscopy data preprocessing with Warp.</a> Nature Methods. 16 (11), 1146-1152 (2019).</li><li>Lander, G. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Appion:+an+integrated,+database-driven+pipeline+to+facilitate+EM+image+processing.">Appion: an integrated, database-driven pipeline to facilitate EM image processing.</a> Journal of Structural Biology. 166 (1), 95-102 (2009).</li><li>Carragher, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+outcomes+when+optimizing+'standard'+sample+preparation+for+single-particle+cryo-EM.">Current outcomes when optimizing 'standard' sample preparation for single-particle cryo-EM.</a> Journal of Microscopy. 276 (1), 39-45 (2019).</li><li>Drulyte, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Approaches+to+altering+particle+distributions+in+cryo-electron+microscopy+sample+preparation.">Approaches to altering particle distributions in cryo-electron microscopy sample preparation.</a> Acta Crystallographica. Section D, Structural Biology. 74 (6), 560-571 (2018).</li><li>Bloch, M., Santiveri, M., Taylor, N. M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+protein+Cryo-EM:+Cryo-grid+optimization+and+data+collection+with+protein+in+detergent.">Membrane protein Cryo-EM: Cryo-grid optimization and data collection with protein in detergent.</a> Methods in Molecular Biology. 2127, 227-244 (2020).</li><li>Cheng, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leginon:+New+features+and+applications.">Leginon: New features and applications.</a> Protein Science. 30 (1), 136-150 (2021).</li><li>Schorb, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Software+tools+for+automated+transmission+electron+microscopy.">Software tools for automated transmission electron microscopy.</a> Nature Methods. 16 (6), 471-477 (2019).</li><li>Li, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+counting+and+beam-induced+motion+correction+enable+near-atomic-resolution+single-particle+cryo-EM.">Electron counting and beam-induced motion correction enable near-atomic-resolution single-particle cryo-EM.</a> Nature Methods. 10 (6), 584-590 (2013).</li><li>Alewijnse, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Best+practices+for+managing+large+CryoEM+facilities.">Best practices for managing large CryoEM facilities.</a> Journal of Structural Biology. 199, 225-236 (2017).</li><li>Baldwin, P. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Big+data+in+cryoEM:+automated+collection,+processing+and+accessibility+of+EM+data.">Big data in cryoEM: automated collection, processing and accessibility of EM data.</a> Current Opinion in Microbiology. 43, 1-8 (2018).</li><li>Guo, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron-event+representation+data+enable+efficient+cryoEM+file+storage+with+full+preservation+of+spatial+and+temporal+resolution.">Electron-event representation data enable efficient cryoEM file storage with full preservation of spatial and temporal resolution.</a> International Union of Crystallography Journal. 7, 860-869 (2020).</li><li>Weis, F., Hagen, W. J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combining+high+throughput+and+high+quality+for+cryo-electron+microscopy+data+collection.">Combining high throughput and high quality for cryo-electron microscopy data collection.</a> Acta Crystallographica. Section D, Structural Biology. 76 (8), 724-728 (2020).</li><li>Zhou, H., Chiu, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+icosahedral+virus+structures+by+electron+cryomicroscopy+at+subnanometer+resolution.">Determination of icosahedral virus structures by electron cryomicroscopy at subnanometer resolution.</a> Advances in Protein Chemistry. 64, 93-124 (2005).</li><li>DeRosier, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correction+of+high-resolution+data+for+curvature+of+the+Ewald+sphere.">Correction of high-resolution data for curvature of the Ewald sphere.</a> Ultramicroscopy. 81 (2), 83-98 (2000).</li><li>Wolf, M., DeRosier, D. J., Grigorieff, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ewald+sphere+correction+for+single-particle+electron+microscopy.">Ewald sphere correction for single-particle electron microscopy.</a> Ultramicroscopy. 106 (4-5), 376-382 (2006).</li><li>Leong, P. A., Yu, X., Hong Zhou, Z., Jensen, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correcting+for+the+ewald+sphere+in+high-resolution+single-particle+reconstructions.">Correcting for the ewald sphere in high-resolution single-particle reconstructions.</a> Methods in Enzymology. 482, 369-380 (2010).</li><li>Zivanov, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+tools+for+automated+high-resolution+cryo-EM+structure+determination+in+RELION-3.">New tools for automated high-resolution cryo-EM structure determination in RELION-3.</a> eLife. 7, 42166 (2018).</li></ol>

Sagar Khavnekar melder om ingen interessekonflikter. De andre forfatterne er ansatte i Thermo Fisher Scientific, MSD-EM-divisjonen.

Den beskrevne protokollen forutsetter at optikken til det brukte TEM-mikroskopet er i en godt justert tilstand. For 200 kV TEM som brukes i denne protokollen, utføres, verifiseres og lagres slike kolonnejusteringer av en erfaren servicetekniker etter mikroskopinstallasjon eller betydelig tjenesteintervensjon. Disse justeringsinnstillingene kan tilbakekalles når som helst i mikroskopgrensesnittet. Brukere kan bruke direct alignment-prosedyrene i mikroskopgrensesnittet til å finjustere kritiske parametere på nytt. Noen justeringer, for eksempel pistolvinkel og pistolskift, er stabile og trenger ikke å justeres av brukere på daglig basis. Kontroller og om justeringer (om nødvendig) av pistolvinkel og skift av mikroskoplederen anbefales to ganger i året. På den annen side er noen justeringer kritiske og må justeres før hver datainnsamling som beskrevet i protokollen ovenfor (for eksempel objektiv astigmatisme og komafri justering). Hvis Autocoma-funksjonen i analyseprogramvaren ikke konvergerer, bør justering av strålevinkel dreiepunkter og / eller rotasjonssenter verifiseres og justeres, og riktig sentrering av C2-blenderåpningen bør bekreftes. Etterpå bør Autostigmate-funksjonen kjøres som objektive stigmatorer brukes også til komakorreksjon. Disse justeringene bør gjentakelsesreguleres til både Autostigmate- og Autocomafunctions lykkes med sin første gjentakelse. Om nødvendig kan et annet område velges (f.eks. støtte karbonfolie uten is), avbildedefokusjustert eller bildeanskaffelsestiden økt for å optimalisere signal-til-støy-forholdet i oppkjøpte bilder, og synligheten til flere Thon-ringer i Fourier-transformasjonen av de oppkjøpte bildene.
Moderne kryo-EM-mikroskoper genererer store mengder data som ofte overstiger 1 TB per datasett for å oppnå høyoppløselige 3D-rekonstruksjoner, spesielt for proteiner med lav symmetri. Cryo-EM-data og resultater kompletteres også vanligvis med data og resultater fra ortogonale metoder for å forstå strukturfunksjonsrelasjoner i hvert vitenskapelige prosjekt fullt ut. Organisering av innsamlede data, overføring til et datasamlebånd for bildebehandling og deling av en resulterende kryo-EM-rekonstruksjon blant samarbeidspartnere stiller ytterligere krav til nye brukere av cryo-EM-metodikk for å sette opp sin lokale IT-infrastruktur. Programvare for databehandling, for eksempel Athena, forenkler sentralisert lagring av data som er samlet inn av et tilkoblet instrument eller programvare som drives av en registrert bruker. Lagrede data og metadata er tilgjengelige ved hjelp av et enkelt nettlesergrensesnitt av flere brukere, som kan ha forskjellige roller i prosjektet med forskjellige tilgangsrettigheter (enten som eier, samarbeidspartner eller seer) basert på påloggingsinformasjon og datadelingsdefinisjon i eksperimentoppsettet. Denne digitaliseringen av eksperimentelle arbeidsflyter gir midler for deling av data og metadata mellom samarbeidspartnere uten unødvendig duplisering og øker produktiviteten og sporbarheten til brukte arbeidsflyter. Implementering av en generell og tilpassbar struktur av prosjekter, eksperimenter og arbeidsflyter i databehandlingsprogramvare er universell og muliggjør tilpasning og integrering av ortogonale eksperimenter ved hjelp av komplementære metoder i en enkelt prosjektdatabase.
Valg av områder for datainnsamlingen på et cryo-EM-rutenett er avgjørende for vellykket innsamling av datasett med høy oppløsning. Cryo-EM-gitter produsert med tradisjonelle dypfrysingsenheter, for eksempel Vitrobot (et helautomatisk vitrifiseringssystem), vil vanligvis vise en gradient av istykkelse over rutenettoverflaten (figur 4). Dette kan være gunstig ettersom rutenettet inneholder områder med forskjellige istykkelser; Områder med den ideelle istykkelsen for datainnsamling må imidlertid identifiseres som beskrevet i protokollen ovenfor. Et optimalt kryo-EM-rutenett bør inneholde så lite overføring isforurensning som mulig og inneholde nok rutenett firkanter med intakt hullete støttefolie. Innsamling av data på grid-firkanter som har sprekker eller ødelagte områder anbefales ikke, da innsamlede bilder vil bli påvirket av betydelig sterkere generell drift ved belysning av en elektronstråle i forhold til rutenettplassene med intakt støttefolie. Overskudd av krystallinsk is kan okkludere de fleste foliehull og/eller forstyrre autofokusering, og slike rutenettstorg bør også unngås. Rutenett firkanter med tynn is viser vanligvis store glassområder og mange lyse foliehull som er synlige i et bilde tatt ved hjelp av Atlas-forhåndsinnstillingen. Forekomsten av tykkere is nær rutenettstenger er å forvente og ukritisk ettersom foliehull i disse områdene av rutenettplassen er utelukket under Hullvalg-prosedyren. Tilstedeværelsen av flere tomme hull i en rutenett firkant kan bety at glassaktig is i de omkringliggende hullene er ekstremt tynn og kan inneholde skadede partikler eller ingen partikler i det hele tatt. Generelt er det lurt å velge rutenett firkanter med en rekke istykkelser på forskjellige regioner på rutenettet for innledende screening og vurdering for å forstå hvilke områder som har de beste forholdene for innsamling av data med høy oppløsning og viser den ideelle partikkeltettheten og orienteringsfordelingen. For apoF- og 20S-proteasomprøvene som brukes i denne studien, inneholder områder med den tynneste observerbare isen de beste forholdene for høyoppløselig avbildning av disse prøvene.
Når du velger hull automatisk i alle valgte rutenett firkanter ved hjelp av datainnsamlingsprogramvaren, anbefales det å utføre malutførelsesoppgave på et representativt hull i hver rutenett firkant for å sjekke og sikre at verken altfor tykke eller altfor tynne eller uventet ikke-glasslegeme firkanter ble valgt for datainnsamling. Under datainnsamlingen kan viktige kvalitetsindikatorer for innsamlede bilder, for eksempel bildedrift og CTF-tilpasning, overvåkes ved hjelp av EQM. Datainnsamling kan deretter optimaliseres ved å hoppe over områder som gir bilder av dårlig kvalitet. Bilder med høyoppløselig CTF-passform kan imidlertid fortsatt inneholde bilder med partikler i noen få foretrukne retninger eller partikler som er denaturert i et for tynt islag. Partikkelplukking i sanntid og 2D-klassifisering fra innsamlede bilder vil gi ytterligere informasjon om kvaliteten på strukturelle data i avbildede partikler og avsløre både foretrukne retninger av intakte partikler i is eller inkonsekvent struktur av (delvis) denaturerte partikler. Beregning av klassegjennomsnitt kan derfor bidra til å ytterligere avgrense passende regioner for datainnsamling, slik det allerede er implementert og vist i andre programvarepakker23,28.
Valg av bildeinnstillinger for datainnsamling, for eksempel forstørrelse, elektrondosehastighet og defokusområde, avhenger av flere kriterier, for eksempel måloppløsning, størrelse på proteinet, prøvekonsentrasjon, ønsket mikroskopgjennomstrømning, etc. For det direkte elektrondetektorkameraet som brukes i disse eksperimentene, ble elektrondosehastigheten valgt i området 4-5 e-/pix/s ved å velge en passende SPOT-størrelse og intensitet for å opprettholde parallell belysning. Som vist i tabell 1, kan en annen SPOT-størrelse brukes i forhåndsinnstillingen Hull/eusentrisk høyde for å sikre tilstrekkelig signal-til-støy-forhold i bildet for sentrering av hull under datainnsamling. Forstørrelsen bør velges slik at pikselstørrelsen er minst 2-3 ganger mindre enn måloppløsningen for cryo-EM-rekonstruksjonen. Imidlertid brukes den høyere forstørrelsen (dvs. mindre pikselstørrelse), det mindre synsfeltet er tatt i bilder, og det er mindre partikler per bilde, noe som til slutt fører til lengre datainnsamlingstid for å samle bilder med nok partikler til å rekonstruere 3D-kart til en høy oppløsning. For apoF-prøven brukte vi pikselstørrelsen på 0,43 Å da vi hadde tilstrekkelig prøvekonsentrasjon for høy tetthet av partikler i bilder og rettet under 2 Å-oppløsningen av rekonstruksjonen. For 20S-proteasomprøven brukte vi pikselstørrelsen på 0,68 Å til å dekke et større synsfelt i oppkjøpte bilder. Vanligvis for 200 kV TEM mikroskoper, er cryo-EM-bilder anskaffet i defokusområdet fra 0,8 til 2,0 μm. Men med det forbedrede kontrast- og signal-til-støy-forholdet ved hjelp av energifilteret, kan datainnsamlinger gjøres mye nærmere fokus for bedre å bevare høyoppløselig informasjon i oppkjøpte bilder på grunn av mindre avvik og tilsvarende redusert forfall av CTF-konvoluttfunksjonen. Vi bruker heller ikke en objektiv blenderåpning, da blenderåpningen kan introdusere flere bildeaberrasjoner, mens bildekontrasten allerede er tilstrekkelig forbedret ved hjelp av energifilteret. For apoF- og 20S-proteasomprøvene brukte vi defokusinnstillingene på 0,5 μm, 0,7μm og 0,9 μm. For mindre proteiner (<200 kDa) brukte vi defokusinnstillinger på -0,5 μm, -0,7 μm og -0,9 μm for å forbedre kontrasten til partikler og lette enklere partikkelplukking og innledende grov justering i 3D-raffineringstrinnet for 3D-rekonstruksjon, noe som førte til ~ 2,5 oppløsning Å 3D-kart (upubliserte resultater).
Vi har allerede vist at avbildning med et energifilter forbedrer signal-til-støy-forholdet (SNR) i cryo-EM-bilder samlet på high-end 300-kV TEM mikroskoper11. Faktisk, når elektroner passerer gjennom en prøve, oppstår to hovedtyper av interaksjoner: i) Elastisk spredte elektroner opprettholder sin energi og bidrar til bildedannelse ved forstyrrelser med den ikke-spredte hendelsesstrålen via fasekontrastmekanismen ii) uelastisk spredte elektroner mister litt energi i prøven og bidrar hovedsakelig til støy i bilder. Derfor kan SNR forbedres betydelig ved å filtrere de uelastisk spredte elektronene, som har lavere energi enn hendelsesstrålen og elastisk spredte elektroner, ved hjelp av en smal energispalte. Det er imidlertid viktig å bruke et tilstrekkelig stabilt energifilter, for eksempel Selectris eller Selectris-X, for å kunne bruke svært smale (10 eV eller mindre) spalter over lange (12+ timer) automatisert datainnsamling av høyoppløselige cryoEM-datasett.
Cryo-EM-bilder ervervet med 200 kV TEM-mikroskoper under samme forhold som med 300 kV TEM-mikroskoper viser mindre SNR ved høy oppløsning (spesielt <4 Å) på grunn av raskere forfall av CTF-konvoluttfunksjonene. Følgelig kreves et høyere antall partikler (og derfor et høyere antall innsamlede bilder) for å oppnå en viss oppløsning ved bruk av 200 kV TEMer. I tillegg er dybdeskarpheten (10-25 nm i oppløsningsområdet 2-3 Å) også omtrent 20% mindre i 200 kV-bilder35, noe som betyr at mindre partikler i islaget (vanligvis 20-50 nm tykk) vil være fullt i fokus og konstruktivt bidra til alle høyoppløselige funksjoner i en beregnet 3D-rekonstruksjon med mindre defokusverdier er raffinert for hver partikkel uavhengig i de senere stadiene av 3D-rekonstruksjonsprosedyren. For større partikler (som icosahedral virions eller andre makromolekylære forsamlinger), kan partikkelstørrelsen overstige dybdeskarpheten ved høye oppløsninger og introdusere fasefeil på grunn av planar-tilnærming av Ewald-sfæren i standard 3D-rekonstruksjonsalgoritmer36. Disse feilene kan forbedres av avanserte algoritmer som allerede er implementert i vanlige cryo-EM-bildebehandlingspakker 37,28,39. Siden Ewald-sfæren har større krumning i 200 kV-data enn 300 kV-data, er Ewald-sfærekorrigering nødvendig ved relativt lavere oppløsninger og/eller for relativt mindre makromolekylære samlinger ved bruk av 200 kV TEM-er. På den annen side viser 200 kV-bilder høyere kontrast av partikler i tynn is (20-50 nm) som er betydelig tynnere enn 200-300 keV-elektronen betyr fri bane (220-280 nm). Den høyere kontrasten bidrar til å forbedre riktig global justering av individuelle partikler, spesielt for svakt spredning av mindre proteiner hvis struktur ennå ikke er kjent, og 3D-referansemodellen er ennå ikke godt etablert.
Her demonstrerte vi på eksempelet på et 20S-proteasom at bildekontrast og kvalitet kunne forbedres på samme måte med et energifilter når du bruker et 200 kV TEM-mikroskop. Ved hjelp av samme antall partikler ble data samlet inn ved hjelp av 20 eV-spalten rekonstruert til 2,26 Å-oppløsning i forhold til data samlet inn med den fullt åpnede energispalten som bare ble rekonstruert til 2,34 Å-oppløsning. Den beste rekonstruksjonen ble oppnådd fra data samlet inn ved hjelp av 10 eV-spalten som ble rekonstruert til 2,14 Å-oppløsning. Disse resultatene er i samsvar med den teoretiske prediksjonen om at filtrering av de uelastisk spredte elektronene øker SNR i innsamlede bilder og letter høyere oppløsning i kryo-EM-rekonstruksjoner fra det gitte antall partikler, som oppsummert i tabell 4. Disse resultatene ble ytterligere bekreftet av B-faktorene beregnet fra disse datasettene som indikerer høyere kvalitet på bilder i de energifiltrerede datasettene.
Vi kan derfor konkludere med at mens 300 kV TEM mikroskoper leverer den høyeste gjennomstrømningen og høyest mulig oppløsning i kryo-EM-rekonstruksjoner, gir 200 kV TEM-mikroskopene også datasett av høy kvalitet for høyoppløselige kryo-EM-rekonstruksjoner. Vi viste her at kvaliteten på oppkjøpte bilder, og derfor samlet tid til struktur, kan forbedres ytterligere ved å bruke 200 kV TEM utstyrt med et energifilter og en direkte elektrondetektor. Den presenterte protokollen beskriver alle nødvendige skritt for å rutinemessig skaffe høyoppløselige cryo-EM-data ved hjelp av dette oppsettet og avsløre fine strukturelle detaljer om makromolekylære 3D-strukturer, som er avgjørende for å forstå de viktigste strukturfunksjonsforholdene i strukturell biologi og strukturbasert legemiddeldesign.

Bestemmelse av proteinstruktur er avgjørende for å forstå molekylær arkitektur, funksjon og regulering av proteinkomplekser involvert i viktige cellulære prosesser, for eksempel cellemetabolisme, signaltransduksjon eller vertspatogeninteraksjoner. Kryo-elektronmikroskopi (kryo-EM) har dukket opp som en kraftig teknikk som er i stand til å løse 3D-strukturen til mange proteiner og deres komplekser som var for utfordrende for de tradisjonelle strukturelle teknikkene, for eksempel røntgendiffraksjon og NMR-spektroskopi. Spesielt har kryo-EM blitt bevist som den valgte metoden for membranproteiner, som ikke lett kan krystalliseres eller tilberedes i tilstrekkelige mengder for de tradisjonelle strukturelle teknikkene, og ga ny innsikt i strukturen og funksjonen til viktige cellulære reseptorer og ionkanaler 1,2,3,4,5 . Senest har cryo-EM spilt en viktig rolle i kampen mot Covid-19-pandemien ved å bestemme mekanismen for SARS-CoV-2-infeksjon på molekylært nivå, som belyste opprinnelsen til Covid-19 sykdom og ga grunnlag for rask utvikling av effektive vaksiner og terapeutiskestoffer 6,7,8,9,10.
Vanligvis brukes high-end 300-kV overføringselektronmikroskop (TEM) til høyoppløselig strukturbestemmelse av biomolekyler ved kryo-EM enpartikkelanalyse (SPA) for å avsløre deres konformasjon og interaksjoner. Nylig nådde SPA-teknikken en ny grense da den vanlige benchmark cryo-EM-prøven apo-ferritin ble rekonstruert ved atomoppløsning (1.2 Å)11,12 ved hjelp av en 300-kV TEM utstyrt med kaldt feltutslippspistol (E-CFEG), en direkte elektrondetektor og et energifilter. Ved denne resolusjonen var det mulig å entydig løse posisjoner av individuelle atomer i strukturen, konformasjon av individuelle aminosyresidekjeder samt hydrogenbinding og andre interaksjoner, som åpner nye muligheter for strukturbasert legemiddeloppdagelse av nye mål og optimalisering av eksisterende legemiddelkandidater.
Mellomtone 200 kV TEM mikroskoper brukes ofte til prøvescreening og prøveoptimalisering før endelig høyoppløselig datainnsamling ved hjelp av high-end TEM mikroskoper, spesielt på større cryo-EM-anlegg. Bildeprøver kan vanligvis løses i oppløsningsområdet 3-4 Å som er tilstrekkelig til å gå over til en avansert TEM på 300 kV for endelig datainnsamling. Derfor er datainnsamling ved hjelp av 200-kV TEM ofte ikke ytterligere optimalisert for høyest mulig oppløsningsresultater. Videre kan mange interessante biologiske spørsmål allerede besvares og publiseres ved disse resolusjonene, da alle aminosyre sidekjeder allerede er løst, og belegg av ligandbindingssteder kan også på en pålitelig måte bestemmes13. Det har allerede vist seg at 200 kV TEMs kan nå oppløsninger utover 3 Å for mange prøver 14,15,16,17,18. Bilder tatt ved 200 kV viser iboende høyere kontrast av avbildet partikler, noe som til og med kan lette mer nøyaktig innledende justering av partiklene til tross for mer svekket signal ved høy oppløsning sammenlignet med 300 kV TEM-bilder. Det er viktig å merke seg at den oppnådde oppløsningen av rekonstruerte kryo-EM-kart også er begrenset av strukturell fleksibilitet og konformasjons heterogenitet av avbildet prøver, som påvirker både 200-kV og 300-kV rekonstruksjoner. Faktisk ble mye mer kryo-EM-rekonstruksjoner oppnådd ved hjelp av 300 kV-systemene løst i 3-4 Å-oppløsningsområdet enn ved høyere oppløsninger19. Siden 200 kV TEM-mikroskoper er mindre komplekse og passer inn i mindre rom, representerer disse mikroskopene et godt, rimeligere alternativ for strukturbestemmelse av biologiske makromolekyler ved kryo-EM samtidig som automatisering av lange datainnsamlinger fra flere prøver som er lagret i mikroskopet Autoloader-systemet, bevares.
Innsamling av cryo-EM-datasett for høyoppløselig strukturbestemmelse krever nøyaktig justering av mikroskopoptikken. Kolonnejusteringer går systematisk fra elektronkilden ned til kondensatorlinsesystemet, objektivlinsen og energifilteret med en elektrondetektor. Den fullstendige sekvensen med justeringer er vanligvis ikke nødvendig. Ved behov styres brukeren via halvautomatiske prosedyrer med riktig beskrivelse av hvert trinn i et kontekstavhengig hjelpevindu gjennom justeringsprosedyren i mikroskopbrukergrensesnittet (Direct Alignments kontrollpanel). Når mikroskopet er fullstendig justert, forblir elektronoptikken stabil, og justeringene trenger ikke å endres i minst noen måneder. Bare de mest sensitive justeringene, for eksempel parallell belysning av prøveplanet, objektiv astigmatisme og komafri justering, må finjusteres like før innsamlingen av hvert datasett startes. Kvaliteten på innsamlede data kan deretter overvåkes under datainnsamling ved hjelp av forskjellige programvarepakker, for eksempel EPU Quality Monitor, cryoSPARC Live20, Relion21, Scipion22, WARP23 eller Appion24.
I tillegg til nøyaktige justeringer av mikroskopet, er den høye kvaliteten på godt rensede prøver med minimal konformasjons- og komposisjonell heterogenitet også en forutsetning for innsamling av høyoppløselige datasett og løsning av høyoppløselige strukturer. Flere detaljer om typiske protokoller, hyppige utfordringer og mulige rettsmidler finner du i andre vurderinger dedikert til dette emnet 25,26,27. I hovedsak er det viktig å finne områder på et gitt kryo-EM-rutenett som har tilstrekkelig tynn is til å bevare høyoppløselig informasjon, og individuelle partikler er tett fordelt ved tilfeldige orienteringer uten overlappinger. Typiske kryo-EM-gitter har imidlertid ikke-ensartet istykkelse, og det er derfor viktig å finne og velge de optimale områdene for avbildning. Ulike måter for estimering av istykkelse på nettet er tilgjengelig i programvarepakker dedikert til automatisert innsamling av cryo-EM-datasett, for eksempel EPU 2, Leginon28 eller SerialEM29.
Fremveksten av raske og sensitive direkte elektrondetektorer gjorde det mulig å samle bilder i mange fraksjoner som filmer som muliggjorde kompensasjon av stråleinduserte bevegelser og resulterte i en betydelig økning i kvaliteten og mengden data som brukes i bildebehandling og endelig 3D-rekonstruksjon30. Samtidig gir automatisering og datainnsamling med høy gjennomstrømning enorme datasett med tusenvis av bilder/filmer som representerer utfordringer for datalagring og tilgang. Den vedtatte modellen med store cryo-EM-anlegg som betjener titalls til hundrevis av brukere, krever spesielt organisert datahåndtering med riktig sporing og datadeling i etablerte cryo-EM-rørledninger31,32.
Denne studien beskriver en protokoll for rutinemessig innsamling av høyoppløselige cryo-EM-datasett ved hjelp av 200 kV Glacios TEM mikroskop. Nødvendige justeringer av mikroskopoptikken er beskrevet sammen med prosedyrer for evaluering av kryo-EM-prøver og valg av egnede områder for datainnsamling med høy oppløsning. Organiseringen av innsamlede data og relaterte metadata med eksempelinformasjon er demonstrert i Athena - en datahåndteringsplattform som letter gjennomgangen av eksempelinformasjon og innsamlede data. Ved hjelp av musens apo-ferritinprøve var det mulig å oppnå en 3D-rekonstruksjon ved 1,6 Å resolusjon13. Ved hjelp av den beskrevne protokollen rekonstruerte vi også 3D-tetthetskartet over 20S-proteasomet fra Thermoplasma acidophilum ved 2,1 Å-oppløsning.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>AutoGrid rings</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>1036173</td>
			<td>Package of 100x AutoGrid rings for the standard EM grids.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C-Clip</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>1036171</td>
			<td>Package of 100 clips that secure 
			the standard EM grids inside the AutoGrid rings.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Data Management Platform</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>1160939</td>
			<td>Part of the Glacios base configuraiton; includes Athena Software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EPU Quality Monitor</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>1179770</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EPU Software</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>1025080</td>
			<td>Part of the Glacios base configuration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethane 3.5</td>
			<td>Westfalen</td>
			<td>A06010110</td>
			<td>Ethane gas used for making liquid ethane (puritiy at least N35, i.e. 99.95% vol)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 4 200kV</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>1166936</td>
			<td>Direct electron detector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glacios</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>1149551</td>
			<td>200 kV TEM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GloQube Plus Glow Discharge System for TEM Grids and surface modification</td>
			<td>Quorum</td>
			<td>N/A</td>
			<td>also available via Thermo Fisher Scientific (PN 1160602)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuantiFoil grids</td>
			<td>Quantifoil</td>
			<td>N/A</td>
			<td>R-2/1, 300 mesh; carbon foil grid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Relion</td>
			<td>MRC Laboratory of Molecular Biology</td>
			<td>N/A</td>
			<td>open source software: 
			https://relion.readthedocs.io/en/release-3.1/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Selectris with Falcon 
			4 for 200 kV</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>1191753</td>
			<td>Energy filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Selectris X with Falcon 
			4 for 200 kV</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>1191755</td>
			<td>Energy filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltrAuFoil grids</td>
			<td>Quantifoil</td>
			<td>N/A</td>
			<td>R-1.2/1.2, 300 mesh; gold foil grids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vitrobot Mk. IV</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>1086439</td>
			<td>Automated vitrification system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman 595 filter paper</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AA00420S</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

routine collection of high-resolution cryo-em datasets using 200 kv transmission electron microscope

Kryo-elektronmikroskopi (kryo-EM) har blitt etablert som en rutinemessig metode for proteinstrukturbestemmelse det siste tiåret, og tar en stadig økende andel av publiserte strukturelle data. Nylige fremskritt innen TEM-teknologi og automatisering har økt både hastigheten på datainnsamling og kvalitet på innsamvede bilder, samtidig som det reduserer det nødvendige kompetansenivået for å skaffe kryo-EM-kart ved sub-3 Å-oppløsninger. Mens de fleste av slike høyoppløselige strukturer er oppnådd ved hjelp av toppmoderne 300 kV cryo-TEM-systemer, kan høyoppløselige strukturer også oppnås med 200 kV cryo-TEM-systemer, spesielt når de er utstyrt med et energifilter. I tillegg reduserer automatisering av mikroskopjusteringer og datainnsamling med bildekvalitetsvurdering i sanntid systemkompleksiteten og sikrer optimale mikroskopinnstillinger, noe som resulterer i økt utbytte av bilder av høy kvalitet og generell gjennomstrømning av datainnsamling. Denne protokollen demonstrerer implementeringen av nyere teknologiske fremskritt og automatiseringsfunksjoner på et 200 kV kryooverføringselektronmikroskop og viser hvordan man samler inn data for rekonstruksjon av 3D-kart som er tilstrekkelig for de novo atommodellbygging. Vi fokuserer på beste praksis, kritiske variabler og vanlige problemer som må vurderes for å muliggjøre rutinemessig innsamling av slike høyoppløselige cryo-EM-datasett. Spesielt følgende viktige emner gjennomgås i detalj: i) automatisering av mikroskopjusteringer, ii) valg av egnede områder for datainnsamling, iii) optimale optiske parametere for innsamling av data av høy kvalitet, iv) energifilterjustering for nulltapsavbildning og v) datahåndtering og kvalitetsvurdering. Anvendelse av beste praksis og forbedring av oppnåelig oppløsning ved hjelp av et energifilter vil bli demonstrert på eksempelet på apo-ferritin som ble rekonstruert til 1,6 Å, og Thermoplasma acidophilum 20S proteasome rekonstruert til 2,1-Å oppløsning ved hjelp av en 200 kV TEM utstyrt med et energifilter og en direkte elektrondetektor.

Databehandlingsportalen gir effektiv, strukturert lagring av innsamlede bilder, data og metadata fra flere eksperimentelle arbeidsflyter i én enkelt programvareplattform. Hvert definert eksperiment i et opprettet prosjekt består av en arbeidsflyt med kundedefinerte trinn for å fange opp eksempelinformasjon, innsamlede data og relaterte metadata uten begrensninger for å gi maksimal fleksibilitet og brukervennlighet for eventuelle eksperimenter og alle brukstilfeller (figur 1, figur 2). Databehandlingsportalen har også en labnotatfunksjonalitet som illustrerer arbeidsflyttrinn, inkludert bildebehandling med mellomliggende resultater, som alle kan knyttes til et prosjekt og gi så fullstendig en post som mulig for analyse og oppretting av rapporter og publikasjoner.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63519/63519fig01.jpg"> Figur 1: Eksempel på mulig organisering av data og metadata i databehandlingsplattformen. Hvert prosjekt kan bestå av flere eksperimenter, for eksempel kryo-EM eller massespektroskopi (viz. Protokoll trinn 2.3). Hvert eksperiment kan inneholde flere brukerdefinerte arbeidsflyter (viz. Protokoll trinn 2.5), som hver består av flere konfigurerbare trinn (viz. Protokoll trinn 2.7). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63519/63519fig01large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63519/63519fig02.jpg"> Figur 2: Vis i en åpnet prosjektarbeidsflyt i databehandlingsplattformen. Figuren viser tilknyttede metadata og notater til det åpne trinnet i arbeidsflyten. Den venstre linjen med ikoner gir rask tilgang til forskjellige alternativer og menyer på databehandlingsplattformen. Panelet til venstre inneholder en liste over lagrede arbeidsflyter (vist bare én lagret arbeidsflyt "Exp2_ApoF_EFTEM_Grid7") og en blå knapp for å legge til en ny arbeidsflyt. Det sentrale panelet viser individuelle trinn i den åpne arbeidsflyten, som vist for SPA-arbeidsflyten her. Den blå knappen øverst til høyre kan legge til et ekstra trinn i den åpne arbeidsflyten. Panelet til høyre inneholder plass til enten innspilte metadata eller brukerinndata Notater for arbeidsflyten, som kan inneholde tekst, tabeller og bilder. Ulike formateringsalternativer for teksten er tilgjengelige. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63519/63519fig02large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
Cryo-EM-gitter produsert med tradisjonelle dypfrysingsenheter, for eksempel Vitrobot, vil vanligvis vise en gradient av istykkelse over rutenettoverflaten. Noen gitter kan også bli skadet (bøyd) etter manuell håndtering og/eller klipping i en autogrid ringbærer. Figur 3 viser eksempler på ulike nett som vist i Atlas-oversikten. Gitteret med tykk is eller skade bør utelukkes fra videre undersøkelser.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63519/63519fig03.jpg"> Figur 3: Galleri av forskjellige gitter som vist i Atlas-oversikten. (A) Et dårlig rutenett med tykk is, (B) et bøyd rutenett med dårlig is- og isforurensning, (C) et akseptabelt rutenett med god isgradient, (D) et typisk rutenett med god tynn is og liten isgradient. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63519/63519fig03large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
Valg av rutenett firkanter uten skade og optimal istykkelse er avgjørende for å samle datasett med høy oppløsning. Istykkelsen kan variere selv på nivået av individuelle rutenett firkanter, og det er derfor viktig å velge bare hull med optimal tynn is fra hver valgte rutenett firkant. Figur 4 viser et egnet rutenett med intakt folie og tynn is i midten. Den viste rutenettplassen er bra for å sette et filter for automatisert valg av hull med tynn is i alle valgte rutenett firkanter, da den inneholder en rekke forskjellige istykkelser samt tomme hull uten is, noe som er ekstremt nyttig for å sette et passende intensitetsområde i isfilteret i Hole Selection-oppgaven.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63519/63519fig04.jpg"> Figur 4: Et eksempel på et rutenett med en stigning av istykkelse, fra tomme rutenett firkanter i midten og tykk is nær rutenettet. Filteret for iskvalitet kan brukes til å velge rekkevidden av intensiteter inne i hull med den ideelle istykkelsen som er valgt i rutenetttorget (hullene med grønt overlegg). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63519/63519fig04large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
Benchmark resultater ved hjelp av den beskrevne protokollen ble oppnådd ved hjelp av prøven av mus apo-ferritin (apoF) fra Kikkawa gruppe11. ApoF er et svært α helisk protein som danner et veldig stabilt oktaedralbur. Høy stabilitet og høy symmetri gjør apoF til en optimal prøve for høyoppløselig kryo-EM-bildebehandling og bildebehandling. ApoF har derfor blitt et standard utvalg for å vurdere ytelsen til kryo-EM-instrumenter 11,12,13. En frossen aliquot som inneholder 15 mg/ml renset apoF-prøve ble tint på is og avklart ved sentrifugering ved 10.000 x g i 10 min. Supernatanten ble fortynnet til 5 mg/ml med 20 mM HEPES pH 7,5, 150 mM NaCl. 3 μL av den fortynnede prøven ble påført på en glød-utladet R-1.2/1.3, 300 mesh gullgitter i 30 s. Deretter ble gitteret blottet i 5 s før de stupte ned i flytende etan avkjølt av flytende nitrogen. Dypfrysing ble utført ved hjelp av et helautomatisk vitrifiseringssystem ved 100% fuktighet og 4 °C. Alle rutenett ble klippet i autogrider og lastet inn i en 200 kV Cryo-TEM. Omtrent 3000 filmer ble samlet inn med en gjennomstrømning på 300 filmer / t. Data ble behandlet ved hjelp av metodene som beskrevet11 med følgende modifikasjoner: i) Relion 4-beta versjon ble brukt i stedet for Relion 3.1, ii) automatisert partikkelplukking ble gjort ved hjelp av 2D-klasse gjennomsnitt av tidligere apoF rekonstruksjoner som referanser, og iii) den første 3D-modellen ble generert fra forrige apoF rekonstruksjon lav-bestått til 15--oppløsning Å oppløsning. Optikkgruppering ble ikke gjort for dette datasettet, da den brukte AFIS-prosedyren34 har vist seg å effektivt og pålitelig minimere strålevinkelinduserte faseskift som ikke begrenser datakvaliteten for å rekonstruere 3D-kart ved de rapporterte oppløsningene. 3D-raffinement etter bayesiansk polering og CTF-raffinement førte til 1,68 Å-oppløsningskart. Oppløsningen ble ytterligere forbedret med Ewald sfærekorreksjon, noe som resulterte i et 1,63 Å-oppløsningskart. Oversikten over datainnsamlings- og behandlingsparametere vises i tabell 2, og det endelige rekonstruerte tetthetskartet vises i figur 5, med Fourier Shell Correlation (FSC)-kurven vist i tilleggs figur 8.
Tabell 2: Datainnsamlings- og bildebehandlingsparametere som brukes til 3D-rekonstruksjon av apo-ferritin. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63519/Table%202-63519R2.xlsx" target="_blank">Klikk her for å laste ned denne tabellen.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63519/63519fig05.jpg"> Figur 5: Kryo-EM rekonstruksjon av apo-ferritin. (Venstre panel) 3D-gjengivelse av det rekonstruerte apoF cryo-EM-kartet ved 1,6 Å oppløsning. (Høyre panel) Detaljert visning av det rekonstruerte kartet på nivået av individuelle aminosyre sidekjeder. Tettheten av aminosyre sidechains er godt løst, og atommodellen kan entydig bygges innenfor dette kartet. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63519/63519fig05large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
Effekter og fordeler ved å bruke et energifilter i SPA-rekonstruksjonene ble evaluert ved hjelp av det prokaryote 20S-proteasomet isolert fra T. acidophilum. Det prokaryote 20S-proteasomet har også blitt brukt som en standard kryo-EM-prøve, da den representerer den stabile katalytiske kjernen i proteasomkomplekset med D7-symmetrien. Gitter ble utarbeidet ved å legge til 4,5 μL av det rensede T. acidophilum 20S proteasomprøven på et glødeladet 200-mesh R 2/1 kobbergitter. Prøver ble vitrifisert i en flytende etan/propanblanding ved hjelp av et helautomatisk vitrifiseringssystem satt til 4 °C og 100 % fuktighet med blolotkraft på 20 og flekktid på 4,5 s.
Tre forskjellige datasett ble samlet inn fra det samme kryo-EM-rutenettet med lignende rutenettstorg ved hjelp av en annen spaltebredde på energifilteret i rekkefølgen: i) spalte helt åpen (ingen spalte satt inn), ii) 20 eV-spalte og iii) 10 eV-spalte. Rutenettplassene ble valgt ved hjelp av et iskvalitetsfilter i analyseprogramvaren. Alle andre parametere for datainnsamling og databehandling ble beholdt på samme måte. Datasett ble samlet inn i 15 timer med totalt 4000 filmer og behandlet ved hjelp av metodene som beskrevet11 ved hjelp av Relion 3.1 med modifikasjonen at Laplacian-of-Gaussian partikkelplukkingsalgoritme ble brukt til å produsere innledende 2D-klassegjennomsnitt for referansebasert partikkelplukking fra de fulle datasettene. Det samme antallet (102 200) tilfeldig utvalgte partikler ble valgt og brukt til endelig gjentakelse og 3D-rekonstruksjon av hvert datasett. Databehandlingsvariabler er beskrevet i tabellen (tabell 3) nedenfor for å oppnå det endelige rekonstruerte EM-tetthetskartet vist i figur 6 med FSC-kurven vist i tilleggs figur 9. Optikkgruppering og Ewald-sfærekorrigering ble heller ikke gjort for disse datasettene.
Tabell 3: Datainnsamlings- og bildebehandlingsparametere som brukes til 3D-rekonstruksjon av T. acidophilum 20S-proteasomet. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63519/Table%203-63519R2.xlsx" target="_blank">Klikk her for å laste ned denne tabellen.</a>
Tabell 4: Oppsummering av oppnådd oppløsning og B-faktor for kryo-EM-rekonstruksjoner av T. acidophilum 20S-proteasomet ved hjelp av datasett med forskjellig energispaltebredde. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63519/Table%204-63519R2.xlsx" target="_blank">Klikk her for å laste ned denne tabellen.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63519/63519fig06.jpg"> Figur 6: Effekt av energifiltrering på cryo-EM-bilder. (A) Cryo-EM-bilder ved forskjellige defokusverdier samlet inn med eller uten 10 eV-spalte. (B) Oversikt over 20S proteasome cryo-EM-kartet med segmenterte underenheter. (C) Zoomvisning på 20S-proteasomkartet med en montert atommodell. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63519/63519fig06large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
Supplerende figur 1: Kalibrering av bildeskiftoppgave (gul ellipse) for å justere bildeskift mellom ulike optiske forhåndsinnstillinger (røde ellipser) i analyseprogramvaren, ved hjelp av en krystall av sekskantet is som er synlig i hele forstørrelsesområdet mellom 100x og 165 000x. (Øverst) Kalibrering mellom forhåndsinnstillingene for datainnsamling og hull/eusentrisk høyde, (midtre) kalibrering mellom forhåndsinnstillingene Hole/Eucentric Height og Grid Square, (nederst) kalibrering mellom forhåndsinnstillingene Grid Square og Atlas. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63519/SuppFigure01_rev01_EPUalign-Final.pdf" target="_blank">Klikk her for å laste ned denne filen.</a>
Supplerende figur 2: Autostigmate-funksjon i analyseprogramvare (gul ellipse). (Venstre bilde) Hentet bilde. (Høyre bilde) Fourier overføring av det oppkjøpte bildet som viser konsentriske Thon-ringer og deres CTF-passform vist i radiale bjelker. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63519/SuppFigure02_rev01_EPUastigmatism-Final.pdf" target="_blank">Klikk her for å laste ned denne filen.</a>
Supplerende figur 3: Brukergrensesnittet til Autocoma-funksjonen i analyseprogramvare (gul ellipse) for komajustering. Bildepanelet viser Fourier-overføringsbilder som er anskaffet ved forskjellige strålevinkeler, og DERES CTF-passform som brukes til beregning av koma. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63519/SuppFigure03_rev01_EPUcoma-Final.pdf" target="_blank">Klikk her for å laste ned denne filen.</a>
Supplerende figur 4: Brukergrensesnitt for energifilterjustering. Eksempel på en god tunning rapport av energifilteret erokromacity med alle parametere (vist i grønn tekst) innenfor spesifikasjoner. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63519/SuppFigure04_rev01_Sherpa_isochromacity%20-final.pdf" target="_blank">Klikk her for å laste ned denne filen.</a>
Supplerende figur 5: Brukergrensesnitt for energifilterjustering. Eksempel på god innstillingsrapport for forstørrelsesforvrengninger for energifilter med alle parametere (vist i grønn tekst) innenfor spesifikasjonene. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63519/SuppFigure05_rev01_Sherpa_mag-distortions-Final.pdf" target="_blank">Klikk her for å laste ned denne filen.</a>
Supplerende figur 6: Brukergrensesnitt for energifilterjustering. Eksempel på god innstilling av energifilterkromatiske forvrengninger med alle parametere (vist i grønn tekst) innenfor spesifikasjonene. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63519/SuppFigure06_rev01_Sherpa_chrom-distortions-Final.pdf" target="_blank">Klikk her for å laste ned denne filen.</a>
Supplerende figur 7: DataViz-panelet på EPU Quality Monitor med en oversikt over datakvalitet i et samlet cryo-EM-datasett. Grafene med aggregerte data fra alle innsamlede bilder/filmer viser verdier (prikkplott) og distribusjon (stolpetegninger) av valgte kritiske kvalitetsindikatorer, for eksempel CTF-tilpasningssikkerhet (blå), defokus (oransje) og astigmatisme (grønn). Et delsett av de innsamlede bildene/filmene kan velges ved å angi parameterfiltre øverst i DataViz-panelet. Etter å ha brukt filtrene, kan utvalgte bilder / filmer eksporteres for videre behandling i en annen bildebehandlingspakke, for eksempel Relion eller CryoSpark. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63519/SuppFigure07_rev01_DataViz.tif" target="_blank">Klikk her for å laste ned denne filen.</a>
Supplerende figur 8: FSC-kurven for den endelige rekonstruksjonen av apoF til 1,6 Å-oppløsning, som rapportert av Relion 4-beta. Den blå kurven viser FSC for maskerte 3D-kart fra to uavhengig raffinerte 3D-rekonstruksjoner fra to gjensidig utelukkende halvdatasett. I henhold til gullstandarden FSC klokken 0.143 tilsvarer oppløsningen på det endelige 3D-kartet rekonstruert fra hele datasettet 1,6 Å. Den oransje kurven viser FSC for de maskerte 3D-rekonstruksjonene med randomiserte faser. FSC-kurvens raske fall indikerer at den brukte masken ikke bidro til den observerte FSC for de opprinnelige rekonstruerte kartene (blå kurve) utover ~2 Å-oppløsningen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63519/SuppFigure08_rev01_FSC_apoF.tif" target="_blank">Klikk her for å laste ned denne filen.</a>
Supplerende figur 9: FSC-kurver for den endelige rekonstruksjonen av T. acidophilum 20S-proteasom ved hjelp av forskjellige spaltebredder på energifilteret, som rapportert av Relion 3.1. De blå kurvene viser FSC for maskerte 3D-kart fra to uavhengig raffinerte rekonstruksjoner fra henholdsvis to halvdatasett av hvert datasett. Gullstandarden FSC på 0,143 indikerer de oppnådde oppløsningene til de endelige 3D-kartene rekonstruert fra de respektive fullstendige datasettene (henholdsvis 2,3 Å, 2,2 Å og 2,1 Å-oppløsning). De røde kurvene viser FSC for maskerte kart med randomiserte faser. Det raske fallet i de røde FSC-kurvene indikerer at den brukte masken ikke bidro til FSC for de opprinnelige rekonstruerte kartene utover ~3 Å-oppløsningen. De grønne kurvene viser FSC for umaskerte 3D-kart, som påvirkes av støy i hele det rekonstruerte 3D-volumet og derfor faller raskere enn FSC for de maskerte 3D-kartene. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63519/SuppFigure09_rev02_T20S_FSCs.tif" target="_blank">Klikk her for å laste ned denne filen.</a>
Datatilgjengelighet: Kryo-EM tetthetskartene er deponert i EM Data Bank under tiltredelsestall: apoferritin: EMD 14173, EMPIAR-10973. 20S proteasome: EMD 14467, EMPIAR-10976.

Watch this Scientific Journal Video about Routine Collection of High-Resolution cryo-EM Datasets Using 200 KV Transmission Electron Microscope at JoVE.com

Routine Collection of High-Resolution cryo-EM Datasets Using 200 KV Transmission Electron Microscope

Høyoppløselige kryo-EM-kart over makromolekyler kan også oppnås ved å bruke 200 kV TEM mikroskoper. Denne protokollen viser de beste fremgangsmåtene for å angi nøyaktige optikkjusteringer, datainnsamlingsordninger og valg av bildeområder som alle er avgjørende for vellykket innsamling av datasett med høy oppløsning ved hjelp av en 200 kV TEM.

Rutinemessig innsamling av kryo-EM-datasett med høy oppløsning ved bruk av 200 KV-transmisjonselektronmikroskop

Cryo-electron microscopy (cryo-EM) has been established as a routine method for protein structure determination during the past decade, taking an ...

Cryo-EM har blitt en standard teknikk for strukturbestemmelse av proteiner og deres komplekser. Denne protokollen beskriver de beste fremgangsmåtene for å få tak i Cryo-EM-datasett med høy oppløsning fra mellomtone-200 kV TEM-mikroskoper. Cryo-EM kan bestemme proteinstruktur i nær innfødte forhold i løsning for flere konformasjonstilstander og funksjonelle tilstander samtidig, noe som er unnvikende for andre strukturelle teknikker.Innhentet strukturell informasjon kan brukes til belysning av molekylære mekanismer for proteinfunksjon, samt for strukturbasert legemiddeldesign. For eksempel avslørte en nylig publikasjon i strukturen av amyloidfibrils flere bindende steder av en vital ligand. I denne protokollen bruker vi imidlertid standardprøvene av apoferritin og proteasom for å demonstrere de kritiske trinnene for å skaffe Cryo-EM-data med høy oppløsning.Driften av en Cryo-TEM har blitt enklere de siste årene, spesielt på grunn av innføringen av avanserte automatiseringsfunksjoner. For den første økten vil vi imidlertid råde deg til å ha en opplæring med mer erfarne brukere. Derfra er progresjonen i teknikken relativt rask.Demonstrere prosedyren vil være Adrian Koh, som er senior applikasjonsforsker ved Thermo Fisher Scientific. Sett inn automatiske gitter i kassetten for automatisk laster under flytende nitrogenforhold. Sett kassetten med autogitter inn i en flytende nitrogenkjølt overføringskapsel.Sett kapselen inn i mikroskopet ytterligere og klikk på Dock-knappen i mikroskopets brukergrensesnitt for å laste kassetten fra kapselen inn i mikroskopets autolaster. Klikk på Inventar-knappen for å sjekke tilstedeværelsen av automatiske rutenett i den lastede kassetten. Klikk deretter på Last inn og fjern-knappene for å sette inn autorutenettene i kolonnen for TEM-avbildning.Velg Atlas-fanen og klikk på Ny økt-knappen for å åpne en ny økt. Fyll ut detaljer som øktnavn og datalagringssted, og klikk på Bruk-knappen. Velg rutenettene av interesse ved å merke av i en avmerkingsboks ved siden av det tilsvarende rutenettnummeret.Klikk på Start-knappen for å starte en helautomatisk samling av atlas av alle valgte rutenett. Når samlingen er ferdig, klikker du på rutenettetiketter for å se gjennom de oppkjøpte atlasene. Velg EPU-fanen og gå til Ny økt for å opprette en ny økt i panelet til venstre.Velg alternativet Ny økt for å bruke gjeldende angitte optiske forhåndsinnstillinger. Fyll ut øktnavnet. Velg den manuelle typen økt som skal ha kontroll over valg av individuelle hull og rutenett firkanter valgt for datainnsamling senere i protokollen.Velg den raskere anskaffelsesmodusen for å bruke avviksfri bildeforskyvning for datainnsamling. Skriv deretter inn plasseringen for å lagre metadataene. Klikk Bruk-knappen for å opprette en ny økt.Velg den firkantede markeringsoppgaven i panelet til venstre for å vise det innsamlede atlaset i rutenettet. Identifiser rutenettplassene med intakt støttefolie uten skade, tynne glassfirtlige is- og foliehull, ubetydelig krystallinsk isforurensning i rutenettplassen og minimal lysstyrkegradient over rutenettplassen og innenfor individuelle foliehull. Velg rutenettplassene for datainnsamling, enten i hele atlaset eller flisbilder av høy kvalitet.Høyreklikk et rutenett som er kvadrat av interesse, og velg hele utvalgsoppgaven. Klikk knappen Automatisk eusentrisk for å gå automatisk til den første valgte rutenettplassen. Juster den eusentriske høyden og få et rutenett firkantet bilde for å finne foliehull.Klikk på Finn hull-knappen for å finne foliehull i bildet. Klikk fjern hull-knappen for å lukke rutenettlinjeknappen for å fjerne merkingen av hull i nærheten av rutenettstenger. Juster grensene i lysstyrken til isfilteret for å fjerne alle hull med for tykk is og alle tomme hull.Høyreklikk på et hull i rutenettet firkantet bilde og velg flytt scenen til plassering flytte scenen her. Velg maldefinisjonsoppgaven i panelet til venstre. Klikk på Hent-knappen for å få et helt bilde.Angi verdier for forsinkelse etter bildeskift til 0,5 sekunder og forsink etter trinnskift til fem sekunder. Klikk på Finn og midtstill hull-knappen for å midtstille et hull i bildet. Velg Knappen Legg til anskaffelsesområde, og klikk på bildet for å velge stedet i det midtstilte hullet der høy forstørrelsesbildeanskaffelse vil bli tatt.Velg knappen Legg til automatisk fokusområde, og klikk på bildet for å velge plasseringen på støttefolien ved siden av det midtstilte hullet der automatisk fokus på bildet skal utføres. Klikk på det grønne anskaffelsesområdet for å angi en sekvens av defokusverdier i defokuslisten i den øverste delen av programvarevinduet. Når du har satt de autofokusspesifikke innstillingene, velger du alternativet Etter sentrering for å fokusere automatisk på starten av hver AFIS-klynge.Velg alternativet Objektivlinse for raskere automatisk fokusering og redusert trinndrift. Klikk på Forbered alle firkanter-knappen i hullvalgoppgaven for å automatisk angi datainnsamling og alle andre valgte rutenett firkanter i henhold til de brukte innstillingene i denne første rutenettplassen. Velg maldefinisjonsoppgaven, skaff deg et nytt bilde, flytt scenen til et rent område på karbonfolie ved å høyreklikke og velge menyalternativet flytt trinn her.Velg kategorien Automatiske funksjoner . Etter å ha stilt inn ønsket defokus og gjentar, bytter du til autofokusforhåndsinnstillingen og klikker på startknappen for å kjøre autofokusfunksjonen. Velg Autostigmate-oppgaven, bytt til forhåndsinnstillingen Thon Ring og trykk på Start-knappen.Velg Autocoma-oppgaven, og trykk startknappen. Flytte fase til et område med en brutt rutenettsnral. Bekreft gjennomsiktighet for området ved å ta ett enkelt bilde med automatisk fokus.Åpne Sherpa UI og velg Energy Filter-programmet. Klikk på Senter-knappen og null tap alternativet for å midtstille null tap energi filter slit. Klikk på Tune-knappen i isochromaticity-alternativet.Klikk alternativet Juster forstørrelse og Juster forvrengninger i de geometriske og kromatiske forvrengningene. Gå til EPU-fanen, velg automatisert anskaffelsesoppgave og klikk på Start kjøring-knappen for å starte fullstendig automatisert datainnsamling. Figuren viser Cryo-EM-rutenett som viser en gradient av istykkelse over rutenettoverflaten.Gitterene som er ekskludert fra den videre undersøkelsen er dårlig nett med tykk is og et bøyd rutenett med dårlig is og forurensning, mens akseptable gitter er de med god isgradient og et typisk rutenett med god tynn is og liten isgradient. Figuren viser den endelige 3D-gjengivelsen av det rekonstruerte apoferritin Cryo-EM-kartet. Den høye stabiliteten og symmetrien gjør den til en optimal benchmark-prøve for høyoppløselig Cryo-EM-bildebehandling og bildebehandling.Bayesiansk polering, CTF-raffinement og Ewald-sfærekorreksjon resulterte i et 1,63 angstrom oppløsningskart. Figuren viser en detaljert visning av det rekonstruerte apoferritin Cryo-EM-kartet på det individuelle aminosyresidekjedenivået. Tettheten av aminosyre sidekjeder er godt løst og atommodellen kan entydig bygges i kartet.Bildet her viser to forskjellige datasett ved forskjellige defokusverdier samlet inn fra det samme Cryo-EM-rutenettet med lignende rutenett firkanter med en spalte helt åpen og en 10 elektron volt spalte som indikerer at 10 elektron volt spalten forbedrer bildekontrasten betydelig. Figuren her viser en oversikt over 20S proteasome Cryo-EM-kartet med segmenterte underenheter som brukes som standard Cryo-EM-prøve. Og den zoomede utsikten med en montert atommodell representerer den stabile katalytiske kjernen i proteasomkomplekset med D7-symmetrien.Protokollen inneholder to kritiske trinn. En, på jakt etter områder med tynn glassaktig is som inneholder homogene partikler. Og to, sette opp parallell belysning for datainnsamling.Med høyoppløselige rekonstruksjoner av proteiner som oppnår to til tre angstrom i oppløsning, er du bedre i stand til å forstå de molekylære mekanismene for sykdom og forbedre legemiddelledninger. Tidligere var krystallisering nødvendig hvis du ønsket å studere det strukturelle grunnlaget for biologiske fenomener. I dag med Cryo-EM er det ikke lenger nødvendig.Og så med Cryo-EM gjør vi det mulig for forskere å studere et bredere spekter av biologiske fenomener på et strukturelt nivå.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Method to Visualize and Analyze Membrane Interacting Proteins by Transmission Electron Microscopy

Metode for å visualisere og analysere Membran samspill proteiner av transmisjonselektronmikroskopi

Monotopic proteins exert their function when attached to a membrane surface, and such interactions depend on the specific lipid composition and on the ...

High-resolution Single Particle Analysis from Electron Cryo-microscopy Images Using SPHIRE

Høyoppløselig enkeltpartikkelanalyse fra elektronkryomikroskopi bilder ved hjelp av SPHIRE

SPHIRE (SPARX for High-Resolution Electron Microscopy) is a novel open-source, user-friendly software suite for the semi-automated processing of single ...

Cryo-EM and Single-Particle Analysis with Scipion

Kryo-EM og enkeltpartikkelanalyse med scipion

Cryo-electron microscopy has become one of the most important tools in biological research to reveal the structural information of macromolecules at ...

Preparation of Sample Support Films in Transmission Electron Microscopy using a Support Floatation Block

Utarbeidelse av prøvestøttefilmer i transmisjonselektronmikroskopi ved hjelp av en støtteflytblokk

Structure determination by cryo-electron microscopy (cryo-EM) has rapidly grown in the last decade; however, sample preparation remains a significant ...

Preparing Lamellae from Vitreous Biological Samples Using a Dual-Beam Scanning Electron Microscope for Cryo-Electron Tomography

Forbereder lameller fra glassaktige biologiske prøver ved hjelp av et dual-beam skanning elektronmikroskop for kryo-elektrontomografi

Presented here is a protocol for preparing cryo-lamellae from plunge-frozen grids of Plasmodium falciparum-infected&#160;human erythrocytes, which could ...

Preparation of High-Temperature Sample Grids for Cryo-EM

Klargjøring av høytemperatur prøvegitter for Cryo-EM

The sample grids for cryo-electron microscopy (cryo-EM) experiments are usually prepared at a temperature optimal for the storage of biological samples, ...

Micropatterning Transmission Electron Microscopy Grids to Direct Cell Positioning within Whole-Cell Cryo-Electron Tomography Workflows

Mikropattering overføring elektronmikroskopinett til direkte celleposisjonering i hele celler Cryo-Electron Tomography Arbeidsflyter

Whole-cell cryo-electron tomography (cryo-ET) is a powerful technology that is used to produce nanometer-level resolution structures of macromolecules ...

Quantification of Subcellular Glycogen Distribution in Skeletal Muscle Fibers using Transmission Electron Microscopy

Kvantifisering av subcellulær glykogenfordeling i skjelettmuskulaturfibre ved hjelp av transmisjonselektronmikroskopi

With the use of transmission electron microscopy, high-resolution images of fixed samples containing individual muscle fibers can be obtained. This ...

A Robust Single-Particle Cryo-Electron Microscopy (cryo-EM) Processing Workflow with cryoSPARC, RELION, and Scipion

A Robust Single-Particle Cryo-Electron Microscopy cryo-EM Processing Workflow with cryoSPARC, RELION, and Scipion

En robust kryo-elektronmikroskopi (cryo-EM) prosesseringsarbeidsflyt med kryoSPARC, RELION og scipion

Recent advances in both instrumentation and image processing software have made single-particle cryo-electron microscopy (cryo-EM) the preferred method ...

Advancing High-Resolution Imaging of Virus Assemblies in Liquid and Ice

Fremme høyoppløselig avbildning av virussamlinger i væske og is

Interest in liquid-electron microscopy (liquid-EM) has skyrocketed in recent years as scientists can now observe real-time processes at the nanoscale. It ...