Name: routine collection of high-resolution cryo-em datasets using 200 kv transmission electron microscope
Uploaded: 2022-03-16T14:00:00
Duration: 9 min 49 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Routine Collection of High-Resolution cryo-EM Datasets Using 200 KV Transmission Electron Microscope at JoVE.com

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	<li>Wang, J., Hua, T., Liu, Z. -. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+features+of+activated+GPCR+signaling+complexes.">Structural features of activated GPCR signaling complexes.</a> Current Opinions in Structural Biology. 63, 82-89 (2020).</li><li>Chen, S., Gouaux, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+mechanism+of+AMPA+receptor+-+auxiliary+protein+complexes.">Structure and mechanism of AMPA receptor - auxiliary protein complexes.</a> Current Opinions in Structural Biology. 54, 104-111 (2019).</li><li>K&#252;hlbrandt, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+mechanisms+of+F-Type+ATP+synthases.">Structure and mechanisms of F-Type ATP synthases.</a> Annual Review of Biochemistry. 88, 515-549 (2019).</li><li>Laverty, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo-EM+structure+of+the+human+&#945;1&#946;3&#947;2+GABA+A+receptor+in+a+lipid+bilayer.">Cryo-EM structure of the human &#945;1&#946;3&#947;2 GABA A receptor in a lipid bilayer.</a> Nature. 565 (7740), 516-520 (2019).</li><li>Liu, F., Zhang, Z., Csan&#225;dy, L., Gadsby, D. 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Sagar Khavnekar não relata conflitos de interesse. Os outros autores são funcionários da Thermo Fisher Scientific, a divisão MSD-EM.

O protocolo descrito pressupõe que a óptica do microscópio TEM usado está em um estado bem alinhado. Para os 200 kV TEM utilizados neste Protocolo, tais alinhamentos de coluna são feitos, verificados e salvos por um engenheiro de serviço experiente após a instalação do microscópio ou qualquer intervenção significativa do serviço. Essas configurações de alinhamento podem ser retiradas a qualquer momento na interface do microscópio. Os usuários podem usar os procedimentos de Alinhamento Direto na interface do microscópio UI para reejustar parâmetros críticos. Alguns alinhamentos, como inclinação de arma e troca de armas, são estáveis e não precisam ser ajustados pelos usuários diariamente. Verificações e re-alinhamentos (se necessário) de inclinação de arma e mudança pelo supervisor de microscópio são aconselhados duas vezes por ano. Por outro lado, alguns alinhamentos são críticos e devem ser alinhados antes de cada coleta de dados, conforme descrito no protocolo acima (como astigmatismo objetivo e alinhamento sem coma). Se a função Autocoma no software de análise não convergir, o alinhamento dos pontos de pivô de inclinação do feixe e/ou centro de rotação deve ser verificado e ajustado, e o centro correto da abertura C2 deve ser confirmado. Posteriormente, a função Autostigmate deve ser executada à medida que os estigmas objetivos também são usados para correção de coma. Esses alinhamentos devem ser iterados até que tanto o Autostigmate quanto o Autocomafunctions tenham sucesso em sua primeira iteração. Se necessário, outra área pode ser selecionada (por exemplo, suporte a folha de carbono sem gelo), desfoco ajustado por imagem ou tempo de aquisição de imagem aumentado para otimizar a relação sinal-ruído em imagens adquiridas e a visibilidade de múltiplos anéis Thon na transformação Fourier das imagens adquiridas.
Microscópios crio-EM modernos geram grandes quantidades de dados que muitas vezes excedem 1 TB por conjunto de dados para alcançar reconstruções 3D de alta resolução, particularmente para proteínas com baixa simetria. Os dados e os resultados crio-EM também são tipicamente complementados por dados e resultados de métodos ortogonais para entender completamente as relações estrutura-função em cada projeto científico. A organização dos dados coletados, sua transferência para um pipeline de processamento de imagens e o compartilhamento de uma reconstrução crio-EM resultante entre os colaboradores colocam requisitos adicionais sobre novos adotantes da metodologia crio-EM para configurar sua infraestrutura local de TI. Softwares de gerenciamento de dados, como o Athena, facilitam o armazenamento centralizado de dados adquiridos por qualquer instrumento ou software conectado operado por um usuário registrado. Dados e metadados armazenados são acessíveis usando uma interface simples do navegador da Web por vários usuários, que podem ter diferentes funções no projeto com diferentes direitos de acesso (seja como proprietário, colaborador ou visualizador) com base em suas credenciais de login e definição de compartilhamento de dados na configuração do Experimento. Essa digitalização dos fluxos de trabalho experimentais fornece meios para o compartilhamento de dados e metadados entre colaboradores sem duplicação desnecessária e aumenta a produtividade e rastreabilidade dos fluxos de trabalho usados. A implementação de uma estrutura geral e personalizável de projetos, experimentos e fluxos de trabalho em softwares de gerenciamento de dados é universal e permite a personalização e integração de experimentos ortogonais usando métodos complementares em um único banco de dados de projetos.
A seleção de áreas para a coleta de dados em uma grade crio-EM é fundamental para a aquisição bem-sucedida de conjuntos de dados de alta resolução. As grades Crio-EM produzidas com dispositivos tradicionais de congelamento de mergulho, como o Vitrobot (um sistema de vitrificação totalmente automatizado), normalmente exibirão um gradiente de espessura de gelo sobre a superfície da grade (Figura 4). Isso pode ser benéfico, pois a rede contém áreas com diferentes espessuras de gelo; no entanto, áreas com a espessura ideal do gelo para coleta de dados devem ser identificadas conforme descrito no protocolo acima. Uma grade crio-EM ideal deve conter o mínimo possível de contaminação de gelo de transferência e conter quadrados de grade suficientes com papel alumínio de suporte furado intacto. A coleta de dados em quadrados de grade que tenham rachaduras ou áreas quebradas não é recomendada, pois as imagens coletadas serão afetadas por uma deriva geral significativamente mais forte após a iluminação por um feixe de elétrons em comparação com os quadrados de grade com papel alumínio intacto. O excesso de gelo cristalino pode ocluir a maioria dos buracos de papel alumínio e/ou interferir no foco automático e tais quadrados de grade também devem ser evitados. Quadrados de grade com gelo fino geralmente exibem grandes áreas vítreas e muitos buracos de folha brilhante que são visíveis em uma imagem tirada usando a predefinição do Atlas. A ocorrência de gelo mais espesso perto de barras de grade é esperada e acrítica, pois os buracos de papel alumínio nessas áreas da grade quadrada são excluídos durante o processo de Seleção de Buracos. A presença de vários buracos vazios em um quadrado de grade pode significar que o gelo vítreo nos orifícios circundantes é extremamente fino e pode conter partículas danificadas ou nenhuma partícula. Geralmente, é sábio escolher quadrados de grade com uma variedade de espessuras de gelo em diferentes regiões da rede para triagem inicial e avaliação para entender quais áreas têm as melhores condições para coleta de dados de alta resolução e exibir a densidade ideal de partículas e distribuição de orientação. Para as amostras proteassentas apoF e 20S utilizadas neste estudo, as áreas com o gelo mais fino observável contêm as melhores condições para imagens de alta resolução dessas amostras.
Ao selecionar os orifícios automaticamente em todos os quadrados de grade selecionados usando o software de coleta de dados, é aconselhável executar a tarefa de execução de modelos em um orifício representativo em cada quadrado de grade para verificar e garantir que não foram escolhidos quadrados excessivamente grossos, nem excessivamente finos, nem inesperadamente não vitreous para coleta de dados. Durante a aquisição de dados, os principais indicadores de qualidade das imagens coletadas, como deriva de imagem e encaixe ctf, podem ser monitorados usando EQM. A coleta de dados pode então ser otimizada pulando áreas que produzem imagens de má qualidade. No entanto, imagens com ajustes ctf de alta resolução ainda podem conter imagens com partículas em algumas orientações preferidas ou partículas desnaturadas em uma camada de gelo muito fina. A colheita de partículas em tempo real e a classificação 2D de imagens coletadas forneceriam informações adicionais sobre a qualidade dos dados estruturais em partículas imagens e revelariam as orientações preferidas de partículas intactas no gelo ou estrutura inconsistente de partículas (parcialmente) desnaturadas. O cálculo das médias de classes pode, portanto, ajudar a refinar ainda mais regiões apropriadas para coleta de dados, como já foi implementado e mostrado em outros pacotesde software 23,28.
A seleção das configurações de imagem para aquisição de dados, como ampliação, taxa de dose de elétrons e intervalo de desfoco, depende de vários critérios, como a resolução de destino, tamanho da proteína, concentração de amostras, rendimento do microscópio desejado, etc. Para a câmera do detector de elétrons diretos usada nestes experimentos, a taxa de dose de elétrons foi escolhida na faixa de 4-5 e-/pix/s, selecionando um tamanho e intensidade SPOT apropriados para manter a iluminação paralela. Como mostrado na Tabela 1, um tamanho SPOT diferente pode ser usado na predefinição hole/eucentric Height para garantir a relação sinal-ruído suficiente na imagem para o centro de furos durante a coleta de dados. A ampliação deve ser escolhida de modo que o tamanho do pixel seja pelo menos 2-3x menor do que a resolução de destino para a reconstrução crio-EM. No entanto, a ampliação mais alta (ou seja, menor tamanho de pixel) é usada, o campo de visão menor é capturado em imagens, e há menos partículas por imagem, o que acaba levando a um tempo de coleta de dados mais longo para coletar imagens com partículas suficientes para reconstruir mapas 3D para uma alta resolução. Para a amostra apoF, utilizamos o tamanho do pixel de 0,43 Å, pois tínhamos concentração amostral suficiente para alta densidade de partículas em imagens e resolução sub-2 Å da reconstrução. Para a amostra proteasome 20S, usamos o tamanho do pixel de 0,68 Å para cobrir um campo de visão maior em imagens adquiridas. Normalmente para microscópios TEM de 200 kV, as imagens crio-EM são adquiridas na faixa de desfocus de 0,8 a 2,0 μm. No entanto, com a melhor relação contraste e sinal-ruído usando o filtro de energia, as aquisições de dados podem ser feitas muito mais perto de se concentrar para preservar melhor as informações de alta resolução em imagens adquiridas devido a aberrações menores e a decadência correspondentemente reduzida da função do envelope CTF. Também não usamos uma abertura objetiva, pois a abertura pode introduzir aberrações adicionais de imagem, enquanto o contraste de imagem já é suficientemente aprimorado usando o filtro de energia. Para as amostras proteassentas apoF e 20S, utilizou-se as configurações de desfoco de 0,5 μm, 0,7μm e 0,9 μm. Para proteínas menores (<200 kDa), utilizamos configurações de desfoco de -0,5 μm, -0,7 μm e -0,9 μm para melhorar o contraste das partículas e facilitar a colheita de partículas e alinhamento inicial grosseiro na etapa de refinamento 3D da reconstrução 3D, o que levou à resolução 3D de ~2,5 Å (resultados inéditos).
Já mostramos que a imagem com um filtro de energia melhora a relação sinal-ruído (SNR) em imagens crio-EM coletadas nos microscópios TEM de 300 kVhigh-end 11. De fato, quando os elétrons passam por uma amostra, dois tipos principais de interações ocorrem: i) Elétrons dispersos elásticos mantêm sua energia e contribuem para a formação de imagens por interferência com o feixe de incidentes não dispersos através do mecanismo de contraste de fase ii) elétrons inelasticamente dispersos perdem alguma energia na amostra e contribuem principalmente para o ruído nas imagens. Portanto, o SNR pode ser significativamente melhorado filtrando os elétrons inestaticamente dispersos, que têm energia menor do que o feixe de incidentes e elétrons dispersos esteticamente, usando uma fenda de energia estreita. No entanto, é fundamental usar um filtro de energia suficientemente estável, como o Selectris ou Selectris-X, para poder usar fendas muito estreitas (10 eV ou menores) ao longo (mais de 12 horas) de aquisição automatizada de dados de conjuntos de dados crioEM de alta resolução.
As imagens Crio-EM adquiridas com microscópios TEM de 200 kV nas mesmas condições que com microscópios TEM de 300 kV exibem SNR menor em alta resolução (particularmente <4 Å) devido à decadência mais rápida das funções do envelope CTF. Consequentemente, um maior número de partículas (e, portanto, um maior número de imagens coletadas) é necessário para alcançar uma certa resolução ao usar TEMs de 200 kV. Além disso, a profundidade de campo (10-25 nm na faixa de resolução 2-3 Å) também é cerca de 20% menor em imagens de 200 kV35, o que significa que menos partículas na camada de gelo (tipicamente de 20-50 nm de espessura) estarão totalmente em foco e contribuirão construtivamente para todas as características de alta resolução de uma reconstrução 3D calculada, a menos que os valores de desfocto sejam refinados para cada partícula independentemente nos estágios posteriores do procedimento de reconstrução 3D. Para partículas maiores (como virões icosaedrais ou outros conjuntos macromoleculares), o tamanho das partículas pode exceder a profundidade do campo em altas resoluções e introduzir erros de fase devido à aproximação planar da esfera Ewald nos algoritmos de reconstrução 3D padrão36. Esses erros podem ser refinados por algoritmos avançados que já são implementados em pacotes comuns de processamento de imagens crio-EM 37,28,39. Como a esfera Ewald tem maior curvatura em dados de 200 kV do que os dados de 300 kV, a correção da esfera de Ewald é necessária em resoluções relativamente menores e/ou para conjuntos macromoleculares relativamente menores ao usar TEMs de 200 kV. Por outro lado, imagens de 200 kV exibem maior contraste de partículas em gelo fino (20-50 nm) que é significativamente mais fino que o elétron de 200-300 keV caminho livre médio (220-280 nm). O contraste maior ajuda a melhorar o alinhamento global correto das partículas individuais, particularmente para dispersar fracamente proteínas menores cuja estrutura ainda não é conhecida, e o modelo de referência 3D ainda não está bem estabelecido.
Aqui, demonstramos no exemplo de um proteasome 20S que o contraste e a qualidade da imagem poderiam ser igualmente melhorados com um filtro de energia ao usar um microscópio TEM de 200 kV. Utilizando o mesmo número de partículas, os dados coletados usando a fenda de 20 eV foram reconstruídos para resolução de 2,26 Å em comparação com os dados coletados com a fenda de energia totalmente aberta que foi reconstruída apenas para resolução de 2,34 Å. A melhor reconstrução foi obtida a partir de dados coletados utilizando a fenda de 10 eV que foi reconstruída para resolução de 2,14 Å. Esses resultados estão de acordo com a previsão teórica de que a filtragem dos elétrons inestaticamente dispersos aumenta o SNR em imagens coletadas e facilita maior resolução nas reconstruções crio-EM a partir do determinado número de partículas, como resumido na Tabela 4. Esses resultados foram ainda confirmados pelos fatores B calculados a partir desses conjuntos de dados que indicam maior qualidade das imagens nos conjuntos de dados filtrados por energia.
Podemos, portanto, concluir que, embora os microscópios TEM de 300 kV ofereçam o maior rendimento e a maior resolução possível em reconstruções crio-EM, os microscópios TEM de 200 kV também fornecem conjuntos de dados de alta qualidade para reconstruções crio-EM de alta resolução. Mostramos aqui que a qualidade das imagens adquiridas e, portanto, o tempo geral para estrutura, pode ser melhorada usando o TEM de 200 kV equipado com um filtro de energia e um detector de elétrons direto. O Protocolo apresentado descreve todas as etapas necessárias sobre como obter rotineiramente dados crio-EM de alta resolução usando esta configuração e revelar detalhes estruturais finos das estruturas 3D macromoleculares, que são essenciais para entender as principais relações estruturais-funções na biologia estrutural e no design de medicamentos baseados em estruturas.

A determinação da estrutura proteica é fundamental para entender a arquitetura molecular, a função e a regulação dos complexos proteicos envolvidos nos principais processos celulares, como metabolismo celular, transdução de sinais ou interações hospedeiro-patógeno. A microscopia crio-elétron (crio-EM) emergiu como uma técnica poderosa capaz de resolver a estrutura 3D de muitas proteínas e seus complexos que eram muito desafiadores para as técnicas estruturais tradicionais, como difração de raios-X e espectroscopia de NMR. Particularmente, a crio-EM tem sido comprovada como o método de escolha para proteínas de membrana, que não podem ser prontamente cristalizadas ou preparadas em quantidades suficientes para as técnicas estruturais tradicionais, e forneceu novas percepções sobre a estrutura e função de importantes receptores celulares e canais de íons 1,2,3,4,5 . Mais recentemente, a crio-EM desempenhou um papel importante no combate à pandemia Covid-19, determinando o mecanismo da infecção pelo SARS-CoV-2 no nível molecular, que elucidou as origens da doença de Covid-19 e forneceu a base para o rápido desenvolvimento de vacinas eficientes e terapêuticas 6,7,8,9,10.
Normalmente, microscópios eletrônicos de transmissão de 300 kV high-end (TEM) são usados para determinação de estrutura de alta resolução de biomoléculas por análise de partículas únicas crio-EM (SPA) para revelar sua conformação e interações. Recentemente, a técnica SPA atingiu uma nova fronteira quando a amostra de referência comum crio-EM apo-ferritin foi reconstruída em resolução atômica (1.2 Å)11,12 usando um TEM de 300 kV equipado com a pistola de emissão de campo frio (E-CFEG), um detector de elétrons direto e um filtro de energia. Nesta resolução, foi possível resolver inequivocamente posições de átomos individuais na estrutura, conformação de cadeias laterais de aminoácidos individuais, bem como ligação de hidrogênio e outras interações, que abrem novas possibilidades para a descoberta de medicamentos baseado em estrutura de novos alvos e otimização de candidatos a medicamentos existentes.
Microscópios TEM de médio alcance de 200 kV são frequentemente usados para triagem de amostras e otimização de amostras antes da coleta final de dados de alta resolução usando os microscópios TEM high-end, particularmente em instalações maiores crio-EM. Normalmente, amostras de imagem podem ser resolvidas na faixa de resolução de 3-4 Å que é suficiente para mover-se para um TEM de 300 kV high-end para coleta final de dados. Consequentemente, a coleta de dados usando o TEM de 200 kV muitas vezes não é mais otimizada para os resultados de resolução mais altos possíveis. Além disso, muitas questões biológicas interessantes já podem ser respondidas e publicadas nessas resoluções, pois todas as cadeias laterais de aminoácidos já estão resolvidas, e a ocupação de locais de ligação de ligantes também pode ser determinada de forma confiável13. Já foi demonstrado que tems de 200 kV podem alcançar resoluções além de 3 Å para inúmeras amostras 14,15,16,17,18. Imagens tiradas a 200 kV exibem contraste inerentemente maior de partículas de imagem, o que pode até facilitar um alinhamento inicial mais preciso das partículas, apesar do sinal mais atenuado em alta resolução em comparação com as imagens TEM de 300 kV. É importante notar que a resolução alcançada de mapas crio-EM reconstruídos também é limitada pela flexibilidade estrutural e heterogeneidade conformacional das amostras imagens, o que impacta tanto as reconstruções de 200 kV quanto de 300 kV. Na verdade, muito mais reconstruções crio-EM obtidas usando os sistemas de 300 kV foram resolvidas na faixa de resolução 3-4 Å do que em resoluções mais altas19. Como os microscópios TEM de 200 kV são menos complexos e se encaixam em salas menores, esses microscópios representam uma boa opção de menor custo para a determinação da estrutura de macromoléculas biológicas por crio-EM, preservando a automação de coleções de dados longas de várias amostras armazenadas dentro do sistema de microscópio Autoloader.
A coleta de conjuntos de dados crio-EM para determinação da estrutura de alta resolução requer um alinhamento preciso da óptica do microscópio. Os alinhamentos das colunas prosseguem sistematicamente da fonte eletrônica até o sistema de lentes condensadoras, a lente objetiva e o filtro de energia com um detector de elétrons. A sequência completa de alinhamentos normalmente não é necessária. Quando necessário, o usuário é guiado por procedimentos semi-automatizados com uma descrição adequada de cada etapa em uma janela de ajuda consciente do contexto durante todo o procedimento de alinhamento na interface do usuário do microscópio (painel de controle de Alinhamentos Diretos). Uma vez que o microscópio está totalmente alinhado, a óptica eletrônica permanece estável, e os alinhamentos não precisam ser alterados por pelo menos alguns meses. Apenas os alinhamentos mais sensíveis, como a iluminação paralela do plano amostral, o astigmatismo objetivo e o alinhamento sem coma, devem ser refinados pouco antes de iniciar a coleta de cada conjunto de dados. A qualidade dos dados coletados pode então ser monitorada durante a coleta de dados usando diferentes pacotes de software, como EPU Quality Monitor, crioSPARC Live20, Relion21, Scipion22, WARP23 ou Appion24.
Além de alinhamentos precisos do microscópio, a alta qualidade de amostras bem purificadas com heterogeneidade conformacional e composicional mínima também é um pré-requisito para a coleta de conjuntos de dados de alta resolução e resolução de estruturas de alta resolução. Mais detalhes sobre protocolos típicos, desafios frequentes e possíveis remédios podem ser encontrados em outras revisões dedicadas a este tópico 25,26,27. Essencialmente, é fundamental encontrar áreas em uma determinada grade crio-EM que tenha gelo suficientemente fino para preservar informações de alta resolução, e partículas individuais são densamente distribuídas em orientações aleatórias sem sobreposições. No entanto, as grades crio-EM típicas têm espessura de gelo não uniforme e, portanto, é importante encontrar e selecionar as áreas ideais para imagens. Diferentes meios para estimativa de espessura de gelo na rede estão disponíveis em pacotes de software dedicados à coleta automatizada de conjuntos de dados crio-EM, como EPU 2, Leginon28 ou SerialEM29.
O advento de detectores de elétrons diretos rápidos e sensíveis possibilitou a coleta de imagens em muitas frações como filmes que permitiram a compensação dos movimentos induzidos pelo feixe e resultaram em um aumento substancial na qualidade e quantidade de dados usados no processamento de imagens e na reconstrução 3D final30. Ao mesmo tempo, a automação e a coleta de dados de alto rendimento fornecem enormes conjuntos de dados com milhares de imagens/filmes que representam desafios para armazenamento e acesso de dados. O modelo adotado com grandes instalações crio-EM que atendem dezenas a centenas de usuários, especialmente solicita o gerenciamento de dados organizado com rastreamento adequado e compartilhamento de dados em dutos crio-EM estabelecidos31,32.
Este estudo descreve um protocolo para coleta de rotina de conjuntos de dados crio-EM de alta resolução usando o microscópio DE 200 kV Glacios TEM. Os alinhamentos necessários da óptica do microscópio são descritos juntamente com procedimentos para avaliação de amostras crio-EM e seleção de áreas adequadas para coleta de dados de alta resolução. A organização de dados coletados e metadados relacionados com informações amostrais é demonstrada na Athena - uma plataforma de gerenciamento de dados que facilita a revisão das informações amostrais e dados coletados. Usando a amostra de apo-ferritina do mouse, foi possível alcançar uma reconstrução 3D a 1,6 Å resolução13. Usando o protocolo descrito, também reconstruímos o mapa de densidade 3D do proteasome 20S a partir de Thermoplasma acidophilum com resolução de 2,1 Å.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>AutoGrid rings</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>1036173</td>
			<td>Package of 100x AutoGrid rings for the standard EM grids.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C-Clip</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>1036171</td>
			<td>Package of 100 clips that secure 
			the standard EM grids inside the AutoGrid rings.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Data Management Platform</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>1160939</td>
			<td>Part of the Glacios base configuraiton; includes Athena Software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EPU Quality Monitor</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>1179770</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EPU Software</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>1025080</td>
			<td>Part of the Glacios base configuration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethane 3.5</td>
			<td>Westfalen</td>
			<td>A06010110</td>
			<td>Ethane gas used for making liquid ethane (puritiy at least N35, i.e. 99.95% vol)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 4 200kV</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>1166936</td>
			<td>Direct electron detector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glacios</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>1149551</td>
			<td>200 kV TEM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GloQube Plus Glow Discharge System for TEM Grids and surface modification</td>
			<td>Quorum</td>
			<td>N/A</td>
			<td>also available via Thermo Fisher Scientific (PN 1160602)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuantiFoil grids</td>
			<td>Quantifoil</td>
			<td>N/A</td>
			<td>R-2/1, 300 mesh; carbon foil grid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Relion</td>
			<td>MRC Laboratory of Molecular Biology</td>
			<td>N/A</td>
			<td>open source software: 
			https://relion.readthedocs.io/en/release-3.1/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Selectris with Falcon 
			4 for 200 kV</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>1191753</td>
			<td>Energy filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Selectris X with Falcon 
			4 for 200 kV</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>1191755</td>
			<td>Energy filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltrAuFoil grids</td>
			<td>Quantifoil</td>
			<td>N/A</td>
			<td>R-1.2/1.2, 300 mesh; gold foil grids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vitrobot Mk. IV</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>1086439</td>
			<td>Automated vitrification system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman 595 filter paper</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AA00420S</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

routine collection of high-resolution cryo-em datasets using 200 kv transmission electron microscope

A microscopia crio-elétron (crio-EM) foi estabelecida como um método rotineiro para a determinação da estrutura proteica durante a última década, tomando uma parcela cada vez maior dos dados estruturais publicados. Os recentes avanços na tecnologia e automação TEM aumentaram tanto a velocidade de coleta de dados quanto a qualidade das imagens adquiridas, ao mesmo tempo em que diminuíram o nível de experiência necessário para a obtenção de mapas crio-EM em resoluções sub-3 Å. Embora a maioria dessas estruturas de alta resolução tenha sido obtida usando sistemas crio-TEM de última geração de 300 kV, estruturas de alta resolução também podem ser obtidas com sistemas crio-TEM de 200 kV, especialmente quando equipadas com um filtro de energia. Além disso, a automação de alinhamentos de microscópios e coleta de dados com avaliação da qualidade da imagem em tempo real reduz a complexidade do sistema e garante configurações ideais de microscópio, resultando em aumento do rendimento de imagens de alta qualidade e rendimento geral da coleta de dados. Este protocolo demonstra a implementação de recentes avanços tecnológicos e recursos de automação em um microscópio eletrônico criotransiência de 200 kV e mostra como coletar dados para a reconstrução de mapas 3D suficientes para a construção do modelo atômico de Novo . Focamos nas melhores práticas, variáveis críticas e questões comuns que devem ser consideradas para permitir a coleta rotineira de tais conjuntos de dados crio-EM de alta resolução. Particularmente os seguintes tópicos essenciais são revisados em detalhes: i) automação de alinhamentos de microscópio, ii) seleção de áreas adequadas para aquisição de dados, iii) parâmetros ópticos ideais para coleta de dados de alta qualidade, coleta de dados de alto rendimento, iv) ajuste de filtro de energia para imagem de perda zero e v) gerenciamento de dados e avaliação da qualidade. A aplicação das melhores práticas e melhoria da resolução alcançável usando um filtro de energia será demonstrada no exemplo da apo-ferritin que foi reconstruída a 1,6 Å, e thermoplasma acidophilum 20S proteasome reconstruída à resolução 2.1-Å usando um TEM de 200 kV equipado com um filtro de energia e um detector de elétrons direto.

O portal de gerenciamento de dados fornece armazenamento eficiente e estruturado de imagens coletadas, dados e metadados de vários fluxos de trabalho experimentais em uma única plataforma de software. Cada experimento definido em um projeto criado consiste em um fluxo de trabalho com etapas definidas pelo cliente para capturar informações amostrais, dados coletados e metadados relacionados sem quaisquer restrições para fornecer flexibilidade máxima e usabilidade para quaisquer experimentos possíveis e todos os casos de uso (Figura 1, Figura 2). O portal de gerenciamento de dados também possui uma funcionalidade de nota de laboratório para ilustrar etapas de fluxo de trabalho, incluindo o processamento de imagens com resultados intermediários, que podem estar todos associados a um projeto e fornecer o máximo de registro possível para análise e criação de relatórios e publicações.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63519/63519fig01.jpg"> Figura 1: Exemplo de possível organização de dados e metadados na plataforma de gerenciamento de dados. Cada projeto pode consistir em vários experimentos, como crio-EM ou espectroscopia em massa (viz. Protocolo passo 2.3). Cada experimento pode incluir vários fluxos de trabalho definidos pelo usuário (viz. Protocolo passo 2.5), cada um consistindo de múltiplas etapas configuráveis (viz. Protocolo passo 2.7). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63519/63519fig01large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63519/63519fig02.jpg"> Figura 2: Veja um fluxo de trabalho de projeto aberto na plataforma de gerenciamento de dados. A figura mostra metadados associados e notas à etapa aberta no fluxo de trabalho. A barra esquerda com ícones fornece acesso rápido a diferentes opções e menus da plataforma de gerenciamento de dados. O painel esquerdo inclui uma lista de fluxos de trabalho salvos (mostrado apenas um fluxo de trabalho salvo "Exp2_ApoF_EFTEM_Grid7") e um botão azul para adicionar um novo Fluxo de Trabalho. O painel central mostra etapas individuais no Fluxo de Trabalho aberto, como é mostrado para o fluxo de trabalho SPA aqui. O botão azul no canto superior direito pode adicionar um passo adicional ao fluxo de trabalho aberto. O painel direito inclui espaço para metadados gravados ou notas de entrada de usuário do fluxo de trabalho, que podem incluir texto, tabelas e imagens. Diferentes opções de formatação para o texto estão disponíveis. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63519/63519fig02large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
As grades Crio-EM produzidas com dispositivos tradicionais de congelamento de mergulho, como o Vitrobot, normalmente exibirão um gradiente de espessura de gelo sobre a superfície da rede. Algumas grades também podem ser danificadas (dobradas) após o manuseio manual e/ou o corte em um porta-anéis com raiva automática. A Figura 3 mostra exemplos de diferentes grades, como mostrado na visão geral do Atlas. As grades com gelo espesso ou danos devem ser excluídas de investigações mais aprofundadas.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63519/63519fig03.jpg"> Figura 3: Galeria de diferentes grades como visto na visão geral do Atlas. (A) Uma grade ruim com gelo espesso, (B) uma grade dobrada com má contaminação de gelo e gelo, (C) uma grade aceitável com bom gradiente de gelo, (D) uma grade típica com gelo fino bom e pequeno gradiente de gelo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63519/63519fig03large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
A seleção de quadrados de grade sem danos e espessura de gelo ideal é fundamental para a coleta de conjuntos de dados de alta resolução. A espessura do gelo pode variar mesmo no nível de quadrados de grade individuais, e é, portanto, importante selecionar apenas orifícios com gelo fino de cada quadrado de grade selecionado. A Figura 4 mostra um quadrado de grade adequado com papel alumínio intacto e gelo fino no centro. O quadrado de grade mostrado é bom para definir um filtro para seleção automatizada de orifícios com gelo fino em todos os quadrados de grade selecionados, pois contém uma gama de diferentes espessuras de gelo, bem como buracos vazios sem gelo, o que é extremamente útil para definir uma faixa apropriada de intensidade no filtro de gelo na tarefa de seleção de buracos.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63519/63519fig04.jpg"> Figura 4: Um exemplo quadrado de grade com um gradiente de espessura de gelo, de quadrados de grade vazios no centro e gelo espesso perto das barras de grade. O filtro de qualidade do gelo pode ser usado para selecionar a faixa de intensidades dentro dos orifícios com a espessura ideal de gelo que são assim selecionadas no quadrado da grade (os orifícios com sobreposição verde). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63519/63519fig04large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
Os resultados de benchmark utilizando o protocolo descrito foram obtidos utilizando-se a amostra de apo-ferritina de rato (apoF) do grupo Kikkawa11. ApoF é uma proteína altamente α helical que forma uma gaiola octaédral muito estável. A alta estabilidade e alta simetria fazem do ApoF uma amostra ideal para imagens crio-EM de alta resolução e processamento de imagens. A ApoF tornou-se, portanto, uma amostra padrão para avaliar o desempenho dos instrumentos crio-EM 11,12,13. Uma alíquota congelada contendo 15 mg/mL purificada amostra de apoF foi descongelada no gelo e esclarecida por centrifugação a 10.000 x g por 10 min. O supernante foi diluído para 5 mg/mL com 20 mM HEPES pH 7,5, 150 mM NaCl. 3 μL da amostra diluída foi aplicado em uma R-1.2/1.3, 300 grades de ouro de malha para 30 s. Em seguida, as grades foram borradas por 5 s antes de mergulhar congelando em etano líquido resfriado por nitrogênio líquido. O congelamento foi realizado utilizando um sistema de vitrificação totalmente automatizado a 100% de umidade e 4 °C. Todas as grades foram cortadas em autogrids e carregadas em um Cryo-TEM de 200 kV. Cerca de 3000 filmes foram coletados em um throughput de 300 filmes/h. Os dados foram processados utilizando-se os métodos descritos11 com as seguintes modificações: i) A versão Relion 4-beta foi usada em vez de Relion 3.1, ii) a coleta automatizada de partículas foi feita utilizando-se médias de classe 2D de reconstruções apoF anteriores como referências, e iii) o modelo 3D inicial foi gerado a partir da reconstrução apoF anterior baixamente aprovada para resolução de 15-Å. O agrupamento óptico não foi feito para este conjunto de dados, pois o procedimento AFIS34 usado tem sido comprovado para minimizar de forma eficiente e confiável mudanças de fase induzidas por inclinação de feixe que não limitam a qualidade dos dados para reconstruir mapas 3D nas resoluções relatadas. O refinamento 3D após o polimento bayesiano e o refinamento CTF levaram a um mapa de resolução de 1,68 Å. A resolução foi melhorada com a correção da esfera de Ewald resultando em um mapa de resolução de 1,63 Å. A visão geral dos parâmetros de coleta e processamento de dados é mostrada na Tabela 2, e o mapa final de densidade reconstruída é mostrado na Figura 5, com a curva Fourier Shell Correlation (FSC) mostrada na Figura Suplementar 8.
Tabela 2: Parâmetros de coleta de dados e processamento de imagens utilizados para a reconstrução 3D da apo-ferritin. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63519/Table%202-63519R2.xlsx" target="_blank">Clique aqui para baixar esta Tabela.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63519/63519fig05.jpg"> Figura 5: Reconstrução crio-EM de apo-ferritin. (Painel esquerdo) renderização 3D do mapa crio-EM reconstruído apoF com resolução de 1,6 Å. (Painel direito) Visão detalhada do mapa reconstruído ao nível de cadeias laterais de aminoácidos individuais. A densidade de sidechains de aminoácidos é bem resolvida, e o modelo atômico pode ser inequivocamente construído dentro deste mapa. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63519/63519fig05large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
Os efeitos e benefícios do uso de um filtro de energia nas reconstruções de SPA foram avaliados utilizando-se o proteasome procariótico 20S isolado de T. acidophilum. O proteasome procariótico 20S também tem sido usado como uma amostra crio-EM padrão, pois representa o núcleo catalítico estável do complexo proteasome com a simetria D7. As grades foram preparadas adicionando 4,5 μL da amostra purificada de proteasome T. acidophilum 20S em uma grade de cobre R 2/1 de tiragem de brilho. As amostras foram vitrificadas em uma mistura líquida de etano/propano utilizando um sistema de vitrificação totalmente automatizado definido para 4 °C e 100% de umidade com força de mancha de 20 e tempo de mancha de 4,5 s.
Três conjuntos de dados diferentes foram coletados da mesma grade crio-EM com quadrados de grade semelhantes usando uma largura de fenda diferente do filtro de energia na ordem: i) fenda totalmente aberta (sem fenda inserida), ii) 20 eV fenda e iii) 10 eV fenda. Os quadrados de grade foram selecionados usando um filtro de qualidade de gelo dentro do software de análise. Todos os outros parâmetros para coleta de dados e processamento de dados foram mantidos os mesmos. Os conjuntos de dados foram coletados por 15 h com um total de 4000 filmes e processados usando os métodos descritos11 usando o Relion 3.1 com a modificação de que o algoritmo de colheita de partículas laplaciana-da-gaussiana foi usado para produzir médias iniciais de classe 2D para a coleta de partículas baseadas em referência a partir dos conjuntos de dados completos. O mesmo número (102.200) de partículas selecionadas aleatoriamente foi escolhido e utilizado para a iteração final e reconstrução 3D de cada conjunto de dados. As variáveis de processamento de dados estão descritas na tabela (Tabela 3) abaixo para alcançar o mapa final de densidade EM reconstruído mostrado na Figura 6 com a curva FSC mostrada na Figura Suplementar 9. O agrupamento óptico e a correção da esfera de Ewald também não foram feitos para esses conjuntos de dados.
Tabela 3: Parâmetros de coleta de dados e processamento de imagem utilizados para a reconstrução 3D do proteasome T. acidophilum 20S. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63519/Table%203-63519R2.xlsx" target="_blank">Clique aqui para baixar esta Tabela.</a>
Tabela 4: Resumo da resolução alcançada e fator B para reconstruções crio-EM do proteasome T. acidophilum 20S usando conjuntos de dados com largura de fenda de energia diferente. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63519/Table%204-63519R2.xlsx" target="_blank">Clique aqui para baixar esta Tabela.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63519/63519fig06.jpg"> Figura 6: Efeito da filtragem de energia em imagens crio-EM. (A) Imagens Cryo-EM em diferentes valores de desfoco coletados com ou sem fenda de 10 eV. (B) Visão geral do mapa crio-EM proteasome 20S com subunidades segmentadas. (C) Versá-lo zoom no mapa proteasome 20S com um modelo atômico equipado. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63519/63519fig06large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
Figura suplementar 1: Calibração da tarefa de mudança de imagem (elipse amarela) para alinhar mudanças de imagem entre diferentes predefinições ópticas (elipses vermelhas) no software de análise, usando um cristal de gelo hexagonal que é visível na faixa de ampliação total entre 100x e 165.000x. (Topo) Calibração entre as predefinições de aquisição de dados e predefinições de altura (média) (média) entre as predefinições hole/eucentric Height e Grid Square, (inferior) calibração entre as predefinições grid Square e Atlas. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63519/SuppFigure01_rev01_EPUalign-Final.pdf" target="_blank">Clique aqui para baixar este Arquivo.</a>
Figura suplementar 2: Função autostigmate no software de análise (elipse amarela). (Imagem à esquerda) Imagem adquirida. (Imagem correta) Transferência de fourier da imagem adquirida mostrando anéis Thon concêntricos e seu ajuste CTF mostrado em feixes radiais. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63519/SuppFigure02_rev01_EPUastigmatism-Final.pdf" target="_blank">Clique aqui para baixar este Arquivo.</a>
Figura suplementar 3: Interface de usuário da função Autocoma em software de análise (elipse amarela) para alinhamento coma. O painel de imagens mostra imagens de transferência de Fourier adquiridas em diferentes inclinações de feixe e seus ajustes ctf que são usados para o cálculo do coma. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63519/SuppFigure03_rev01_EPUcoma-Final.pdf" target="_blank">Clique aqui para baixar este Arquivo.</a>
Figura suplementar 4: Interface de usuário da sintonia do filtro de energia. Exemplo de um bom relatório de sintonia da isoquimalidade do filtro de energia com todos os parâmetros (mostrados em texto verde) dentro das especificações. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63519/SuppFigure04_rev01_Sherpa_isochromacity%20-final.pdf" target="_blank">Clique aqui para baixar este Arquivo.</a>
Figura suplementar 5: Interface de usuário da sintonia do filtro de energia. Exemplo de bom relatório de ajuste das distorções de ampliação do filtro de energia com todos os parâmetros (mostrados em texto verde) dentro das especificações. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63519/SuppFigure05_rev01_Sherpa_mag-distortions-Final.pdf" target="_blank">Clique aqui para baixar este Arquivo.</a>
Figura suplementar 6: Interface de usuário da sintonia do filtro de energia. Exemplo de boa sintonia das distorções cromáticas do filtro de energia com todos os parâmetros (mostrados em texto verde) dentro das especificações. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63519/SuppFigure06_rev01_Sherpa_chrom-distortions-Final.pdf" target="_blank">Clique aqui para baixar este Arquivo.</a>
Figura suplementar 7: Painel DataViz do EPU Quality Monitor com uma visão geral da qualidade dos dados em um conjunto de dados crio-EM coletado. Os gráficos com dados agregados de todas as imagens/filmes coletados mostram valores (parcelas de pontos) e distribuição (parcelas de barra) de indicadores de qualidade crítica selecionados, como o CTF fit confidence (azul), defocus (laranja) e astigmatismo (verde). Um subconjunto das imagens/filmes coletados pode ser selecionado definindo filtros de parâmetro na parte superior do painel DataViz. Após a aplicação dos filtros, imagens/filmes selecionados podem ser exportados para processamento posterior em outro pacote de processamento de imagem, como Relion ou CryoSpark. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63519/SuppFigure07_rev01_DataViz.tif" target="_blank">Clique aqui para baixar este Arquivo.</a>
Figura suplementar 8: Curva FSC da reconstrução final da resolução apoF para 1,6 Å, conforme relatado pelo Relion 4-beta. A curva azul mostra o FSC de mapas 3D mascarados de duas reconstruções 3D refinadas independentemente de dois conjuntos de meio-dados mutuamente exclusivos. De acordo com o padrão-ouro FSC em 0,143, a resolução do mapa 3D final reconstruído a partir do conjunto de dados completo corresponde a 1,6 Å. A curva laranja mostra o FSC das reconstruções 3D mascaradas com fases aleatórias. A queda rápida da curva FSC indica que a máscara usada não contribuiu para o FSC observado dos mapas original reconstruídos (curva azul) além da resolução ~2 Å. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63519/SuppFigure08_rev01_FSC_apoF.tif" target="_blank">Clique aqui para baixar este Arquivo.</a>
Figura suplementar 9: Curvas FSC da reconstrução final do proteasome T. acidphilum 20S utilizando diferentes larguras de fenda do filtro de energia, conforme relatado pelo Relion 3.1. As curvas azuis mostram o FSC de mapas 3D mascarados de duas reconstruções independentemente refinadas a partir de dois conjuntos de meio-dados de cada conjunto de dados, respectivamente. O FSC padrão-ouro em 0,143 indica as resoluções alcançadas dos mapas 3D finais reconstruídos a partir dos respectivos conjuntos de dados completos (resolução 2.3 Å, 2.2 Å e 2.1 Å, respectivamente). As curvas vermelhas mostram o FSC de mapas mascarados com fases aleatórias. A queda rápida das curvas FSC vermelhas indica que a máscara usada não contribuiu para o FSC dos mapas originais reconstruídos além da resolução ~3 Å. As curvas verdes mostram o FSC de mapas 3D desmascarados, que são influenciados pelo ruído em todo o volume 3D reconstruído e, portanto, caem mais cedo que o FSC dos mapas 3D mascarados. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63519/SuppFigure09_rev02_T20S_FSCs.tif" target="_blank">Clique aqui para baixar este Arquivo.</a>
Disponibilidade de dados: Os mapas de densidade crio-EM foram depositados no EM Data Bank sob números de adesão: apoferritina: EMD 14173, EMPIAR-10973. 20S proteasome: EMD 14467, EMPIAR-10976.

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Routine Collection of High-Resolution cryo-EM Datasets Using 200 KV Transmission Electron Microscope

Mapas crio-EM de alta resolução de macromoléculas também podem ser alcançados usando microscópios TEM de 200 kV. Este protocolo mostra as melhores práticas para definir alinhamentos ópticos precisos, esquemas de aquisição de dados e seleção de áreas de imagem que são essenciais para a coleta bem-sucedida de conjuntos de dados de alta resolução usando um TEM de 200 kV.

Coleta rotineira de conjuntos de dados crio-EM de alta resolução usando microscópio eletrônico de transmissão de 200 KV

Cryo-electron microscopy (cryo-EM) has been established as a routine method for protein structure determination during the past decade, taking an ...

O Crio-EM tornou-se uma técnica padrão para a determinação da estrutura de proteínas e seus complexos. Este protocolo descreve as melhores práticas de como obter conjuntos de dados Cryo-EM de alta resolução a partir dos microscópios TEM de 200 kV de gama média. O Crio-EM pode determinar a estrutura proteica em condições quase nativas em solução para vários estados conformacionais e estados funcionais simultaneamente, o que é evasivo para outras técnicas estruturais.Informações estruturais obtidas podem ser utilizadas para a elucidação de mecanismos moleculares da função proteica, bem como para o desenho de medicamentos baseados em estruturas. Por exemplo, uma publicação recente na estrutura de fibrilas amiloides revelou vários locais de ligação de um ligante vital. No entanto, neste protocolo, usamos as amostras padrão de apoferritina e proteasome para demonstrar os passos críticos na obtenção de dados Cryo-EM de alta resolução.A operação de um Crio-TEM tornou-se mais fácil nos últimos anos, especialmente devido à introdução de recursos avançados de automação. No entanto, para a primeira sessão, aconselhamos que você tenha um treinamento com usuários mais experientes. A partir daí, a progressão na técnica é relativamente rápida.Demonstrando o procedimento estará Adrian Koh, que é cientista sênior de aplicação da Thermo Fisher Scientific. Insira grades automáticas no do carregador automático em condições de nitrogênio líquido. Insira o com grades automáticas em uma cápsula de transferência de nitrogênio líquido resfriado.Insira ainda a cápsula no microscópio e clique no botão Dock na interface do microscópio UI para carregar o da cápsula no carregador automático do microscópio. Clique no botão Inventário para verificar a presença de grades automáticas no carregado. Em seguida, clique nos botões Carregar e Descarregar para inserir as grades automáticas na coluna para imagens TEM.Selecione a guia Atlas e clique no botão Nova Sessão para abrir uma nova sessão. Preencha detalhes como nome da sessão e localização de armazenamento de dados e clique no botão Aplicar. Selecione as grades de interesse selecionando uma caixa de seleção ao lado do número de grade correspondente.Clique no botão Iniciar para iniciar uma coleção totalmente automatizada de atlas de todas as grades selecionadas. Quando a coleção for concluída, clique em etiquetas de grade para revisar os atlases adquiridos. Selecione a guia EPU e vá para Nova Sessão para criar uma nova sessão no painel esquerdo.Selecione a opção Nova sessão para usar as predefinições ópticas do conjunto atual. Preencha o nome da sessão. Selecione o tipo manual da sessão para ter controle sobre a seleção de furos individuais e quadrados de grade selecionados para coleta de dados posteriormente no protocolo.Selecione o modo de aquisição mais rápido para usar a mudança de imagem livre de aberração para coleta de dados. Em seguida, digite o local para salvar os metadados. Clique no botão Aplicar para criar uma nova sessão.Selecione a tarefa de seleção quadrada no painel esquerdo para mostrar o atlas coletado da grade. Identifique os quadrados da grade com papel alumínio de suporte intacto sem danos, gelo fino e buracos de papel alumínio, contaminação de gelo cristalino insignificante no quadrado da grade e gradiente de brilho mínimo em toda a grade quadrada e dentro de buracos de folha individuais. Selecione os quadrados de grade para coleta de dados, seja no atlas completo ou em imagens de ladrilhos de alta qualidade.Clique com o botão direito do mouse em um quadrado de grade de interesse e escolha toda a tarefa de seleção. Clique no botão Auto Eucentric para mover-se automaticamente para o primeiro quadrado de grade selecionado. Ajuste a altura eucêntrica e adquira uma imagem quadrada da grade para encontrar furos de papel alumínio.Clique no botão Encontrar buracos para encontrar furos de papel alumínio na imagem. Clique no botão Remover buracos para fechar o botão da barra de grade para desmarcar orifícios perto das barras de grade. Ajuste os limites no histograma de brilho do filtro de gelo para remover todos os orifícios com gelo muito grosso e todos os orifícios vazios.Clique com o botão direito do mouse em um buraco na imagem quadrada da grade e selecione mover o estágio para o local mover o palco aqui. Selecione a tarefa de definição de modelo no painel esquerdo. Clique no botão Adquirir para adquirir uma imagem inteira.Defina os valores para atraso após a mudança de imagem para 0,5 segundos e atraso após o turno para cinco segundos. Clique no botão Encontrar e Centralizar para centralizar um buraco na imagem. Selecione o botão Adicionar área de aquisição e clique na imagem para selecionar o local no buraco centrado onde será feita a aquisição de imagens de alta ampliação.Selecione o botão Adicionar área de foco automático e clique na imagem para selecionar o local na folha de suporte ao lado do orifício centralado onde o foco automático da imagem será realizado. Clique na área de aquisição verde para definir uma sequência de valores de desfocado na lista de desfocus na seção superior da janela de software. Depois de definir as configurações específicas do foco automático, escolha a opção Depois de centralizar para focar automaticamente no início de cada cluster AFIS.Escolha a opção Lente Objetiva para foco automático mais rápido e redução de fase de deriva. Clique no botão Preparar todos os quadrados na tarefa de seleção de furos para definir automaticamente a coleta de dados e todos os outros quadrados de grade selecionados de acordo com as configurações usadas neste primeiro quadrado de grade. Selecione a tarefa de definição de modelo, adquira uma nova imagem, mova o palco para uma área limpa na folha de carbono pelo clique com o botão direito do mouse e selecione a opção de menu mover o estágio aqui.Selecione a guia Funções automáticas. Depois de definir o desfoco e iterado desejados, mude para a predefinição de foco automático e clique no botão iniciar para executar a função de foco automático. Selecione a tarefa Autostigmate, mude para a predefinição do anel de Thon e pressione o botão Iniciar.Selecione a tarefa Autocoma e pressione o botão Iniciar. Mova o palco para uma área com uma grade quebrada quadrada. Confirme a transparência da área tirando uma única imagem de foco automático.Abra a interface do usuário Sherpa e selecione o aplicativo Filtro de Energia. Clique no botão Centro e na opção de perda zero para centralizar a fenda do filtro de energia de perda zero. Clique no botão Sintonizar na opção isochromaticity.Clique na opção Ampliação de sintonia e distorções de sintonia nas distorções geométricas e cromáticas. Vá para a guia EPU, selecione a tarefa Aquisição Automatizada e clique no botão Iniciar Execução para iniciar a coleta de dados totalmente automatizada. A figura mostra grades Cryo-EM exibindo um gradiente de espessura de gelo sobre a superfície da grade.As grades excluídas da investigação são grade ruim com gelo espesso e uma grade dobrada com gelo ruim e contaminação, enquanto grades aceitáveis são aquelas com bom gradiente de gelo e uma grade típica com gelo fino bom e pequeno gradiente de gelo. A figura mostra a renderização 3D final do mapa Cryo-EM de apoferritina reconstruída. A alta estabilidade e simetria fazem dela uma amostra de referência ideal para imagens e processamento de imagens Cryo-EM de alta resolução.O polimento bayesiano, o refinamento ctf e a correção da esfera de Ewald resultaram em um mapa de resolução de 1,63 angstrom. A figura mostra uma visão detalhada do mapa crio-EM de apoferritina reconstruída no nível da cadeia lateral do aminoácido individual. A densidade das cadeias laterais de aminoácidos é bem resolvida e o modelo atômico pode ser inequivocamente construído dentro do mapa.A imagem aqui mostra dois conjuntos de dados diferentes em diferentes valores de desfoco coletados da mesma grade Cryo-EM com quadrados de grade semelhantes com uma fenda totalmente aberta e uma fenda de 10 elétrons volts que indica que a fenda de 10 elétrons volts melhora significativamente o contraste da imagem. A figura aqui mostra uma visão geral do mapa Cryo-EM proteasome 20S com subunidades segmentadas usadas como amostra Cryo-EM padrão. E sua visão ampliada com um modelo atômico equipado representa o núcleo catalítico estável do complexo proteasome com a simetria D7.O protocolo contém duas etapas críticas. Primeiro, procurando áreas com gelo fino e vítreo contendo partículas homogêneas. E segundo, configurando iluminação paralela para aquisição de dados.Com reconstruções de alta resolução de proteínas alcançando dois a três angstroms em resolução, você é mais capaz de entender os mecanismos moleculares da doença e melhorar os condutores de drogas. Anteriormente, a cristalização era necessária se você quisesse estudar a base estrutural dos fenômenos biológicos. Hoje com o Cryo-EM, isso não é mais necessário.E assim, com o Cryo-EM, permitimos que os cientistas estudem uma gama mais ampla de fenômenos biológicos em um nível estrutural.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Method to Visualize and Analyze Membrane Interacting Proteins by Transmission Electron Microscopy

Método para visualizar e analisar proteínas de interação de membrana por microscopia eletrônica de transmissão

Monotopic proteins exert their function when attached to a membrane surface, and such interactions depend on the specific lipid composition and on the ...

Bioquímica

High-resolution Single Particle Analysis from Electron Cryo-microscopy Images Using SPHIRE

Análise de uma única partícula de alta resolução a partir de imagens de crio-microscopia de elétrons usando SPHIRE

SPHIRE (SPARX for High-Resolution Electron Microscopy) is a novel open-source, user-friendly software suite for the semi-automated processing of single ...

Cryo-EM and Single-Particle Analysis with Scipion

Crio-EM e Análise de Partículas Únicas com Scipion

Cryo-electron microscopy has become one of the most important tools in biological research to reveal the structural information of macromolecules at ...

Preparation of Sample Support Films in Transmission Electron Microscopy using a Support Floatation Block

Preparação de filmes de suporte à amostra em microscopia eletrônica de transmissão usando um bloco de flutuação de suporte

Structure determination by cryo-electron microscopy (cryo-EM) has rapidly grown in the last decade; however, sample preparation remains a significant ...

Preparing Lamellae from Vitreous Biological Samples Using a Dual-Beam Scanning Electron Microscope for Cryo-Electron Tomography

Preparação de Lamelas a partir de Amostras Biológicas Vítreas Usando um Microscópio Eletrônico de Varredura de Feixe Duplo para Tomografia Crio-Eletrônica

Presented here is a protocol for preparing cryo-lamellae from plunge-frozen grids of Plasmodium falciparum-infected&#160;human erythrocytes, which could ...

Preparation of High-Temperature Sample Grids for Cryo-EM

Preparação de grades de amostras de alta temperatura para crio-EM

The sample grids for cryo-electron microscopy (cryo-EM) experiments are usually prepared at a temperature optimal for the storage of biological samples, ...

Micropatterning Transmission Electron Microscopy Grids to Direct Cell Positioning within Whole-Cell Cryo-Electron Tomography Workflows

Micropatterning Transmissão Electron Microscopy Grids para Posicionamento Direto celular dentro de fluxos de trabalho de tomografia crio-elétron inteira

Whole-cell cryo-electron tomography (cryo-ET) is a powerful technology that is used to produce nanometer-level resolution structures of macromolecules ...

Quantification of Subcellular Glycogen Distribution in Skeletal Muscle Fibers using Transmission Electron Microscopy

Quantificação da Distribuição de Glicogênio Subcelular em Fibras Musculares Esqueléticas usando Microscopia eletrônica de transmissão

With the use of transmission electron microscopy, high-resolution images of fixed samples containing individual muscle fibers can be obtained. This ...

A Robust Single-Particle Cryo-Electron Microscopy (cryo-EM) Processing Workflow with cryoSPARC, RELION, and Scipion

A Robust Single-Particle Cryo-Electron Microscopy cryo-EM Processing Workflow with cryoSPARC, RELION, and Scipion

Um fluxo de trabalho robusto de crio-elétron de partículas únicas (crio-EM) com cryoSPARC, RELION e Scipion

Recent advances in both instrumentation and image processing software have made single-particle cryo-electron microscopy (cryo-EM) the preferred method ...

Advancing High-Resolution Imaging of Virus Assemblies in Liquid and Ice

Avançando a imagem de alta resolução de conjuntos de vírus em líquido e gelo

Interest in liquid-electron microscopy (liquid-EM) has skyrocketed in recent years as scientists can now observe real-time processes at the nanoscale. It ...