Name: routine collection of high-resolution cryo-em datasets using 200 kv transmission electron microscope
Uploaded: 2022-03-16T14:00:00
Duration: 9 min 49 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Routine Collection of High-Resolution cryo-EM Datasets Using 200 KV Transmission Electron Microscope at JoVE.com

Никакой.

<ol>
	<li>Wang, J., Hua, T., Liu, Z. -. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+features+of+activated+GPCR+signaling+complexes.">Structural features of activated GPCR signaling complexes.</a> Current Opinions in Structural Biology. 63, 82-89 (2020).</li><li>Chen, S., Gouaux, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+mechanism+of+AMPA+receptor+-+auxiliary+protein+complexes.">Structure and mechanism of AMPA receptor - auxiliary protein complexes.</a> Current Opinions in Structural Biology. 54, 104-111 (2019).</li><li>K&#252;hlbrandt, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+mechanisms+of+F-Type+ATP+synthases.">Structure and mechanisms of F-Type ATP synthases.</a> Annual Review of Biochemistry. 88, 515-549 (2019).</li><li>Laverty, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo-EM+structure+of+the+human+&#945;1&#946;3&#947;2+GABA+A+receptor+in+a+lipid+bilayer.">Cryo-EM structure of the human &#945;1&#946;3&#947;2 GABA A receptor in a lipid bilayer.</a> Nature. 565 (7740), 516-520 (2019).</li><li>Liu, F., Zhang, Z., Csan&#225;dy, L., Gadsby, D. C., Chen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+structure+of+the+Human+CFTR+ion+channel.">Molecular structure of the Human CFTR ion channel.</a> Cell. 169 (1), 85-95 (2017).</li><li>Wrapp, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo-EM+structure+of+the+2019-nCoV+spike+in+the+prefusion+conformation.">Cryo-EM structure of the 2019-nCoV spike in the prefusion conformation.</a> Science. 367 (6483), 1260-1263 (2020).</li><li>Ke, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structures+and+distributions+of+SARS-CoV-2+spike+proteins+on+intact+virions.">Structures and distributions of SARS-CoV-2 spike proteins on intact virions.</a> Nature. 588, 498-502 (2020).</li><li>Yan, R., Zhang, Y., Li, Y., Xia, L., Guo, Y., Zhou, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+for+the+recognition+of+SARS-CoV-2+by+full-length+human+ACE2.">Structural basis for the recognition of SARS-CoV-2 by full-length human ACE2.</a> Science. 367 (6485), 1444-1448 (2020).</li><li>Walls, A. C., Park, Y. -. J., Tortorici, M. A., Wall, A., McGuire, A. T., Veesler, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure,+function,+and+antigenicity+of+the+SARS-CoV-2+spike+glycoprotein.">Structure, function, and antigenicity of the SARS-CoV-2 spike glycoprotein.</a> Cell. 180, 281-292 (2020).</li><li>Chiba, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multivalent+nanoparticle-based+vaccines+protect+hamsters+against+SARS-CoV-2+after+a+single+immunization.">Multivalent nanoparticle-based vaccines protect hamsters against SARS-CoV-2 after a single immunization.</a> Communications Biology. 4 (1), 597 (2021).</li><li>Nakane, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-particle+cryo-EM+at+atomic+resolution.">Single-particle cryo-EM at atomic resolution.</a> Nature. 587, 152-156 (2020).</li><li>Bai, X. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Seeing+atoms+by+single-particle+Cryo-EM.">Seeing atoms by single-particle Cryo-EM.</a> Trends in Biochemical Sciences. 46 (4), 253-254 (2021).</li><li>Koh, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+cryo-EM+at+200kV+enabled+by+Selectris-X+and+Falcon+4.">High-resolution cryo-EM at 200kV enabled by Selectris-X and Falcon 4.</a> Microscience Microscopy Congress 2021. , (2021).</li><li>Herzik, M. A., Wu, M., Lander, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Achieving+better-than-3-&#197;+resolution+by+single-particle+cryo-EM+at+200+keV.">Achieving better-than-3-&#197; resolution by single-particle cryo-EM at 200 keV.</a> Nature Methods. 14 (11), 1075-1078 (2017).</li><li>Herzik, M. A., Wu, M., Lander, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+structure+determination+of+sub-100+kDa+complexes+using+conventional+cryo-EM.">High-resolution structure determination of sub-100 kDa complexes using conventional cryo-EM.</a> Nature Communications. 10 (1), 1032 (2019).</li><li>Wu, M., Lander, G. C., Herzik, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sub-2+Angstrom+resolution+structure+determination+using+single-particle+cryo-EM+at+200+keV.">Sub-2 Angstrom resolution structure determination using single-particle cryo-EM at 200 keV.</a> Journal of Structural Biology X. 4, 100020-100029 (2020).</li><li>Mori, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=C-Glycoside+metabolism+in+the+gut+and+in+nature:+Identification,+characterization,+structural+analyses+and+distribution+of+C-C+bond-cleaving+enzymes.">C-Glycoside metabolism in the gut and in nature: Identification, characterization, structural analyses and distribution of C-C bond-cleaving enzymes.</a> Nature Communications. 12 (1), 6294 (2021).</li><li>Hamdi, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=2.7+&#197;+cryo-EM+structure+of+vitrified+M.+musculus+H-chain+apoferritin+from+a+compact+200+keV+cryo-microscope.">2.7 &#197; cryo-EM structure of vitrified M. musculus H-chain apoferritin from a compact 200 keV cryo-microscope.</a> PLoS One. 15 (5), 0232540 (2020).</li><li>Abbott, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EMDB+web+resources.">EMDB web resources.</a> Current Protocols in Bioinformatics. 61 (1), 1-12 (2018).</li><li>Punjani, A., Rubinstein, J. L., Fleet, D. J., Brubaker, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CryoSPARC:+algorithms+for+rapid+unsupervised+cryo-EM+structure+determination.">CryoSPARC: algorithms for rapid unsupervised cryo-EM structure determination.</a> Nature Methods. 14 (3), 290-296 (2017).</li><li>Scheres, S. H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RELION:+Implementation+of+a+Bayesian+approach+to+cryo-EM+structure+determination.">RELION: Implementation of a Bayesian approach to cryo-EM structure determination.</a> Journal of Structural Biology. 180 (3), 519-530 (2012).</li><li>G&#243;mez-Blanco, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+Scipion+for+stream+image+processing+at+Cryo-EM+facilities.">Using Scipion for stream image processing at Cryo-EM facilities.</a> Journal of Structural Biology. 204 (3), 457-463 (2018).</li><li>Tegunov, D., Cramer, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+cryo-electron+microscopy+data+preprocessing+with+Warp.">Real-time cryo-electron microscopy data preprocessing with Warp.</a> Nature Methods. 16 (11), 1146-1152 (2019).</li><li>Lander, G. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Appion:+an+integrated,+database-driven+pipeline+to+facilitate+EM+image+processing.">Appion: an integrated, database-driven pipeline to facilitate EM image processing.</a> Journal of Structural Biology. 166 (1), 95-102 (2009).</li><li>Carragher, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+outcomes+when+optimizing+'standard'+sample+preparation+for+single-particle+cryo-EM.">Current outcomes when optimizing 'standard' sample preparation for single-particle cryo-EM.</a> Journal of Microscopy. 276 (1), 39-45 (2019).</li><li>Drulyte, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Approaches+to+altering+particle+distributions+in+cryo-electron+microscopy+sample+preparation.">Approaches to altering particle distributions in cryo-electron microscopy sample preparation.</a> Acta Crystallographica. Section D, Structural Biology. 74 (6), 560-571 (2018).</li><li>Bloch, M., Santiveri, M., Taylor, N. M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+protein+Cryo-EM:+Cryo-grid+optimization+and+data+collection+with+protein+in+detergent.">Membrane protein Cryo-EM: Cryo-grid optimization and data collection with protein in detergent.</a> Methods in Molecular Biology. 2127, 227-244 (2020).</li><li>Cheng, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leginon:+New+features+and+applications.">Leginon: New features and applications.</a> Protein Science. 30 (1), 136-150 (2021).</li><li>Schorb, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Software+tools+for+automated+transmission+electron+microscopy.">Software tools for automated transmission electron microscopy.</a> Nature Methods. 16 (6), 471-477 (2019).</li><li>Li, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+counting+and+beam-induced+motion+correction+enable+near-atomic-resolution+single-particle+cryo-EM.">Electron counting and beam-induced motion correction enable near-atomic-resolution single-particle cryo-EM.</a> Nature Methods. 10 (6), 584-590 (2013).</li><li>Alewijnse, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Best+practices+for+managing+large+CryoEM+facilities.">Best practices for managing large CryoEM facilities.</a> Journal of Structural Biology. 199, 225-236 (2017).</li><li>Baldwin, P. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Big+data+in+cryoEM:+automated+collection,+processing+and+accessibility+of+EM+data.">Big data in cryoEM: automated collection, processing and accessibility of EM data.</a> Current Opinion in Microbiology. 43, 1-8 (2018).</li><li>Guo, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron-event+representation+data+enable+efficient+cryoEM+file+storage+with+full+preservation+of+spatial+and+temporal+resolution.">Electron-event representation data enable efficient cryoEM file storage with full preservation of spatial and temporal resolution.</a> International Union of Crystallography Journal. 7, 860-869 (2020).</li><li>Weis, F., Hagen, W. J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combining+high+throughput+and+high+quality+for+cryo-electron+microscopy+data+collection.">Combining high throughput and high quality for cryo-electron microscopy data collection.</a> Acta Crystallographica. Section D, Structural Biology. 76 (8), 724-728 (2020).</li><li>Zhou, H., Chiu, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+icosahedral+virus+structures+by+electron+cryomicroscopy+at+subnanometer+resolution.">Determination of icosahedral virus structures by electron cryomicroscopy at subnanometer resolution.</a> Advances in Protein Chemistry. 64, 93-124 (2005).</li><li>DeRosier, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correction+of+high-resolution+data+for+curvature+of+the+Ewald+sphere.">Correction of high-resolution data for curvature of the Ewald sphere.</a> Ultramicroscopy. 81 (2), 83-98 (2000).</li><li>Wolf, M., DeRosier, D. J., Grigorieff, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ewald+sphere+correction+for+single-particle+electron+microscopy.">Ewald sphere correction for single-particle electron microscopy.</a> Ultramicroscopy. 106 (4-5), 376-382 (2006).</li><li>Leong, P. A., Yu, X., Hong Zhou, Z., Jensen, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correcting+for+the+ewald+sphere+in+high-resolution+single-particle+reconstructions.">Correcting for the ewald sphere in high-resolution single-particle reconstructions.</a> Methods in Enzymology. 482, 369-380 (2010).</li><li>Zivanov, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+tools+for+automated+high-resolution+cryo-EM+structure+determination+in+RELION-3.">New tools for automated high-resolution cryo-EM structure determination in RELION-3.</a> eLife. 7, 42166 (2018).</li></ol>

Сагар Хавнекар сообщает об отсутствии конфликта интересов. Другие авторы являются сотрудниками Thermo Fisher Scientific, подразделения MSD-EM.

Определение структуры белка имеет решающее значение для понимания молекулярной архитектуры, функции и регуляции белковых комплексов, участвующих в ключевых клеточных процессах, таких как клеточный метаболизм, трансдукция сигналов или взаимодействия хозяин-патоген. Криоэлектронная микроскопия (крио-ЭМ) стала мощным методом, способным решать 3D-структуру многих белков и их комплексов, которые были слишком сложными для традиционных структурных методов, таких как рентгеновская дифракция и ЯМР-спектроскопия. В частности, крио-ЭМ был доказан как метод выбора для мембранных белков, которые не могут быть легко кристаллизованы или приготовлены в достаточных количествах для традиционных структурных методов, и обеспечил новое понимание структуры и функции важных клеточных рецепторов и ионных каналов 1,2,3,4,5 . Совсем недавно крио-ЭМ сыграл важную роль в борьбе с пандемией Covid-19, определив механизм инфекции SARS-CoV-2 на молекулярном уровне, что прояснило происхождение болезни Covid-19 и обеспечило основу для быстрой разработки эффективных вакцин и терапевтических средств 6,7,8,9,10.
Как правило, высококачественные просвечивающие электронные микроскопы 300 кВ (ТЭМ) используются для определения структуры биомолекул с высоким разрешением путем крио-ЭМ-анализа одной частицы (SPA) для выявления их конформации и взаимодействий. Недавно метод SPA достиг нового рубежа, когда общий эталонный крио-ЭМ образец апо-ферритина был реконструирован с атомным разрешением (1,2 Å)11,12 с использованием TEM 300 кВ, оснащенного эмиссионной пушкой холодного поля (E-CFEG), прямым электронным детектором и энергетическим фильтром. При этом решении удалось однозначно разрешить положения отдельных атомов в структуре, конформацию отдельных аминокислотных боковых цепей, а также водородные связи и другие взаимодействия, которые открывают новые возможности для структурного открытия новых мишеней и оптимизации существующих лекарственных средств-кандидатов.
Микроскопы среднего класса 200 кВ TEM часто используются для скрининга образцов и оптимизации образцов перед окончательным сбором данных высокого разрешения с использованием высококачественных микроскопов TEM, особенно на крупных крио-ЭМ-объектах. Как правило, изображенные образцы могут быть разрешены в диапазоне разрешения 3-4 Å, что достаточно для перехода на высококачественную ТЕА 300 кВ для окончательного сбора данных. Следовательно, сбор данных с использованием ТЕА 200 кВ часто не оптимизируется для достижения максимально возможных результатов разрешения. Более того, многие интересные биологические вопросы уже могут быть даны и опубликованы в этих разрешениях, поскольку все аминокислотные боковые цепи уже разрешены, и заполненность сайтов связывания лигандов также может быть надежно определена13. Уже было показано, что ТЭМ 200 кВ могут достигать разрешений выше 3 Å для многочисленных образцов 14,15,16,17,18. Изображения, сделанные при 200 кВ, демонстрируют по своей сути более высокую контрастность изображенных частиц, что может даже способствовать более точному начальному выравниванию частиц, несмотря на более ослабленный сигнал при высоком разрешении по сравнению с изображениями TEM 300 кВ. Важно отметить, что достигнутое разрешение реконструированных крио-ЭМ карт также ограничено структурной гибкостью и конформационной неоднородностью изображений образцов, что влияет как на реконструкции 200 кВ, так и на реконструкции 300 кВ. Фактически, гораздо больше крио-ЭМ реконструкций, полученных с использованием систем 300 кВ, было решено в диапазоне разрешения 3-4 Å, чем при более высоких разрешениях19. Поскольку микроскопы TEM 200 кВ менее сложны и помещаются в меньших помещениях, эти микроскопы представляют собой хороший, более дешевый вариант определения структуры биологических макромолекул крио-ЭМ при сохранении автоматизации длинных сборов данных из нескольких образцов, хранящихся в системе автозагрузчика микроскопа.
Сбор наборов крио-ЭМ данных для определения структуры высокого разрешения требует точного выравнивания оптики микроскопа. Выравнивание колонн систематически происходит от источника электронов до системы линз конденсатора, объектива и энергетического фильтра с электронным детектором. Полная последовательность выравниваний обычно не требуется. При необходимости пользователь направляется с помощью полуавтоматических процедур с надлежащим описанием каждого шага в контекстно-зависимом окне справки на протяжении всей процедуры выравнивания в пользовательском интерфейсе микроскопа (панель управления Direct Alignments). Как только микроскоп полностью выровнен, электронная оптика остается стабильной, и выравнивания не нужно менять в течение как минимум нескольких месяцев. Только наиболее чувствительные выравнивания, такие как параллельное освещение плоскости выборки, объективный астигматизм и выравнивание без комы, должны быть уточнены непосредственно перед началом сбора каждого набора данных. Затем качество собранных данных можно контролировать во время сбора данных с помощью различных программных пакетов, таких как EPU Quality Monitor, cryoSPARC Live20, Relion21, Scipion22, WARP23 или Appion24.
Помимо точного выравнивания микроскопа, высокое качество хорошо очищенных образцов с минимальной конформационной и композиционной гетерогенностью также является необходимым условием для сбора наборов данных высокого разрешения и решения структур высокого разрешения. Более подробную информацию о типичных протоколах, частых проблемах и возможных средствах правовой защиты можно найти в других обзорах, посвященных этой теме 25,26,27. По сути, крайне важно найти области на заданной крио-ЭМ-сетке, которая имеет достаточно тонкий лед для сохранения информации с высоким разрешением, а отдельные частицы плотно распределены в случайных ориентациях без перекрытий. Однако типичные крио-ЭМ сетки имеют неравномерную толщину льда, и поэтому важно найти и выбрать оптимальные области для визуализации. Различные средства оценки толщины льда в сетке доступны в пакетах программного обеспечения, предназначенных для автоматизированного сбора наборов крио-ЭМ данных, таких как EPU 2, Leginon28 или SerialEM29.
Появление быстрых и чувствительных детекторов прямых электронов позволило собирать изображения во многих фракциях в виде фильмов, что позволило компенсировать движения, вызванные пучком, и привело к значительному увеличению качества и количества данных, используемых при обработке изображений и окончательной 3D-реконструкции30. В то же время автоматизация и высокая пропускная способность сбора данных обеспечивают огромные наборы данных с тысячами изображений / фильмов, которые представляют собой проблемы для хранения данных и доступа к ним. Принятая модель с большими крио-ЭМ-объектами, обслуживающими от десятков до сотен пользователей, особенно требует организованного управления данными с надлежащим отслеживанием и обменом данными в установленных крио-ЭМ-трубопроводах31,32.
Это исследование описывает протокол для рутинного сбора наборов крио-ЭМ высокого разрешения с использованием микроскопа Glacios TEM 200 кВ. Описаны необходимые выравнивания оптики микроскопа вместе с процедурами оценки крио-ЭМ образцов и выбора подходящих областей для сбора данных высокого разрешения. Организация собранных данных и связанных с ними метаданных с выборочной информацией демонстрируется в Athena - платформе управления данными, которая облегчает обзор выборочной информации и собранных данных. Используя образец апо-ферритина мыши, удалось достичь 3D-реконструкции с разрешением 1,6 Å13. Используя описанный протокол, мы также реконструировали 3D-карту плотности протеасомы 20S из Thermoplasma acidophilum с разрешением 2,1 Å.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>AutoGrid rings</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>1036173</td>
			<td>Package of 100x AutoGrid rings for the standard EM grids.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C-Clip</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>1036171</td>
			<td>Package of 100 clips that secure 
			the standard EM grids inside the AutoGrid rings.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Data Management Platform</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>1160939</td>
			<td>Part of the Glacios base configuraiton; includes Athena Software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EPU Quality Monitor</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>1179770</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EPU Software</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>1025080</td>
			<td>Part of the Glacios base configuration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethane 3.5</td>
			<td>Westfalen</td>
			<td>A06010110</td>
			<td>Ethane gas used for making liquid ethane (puritiy at least N35, i.e. 99.95% vol)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 4 200kV</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>1166936</td>
			<td>Direct electron detector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glacios</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>1149551</td>
			<td>200 kV TEM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GloQube Plus Glow Discharge System for TEM Grids and surface modification</td>
			<td>Quorum</td>
			<td>N/A</td>
			<td>also available via Thermo Fisher Scientific (PN 1160602)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuantiFoil grids</td>
			<td>Quantifoil</td>
			<td>N/A</td>
			<td>R-2/1, 300 mesh; carbon foil grid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Relion</td>
			<td>MRC Laboratory of Molecular Biology</td>
			<td>N/A</td>
			<td>open source software: 
			https://relion.readthedocs.io/en/release-3.1/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Selectris with Falcon 
			4 for 200 kV</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>1191753</td>
			<td>Energy filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Selectris X with Falcon 
			4 for 200 kV</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>1191755</td>
			<td>Energy filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltrAuFoil grids</td>
			<td>Quantifoil</td>
			<td>N/A</td>
			<td>R-1.2/1.2, 300 mesh; gold foil grids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vitrobot Mk. IV</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>1086439</td>
			<td>Automated vitrification system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman 595 filter paper</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AA00420S</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

routine collection of high-resolution cryo-em datasets using 200 kv transmission electron microscope

Криоэлектронная микроскопия (крио-ЭМ) была создана в качестве рутинного метода определения структуры белка в течение последнего десятилетия, занимая все большую долю опубликованных структурных данных. Последние достижения в области технологий и автоматизации ТЕА повысили как скорость сбора данных, так и качество получаемых изображений, одновременно снижая требуемый уровень знаний для получения крио-ЭМ-карт с разрешением ниже 3 Å. В то время как большинство таких структур с высоким разрешением были получены с использованием современных крио-ТЕА 300 кВ, структуры высокого разрешения могут быть также получены с помощью крио-ТЕА-систем 200 кВ, особенно при оснащении энергетическим фильтром. Кроме того, автоматизация выравнивания микроскопов и сбора данных с оценкой качества изображения в режиме реального времени снижает сложность системы и обеспечивает оптимальные настройки микроскопа, что приводит к увеличению выхода высококачественных изображений и общей пропускной способности сбора данных. Этот протокол демонстрирует реализацию последних технологических достижений и функций автоматизации на электронном микроскопе криопропускания 200 кВ и показывает, как собирать данные для реконструкции 3D-карт, достаточных для построения атомной модели de novo . Мы фокусируемся на лучших практиках, критических переменных и общих проблемах, которые необходимо учитывать, чтобы обеспечить рутинный сбор таких наборов крио-ЭМ с высоким разрешением. В частности, подробно рассматриваются следующие важные темы: i) автоматизация выравнивания микроскопов, ii) выбор подходящих областей для сбора данных, iii) оптимальные оптические параметры для высококачественного, высокопроизводительного сбора данных, iv) настройка энергетического фильтра для визуализации с нулевыми потерями и v) управление данными и оценка качества. Применение лучших практик и улучшение достижимого разрешения с помощью энергетического фильтра будет продемонстрировано на примере апо-ферритина, который был реконструирован до 1,6 Å, и протеасомы Thermoplasma acidophilum 20S, реконструированной до разрешения 2,1-Å с использованием ТЭМ 200 кВ, оснащенного энергетическим фильтром и прямым электронным детектором.

Watch this Scientific Journal Video about Routine Collection of High-Resolution cryo-EM Datasets Using 200 KV Transmission Electron Microscope at JoVE.com

Routine Collection of High-Resolution cryo-EM Datasets Using 200 KV Transmission Electron Microscope

Крио-ЭМ карты макромолекул с высоким разрешением также могут быть получены с помощью микроскопов TEM 200 кВ. Этот протокол демонстрирует лучшие практики для установки точных оптических выравниваний, схем сбора данных и выбора областей изображения, которые необходимы для успешного сбора наборов данных высокого разрешения с использованием ТЕА 200 кВ.

Рутинный сбор наборов крио-ЭМ данных высокого разрешения с использованием просвечивающего электронного микроскопа 200 кВ

Cryo-electron microscopy (cryo-EM) has been established as a routine method for protein structure determination during the past decade, taking an ...

Крио-ЭМ стал стандартным методом определения структуры белков и их комплексов. Этот протокол описывает лучшие практики получения наборов данных Cryo-EM высокого разрешения из микроскопов среднего класса 200 кВ TEM. Крио-ЭМ может определять структуру белка в близких нативных условиях в растворе для нескольких конформационных состояний и функциональных состояний одновременно, что неуловимо для других структурных методов.Полученная структурная информация может быть использована для выяснения молекулярных механизмов функции белка, а также для структурного проектирования лекарственных средств. Например, недавняя публикация в структуре амилоидных фибрилл выявила множественные сайты связывания жизненно важного лиганда. Однако в этом протоколе мы используем стандартные образцы апоферритина и протеасомы, чтобы продемонстрировать критические шаги в получении крио-ЭМ данных высокого разрешения.Эксплуатация Cryo-TEM стала более простой за последние годы, особенно благодаря внедрению передовых функций автоматизации. Тем не менее, для первого сеанса мы бы посоветовали вам пройти обучение с более опытными пользователями. Оттуда прогресс в технике относительно быстрый.Демонстрировать процедуру будет Адриан Кох, который является старшим научным сотрудником Thermo Fisher Scientific. Вставьте автосетки в кассету автозагрузчика в условиях жидкого азота. Вставьте кассету с автосетками в капсулу с жидкостным азотным охлаждением.Далее вставьте капсулу в микроскоп и нажмите кнопку Dock в пользовательском интерфейсе микроскопа, чтобы загрузить кассету из капсулы в автоматический загрузчик микроскопа. Нажмите на кнопку Инвентарь, чтобы проверить наличие автосеток в загруженной кассете. Затем нажмите кнопки «Загрузить» и «Выгрузить», чтобы вставить автоматические сетки в столбец для визуализации TEM.Выберите вкладку Atlas и нажмите кнопку New Session (Новый сеанс), чтобы открыть новый сеанс. Заполните такие сведения, как имя сеанса и место хранения данных, и нажмите кнопку Применить. Выберите интересующие сетки, установив флажок рядом с соответствующим номером сетки.Нажмите кнопку Пуск, чтобы начать полностью автоматизированную коллекцию атласов всех выбранных сеток. Когда коллекция будет завершена, нажмите на метки сетки, чтобы просмотреть приобретенные атласы. Выберите вкладку EPU и перейдите в раздел Новый сеанс, чтобы создать новый сеанс на левой панели.Выберите параметр «Новый сеанс», чтобы использовать текущий набор оптических пресетов. Введите имя сеанса. Выберите ручной тип сеанса, чтобы иметь контроль над выбором отдельных отверстий и квадратов сетки, выбранных для сбора данных позже в протоколе.Выберите более быстрый режим получения, чтобы использовать сдвиг изображения без аберрации для сбора данных. Затем введите расположение для сохранения метаданных. Нажмите кнопку Применить, чтобы создать новый сеанс.Выберите задачу выделения квадрата на левой панели, чтобы отобразить собранный атлас сетки. Определите квадраты сетки с неповрежденной опорной фольгой без повреждений, тонким стекловидным льдом и отверстиями из фольги, незначительным загрязнением кристаллического льда в квадрате сетки и минимальным градиентом яркости по квадрату сетки и в отдельных отверстиях фольги. Выберите квадраты сетки для сбора данных либо в полном атласе, либо в высококачественных изображениях плиток.Щелкните правой кнопкой мыши по интересующему квадрату сетки и выберите всю задачу выбора. Нажмите кнопку Auto Eucentric, чтобы автоматически перейти к первому выбранному квадрату сетки. Отрегулируйте высоту эйцентрика и получите квадратное изображение сетки для поиска отверстий в фольге.Нажмите на кнопку «Найти отверстия», чтобы найти отверстия в фольге на изображении. Нажмите кнопку «Удалить отверстия», чтобы закрыть кнопку панели сетки, чтобы отменить выделение отверстий рядом с полосами сетки. Отрегулируйте пределы яркости гистограммы ледяного фильтра, чтобы удалить все отверстия со слишком толстым льдом и все пустые отверстия.Щелкните правой кнопкой мыши отверстие в квадратном изображении сетки и выберите переместить этап в место перемещения этапа здесь. Выберите задачу определения шаблона на левой панели. Нажмите на кнопку «Получить», чтобы получить целое изображение.Установите значения задержки после сдвига изображения на 0,5 секунды и задержки после сдвига этапа на пять секунд. Нажмите кнопку «Найти и центрировать отверстие», чтобы отцентрировать отверстие на изображении. Нажмите кнопку «Добавить область сбора» и нажмите на изображение, чтобы выбрать место в центрированном отверстии, где будет происходить получение изображения с большим увеличением.Нажмите кнопку «Добавить область автофокусировки» и нажмите на изображение, чтобы выбрать место на опорной фольге рядом с центрированным отверстием, где будет выполняться автофокус изображения. Нажмите на зеленую область сбора, чтобы задать последовательность значений расфокусировки в списке расфокусировки в верхней части окна программного обеспечения. После установки параметров автофокусировки выберите параметр После центрирования, чтобы автофокусироваться в начале каждого кластера AFIS.Выберите опцию Объектив для более быстрой автофокусировки и уменьшенного дрейфа ступени. Нажмите кнопку «Подготовить все квадраты» в задаче выбора отверстий, чтобы автоматически настроить сбор данных и все другие выбранные квадраты сетки в соответствии с используемыми настройками в этом первом квадрате сетки. Выберите задачу определения шаблона, получите новое изображение, переместите этап в чистую область на углеродной фольге щелчком правой кнопкой мыши и выберите пункт меню переместить этап здесь.Выберите вкладку Автофункции. После установки нужной расфокусировки и итерации переключитесь на предустановку автофокусировки и нажмите кнопку «Пуск», чтобы запустить функцию автофокусировки. Выберите задачу Autostigmate, переключитесь на предустановку Thon Ring и нажмите кнопку Пуск.Выберите задачу Автокома и нажмите кнопку Пуск. Перемещение этапа в область с разбитым квадратом сетки. Подтвердите прозрачность области, сделав одно изображение автофокусировки.Откройте пользовательский интерфейс Sherpa и выберите приложение Energy Filter. Нажмите кнопку «Центр» и опцию «Нулевые потери», чтобы центрировать щель энергетического фильтра с нулевыми потерями. Нажмите кнопку «Настроить» в параметре «Изохроматичность».Нажмите на опцию Tune Magnification and Tune Distortions в геометрических и хроматических искажениях. Перейдите на вкладку EPU, выберите задачу Автоматическое получение и нажмите кнопку Начать запуск, чтобы начать полностью автоматизированный сбор данных. На рисунке показаны сетки Cryo-EM, отображающие градиент толщины льда над поверхностью сетки.Сетки, исключенные из дальнейшего исследования, представляют собой плохую сетку с толстым льдом и изогнутой сеткой с плохим льдом и загрязнением, в то время как приемлемыми сетками являются сетки с хорошим градиентом льда и типичной сеткой с хорошим тонким льдом и небольшим градиентом льда. На рисунке показан окончательный 3D-рендеринг реконструированной карты апоферритина Cryo-EM. Высокая стабильность и симметрия делают его оптимальным эталонным образцом для крио-ЭМ визуализации и обработки изображений с высоким разрешением.Байесовская полировка, уточнение CTF и коррекция сферы Эвальда привели к созданию карты с разрешением 1,63 ангстрема. На рисунке показан детальный вид реконструированной карты крио-ЭМ апоферритина на уровне отдельной аминокислотной боковой цепи. Плотность аминокислотных боковых цепей хорошо разрешена, и атомная модель может быть однозначно построена в пределах карты.На изображении здесь показаны два разных набора данных с разными значениями расфокусировки, собранные из одной и той же сетки Cryo-EM с аналогичными квадратами сетки с полностью открытой щелью и щелью 10 электрон-вольт, что указывает на то, что щель 10 электрон-вольт значительно улучшает контрастность изображения. На рисунке здесь показан обзор карты крио-ЭМ протеасомы 20S с сегментированными субъединицами, используемыми в качестве стандартного образца Крио-ЭМ. А его увеличенный вид с установленной атомной моделью представляет собой стабильное каталитическое ядро протеасомного комплекса с симметрией D7.Протокол содержит два критических шага. Во-первых, искать участки с тонким стекловидным льдом, содержащим однородные частицы. И второе, настройка параллельного освещения для сбора данных.Благодаря реконструкциям белков с высоким разрешением, достигающим двух-трех ангстрем в разрешении, вы сможете лучше понять молекулярные механизмы заболевания и улучшить лекарственные провода. Раньше кристаллизация была необходима, если вы хотели изучить структурные основы биологических явлений. Сегодня с Cryo-EM это больше не нужно.И поэтому с Cryo-EM мы позволяем ученым изучать более широкий спектр биологических явлений на структурном уровне.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Method to Visualize and Analyze Membrane Interacting Proteins by Transmission Electron Microscopy

Метод визуализации и анализа Мембранные белков, взаимодействующих с помощью просвечивающей электронной микроскопии

Monotopic proteins exert their function when attached to a membrane surface, and such interactions depend on the specific lipid composition and on the ...

High-resolution Single Particle Analysis from Electron Cryo-microscopy Images Using SPHIRE

Анализ одиночных частиц с высокой разрешающей способностью при электронно-микроскопической микроскопии Изображения с использованием SPHIRE

SPHIRE (SPARX for High-Resolution Electron Microscopy) is a novel open-source, user-friendly software suite for the semi-automated processing of single ...

Cryo-EM and Single-Particle Analysis with Scipion

Крио-ЭМ и анализ одиночных частиц с помощью Scipion

Cryo-electron microscopy has become one of the most important tools in biological research to reveal the structural information of macromolecules at ...

Preparation of Sample Support Films in Transmission Electron Microscopy using a Support Floatation Block

Подготовка образцов опорных пленок в просвечивающей электронной микроскопии с использованием опорного флотационного блока

Structure determination by cryo-electron microscopy (cryo-EM) has rapidly grown in the last decade; however, sample preparation remains a significant ...

Preparing Lamellae from Vitreous Biological Samples Using a Dual-Beam Scanning Electron Microscope for Cryo-Electron Tomography

Получение ламелей из биологических образцов стекловидного тела с помощью двухлучевого сканирующего электронного микроскопа для криоэлектронной томографии

Presented here is a protocol for preparing cryo-lamellae from plunge-frozen grids of Plasmodium falciparum-infected&#160;human erythrocytes, which could ...

Preparation of High-Temperature Sample Grids for Cryo-EM

Подготовка высокотемпературных сеток для отбора проб для крио-ЭМ

The sample grids for cryo-electron microscopy (cryo-EM) experiments are usually prepared at a temperature optimal for the storage of biological samples, ...

Micropatterning Transmission Electron Microscopy Grids to Direct Cell Positioning within Whole-Cell Cryo-Electron Tomography Workflows

Микроструктурирование просвечивающих электронных микроскопических сеток для прямого позиционирования клеток в рабочих процессах криоэлектронной томографии цельноклеточной криоэлектронной томографии

Whole-cell cryo-electron tomography (cryo-ET) is a powerful technology that is used to produce nanometer-level resolution structures of macromolecules ...

Quantification of Subcellular Glycogen Distribution in Skeletal Muscle Fibers using Transmission Electron Microscopy

Количественная оценка распределения субклеточного гликогена в волокнах скелетных мышц с помощью просвечивающей электронной микроскопии

With the use of transmission electron microscopy, high-resolution images of fixed samples containing individual muscle fibers can be obtained. This ...

A Robust Single-Particle Cryo-Electron Microscopy (cryo-EM) Processing Workflow with cryoSPARC, RELION, and Scipion

A Robust Single-Particle Cryo-Electron Microscopy cryo-EM Processing Workflow with cryoSPARC, RELION, and Scipion

Надежный рабочий процесс обработки криоэлектронной микроскопии с одной частицей (крио-ЭМ) с криоСПАРК, RELION и Scipion

Recent advances in both instrumentation and image processing software have made single-particle cryo-electron microscopy (cryo-EM) the preferred method ...

Advancing High-Resolution Imaging of Virus Assemblies in Liquid and Ice

Усовершенствование визуализации вирусных сборок с высоким разрешением в жидкости и льду

Interest in liquid-electron microscopy (liquid-EM) has skyrocketed in recent years as scientists can now observe real-time processes at the nanoscale. It ...