Name: routine collection of high-resolution cryo-em datasets using 200 kv transmission electron microscope
Uploaded: 2022-03-16T14:00:00
Duration: 9 min 49 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Routine Collection of High-Resolution cryo-EM Datasets Using 200 KV Transmission Electron Microscope at JoVE.com

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	<li>Wang, J., Hua, T., Liu, Z. -. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+features+of+activated+GPCR+signaling+complexes.">Structural features of activated GPCR signaling complexes.</a> Current Opinions in Structural Biology. 63, 82-89 (2020).</li><li>Chen, S., Gouaux, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+mechanism+of+AMPA+receptor+-+auxiliary+protein+complexes.">Structure and mechanism of AMPA receptor - auxiliary protein complexes.</a> Current Opinions in Structural Biology. 54, 104-111 (2019).</li><li>K&#252;hlbrandt, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+mechanisms+of+F-Type+ATP+synthases.">Structure and mechanisms of F-Type ATP synthases.</a> Annual Review of Biochemistry. 88, 515-549 (2019).</li><li>Laverty, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo-EM+structure+of+the+human+&#945;1&#946;3&#947;2+GABA+A+receptor+in+a+lipid+bilayer.">Cryo-EM structure of the human &#945;1&#946;3&#947;2 GABA A receptor in a lipid bilayer.</a> Nature. 565 (7740), 516-520 (2019).</li><li>Liu, F., Zhang, Z., Csan&#225;dy, L., Gadsby, D. 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Sagar Khavnekar no informa de conflictos de intereses. Los otros autores son empleados de Thermo Fisher Scientific, la división MSD-EM.

El protocolo descrito asume que la óptica del microscopio TEM utilizado está en un estado bien alineado. Para el TEM de 200 kV utilizado en este Protocolo, dichas alineaciones de columna son realizadas, verificadas y guardadas por un ingeniero de servicio experimentado después de la instalación del microscopio o cualquier intervención de servicio significativa. Estos ajustes de alineación se pueden recuperar en cualquier momento en la interfaz de usuario del microscopio. Los usuarios pueden usar los procedimientos de alineación directa en la interfaz de usuario del microscopio para reajustar los parámetros críticos. Algunas alineaciones, como la inclinación de la pistola y el cambio de la pistola, son estables y no necesitan ser ajustadas por los usuarios a diario. Se recomienda que el supervisor del microscopio realice comprobaciones y realineaciones (si es necesario) de la inclinación y el desplazamiento de la pistola dos veces al año. Por otro lado, algunas alineaciones son críticas y deben alinearse antes de cada recopilación de datos como se describe en el protocolo anterior (como el astigmatismo objetivo y la alineación libre de coma). Si la función Autocoma en el software de análisis no converge, se debe verificar y ajustar la alineación de los puntos de pivote de inclinación del haz y / o el centro de rotación, y se debe confirmar el centrado correcto de la apertura C2. Después, la función Autostigmate debe ejecutarse ya que también se utilizan estigmatizadores objetivos para la corrección del coma. Estas alineaciones deben iterarse hasta que tanto las funciones Autostigmate como Autocomafunctions tengan éxito en su primera iteración. Si es necesario, se puede seleccionar otra área (por ejemplo, apoyar la lámina de carbono sin hielo), ajustar el desenfoque de la imagen o aumentar el tiempo de adquisición de la imagen para optimizar la relación señal-ruido en las imágenes adquiridas y la visibilidad de múltiples anillos thon en la transformada de Fourier de las imágenes adquiridas.
Los microscopios crio-EM modernos generan grandes cantidades de datos que a menudo superan 1 TB por conjunto de datos para lograr reconstrucciones 3D de alta resolución, particularmente para proteínas con baja simetría. Los datos y resultados de cryo-EM también suelen complementarse con datos y resultados de métodos ortogonales para comprender completamente las relaciones estructura-función en cada proyecto científico. La organización de los datos recopilados, su transferencia a una tubería de procesamiento de imágenes y el intercambio de una reconstrucción crio-EM resultante entre los colaboradores imponen requisitos adicionales a los nuevos adoptantes de la metodología cryo-EM para configurar su infraestructura de TI local. El software de gestión de datos, como Athena, facilita el almacenamiento centralizado de los datos adquiridos por cualquier instrumento o software conectado operado por un usuario registrado. Los datos y metadatos almacenados son accesibles mediante una interfaz de navegador web simple por varios usuarios, que pueden tener diferentes roles en el proyecto con diferentes derechos de acceso (ya sea como propietario, colaborador o espectador) según sus credenciales de inicio de sesión y la definición de uso compartido de datos en la configuración del experimento. Esta digitalización de los flujos de trabajo experimentales proporciona medios para compartir datos y metadatos entre los colaboradores sin duplicaciones innecesarias y aumenta la productividad y la trazabilidad de los flujos de trabajo utilizados. La implementación de una estructura general y personalizable de proyectos, experimentos y flujos de trabajo en el software de gestión de datos es universal y permite la personalización e integración de experimentos ortogonales utilizando métodos complementarios en una sola base de datos de proyectos.
La selección de áreas para la recopilación de datos en una red crio-EM es fundamental para la adquisición exitosa de conjuntos de datos de alta resolución. Las rejillas Cryo-EM producidas con dispositivos tradicionales de congelación por inmersión, como el Vitrobot (un sistema de vitrificación totalmente automatizado), generalmente mostrarán un gradiente de espesor de hielo sobre la superficie de la rejilla (Figura 4). Esto puede ser beneficioso ya que la rejilla contiene áreas con diferentes espesores de hielo; sin embargo, las áreas con el espesor de hielo ideal para la recopilación de datos deben identificarse como se describe en el protocolo anterior. Una rejilla crio-EM óptima debe contener la menor contaminación posible por hielo de transferencia y contener suficientes cuadrados de rejilla con una lámina de soporte agujereada intacta. No se recomienda la recopilación de datos sobre cuadrados de cuadrícula que tienen grietas o áreas rotas, ya que las imágenes recopiladas se verán afectadas por una deriva general significativamente más fuerte al iluminar un haz de electrones en comparación con los cuadrados de la rejilla con lámina de soporte intacta. El exceso de hielo cristalino puede ocluir la mayoría de los agujeros de lámina y / o interferir con el enfoque automático y tales cuadrados de cuadrícula también deben evitarse. Los cuadrados de cuadrícula con hielo delgado generalmente exhiben grandes áreas vítreas y muchos agujeros de lámina brillantes que son visibles en una imagen tomada con el ajuste preestablecido Atlas. La aparición de hielo más grueso cerca de las barras de la rejilla es de esperar y no es crítica, ya que los agujeros de lámina en estas áreas del cuadrado de la rejilla se excluyen durante el procedimiento de selección de agujeros. La presencia de varios agujeros vacíos en un cuadrado de cuadrícula puede significar que el hielo vítreo en los agujeros circundantes es extremadamente delgado y puede contener partículas dañadas o ninguna partícula en absoluto. En general, es aconsejable elegir cuadrados de cuadrícula con una variedad de espesores de hielo en diferentes regiones de la cuadrícula para la detección y evaluación iniciales para comprender qué áreas tienen las mejores condiciones para la recopilación de datos de alta resolución y exhiben la densidad de partículas ideal y la distribución de orientación. Para las muestras de proteasoma apoF y 20S utilizadas en este estudio, las áreas con el hielo observable más delgado contienen las mejores condiciones para obtener imágenes de alta resolución de estas muestras.
Al seleccionar taladros automáticamente en todos los cuadrados de cuadrícula seleccionados utilizando el software de recopilación de datos, se recomienda realizar la tarea de ejecución de plantillas en un orificio representativo en cada cuadrado de cuadrícula para verificar y asegurarse de que no se eligieron cuadrados demasiado gruesos ni demasiado delgados ni inesperadamente no vítreos para la recopilación de datos. Durante la adquisición de datos, los indicadores clave de calidad de las imágenes recopiladas, como la deriva de la imagen y el ajuste CTF, se pueden monitorear utilizando EQM. La recopilación de datos se puede optimizar omitiendo áreas que producen imágenes de mala calidad. Sin embargo, las imágenes con ajustes CTF de alta resolución aún pueden contener imágenes con partículas en algunas orientaciones preferidas o partículas desnaturalizadas en una capa de hielo demasiado delgada. La selección de partículas en tiempo real y la clasificación 2D a partir de imágenes recopiladas proporcionarían información adicional sobre la calidad de los datos estructurales en las partículas fotografiadas y revelarían tanto las orientaciones preferidas de las partículas intactas en el hielo como la estructura inconsistente de las partículas (parcialmente) desnaturalizadas. Por lo tanto, el cálculo de los promedios de clase puede ayudar a refinar aún más las regiones apropiadas para la recopilación de datos, como ya se ha implementado y demostrado en otros paquetesde software 23,28.
La selección de los ajustes de imagen para la adquisición de datos, como la ampliación, la tasa de dosis de electrones y el rango de desenfoque, depende de varios criterios, como la resolución objetivo, el tamaño de la proteína, la concentración de la muestra, el rendimiento deseado del microscopio, etc. Para la cámara detectora directa de electrones utilizada en estos experimentos, se eligió la tasa de dosis de electrones en el rango de 4-5 e-/pix/s seleccionando un tamaño e intensidad SPOT apropiados para mantener la iluminación paralela. Como se muestra en la Tabla 1, se puede utilizar un tamaño SPOT diferente en el ajuste preestablecido Hole/Eucentric Height para asegurar una relación señal-ruido suficiente en la imagen para centrar los orificios durante la recopilación de datos. El aumento debe elegirse de tal manera que el tamaño del píxel sea al menos 2-3 veces más pequeño que la resolución objetivo para la reconstrucción crio-EM. Sin embargo, se utiliza el aumento más alto (es decir, un tamaño de píxel más pequeño), el campo de visión más pequeño se captura en las imágenes y hay menos partículas por imagen, lo que en última instancia conduce a un mayor tiempo de recopilación de datos para recopilar imágenes con suficientes partículas para reconstruir mapas 3D a una alta resolución. Para la muestra de apoF, utilizamos el tamaño de píxel de 0,43 Å, ya que teníamos suficiente concentración de muestra para una alta densidad de partículas en las imágenes y apuntamos a una resolución sub-2 Å de la reconstrucción. Para la muestra de proteasoma 20S, utilizamos el tamaño de píxel de 0,68 Å para cubrir un campo de visión más grande en las imágenes adquiridas. Por lo general, para los microscopios TEM de 200 kV, las imágenes crio-EM se adquieren en el rango de desenfoque de 0,8 a 2,0 μm. Sin embargo, con el contraste mejorado y la relación señal-ruido utilizando el filtro de energía, las adquisiciones de datos se pueden hacer mucho más cerca del enfoque para preservar mejor la información de alta resolución en las imágenes adquiridas debido a aberraciones más pequeñas y, en consecuencia, a la reducción de la descomposición de la función de envolvente CTF. Tampoco utilizamos una apertura objetiva, ya que la apertura puede introducir aberraciones adicionales de la imagen, mientras que el contraste de la imagen ya está lo suficientemente mejorado mediante el uso del filtro de energía. Para las muestras de proteasoma apoF y 20S, se utilizaron los ajustes de desenfoque de 0,5 μm, 0,7 μm y 0,9 μm. Para proteínas más pequeñas (<200 kDa), utilizamos ajustes de desenfoque de -0,5 μm, -0,7 μm y -0,9 μm para mejorar el contraste de las partículas y facilitar la selección de partículas y la alineación gruesa inicial en el paso de refinamiento 3D de la reconstrucción 3D, lo que condujo a mapas 3D de resolución de ~ 2,5 Å (resultados no publicados).
Ya hemos demostrado que las imágenes con un filtro de energía mejoran la relación señal-ruido (SNR) en imágenes crio-EM recogidas en los microscopios TEM de 300 kV de gama alta11. De hecho, cuando los electrones pasan a través de una muestra, se producen dos tipos principales de interacciones: i) Los electrones dispersos elásticamente mantienen su energía y contribuyen a la formación de imágenes mediante la interferencia con el haz incidente no disperso a través del mecanismo de contraste de fase ii) los electrones dispersos inelásticamente pierden algo de energía en la muestra y contribuyen principalmente al ruido en las imágenes. Por lo tanto, SNR se puede mejorar significativamente filtrando los electrones dispersos inelásticamente, que tienen menor energía que el haz incidente y los electrones dispersados elásticamente, utilizando una estrecha hendidura de energía. Sin embargo, es fundamental utilizar un filtro de energía suficientemente estable, como el Selectris o el Selectris-X, para poder utilizar ranuras muy estrechas (10 eV o menos) durante la adquisición automatizada de datos de alta resolución (más de 12 horas) de conjuntos de datos crioEM de alta resolución.
Las imágenes crio-EM adquiridas con microscopios TEM de 200 kV en las mismas condiciones que con microscopios TEM de 300 kV exhiben un SNR más pequeño a alta resolución (particularmente <4 Å) debido a la desintegración más rápida de las funciones de la envoltura CTF. En consecuencia, se requiere un mayor número de partículas (y, por lo tanto, un mayor número de imágenes recopiladas) para lograr una cierta resolución cuando se utilizan TEM de 200 kV. Además, la profundidad de campo (10-25 nm en el rango de resolución 2-3 Å) también es aproximadamente un 20% más pequeña en imágenes de 200 kV35, lo que significa que menos partículas en la capa de hielo (típicamente 20-50 nm de espesor) estarán completamente enfocadas y contribuirán constructivamente a todas las características de alta resolución de una reconstrucción 3D calculada a menos que los valores de desenfoque se refinen para cada partícula de forma independiente en las etapas posteriores del procedimiento de reconstrucción 3D. Para partículas más grandes (como viriones icosaédricos u otros conjuntos macromoleculares), el tamaño de partícula puede exceder la profundidad de campo a altas resoluciones e introducir errores de fase debido a la aproximación plana de la esfera de Ewald en los algoritmos de reconstrucción 3D estándar36. Estos errores pueden ser refinados por algoritmos avanzados que ya están implementados en paquetes comunes de procesamiento de imágenes crio-EM 37,28,39. Como la esfera de Ewald tiene una curvatura mayor en datos de 200 kV que en datos de 300 kV, la corrección de la esfera de Ewald es necesaria a resoluciones relativamente más bajas y/o para conjuntos macromoleculares relativamente más pequeños cuando se utilizan TEMs de 200 kV. Por otro lado, las imágenes de 200 kV exhiben un mayor contraste de partículas en hielo delgado (20-50 nm) que es significativamente más delgado que la trayectoria libre media de electrones de 200-300 keV (220-280 nm). El mayor contraste ayuda a mejorar la alineación global correcta de partículas individuales, particularmente para dispersar débilmente proteínas más pequeñas cuya estructura aún no se conoce, y el modelo de referencia 3D aún no está bien establecido.
Aquí, demostramos en el ejemplo de un proteasoma 20S que el contraste y la calidad de la imagen podrían mejorarse de manera similar con un filtro de energía cuando se utiliza un microscopio TEM de 200 kV. Utilizando el mismo número de partículas, los datos recopilados utilizando la rendija de 20 eV se reconstruyeron a una resolución de 2,26 Å en comparación con los datos recopilados con la rendija de energía completamente abierta que se reconstruyó solo a una resolución de 2,34 Å. La mejor reconstrucción se logró a partir de los datos recopilados utilizando la hendidura de 10 eV que se reconstruyó a una resolución de 2,14 Å. Estos resultados están de acuerdo con la predicción teórica de que el filtrado de los electrones dispersos inelásticamente aumenta el SNR en las imágenes recogidas y facilita una mayor resolución en las reconstrucciones crio-EM a partir del número dado de partículas, como se resume en la Tabla 4. Estos resultados fueron confirmados por los factores B calculados a partir de estos conjuntos de datos que indican una mayor calidad de las imágenes en los conjuntos de datos filtrados por energía.
Por lo tanto, podemos concluir que, si bien los microscopios TEM de 300 kV ofrecen el mayor rendimiento y la mayor resolución posible en las reconstrucciones crio-EM, los microscopios TEM de 200 kV también proporcionan conjuntos de datos de alta calidad para reconstrucciones crio-EM de alta resolución. Demostramos aquí que la calidad de las imágenes adquiridas, y por lo tanto el tiempo general de estructuración, se puede mejorar aún más mediante el uso del TEM de 200 kV equipado con un filtro de energía y un detector de electrones directo. El Protocolo presentado describe todos los pasos necesarios sobre cómo obtener rutinariamente datos crio-EM de alta resolución utilizando esta configuración y revela detalles estructurales finos de estructuras 3D macromoleculares, que son esenciales para comprender las relaciones clave estructura-función en biología estructural y diseño de fármacos basados en estructuras.

La determinación de la estructura de la proteína es fundamental para comprender la arquitectura molecular, la función y la regulación de los complejos de proteínas involucrados en procesos celulares clave, como el metabolismo celular, la transducción de señales o las interacciones huésped-patógeno. La microscopía crioelectrónica (crio-EM) ha surgido como una técnica poderosa capaz de resolver la estructura 3D de muchas proteínas y sus complejos que eran demasiado desafiantes para las técnicas estructurales tradicionales, como la difracción de rayos X y la espectroscopia de RMN. En particular, se ha demostrado que el crio-EM es el método de elección para las proteínas de membrana, que no se pueden cristalizar fácilmente o preparar en cantidades suficientes para las técnicas estructurales tradicionales, y proporcionó nuevos conocimientos sobre la estructura y función de importantes receptores celulares y canales iónicos 1,2,3,4,5 . Más recientemente, la crio-EM ha desempeñado un papel importante en la lucha contra la pandemia de Covid-19 al determinar el mecanismo de infección por SARS-CoV-2 a nivel molecular, que dilucidó los orígenes de la enfermedad Covid-19 y proporcionó la base para el rápido desarrollo de vacunas y terapias eficientes 6,7,8,9,10.
Por lo general, los microscopios electrónicos de transmisión (TEM) de 300 kV de alta gama se utilizan para la determinación de la estructura de alta resolución de biomoléculas mediante el análisis de partículas únicas (SPA) crio-EM para revelar su conformación e interacciones. Recientemente, la técnica SPA alcanzó una nueva frontera cuando la muestra común de crio-EM apo-ferritina se reconstruyó a resolución atómica (1.2 Å)11,12 utilizando un TEM de 300 kV equipado con la pistola de emisión de campo frío (E-CFEG), un detector de electrones directo y un filtro de energía. En esta resolución, fue posible resolver inequívocamente las posiciones de los átomos individuales en la estructura, la conformación de las cadenas laterales de aminoácidos individuales, así como el enlace de hidrógeno y otras interacciones, lo que abre nuevas posibilidades para el descubrimiento de nuevos objetivos basados en la estructura y la optimización de los candidatos a fármacos existentes.
Los microscopios TEM de 200 kV de rango medio se utilizan a menudo para el cribado de muestras y la optimización de muestras antes de la recopilación final de datos de alta resolución utilizando los microscopios TEM de gama alta, particularmente en instalaciones crio-EM más grandes. Por lo general, las muestras con imágenes se pueden resolver en el rango de resolución de 3-4 Å que es suficiente para pasar a un TEM de 300 kV de gama alta para la recopilación final de datos. En consecuencia, la recopilación de datos utilizando el TEM de 200 kV a menudo no se optimiza aún más para obtener los resultados de mayor resolución posibles. Además, muchas preguntas biológicas interesantes ya pueden ser respondidas y publicadas a estas resoluciones, ya que todas las cadenas laterales de aminoácidos ya están resueltas, y la ocupación de los sitios de unión de ligandos también se puede determinar de manera confiable13. Ya se ha demostrado que los TEMs de 200 kV pueden alcanzar resoluciones superiores a 3 Å para numerosas muestras 14,15,16,17,18. Las imágenes tomadas a 200 kV exhiben un contraste inherentemente mayor de partículas fotografiadas, lo que incluso puede facilitar una alineación inicial más precisa de las partículas a pesar de una señal más atenuada a alta resolución en comparación con las imágenes TEM de 300 kV. Es importante tener en cuenta que la resolución alcanzada de los mapas crio-EM reconstruidos también está limitada por la flexibilidad estructural y la heterogeneidad conformacional de las muestras fotografiadas, lo que afecta tanto a las reconstrucciones de 200 kV como a las de 300 kV. De hecho, muchas más reconstrucciones crio-EM obtenidas utilizando los sistemas de 300 kV se resolvieron en el rango de resolución de 3-4 Å que en resoluciones más altas19. Como los microscopios TEM de 200 kV son menos complejos y caben en salas más pequeñas, estos microscopios representan una buena opción de menor costo para la determinación de la estructura de macromoléculas biológicas mediante crio-EM, al tiempo que preservan la automatización de largas colecciones de datos de múltiples muestras almacenadas dentro del sistema Autoloader del microscopio.
La recopilación de conjuntos de datos crio-EM para la determinación de estructuras de alta resolución requiere una alineación precisa de la óptica del microscopio. Las alineaciones de columna proceden sistemáticamente desde la fuente de electrones hasta el sistema de lentes del condensador, la lente del objetivo y el filtro de energía con un detector de electrones. Normalmente no se requiere la secuencia completa de alineaciones. Cuando es necesario, el usuario es guiado a través de procedimientos semiautomatizados con una descripción adecuada de cada paso en una ventana de ayuda sensible al contexto durante todo el procedimiento de alineación en la interfaz de usuario del microscopio (panel de control Alineaciones directas). Una vez que el microscopio está completamente alineado, la óptica electrónica permanece estable y las alineaciones no necesitan cambiarse durante al menos unos meses. Solo las alineaciones más sensibles, como la iluminación paralela del plano de muestra, el astigmatismo objetivo y la alineación libre de coma, deben refinarse justo antes de comenzar la recopilación de cada conjunto de datos. La calidad de los datos recopilados se puede monitorear durante la recopilación de datos utilizando diferentes paquetes de software, como EPU Quality Monitor, cryoSPARC Live20, Relion21, Scipion22, WARP23 o Appion24.
Además de las alineaciones precisas del microscopio, la alta calidad de las muestras bien purificadas con una heterogeneidad conformacional y compositiva mínima también es un requisito previo para la recopilación de conjuntos de datos de alta resolución y la resolución de estructuras de alta resolución. Se pueden encontrar más detalles sobre los protocolos típicos, los desafíos frecuentes y los posibles remedios en otras revisiones dedicadas a este tema 25,26,27. Esencialmente, es fundamental encontrar áreas en una cuadrícula crio-EM dada que tenga hielo lo suficientemente delgado como para preservar la información de alta resolución, y las partículas individuales se distribuyen densamente en orientaciones aleatorias sin superposiciones. Sin embargo, las rejillas crio-EM típicas tienen un espesor de hielo no uniforme y, por lo tanto, es importante encontrar y seleccionar las áreas óptimas para la obtención de imágenes. Diferentes medios para la estimación del espesor del hielo en la red están disponibles en paquetes de software dedicados a la recopilación automatizada de conjuntos de datos crio-EM, como EPU 2, Leginon28 o SerialEM29.
El advenimiento de detectores de electrones directos rápidos y sensibles permitió la recopilación de imágenes en muchas fracciones como películas que permitieron la compensación de los movimientos inducidos por el haz y dieron como resultado un aumento sustancial en la calidad y cantidad de datos utilizados en el procesamiento de imágenes y la reconstrucción final en 3D30. Al mismo tiempo, la automatización y la recopilación de datos de alto rendimiento proporcionan enormes conjuntos de datos con miles de imágenes / películas que representan desafíos para el almacenamiento y el acceso a los datos. El modelo adoptado con grandes instalaciones de crio-EM que sirven a decenas a cientos de usuarios, especialmente requiere una gestión de datos organizada con un seguimiento adecuado y el intercambio de datos en tuberías de cryo-EM establecidas31,32.
Este estudio describe un protocolo para la recolección rutinaria de conjuntos de datos crio-EM de alta resolución utilizando el microscopio TEM Glacios de 200 kV. Las alineaciones necesarias de la óptica del microscopio se describen junto con los procedimientos para la evaluación de muestras crio-EM y la selección de áreas adecuadas para la recopilación de datos de alta resolución. La organización de los datos recopilados y los metadatos relacionados con la información de muestra se demuestra en Athena, una plataforma de gestión de datos que facilita la revisión de la información de la muestra y los datos recopilados. Utilizando la muestra de apo-ferritina del ratón, fue posible lograr una reconstrucción 3D a una resolución de 1,6 Å13. Utilizando el protocolo descrito, también reconstruimos el mapa de densidad 3D del proteasoma 20S de Thermoplasma acidophilum a una resolución de 2.1 Å.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>AutoGrid rings</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>1036173</td>
			<td>Package of 100x AutoGrid rings for the standard EM grids.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C-Clip</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>1036171</td>
			<td>Package of 100 clips that secure 
			the standard EM grids inside the AutoGrid rings.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Data Management Platform</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>1160939</td>
			<td>Part of the Glacios base configuraiton; includes Athena Software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EPU Quality Monitor</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>1179770</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EPU Software</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>1025080</td>
			<td>Part of the Glacios base configuration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethane 3.5</td>
			<td>Westfalen</td>
			<td>A06010110</td>
			<td>Ethane gas used for making liquid ethane (puritiy at least N35, i.e. 99.95% vol)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 4 200kV</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>1166936</td>
			<td>Direct electron detector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glacios</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>1149551</td>
			<td>200 kV TEM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GloQube Plus Glow Discharge System for TEM Grids and surface modification</td>
			<td>Quorum</td>
			<td>N/A</td>
			<td>also available via Thermo Fisher Scientific (PN 1160602)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuantiFoil grids</td>
			<td>Quantifoil</td>
			<td>N/A</td>
			<td>R-2/1, 300 mesh; carbon foil grid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Relion</td>
			<td>MRC Laboratory of Molecular Biology</td>
			<td>N/A</td>
			<td>open source software: 
			https://relion.readthedocs.io/en/release-3.1/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Selectris with Falcon 
			4 for 200 kV</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>1191753</td>
			<td>Energy filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Selectris X with Falcon 
			4 for 200 kV</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>1191755</td>
			<td>Energy filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltrAuFoil grids</td>
			<td>Quantifoil</td>
			<td>N/A</td>
			<td>R-1.2/1.2, 300 mesh; gold foil grids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vitrobot Mk. IV</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>1086439</td>
			<td>Automated vitrification system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman 595 filter paper</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AA00420S</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

routine collection of high-resolution cryo-em datasets using 200 kv transmission electron microscope

La microscopía crioelectrónica (crio-EM) se ha establecido como un método de rutina para la determinación de la estructura de proteínas durante la última década, tomando una parte cada vez mayor de los datos estructurales publicados. Los recientes avances en la tecnología TEM y la automatización han aumentado tanto la velocidad de recopilación de datos como la calidad de las imágenes adquiridas, al tiempo que disminuyen el nivel requerido de experiencia para obtener mapas crio-EM a resoluciones inferiores a 3 Å. Si bien la mayoría de estas estructuras de alta resolución se han obtenido utilizando sistemas crio-TEM de 300 kV de última generación, las estructuras de alta resolución también se pueden obtener con sistemas crio-TEM de 200 kV, especialmente cuando están equipadas con un filtro de energía. Además, la automatización de las alineaciones del microscopio y la recopilación de datos con la evaluación de la calidad de la imagen en tiempo real reduce la complejidad del sistema y garantiza una configuración óptima del microscopio, lo que resulta en un mayor rendimiento de imágenes de alta calidad y un rendimiento general de la recopilación de datos. Este protocolo demuestra la implementación de los recientes avances tecnológicos y características de automatización en un microscopio electrónico de criotransmisión de 200 kV y muestra cómo recopilar datos para la reconstrucción de mapas 3D que son suficientes para la construcción de modelos atómicos de novo . Nos centramos en las mejores prácticas, las variables críticas y los problemas comunes que deben considerarse para permitir la recopilación rutinaria de dichos conjuntos de datos crio-EM de alta resolución. En particular, se revisan en detalle los siguientes temas esenciales: i) automatización de alineaciones de microscopios, ii) selección de áreas adecuadas para la adquisición de datos, iii) parámetros ópticos óptimos para la recopilación de datos de alta calidad y alto rendimiento, iv) ajuste del filtro de energía para imágenes de pérdida cero, y v) gestión de datos y evaluación de calidad. La aplicación de las mejores prácticas y la mejora de la resolución alcanzable utilizando un filtro de energía se demostrará en el ejemplo de apo-ferritina que se reconstruyó a 1,6 Å, y thermoplasma acidophilum 20S proteasoma reconstruido a resolución 2,1-Å utilizando un TEM de 200 kV equipado con un filtro de energía y un detector de electrones directo.

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Routine Collection of High-Resolution cryo-EM Datasets Using 200 KV Transmission Electron Microscope

Los mapas crio-EM de alta resolución de macromoléculas también se pueden lograr mediante el uso de microscopios TEM de 200 kV. Este protocolo muestra las mejores prácticas para establecer alineaciones ópticas precisas, esquemas de adquisición de datos y selección de áreas de imágenes que son esenciales para la recopilación exitosa de conjuntos de datos de alta resolución utilizando un TEM de 200 kV.

Recopilación rutinaria de conjuntos de datos crio-EM de alta resolución utilizando un microscopio electrónico de transmisión de 200 KV

Cryo-electron microscopy (cryo-EM) has been established as a routine method for protein structure determination during the past decade, taking an ...

Cryo-EM se ha convertido en una técnica estándar para la determinación de la estructura de las proteínas y sus complejos. Este protocolo describe las mejores prácticas para obtener conjuntos de datos Cryo-EM de alta resolución a partir de los microscopios TEM de 200 kV de rango medio. Cryo-EM puede determinar la estructura de la proteína en condiciones casi nativas en solución para múltiples estados conformacionales y estados funcionales simultáneamente, lo cual es difícil de alcanzar para otras técnicas estructurales.La información estructural obtenida se puede utilizar para la elucidación de los mecanismos moleculares de la función de la proteína, así como para el diseño de fármacos basados en la estructura. Por ejemplo, una publicación reciente en la estructura de las fibrillas amiloides reveló múltiples sitios de unión de un ligando vital. Sin embargo, en este protocolo, utilizamos las muestras estándar de apoferritina y proteasoma para demostrar los pasos críticos en la obtención de datos Cryo-EM de alta resolución.La operación de un Cryo-TEM se ha vuelto más fácil en los últimos años, especialmente debido a la introducción de funciones avanzadas de automatización. Sin embargo, para la primera sesión, le aconsejamos que tenga una capacitación con usuarios más experimentados. A partir de ahí, la progresión en la técnica es relativamente rápida.La demostración del procedimiento será Adrian Koh, quien es un científico senior de aplicaciones en Thermo Fisher Scientific. Inserte rejillas automáticas en el cassette del cargador automático en condiciones de nitrógeno líquido. Inserte el cassette con rejillas automáticas en una cápsula de transferencia refrigerada por nitrógeno líquido.Inserte la cápsula en el microscopio y haga clic en el botón Dock en la interfaz de usuario del microscopio para cargar el cassette desde la cápsula en el cargador automático del microscopio. Haga clic en el botón Inventario para verificar la presencia de cuadrículas automáticas en el casete cargado. Luego haga clic en los botones Cargar y Descargar para insertar las cuadrículas automáticas en la columna para imágenes TEM.Seleccione la pestaña Atlas y haga clic en el botón Nueva sesión para abrir una nueva sesión. Complete detalles como el nombre de la sesión y la ubicación de almacenamiento de datos y haga clic en el botón Aplicar. Seleccione las cuadrículas de interés seleccionando una casilla de verificación junto al número de cuadrícula correspondiente.Haga clic en el botón Inicio para iniciar una colección totalmente automatizada de atlas de todas las cuadrículas seleccionadas. Cuando se complete la colección, haga clic en las etiquetas de la cuadrícula para revisar los atlas adquiridos. Seleccione la pestaña EPU y vaya a Nueva sesión para crear una nueva sesión en el panel izquierdo.Seleccione la opción Nueva sesión para utilizar los ajustes preestablecidos ópticos establecidos actualmente. Rellene el nombre de la sesión. Seleccione el tipo manual de la sesión para tener control sobre la selección de taladros individuales y cuadrados de cuadrícula seleccionados para la recopilación de datos más adelante en el protocolo.Seleccione el modo de adquisición más rápido para utilizar el cambio de imagen sin aberraciones para la recopilación de datos. A continuación, introduzca la ubicación para guardar los metadatos. Haga clic en el botón Aplicar para crear una nueva sesión.Seleccione la tarea de selección de cuadrados en el panel izquierdo para mostrar el atlas recopilado de la cuadrícula. Identifique los cuadrados de la rejilla con la lámina de soporte intacta sin daños, el hielo vítreo delgado y los orificios de la lámina, la contaminación insignificante del hielo cristalino en el cuadrado de la rejilla y el gradiente de brillo mínimo a través del cuadrado de la rejilla y dentro de los orificios individuales de la lámina. Seleccione los cuadrados de cuadrícula para la recopilación de datos, ya sea en el atlas completo o en imágenes de mosaico de alta calidad.Haga clic con el botón derecho en un cuadrado de cuadrícula de interés y elija toda la tarea de selección. Haga clic en el botón Auto Eucentric para moverse automáticamente al primer cuadrado de cuadrícula seleccionado. Ajuste la altura eucéntrica y adquiera una imagen cuadrada de cuadrícula para encontrar agujeros de lámina.Haga clic en el botón Buscar agujeros para encontrar agujeros de lámina en la imagen. Haga clic en el botón Quitar taladros para cerrar el botón de la barra de cuadrícula y anular la selección de taladros cerca de las barras de cuadrícula. Ajuste los límites en el histograma de brillo del filtro de hielo para eliminar todos los agujeros con hielo demasiado grueso y todos los orificios vacíos.Haga clic con el botón derecho en un agujero en la imagen cuadrada de la cuadrícula y seleccione mover etapa a la ubicación mover etapa aquí. Seleccione la tarea de definición de plantilla en el panel izquierdo. Haga clic en el botón Adquirir para adquirir una imagen completa.Establezca valores para el retraso después del cambio de imagen a 0,5 segundos y el retraso después del cambio de etapa a cinco segundos. Haga clic en el botón Buscar y centrar taladro para centrar un taladro en la imagen. Seleccione el botón Agregar área de adquisición y haga clic en la imagen para seleccionar la ubicación en el orificio centrado donde se realizará la adquisición de imágenes de alta ampliación.Seleccione el botón Agregar área de enfoque automático y haga clic en la imagen para seleccionar la ubicación en la lámina de soporte junto al orificio centrado donde se realizará el enfoque automático de la imagen. Haga clic en el área de adquisición verde para establecer una secuencia de valores de desenfoque en la lista de desenfoque en la sección superior de la ventana del software. Después de establecer la configuración específica del enfoque automático, elija la opción Después del centrado para enfocar automáticamente al inicio de cada clúster AFIS.Elija la opción Lente de objetivo para un enfoque automático más rápido y una deriva de etapa reducida. Haga clic en el botón Preparar todos los cuadrados en la tarea de selección de taladros para establecer automáticamente la recopilación de datos y todos los demás cuadrados de cuadrícula seleccionados de acuerdo con la configuración utilizada en este primer cuadrado de cuadrícula. Seleccione la tarea de definición de plantilla, adquiera una nueva imagen, mueva el escenario a un área limpia en papel de carbón haciendo clic con el botón derecho y seleccione la opción de menú mover etapa aquí.Seleccione la ficha Funciones automáticas. Después de configurar el desenfoque deseado y la iteración, cambie al ajuste preestablecido de enfoque automático y haga clic en el botón de inicio para ejecutar la función de enfoque automático. Seleccione la tarea Autostigmate, cambie al ajuste preestablecido Thon Ring y presione el botón Inicio.Seleccione la tarea Autocoma y pulse el botón Inicio. Mueva el escenario a un área con un cuadrado de cuadrícula roto. Confirme la transparencia del área tomando una sola imagen de enfoque automático.Abra Sherpa UI y seleccione la aplicación Filtro de energía. Haga clic en el botón Centrar y la opción de pérdida cero para centrar la ranura del filtro de energía de pérdida cero. Haga clic en el botón Sintonizar en la opción de isocromaticidad.Haga clic en la opción Ajustar aumento y ajustar distorsiones en las distorsiones geométricas y cromáticas. Vaya a la pestaña EPU, seleccione la tarea Adquisición automatizada y haga clic en el botón Iniciar ejecución para comenzar la recopilación de datos totalmente automatizada. La figura muestra cuadrículas Cryo-EM que muestran un gradiente de espesor de hielo sobre la superficie de la rejilla.Las rejillas excluidas de la investigación adicional son la rejilla mala con hielo grueso y una rejilla doblada con hielo malo y contaminación, mientras que las rejillas aceptables son aquellas con buen gradiente de hielo y una rejilla típica con buen hielo delgado y pequeño gradiente de hielo. La figura muestra la representación 3D final del mapa cryo-EM de apoferritina reconstruido. La alta estabilidad y simetría lo convierten en una muestra de referencia óptima para imágenes Cryo-EM de alta resolución y procesamiento de imágenes.El pulido bayesiano, el refinamiento de CTF y la corrección de la esfera de Ewald dieron como resultado un mapa de resolución de 1.63 angstrom. La figura muestra una vista detallada del mapa cryo-EM de apoferritina reconstruido a nivel de cadena lateral de aminoácidos individuales. La densidad de las cadenas laterales de aminoácidos está bien resuelta y el modelo atómico se puede construir inequívocamente dentro del mapa.La imagen aquí muestra dos conjuntos de datos diferentes a diferentes valores de desenfoque recopilados de la misma cuadrícula Cryo-EM con cuadrados de cuadrícula similares con una hendidura completamente abierta y una ranura de 10 electronvoltios que indica que la ranura de 10 electronvoltios mejora significativamente el contraste de la imagen. La figura aquí muestra una descripción general del mapa Cryo-EM del proteasoma 20S con subunidades segmentadas utilizadas como muestra estándar de Cryo-EM. Y su vista ampliada con un modelo atómico ajustado representa el núcleo catalítico estable del complejo proteasoma con la simetría D7.El protocolo contiene dos pasos críticos. Uno, buscando áreas con hielo vítreo delgado que contenga partículas homogéneas. Y dos, configurar la iluminación paralela para la adquisición de datos.Con las reconstrucciones de alta resolución de proteínas que logran de dos a tres angstroms en resolución, puede comprender mejor los mecanismos moleculares de la enfermedad y mejorar los plomos de los medicamentos. Anteriormente, la cristalización era necesaria si se quería estudiar la base estructural de los fenómenos biológicos. Hoy con Cryo-EM, eso ya no es necesario.Y así, con Cryo-EM, permitimos a los científicos estudiar una gama más amplia de fenómenos biológicos a nivel estructural.

Research

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A Robust Single-Particle Cryo-Electron Microscopy (cryo-EM) Processing Workflow with cryoSPARC, RELION, and Scipion

A Robust Single-Particle Cryo-Electron Microscopy cryo-EM Processing Workflow with cryoSPARC, RELION, and Scipion

Un robusto flujo de trabajo de procesamiento de criomicroscopía electrónica de una sola partícula (cryo-EM) con cryoSPARC, RELION y Scipion

Recent advances in both instrumentation and image processing software have made single-particle cryo-electron microscopy (cryo-EM) the preferred method ...

Advancing High-Resolution Imaging of Virus Assemblies in Liquid and Ice

Avance de imágenes de alta resolución de ensamblajes de virus en líquido y hielo

Interest in liquid-electron microscopy (liquid-EM) has skyrocketed in recent years as scientists can now observe real-time processes at the nanoscale. It ...