Name: routine collection of high-resolution cryo-em datasets using 200 kv transmission electron microscope
Uploaded: 2022-03-16T14:00:00
Duration: 9 min 49 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Routine Collection of High-Resolution cryo-EM Datasets Using 200 KV Transmission Electron Microscope at JoVE.com

<ol>
	<li>Wang, J., Hua, T., Liu, Z. -. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+features+of+activated+GPCR+signaling+complexes.">Structural features of activated GPCR signaling complexes.</a> Current Opinions in Structural Biology. 63, 82-89 (2020).</li><li>Chen, S., Gouaux, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+mechanism+of+AMPA+receptor+-+auxiliary+protein+complexes.">Structure and mechanism of AMPA receptor - auxiliary protein complexes.</a> Current Opinions in Structural Biology. 54, 104-111 (2019).</li><li>K&#252;hlbrandt, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+mechanisms+of+F-Type+ATP+synthases.">Structure and mechanisms of F-Type ATP synthases.</a> Annual Review of Biochemistry. 88, 515-549 (2019).</li><li>Laverty, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo-EM+structure+of+the+human+&#945;1&#946;3&#947;2+GABA+A+receptor+in+a+lipid+bilayer.">Cryo-EM structure of the human &#945;1&#946;3&#947;2 GABA A receptor in a lipid bilayer.</a> Nature. 565 (7740), 516-520 (2019).</li><li>Liu, F., Zhang, Z., Csan&#225;dy, L., Gadsby, D. C., Chen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+structure+of+the+Human+CFTR+ion+channel.">Molecular structure of the Human CFTR ion channel.</a> Cell. 169 (1), 85-95 (2017).</li><li>Wrapp, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo-EM+structure+of+the+2019-nCoV+spike+in+the+prefusion+conformation.">Cryo-EM structure of the 2019-nCoV spike in the prefusion conformation.</a> Science. 367 (6483), 1260-1263 (2020).</li><li>Ke, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structures+and+distributions+of+SARS-CoV-2+spike+proteins+on+intact+virions.">Structures and distributions of SARS-CoV-2 spike proteins on intact virions.</a> Nature. 588, 498-502 (2020).</li><li>Yan, R., Zhang, Y., Li, Y., Xia, L., Guo, Y., Zhou, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+for+the+recognition+of+SARS-CoV-2+by+full-length+human+ACE2.">Structural basis for the recognition of SARS-CoV-2 by full-length human ACE2.</a> Science. 367 (6485), 1444-1448 (2020).</li><li>Walls, A. C., Park, Y. -. J., Tortorici, M. A., Wall, A., McGuire, A. T., Veesler, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure,+function,+and+antigenicity+of+the+SARS-CoV-2+spike+glycoprotein.">Structure, function, and antigenicity of the SARS-CoV-2 spike glycoprotein.</a> Cell. 180, 281-292 (2020).</li><li>Chiba, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multivalent+nanoparticle-based+vaccines+protect+hamsters+against+SARS-CoV-2+after+a+single+immunization.">Multivalent nanoparticle-based vaccines protect hamsters against SARS-CoV-2 after a single immunization.</a> Communications Biology. 4 (1), 597 (2021).</li><li>Nakane, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-particle+cryo-EM+at+atomic+resolution.">Single-particle cryo-EM at atomic resolution.</a> Nature. 587, 152-156 (2020).</li><li>Bai, X. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Seeing+atoms+by+single-particle+Cryo-EM.">Seeing atoms by single-particle Cryo-EM.</a> Trends in Biochemical Sciences. 46 (4), 253-254 (2021).</li><li>Koh, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+cryo-EM+at+200kV+enabled+by+Selectris-X+and+Falcon+4.">High-resolution cryo-EM at 200kV enabled by Selectris-X and Falcon 4.</a> Microscience Microscopy Congress 2021. , (2021).</li><li>Herzik, M. A., Wu, M., Lander, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Achieving+better-than-3-&#197;+resolution+by+single-particle+cryo-EM+at+200+keV.">Achieving better-than-3-&#197; resolution by single-particle cryo-EM at 200 keV.</a> Nature Methods. 14 (11), 1075-1078 (2017).</li><li>Herzik, M. A., Wu, M., Lander, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+structure+determination+of+sub-100+kDa+complexes+using+conventional+cryo-EM.">High-resolution structure determination of sub-100 kDa complexes using conventional cryo-EM.</a> Nature Communications. 10 (1), 1032 (2019).</li><li>Wu, M., Lander, G. C., Herzik, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sub-2+Angstrom+resolution+structure+determination+using+single-particle+cryo-EM+at+200+keV.">Sub-2 Angstrom resolution structure determination using single-particle cryo-EM at 200 keV.</a> Journal of Structural Biology X. 4, 100020-100029 (2020).</li><li>Mori, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=C-Glycoside+metabolism+in+the+gut+and+in+nature:+Identification,+characterization,+structural+analyses+and+distribution+of+C-C+bond-cleaving+enzymes.">C-Glycoside metabolism in the gut and in nature: Identification, characterization, structural analyses and distribution of C-C bond-cleaving enzymes.</a> Nature Communications. 12 (1), 6294 (2021).</li><li>Hamdi, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=2.7+&#197;+cryo-EM+structure+of+vitrified+M.+musculus+H-chain+apoferritin+from+a+compact+200+keV+cryo-microscope.">2.7 &#197; cryo-EM structure of vitrified M. musculus H-chain apoferritin from a compact 200 keV cryo-microscope.</a> PLoS One. 15 (5), 0232540 (2020).</li><li>Abbott, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EMDB+web+resources.">EMDB web resources.</a> Current Protocols in Bioinformatics. 61 (1), 1-12 (2018).</li><li>Punjani, A., Rubinstein, J. L., Fleet, D. J., Brubaker, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CryoSPARC:+algorithms+for+rapid+unsupervised+cryo-EM+structure+determination.">CryoSPARC: algorithms for rapid unsupervised cryo-EM structure determination.</a> Nature Methods. 14 (3), 290-296 (2017).</li><li>Scheres, S. H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RELION:+Implementation+of+a+Bayesian+approach+to+cryo-EM+structure+determination.">RELION: Implementation of a Bayesian approach to cryo-EM structure determination.</a> Journal of Structural Biology. 180 (3), 519-530 (2012).</li><li>G&#243;mez-Blanco, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+Scipion+for+stream+image+processing+at+Cryo-EM+facilities.">Using Scipion for stream image processing at Cryo-EM facilities.</a> Journal of Structural Biology. 204 (3), 457-463 (2018).</li><li>Tegunov, D., Cramer, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+cryo-electron+microscopy+data+preprocessing+with+Warp.">Real-time cryo-electron microscopy data preprocessing with Warp.</a> Nature Methods. 16 (11), 1146-1152 (2019).</li><li>Lander, G. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Appion:+an+integrated,+database-driven+pipeline+to+facilitate+EM+image+processing.">Appion: an integrated, database-driven pipeline to facilitate EM image processing.</a> Journal of Structural Biology. 166 (1), 95-102 (2009).</li><li>Carragher, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+outcomes+when+optimizing+'standard'+sample+preparation+for+single-particle+cryo-EM.">Current outcomes when optimizing 'standard' sample preparation for single-particle cryo-EM.</a> Journal of Microscopy. 276 (1), 39-45 (2019).</li><li>Drulyte, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Approaches+to+altering+particle+distributions+in+cryo-electron+microscopy+sample+preparation.">Approaches to altering particle distributions in cryo-electron microscopy sample preparation.</a> Acta Crystallographica. Section D, Structural Biology. 74 (6), 560-571 (2018).</li><li>Bloch, M., Santiveri, M., Taylor, N. M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+protein+Cryo-EM:+Cryo-grid+optimization+and+data+collection+with+protein+in+detergent.">Membrane protein Cryo-EM: Cryo-grid optimization and data collection with protein in detergent.</a> Methods in Molecular Biology. 2127, 227-244 (2020).</li><li>Cheng, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leginon:+New+features+and+applications.">Leginon: New features and applications.</a> Protein Science. 30 (1), 136-150 (2021).</li><li>Schorb, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Software+tools+for+automated+transmission+electron+microscopy.">Software tools for automated transmission electron microscopy.</a> Nature Methods. 16 (6), 471-477 (2019).</li><li>Li, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+counting+and+beam-induced+motion+correction+enable+near-atomic-resolution+single-particle+cryo-EM.">Electron counting and beam-induced motion correction enable near-atomic-resolution single-particle cryo-EM.</a> Nature Methods. 10 (6), 584-590 (2013).</li><li>Alewijnse, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Best+practices+for+managing+large+CryoEM+facilities.">Best practices for managing large CryoEM facilities.</a> Journal of Structural Biology. 199, 225-236 (2017).</li><li>Baldwin, P. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Big+data+in+cryoEM:+automated+collection,+processing+and+accessibility+of+EM+data.">Big data in cryoEM: automated collection, processing and accessibility of EM data.</a> Current Opinion in Microbiology. 43, 1-8 (2018).</li><li>Guo, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron-event+representation+data+enable+efficient+cryoEM+file+storage+with+full+preservation+of+spatial+and+temporal+resolution.">Electron-event representation data enable efficient cryoEM file storage with full preservation of spatial and temporal resolution.</a> International Union of Crystallography Journal. 7, 860-869 (2020).</li><li>Weis, F., Hagen, W. J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combining+high+throughput+and+high+quality+for+cryo-electron+microscopy+data+collection.">Combining high throughput and high quality for cryo-electron microscopy data collection.</a> Acta Crystallographica. Section D, Structural Biology. 76 (8), 724-728 (2020).</li><li>Zhou, H., Chiu, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+icosahedral+virus+structures+by+electron+cryomicroscopy+at+subnanometer+resolution.">Determination of icosahedral virus structures by electron cryomicroscopy at subnanometer resolution.</a> Advances in Protein Chemistry. 64, 93-124 (2005).</li><li>DeRosier, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correction+of+high-resolution+data+for+curvature+of+the+Ewald+sphere.">Correction of high-resolution data for curvature of the Ewald sphere.</a> Ultramicroscopy. 81 (2), 83-98 (2000).</li><li>Wolf, M., DeRosier, D. J., Grigorieff, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ewald+sphere+correction+for+single-particle+electron+microscopy.">Ewald sphere correction for single-particle electron microscopy.</a> Ultramicroscopy. 106 (4-5), 376-382 (2006).</li><li>Leong, P. A., Yu, X., Hong Zhou, Z., Jensen, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correcting+for+the+ewald+sphere+in+high-resolution+single-particle+reconstructions.">Correcting for the ewald sphere in high-resolution single-particle reconstructions.</a> Methods in Enzymology. 482, 369-380 (2010).</li><li>Zivanov, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+tools+for+automated+high-resolution+cryo-EM+structure+determination+in+RELION-3.">New tools for automated high-resolution cryo-EM structure determination in RELION-3.</a> eLife. 7, 42166 (2018).</li></ol>

Sagar Khavnekar rapporterar inga intressekonflikter. De andra författarna är anställda vid Thermo Fisher Scientific, MSD-EM-divisionen.

Det beskrivna protokollet förutsätter att optiken hos det använda TEM-mikroskopet är i ett väljusterat tillstånd. För TEM på 200 kV som används i detta protokoll görs, verifieras och sparas sådana kolumnjusteringar av en erfaren servicetekniker efter mikroskopinstallation eller någon betydande serviceintervention. Dessa justeringsinställningar kan återkallas när som helst i mikroskopets användargränssnitt. Användare kan använda direct alignment-procedurerna i mikroskopgränssnittet för att justera kritiska parametrar igen. Vissa inriktningar, såsom pistollutning och pistolförskjutning, är stabila och behöver inte justeras av användare dagligen. Kontroller och omjusteringar (om så krävs) av pistollutning och förskjutning av mikroskopövervakaren rekommenderas två gånger om året. Å andra sidan är vissa anpassningar kritiska och måste anpassas före varje datainsamling som beskrivs i protokollet ovan (såsom objektiv astigmatism och komafri anpassning). Om Autokoma-funktionen i analysprogramvaran inte konvergerar, bör justering av strålens lutningssvängpunkter och/eller rotationscentrum verifieras och justeras, och korrekt centrering av C2-bländaren bör bekräftas. Därefter bör Autostigmate-funktionen köras eftersom objektiva stigmatorer också används för komakorrigering. Dessa justeringar bör itereras tills både Autostigmate och Autocomafunctions lyckas med sin första iteration. Vid behov kan ett annat område väljas (t.ex. stödja kolfolie utan is), avbildad defokus justeras eller bildförvärvstiden ökas för att optimera signal-brusförhållandet i förvärvade bilder och synligheten för flera Thon-ringar i Fourier-transformen av de förvärvade bilderna.
Moderna kryo-EM-mikroskop genererar stora mängder data som ofta överstiger 1 TB per dataset för att uppnå högupplösta 3D-rekonstruktioner, särskilt för proteiner med låg symmetri. Cryo-EM-data och resultat kompletteras också vanligtvis med data och resultat från ortogonala metoder för att fullt ut förstå struktur-funktionsrelationer i varje vetenskapligt projekt. Organisering av insamlade data, deras överföring till en bildbehandlingspipeline och delning av en resulterande kryo-EM-rekonstruktion bland medarbetare ställer ytterligare krav på nya adoptörer av kryo-EM-metodik för att inrätta sin lokala IT-infrastruktur. Datahanteringsprogramvara, såsom Athena, underlättar centraliserad lagring av data som förvärvats av alla anslutna instrument eller program som drivs av en registrerad användare. Lagrade data och metadata är tillgängliga med ett enkelt webbläsargränssnitt för flera användare, som kan ha olika roller i projektet med olika åtkomsträttigheter (antingen som ägare, medarbetare eller tittare) baserat på deras inloggningsuppgifter och datadelningsdefinition i experimentkonfigurationen. Denna digitalisering av experimentella arbetsflöden ger möjlighet till data- och metadatadelning mellan medarbetare utan onödigt dubbelarbete och ökar produktiviteten och spårbarheten för använda arbetsflöden. Implementering av en allmän och anpassningsbar struktur av projekt, experiment och arbetsflöden i datahanteringsprogramvara är universell och möjliggör anpassning och integration av ortogonala experiment med hjälp av kompletterande metoder i en enda projektdatabas.
Valet av områden för datainsamling på ett kryo-EM-nät är avgörande för ett framgångsrikt förvärv av högupplösta dataset. Cryo-EM-galler som produceras med traditionella fallfrysningsanordningar, såsom Vitrobot (ett helautomatiserat förglasningssystem), kommer vanligtvis att visa en gradient av istjocklek över gallerytan (figur 4). Detta kan vara fördelaktigt eftersom gallret innehåller områden med olika istjocklekar; Områden med den ideala istjockleken för datainsamling måste dock identifieras enligt beskrivningen i protokollet ovan. Ett optimalt kryo-EM-nät bör innehålla så lite överföringsisförorening som möjligt och innehålla tillräckligt med rutnätsrutor med intakt hålig stödfolie. Insamling av data om rutnätsrutor som har sprickor eller trasiga områden rekommenderas inte eftersom insamlade bilder kommer att påverkas av betydligt starkare total drift vid belysning av en elektronstråle jämfört med rutnätsrutorna med intakt stödfolie. Överskott av kristallin is kan täppa till majoriteten av foliehålen och / eller störa autofokusering och sådana rutnätsrutor bör också undvikas. Rutnätsrutor med tunn is uppvisar vanligtvis stora glasytor och många ljusa foliehål som syns i en bild tagen med Atlas-förinställningen. Förekomsten av tjockare is nära gallerstänger är att förvänta sig och okritisk eftersom foliehål i dessa områden av rutnätstorget utesluts under hålvalsförfarandet. Närvaron av flera tomma hål i en rutnätskvadrat kan betyda att glasris i de omgivande hålen är extremt tunn och kan innehålla skadade partiklar eller inga partiklar alls. I allmänhet är det klokt att välja rutnätsrutor med olika istjocklekar vid olika regioner på nätet för inledande screening och bedömning för att förstå vilka områden som har de bästa förutsättningarna för högupplöst datainsamling och uppvisar den ideala partikeldensiteten och orienteringsfördelningen. För de apoF- och 20S-proteasomprover som används i denna studie innehåller områden med den tunnaste observerbara isen de bästa förutsättningarna för högupplöst avbildning av dessa prover.
När du väljer hål automatiskt i alla valda rutnätsrutor med hjälp av datainsamlingsprogramvaran rekommenderas det att utföra mallkörningsuppgift på ett representativt hål i varje rutnätsruta för att kontrollera och säkerställa att varken alltför tjocka eller alltför tunna eller oväntat icke-glasrutor valdes för datainsamling. Under datainsamlingen kan viktiga kvalitetsindikatorer för insamlade bilder, såsom bilddrift och CTF-montering, övervakas med EQM. Datainsamlingen kan sedan optimeras genom att hoppa över områden som ger bilder av dålig kvalitet. Bilder med högupplösta CTF-passningar kan dock fortfarande innehålla bilder med partiklar i några få föredragna riktningar eller partiklar denaturerade i ett för tunt islager. Partikelplockning i realtid och 2D-klassificering från insamlade bilder skulle ge ytterligare information om kvaliteten på strukturdata i avbildade partiklar och avslöja både föredragna orienteringar av intakta partiklar i is eller inkonsekvent struktur av (delvis) denaturerade partiklar. Beräkning av klassmedelvärde kan därför bidra till att ytterligare förfina lämpliga regioner för datainsamling, vilket redan har implementerats och visats i andra programvarupaket23,28.
Val av avbildningsinställningar för datainsamling, såsom förstoring, elektrondosrat och defokusområde, beror på flera kriterier, såsom målupplösning, proteinets storlek, provkoncentration, önskad mikroskopgenomströmning etc. För den direkta elektrondetektorkameran som användes i dessa experiment valdes elektrondosraten i intervallet 4-5 e-/pix/s genom att välja en lämplig SPOT-storlek och intensitet för att upprätthålla parallell belysning. Som visas i tabell 1 kan en annan SPOT-storlek användas i förinställningen Hål/Eucentrisk höjd för att säkerställa tillräckligt signal-brusförhållande i bilden för centrering av hål under datainsamling. Förstoringen bör väljas så att pixelstorleken är minst 2-3x mindre än målupplösningen för kryo-EM-rekonstruktionen. Den högre förstoringen (dvs. mindre pixelstorlek) används dock, det mindre synfältet fångas i bilder och det finns mindre partiklar per bild, vilket i slutändan leder till längre datainsamlingstid för att samla in bilder med tillräckligt med partiklar för att rekonstruera 3D-kartor till en hög upplösning. För apoF-provet använde vi pixelstorleken 0,43 Å eftersom vi hade tillräcklig provkoncentration för hög densitet av partiklar i bilder och riktade sub-2 Å upplösning av rekonstruktionen. För 20S-proteasomprovet använde vi pixelstorleken 0,68 Å för att täcka ett större synfält i förvärvade bilder. Typiskt för 200 kV TEM-mikroskop förvärvas kryo-EM-bilder i defokusområdet från 0,8 till 2,0 μm. Men med det förbättrade kontrast- och signalbrusförhållandet med hjälp av energifiltret kan datainsamlingar göras mycket närmare fokus för att bättre bevara högupplöst information i förvärvade bilder på grund av mindre avvikelser och motsvarande minskat sönderfall av CTF-kuvertfunktionen. Vi använder inte heller en objektiv bländare eftersom bländaren kan införa ytterligare bildavvikelser medan bildkontrasten redan är tillräckligt förbättrad genom att använda energifiltret. För apoF- och 20S-proteasomproverna använde vi defokusinställningarna på 0,5 μm, 0,7 μm och 0,9 μm. För mindre proteiner (<200 kDa) använde vi defokusinställningar på -0,5 μm, -0,7 μm och -0,9 μm för att förbättra partiklarnas kontrast och underlätta enklare partikelplockning och initial grov inriktning i 3D-förfiningssteget för 3D-rekonstruktion, vilket ledde till ~ 2,5 Å upplösning 3D-kartor (opublicerade resultat).
Vi har redan visat att avbildning med ett energifilter förbättrar signal-brusförhållandet (SNR) i kryo-EM-bilder som samlats in på de avancerade 300 kV TEM-mikroskopen11. Faktum är att när elektroner passerar genom ett prov uppstår två huvudtyper av interaktioner: i) Elastiskt spridda elektroner bibehåller sin energi och bidrar till bildbildning genom störningar i den icke-spridda infallande strålen via faskontrastmekanismen ii) oelastiskt spridda elektroner förlorar lite energi i provet och bidrar huvudsakligen till brus i bilder. Därför kan SNR förbättras avsevärt genom att filtrera de oelastiskt spridda elektronerna, som har lägre energi än den infallande strålen och elastiskt utspridda elektroner, med hjälp av en smal energislits. Det är dock viktigt att använda ett tillräckligt stabilt energifilter, såsom Selectris eller Selectris-X, för att kunna använda mycket smala (10 eV eller mindre) slitsar under lång (12+ timmar) automatiserad datainsamling av högupplösta kryoEM-dataset.
Cryo-EM-bilder som förvärvats med 200 kV TEM-mikroskop vid samma förhållanden som med 300 kV TEM-mikroskop uppvisar mindre SNR vid hög upplösning (särskilt <4 Å) på grund av snabbare sönderfall av CTF-kuvertfunktionerna. Följaktligen krävs ett högre antal partiklar (och därmed ett högre antal insamlade bilder) för att uppnå en viss upplösning vid användning av 200 kV TEM. Dessutom är skärpedjupet (10-25 nm i upplösningsområdet 2-3 Å) också cirka 20% mindre i 200 kV-bilder35, vilket innebär att mindre partiklar i isskiktet (vanligtvis 20-50 nm tjockt) kommer att vara helt i fokus och konstruktivt bidra till alla högupplösta funktioner i en beräknad 3D-rekonstruktion om inte defokusvärdena förfinas för varje partikel oberoende av varandra i de senare stadierna av 3D-rekonstruktionsproceduren. För större partiklar (såsom ikosaedriska virioner eller andra makromolekylära sammansättningar) kan partikelstorleken överstiga skärpedjupet vid höga upplösningar och införa fasfel på grund av plan approximation av Ewaldsfären i standard 3D-rekonstruktionsalgoritmerna36. Dessa fel kan förfinas av avancerade algoritmer som redan är implementerade i vanliga kryo-EM-bildbehandlingspaket 37,28,39. Eftersom Ewaldsfären har större krökning i 200 kV-data än 300 kV-data behövs Ewald-sfärkorrigeringen vid relativt lägre upplösningar och/eller för relativt mindre makromolekylära enheter vid användning av 200 kV TEM. Å andra sidan uppvisar 200 kV-bilder högre kontrast av partiklar i tunn is (20-50 nm) som är betydligt tunnare än 200-300 keV-elektronens genomsnittliga fria väg (220-280 nm). Den högre kontrasten bidrar till att förbättra den korrekta globala inriktningen av enskilda partiklar, särskilt för svagt spridda mindre proteiner vars struktur ännu inte är känd, och 3D-referensmodellen är ännu inte väl etablerad.
Här visade vi på exemplet med en 20S proteasom att bildkontrast och kvalitet på samma sätt kan förbättras med ett energifilter när man använder ett 200 kV TEM-mikroskop. Med samma antal partiklar rekonstruerades data som samlats in med hjälp av 20 eV-slitsen till 2,26 Å-upplösning jämfört med data som samlats in med den helt öppnade energislitsen som endast rekonstruerades till 2,34 Å-upplösning. Den bästa rekonstruktionen uppnåddes från data som samlats in med hjälp av 10 eV-slitsen som rekonstruerades till 2,14 Å upplösning. Dessa resultat är i överensstämmelse med den teoretiska förutsägelsen att filtrering av de olastiskt spridda elektronerna ökar SNR i insamlade bilder och underlättar högre upplösning i kryo-EM-rekonstruktioner från det givna antalet partiklar, som sammanfattas i tabell 4. Dessa resultat bekräftades ytterligare av B-faktorer beräknade från dessa dataset som indikerar högre kvalitet på bilderna i de energifiltrerade dataseten.
Vi kan därför dra slutsatsen att medan 300 kV TEM-mikroskop levererar högsta genomströmning och högsta möjliga upplösning i kryo-EM-rekonstruktioner, ger 200 kV TEM-mikroskop också högkvalitativa dataset för högupplösta kryo-EM-rekonstruktioner. Vi visade här att kvaliteten på förvärvade bilder, och därmed den totala tiden till struktur, kan förbättras ytterligare genom att använda 200 kV TEM utrustad med ett energifilter och en direktelektrondetektor. Det presenterade protokollet beskriver alla nödvändiga steg för hur man rutinmässigt kan erhålla högupplösta kryo-EM-data med hjälp av denna inställning och avslöja fina strukturella detaljer om makromolekylära 3D-strukturer, som är väsentliga för att förstå de viktigaste struktur-funktionsförhållandena i strukturbiologi och strukturbaserad läkemedelsdesign.

Bestämning av proteinstruktur är avgörande för att förstå molekylär arkitektur, funktion och reglering av proteinkomplex som är involverade i viktiga cellulära processer, såsom cellmetabolism, signaltransduktion eller värdpatogeninteraktioner. Kryoelektronmikroskopi (kryo-EM) har framstått som en kraftfull teknik som kan lösa 3D-strukturen hos många proteiner och deras komplex som var för utmanande för de traditionella strukturteknikerna, såsom röntgendiffraktion och NMR-spektroskopi. Särskilt har kryo-EM visat sig vara den metod som valts för membranproteiner, som inte lätt kan kristalliseras eller framställas i tillräckliga mängder för de traditionella strukturteknikerna, och gett nya insikter i strukturen och funktionen hos viktiga cellulära receptorer och jonkanaler 1,2,3,4,5 . Senast har kryo-EM spelat en viktig roll i kampen mot Covid-19-pandemin genom att bestämma mekanismen för SARS-CoV-2-infektion på molekylär nivå, vilket belyste ursprunget till Covid-19-sjukdomen och utgjorde grunden för den snabba utvecklingen av effektiva vacciner och terapier 6,7,8,9,10.
Vanligtvis används avancerade 300 kV transmissionselektronmikroskop (TEM) för högupplöst strukturbestämning av biomolekyler genom kryo-EM-enpartikelanalys (SPA) för att avslöja deras konformation och interaktioner. Nyligen nådde SPA-tekniken en ny gräns när det gemensamma riktmärket kryo-EM-prov apo-ferritin rekonstruerades vid atomupplösning (1,2 Å)11,12 med hjälp av en 300 kV TEM utrustad med kallfältsemissionspistolen (E-CFEG), en direktelektrondetektor och ett energifilter. Vid denna upplösning var det möjligt att entydigt lösa positioner för enskilda atomer i strukturen, konformation av enskilda aminosyrasidokedjor samt vätebindning och andra interaktioner, vilket öppnar nya möjligheter för strukturbaserad läkemedelsupptäckt av nya mål och optimering av befintliga läkemedelskandidater.
Mellanklass 200 kV TEM-mikroskop används ofta för provscreening och provoptimering före slutlig högupplöst datainsamling med hjälp av avancerade TEM-mikroskop, särskilt vid större kryo-EM-anläggningar. Vanligtvis kan avbildade prover lösas i upplösningsområdet 3-4 Å som är tillräckligt för att flytta till en avancerad 300 kV TEM för slutlig datainsamling. Följaktligen är datainsamling med hjälp av 200 kV TEM ofta inte ytterligare optimerad för högsta möjliga upplösningsresultat. Dessutom kan många intressanta biologiska frågor redan besvaras och publiceras vid dessa resolutioner eftersom alla aminosyras sidokedjor redan är lösta, och beläggningen av ligandbindningsställen kan också bestämmas på ett tillförlitligt sätt13. Det har redan visats att 200 kV TEM kan nå upplösningar utöver 3 Å för många prover 14,15,16,17,18. Bilder tagna med 200 kV uppvisar i sig högre kontrast av avbildade partiklar, vilket till och med kan underlätta mer exakt initial inriktning av partiklarna trots mer dämpad signal vid hög upplösning jämfört med 300 kV TEM-bilder. Det är viktigt att notera att den uppnådda upplösningen av rekonstruerade kryo-EM-kartor också begränsas av strukturell flexibilitet och konformationsheterogenitet hos avbildade prover, vilket påverkar både 200 kV och 300 kV rekonstruktioner. Faktum är att mycket fler kryo-EM-rekonstruktioner som erhölls med 300 kV-systemen löstes i upplösningsområdet 3-4 Å än vid högreupplösningar 19. Eftersom 200 kV TEM-mikroskop är mindre komplexa och passar in i mindre rum, representerar dessa mikroskop ett bra, billigare alternativ för strukturbestämning av biologiska makromolekyler med kryo-EM samtidigt som automatisering av långa datainsamlingar från flera prover lagrade i mikroskop autoloader-systemet bevaras.
Insamling av kryo-EM-dataset för högupplöst strukturbestämning kräver noggrann anpassning av mikroskopoptiken. Kolonninriktningar fortsätter systematiskt från elektronkällan ner till kondensorlinssystemet, objektivlinsen och energifiltret med en elektrondetektor. Den fullständiga sekvensen av justeringar krävs vanligtvis inte. Vid behov guidas användaren via halvautomatiska procedurer med en korrekt beskrivning av varje steg i ett kontextmedvetet hjälpfönster under hela justeringsproceduren i mikroskopets användargränssnitt (kontrollpanelen för direkta justeringar). När mikroskopet är helt inriktat förblir elektronoptiken stabil och inriktningarna behöver inte ändras på minst några månader. Endast de känsligaste justeringarna, till exempel parallell belysning av provplanet, objektiv astigmatism och komafri justering, måste förfinas precis innan insamlingen av varje datauppsättning påbörjas. Kvaliteten på insamlade data kan sedan övervakas under datainsamling med hjälp av olika mjukvarupaket, såsom EPU Quality Monitor, cryoSPARC Live20, Relion21, Scipion22, WARP23 eller Appion24.
Förutom noggranna anpassningar av mikroskopet är den höga kvaliteten på välrenade prover med minimal konformations- och kompositionell heterogenitet också en förutsättning för insamling av högupplösta dataset och lösning av högupplösta strukturer. Mer information om typiska protokoll, frekventa utmaningar och möjliga lösningar finns i andra recensioner tillägnad detta ämne 25,26,27. I huvudsak är det viktigt att hitta områden på ett visst kryo-EM-nät som har tillräckligt tunn is för att bevara högupplöst information, och enskilda partiklar fördelas tätt vid slumpmässiga orienteringar utan överlappningar. Typiska kryo-EM-nät har emellertid ojämn istjocklek, och det är därför viktigt att hitta och välja de optimala områdena för avbildning. Olika sätt att uppskatta istjockleken på nätet finns i programvarupaket avsedda för automatiserad insamling av kryo-EM-dataset, såsom EPU 2, Leginon28 eller SerialEM29.
Tillkomsten av snabba och känsliga direkta elektrondetektorer möjliggjorde insamling av bilder i många fraktioner som filmer som möjliggjorde kompensation av strålinducerade rörelser och resulterade i en betydande ökning av kvaliteten och kvantiteten av data som används vid bildbehandling och slutlig 3D-rekonstruktion30. Samtidigt ger automatisering och datainsamling med högt dataflöde enorma datamängder med tusentals bilder/filmer som utgör utmaningar för datalagring och åtkomst. Den antagna modellen med stora kryo-EM-anläggningar som betjänar tiotals till hundratals användare kräver särskilt organiserad datahantering med korrekt spårning och datadelning i etablerade kryo-EM-rörledningar31,32.
Denna studie beskriver ett protokoll för rutinmässig insamling av högupplösta kryo-EM-dataset med hjälp av 200 kV Glacios TEM-mikroskop. Nödvändiga anpassningar av mikroskopoptiken beskrivs tillsammans med förfaranden för utvärdering av kryo-EM-prover och val av lämpliga områden för högupplöst datainsamling. Organisationen av insamlade data och relaterade metadata med provinformation demonstreras i Athena - en datahanteringsplattform som underlättar granskningen av provinformation och insamlade data. Med hjälp av musens apo-ferritinprov var det möjligt att uppnå en 3D-rekonstruktion vid 1,6 Å upplösning13. Med hjälp av det beskrivna protokollet rekonstruerade vi också 3D-densitetskartan över 20S-proteasomen från Thermoplasma acidophilum vid 2,1 Å-upplösning.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>AutoGrid rings</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>1036173</td>
			<td>Package of 100x AutoGrid rings for the standard EM grids.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C-Clip</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>1036171</td>
			<td>Package of 100 clips that secure 
			the standard EM grids inside the AutoGrid rings.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Data Management Platform</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>1160939</td>
			<td>Part of the Glacios base configuraiton; includes Athena Software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EPU Quality Monitor</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>1179770</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EPU Software</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>1025080</td>
			<td>Part of the Glacios base configuration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethane 3.5</td>
			<td>Westfalen</td>
			<td>A06010110</td>
			<td>Ethane gas used for making liquid ethane (puritiy at least N35, i.e. 99.95% vol)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 4 200kV</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>1166936</td>
			<td>Direct electron detector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glacios</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>1149551</td>
			<td>200 kV TEM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GloQube Plus Glow Discharge System for TEM Grids and surface modification</td>
			<td>Quorum</td>
			<td>N/A</td>
			<td>also available via Thermo Fisher Scientific (PN 1160602)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuantiFoil grids</td>
			<td>Quantifoil</td>
			<td>N/A</td>
			<td>R-2/1, 300 mesh; carbon foil grid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Relion</td>
			<td>MRC Laboratory of Molecular Biology</td>
			<td>N/A</td>
			<td>open source software: 
			https://relion.readthedocs.io/en/release-3.1/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Selectris with Falcon 
			4 for 200 kV</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>1191753</td>
			<td>Energy filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Selectris X with Falcon 
			4 for 200 kV</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>1191755</td>
			<td>Energy filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltrAuFoil grids</td>
			<td>Quantifoil</td>
			<td>N/A</td>
			<td>R-1.2/1.2, 300 mesh; gold foil grids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vitrobot Mk. IV</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>1086439</td>
			<td>Automated vitrification system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman 595 filter paper</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AA00420S</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

routine collection of high-resolution cryo-em datasets using 200 kv transmission electron microscope

Kryoelektronmikroskopi (kryo-EM) har etablerats som en rutinmässig metod för bestämning av proteinstruktur under det senaste decenniet och tar en ständigt ökande andel av publicerade strukturdata. De senaste framstegen inom TEM-teknik och automatisering har ökat både hastigheten på datainsamlingen och kvaliteten på förvärvade bilder samtidigt som den minskar den nödvändiga kompetensnivån för att erhålla kryo-EM-kartor vid sub-3 Å-upplösningar. Medan de flesta av sådana högupplösta strukturer har erhållits med hjälp av toppmoderna 300 kV kryo-TEM-system, kan högupplösta strukturer också erhållas med 200 kV kryo-TEM-system, särskilt när de är utrustade med ett energifilter. Dessutom minskar automatiseringen av mikroskopjusteringar och datainsamling med bedömning av bildkvalitet i realtid systemets komplexitet och säkerställer optimala mikroskopinställningar, vilket resulterar i ökat utbyte av högkvalitativa bilder och övergripande genomströmning av datainsamling. Detta protokoll visar implementeringen av de senaste tekniska framstegen och automatiseringsfunktionerna på ett 200 kV kryoöverföringselektronmikroskop och visar hur man samlar in data för rekonstruktion av 3D-kartor som är tillräckliga för de novo atommodellbyggnad. Vi fokuserar på bästa praxis, kritiska variabler och vanliga problem som måste beaktas för att möjliggöra rutinmässig insamling av sådana högupplösta kryo-EM-dataset. Särskilt följande viktiga ämnen granskas i detalj: i) automatisering av mikroskopinriktningar, ii) val av lämpliga områden för datainsamling, iii) optimala optiska parametrar för datainsamling av hög kvalitet, hög genomströmning, iv) energifilterjustering för nollförlustavbildning och v) datahantering och kvalitetsbedömning. Tillämpning av bästa praxis och förbättring av uppnåelig upplösning med hjälp av ett energifilter kommer att demonstreras på exemplet apo-ferritin som rekonstruerades till 1,6 Å och Thermoplasma acidophilum 20S proteasom rekonstruerad till 2,1-Å upplösning med hjälp av en 200 kV TEM utrustad med ett energifilter och en direktelektrondetektor.

Datahanteringsportalen ger effektiv, strukturerad lagring av insamlade bilder, data och metadata från flera experimentella arbetsflöden i en enda programvaruplattform. Varje definierat experiment i ett skapat projekt består av ett arbetsflöde med kunddefinierade steg för att samla in exempelinformation, insamlade data och relaterade metadata utan några begränsningar för att ge maximal flexibilitet och användbarhet för eventuella experiment och alla användningsfall (Figur 1, Figur 2). Datahanteringsportalen har också en labbanteckningsfunktionalitet för att illustrera arbetsflödessteg, inklusive bildbehandling med mellanliggande resultat, som tillsammans kan associeras med ett projekt och ge en så fullständig post som möjligt för analys och skapande av rapporter och publikationer.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63519/63519fig01.jpg"> Bild 1: Exempel på möjlig organisering av data och metadata i datahanteringsplattformen. Varje projekt kan bestå av flera experiment, såsom kryo-EM eller massspektroskopi (dvs. protokollsteg 2.3). Varje experiment kan innehålla flera användardefinierade arbetsflöden (dvs. protokollsteg 2.5), var och en bestående av flera konfigurerbara steg (dvs. protokollsteg 2.7). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63519/63519fig01large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna figur.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63519/63519fig02.jpg"> Bild 2: Visa i ett öppnat projektarbetsflöde i datahanteringsplattformen. Bilden visar associerade metadata och anteckningar till det öppnade steget i arbetsflödet. Det vänstra fältet med ikoner ger snabb åtkomst till olika alternativ och menyer på datahanteringsplattformen. Den vänstra panelen innehåller en lista över sparade arbetsflöden (visas endast ett sparat arbetsflöde "Exp2_ApoF_EFTEM_Grid7") och en blå knapp för att lägga till ett nytt arbetsflöde. Den centrala panelen visar enskilda steg i det öppnade arbetsflödet, som visas för SPA arbetsflödet här. Den blå knappen uppe till höger kan lägga till ytterligare ett steg i det öppnade arbetsflödet. Den högra panelen innehåller utrymme för antingen inspelade metadata eller användarindataAnteckningar i arbetsflödet, som kan innehålla text, tabeller och bilder. Olika formateringsalternativ för texten är tillgängliga. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63519/63519fig02large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna figur.</a>
Cryo-EM-galler som produceras med traditionella sänkfrysningsanordningar, såsom Vitrobot, visar vanligtvis en gradient av istjocklek över gallerytan. Vissa galler kan också skadas (böjas) efter manuell hantering och/eller klippning i en autogrid-ringbärare. Figur 3 visar exempel på olika rutnät som visas i Atlasöversikten. Gallret med tjock is eller skada bör uteslutas från vidare undersökning.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63519/63519fig03.jpg"> Figur 3: Galleri över olika rutnät som ses i Atlasöversikten. (A) Ett dåligt rutnät med tjock is, (B) ett böjt rutnät med dålig is och isförorening, (C) ett acceptabelt rutnät med god isgradient, (D) ett typiskt rutnät med bra tunn is och liten isgradient. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63519/63519fig03large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna figur.</a>
Valet av rutnätsrutor utan skador och optimal istjocklek är avgörande för att samla in högupplösta datamängder. Istjockleken kan variera även på nivån för enskilda rutnätsrutor, och det är därför viktigt att endast välja hål med optimalt tunn is från varje vald rutnätskvadrat. Figur 4 visar en lämplig rutnätsruta med intakt folie och tunn is i mitten. Den visade rutnätskvadraten är bra för att ställa in ett filter för automatiserat urval av hål med tunn is i alla valda rutnätsrutor eftersom den innehåller en rad olika istjockleringar samt tomma hål utan is, vilket är extremt användbart för att ställa in ett lämpligt intensitetsområde i isfiltret i hålvalsuppgiften.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63519/63519fig04.jpg"> Figur 4: Ett exempel på rutnätskvadrat med en gradient av istjocklek, från tomma rutnätsrutor i mitten och tjock is nära rutnätstängerna. Filtret för iskvalitet kan användas för att välja intervallet av intensiteter inuti hål med den ideala istjockleken som följaktligen väljs i rutnätstorget (hålen med grönt överlägg). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63519/63519fig04large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna figur.</a>
Benchmark-resultat med hjälp av det beskrivna protokollet erhölls med hjälp av provet av mus apo-ferritin (apoF) från Kikkawa-gruppen11. ApoF är ett mycket α-spiralformat protein som bildar en mycket stabil oktaedrisk bur. Den höga stabiliteten och den höga symmetrin gör apoF till ett optimalt prov för högupplöst kryo-EM-avbildning och bildbehandling. ApoF har därför blivit ett standardprov för att bedöma prestanda för kryo-EM-instrument 11,12,13. En fryst alikvot innehållande 15 mg/ml renat apoF-prov tinades på is och klarades genom centrifugering vid 10 000 x g i 10 minuter. Supernatanten späddes till 5 mg/ml med 20 mM HEPES pH 7,5, 150 mM NaCl. 3 μL av det utspädda provet applicerades på ett glödurladdat R-1,2/1,3, 300 mesh guldnät i 30 s. Därefter blottades gallret i 5 s innan det sjönk frysning i flytande etan kyld av flytande kväve. Störtdykningsfrysning utfördes med hjälp av ett helautomatiskt förglasningssystem vid 100 % luftfuktighet och 4 °C. Alla rutnät klipptes i autogrids och laddades i en 200 kV Cryo-TEM. Cirka 3000 filmer samlades in med en genomströmning på 300 filmer/h. Data bearbetades med hjälp av metoderna som beskrivits11 med följande modifieringar: i) Relion 4-betaversion användes istället för Relion 3.1, ii) automatiserad partikelplockning gjordes med 2D-klassmedelvärde av tidigare apoF-rekonstruktioner som referenser, och iii) den ursprungliga 3D-modellen genererades från den tidigare apoF-rekonstruktionen lågpasserad till 15-Å-upplösning. Optikgruppering gjordes inte för denna datauppsättning eftersom den använda AFIS-proceduren34 har visat sig effektivt och tillförlitligt minimera strållutningsinducerade fasförskjutningar som inte begränsar datakvaliteten för att rekonstruera 3D-kartor vid de rapporterade upplösningarna. 3D-förfining efter Bayesiansk polering och CTF-förfining ledde till 1,68 Å upplösningskarta. Upplösningen förbättrades ytterligare med Ewaldsfärkorrigering vilket resulterade i en 1,63 Å upplösningskarta. Översikten över datainsamlings- och bearbetningsparametrar visas i tabell 2, och den slutliga rekonstruerade densitetskartan visas i figur 5, med Fourier Shell Correlation (FSC) -kurvan som visas i kompletterande figur 8.
Tabell 2: Parametrar för datainsamling och bildbehandling som används för 3D-rekonstruktion av apo-ferritin. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63519/Table%202-63519R2.xlsx" target="_blank">Klicka här för att ladda ner denna tabell.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63519/63519fig05.jpg"> Figur 5: Cryo-EM-rekonstruktion av apo-ferritin. (Vänster panel) 3D-rendering av den rekonstruerade apoF cryo-EM-kartan med 1,6 Å upplösning. (Höger panel) Detaljerad bild av den rekonstruerade kartan på nivån av enskilda aminosyras sidokedjor. Tätheten av aminosyras sidokedjor är väl upplöst, och atommodellen kan entydigt byggas inom denna karta. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63519/63519fig05large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna figur.</a>
Effekter och fördelar med att använda ett energifilter i SPA-rekonstruktionerna utvärderades med användning av den prokaryota 20S-proteasomen isolerad från T. acidophilum. Den prokaryota 20S-proteasomen har också använts som ett standard kryo-EM-prov eftersom det representerar den stabila katalytiska kärnan i proteasomkomplexet med D7-symmetrin. Grids framställdes genom tillsats av 4,5 μL av det renade T. acidophilum 20S proteasomprovet på ett glödurladdat 200-mesh R2/1 kopparnät. Proverna förglasades i en flytande etan/propanblandning med hjälp av ett helautomatiskt förglasningssystem inställt på 4 °C och 100 % fuktighet med en fläckkraft på 20 och en fläcktid på 4,5 s.
Tre olika dataset samlades in från samma kryo-EM-rutnät med liknande rutnätsrutor med en annan slitsbredd på energifiltret i ordningen: i) slits helt öppen (ingen slits införd), ii) 20 eV slits och iii) 10 eV slits. Rutnätsrutorna valdes med hjälp av ett iskvalitetsfilter i analysprogramvaran. Alla andra parametrar för datainsamling och databehandling behölls desamma. Dataset samlades in i 15 timmar med totalt 4000 filmer och bearbetades med hjälp av metoderna som beskrivs11 med relion 3.1 med modifieringen att Laplacian-of-Gaussian partikelplockningsalgoritm användes för att producera initiala 2D-klassmedelvärde för referensbaserad partikelplockning från de fullständiga dataseten. Samma antal (102 200) slumpmässigt utvalda partiklar valdes och användes för den slutliga iterationen och 3D-rekonstruktionen av varje dataset. Databehandlingsvariabler beskrivs i tabellen (tabell 3) nedan för att uppnå den slutliga rekonstruerade EM-densitetskartan som visas i figur 6 med FSC-kurvan som visas i tilläggsfigur 9. Optikgruppering och Ewald-sfärkorrigering gjordes inte heller för dessa dataset.
Tabell 3: Parametrar för datainsamling och bildbehandling som används för 3D-rekonstruktion av proteasomen T. acidophilum 20S. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63519/Table%203-63519R2.xlsx" target="_blank">Klicka här för att ladda ner denna tabell.</a>
Tabell 4: Sammanfattning av uppnådd upplösning och B-faktor för kryo-EM-rekonstruktioner av T. acidophilum 20S-proteasomen med hjälp av dataset med olika energislitsbredd. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63519/Table%204-63519R2.xlsx" target="_blank">Klicka här för att ladda ner denna tabell.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63519/63519fig06.jpg"> Figur 6: Effekt av energifiltrering på kryo-EM-bilder. (A) Cryo-EM-bilder vid olika defokusvärden som samlats in med eller utan 10 eV-slits. (B) Översikt över 20S proteasomkryo-EM-kartan med segmenterade underenheter. (C) Zoomvy på 20S proteasomkarta med en monterad atommodell. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63519/63519fig06large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna figur.</a>
Kompletterande figur 1: Kalibrering av bildförskjutningsuppgift (gul ellips) för att justera bildförskjutningar mellan olika optiska förinställningar (röda ellipser) i analysprogramvaran, med hjälp av en kristall av sexkantig is som är synlig i hela förstoringsområdet mellan 100x och 165 000x. (Överst) Kalibrering mellan förinställningarna Datainsamling och Hål/Eucentrisk höjd, (mitten) kalibrering mellan förinställningarna Hål/Eucentrisk höjd och Rutnätskvadrat, (nedre) kalibrering mellan förinställningarna Rutnätskvadrat och Atlas. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63519/SuppFigure01_rev01_EPUalign-Final.pdf" target="_blank">Klicka här för att ladda ner den här filen.</a>
Kompletterande figur 2: Autostigmate funktion i analysprogramvara (gul ellips). (Vänster bild) Förvärvad bild. (Höger bild) Fourieröverföring av den förvärvade bilden som visar koncentriska Thon-ringar och deras CTF-passform som visas i radiella balkar. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63519/SuppFigure02_rev01_EPUastigmatism-Final.pdf" target="_blank">Klicka här för att ladda ner den här filen.</a>
Kompletterande figur 3: Användargränssnitt för Autokomfunktionen i analysprogramvara (gul ellips) för komajustering. Bildpanelen visar Fourier-överföringsbilder som förvärvats vid olika strållutningar och deras CTF-passningar som används för beräkning av koma. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63519/SuppFigure03_rev01_EPUcoma-Final.pdf" target="_blank">Klicka här för att ladda ner den här filen.</a>
Kompletterande figur 4: Användargränssnitt för inställning av energifilter. Exempel på en bra tunnningsrapport om energifiltrets isokromaticitet med alla parametrar (visas i grön text) inom specifikationerna. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63519/SuppFigure04_rev01_Sherpa_isochromacity%20-final.pdf" target="_blank">Klicka här för att ladda ner den här filen.</a>
Kompletterande figur 5: Användargränssnitt för inställning av energifilter. Exempel på bra justeringsrapport om energifilterförstoringsförvrängningar med alla parametrar (visas i grön text) inom specifikationerna. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63519/SuppFigure05_rev01_Sherpa_mag-distortions-Final.pdf" target="_blank">Klicka här för att ladda ner den här filen.</a>
Kompletterande figur 6: Användargränssnitt för inställning av energifilter. Exempel på bra inställning av energifiltrets kromatiska distorsioner med alla parametrar (visas i grön text) inom specifikationerna. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63519/SuppFigure06_rev01_Sherpa_chrom-distortions-Final.pdf" target="_blank">Klicka här för att ladda ner den här filen.</a>
Kompletterande figur 7: DataViz-panelen i EPU Quality Monitor med en översikt över datakvaliteten i en insamlad cryo-EM-dataset. Graferna med aggregerade data från alla insamlade bilder/filmer visar värden (punktdiagram) och fördelning (stapeldiagram) för utvalda kritiska kvalitetsindikatorer, såsom CTF-passformsförtroende (blå), defokus (orange) och astigmatism (grön). En delmängd av de insamlade bilderna/filmerna kan väljas genom att ställa in parameterfilter högst upp på DataViz-panelen. Efter att filtren har tillämpats kan utvalda bilder/filmer exporteras för vidare bearbetning i ett annat bildbehandlingspaket, till exempel Relion eller CryoSpark. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63519/SuppFigure07_rev01_DataViz.tif" target="_blank">Klicka här för att ladda ner den här filen.</a>
Kompletterande figur 8: FSC-kurva för den slutliga rekonstruktionen av apoF till 1,6 Å upplösning, som rapporterats av Relion 4-beta. Den blå kurvan visar FSC av maskerade 3D-kartor från två oberoende raffinerade 3D-rekonstruktioner från två ömsesidigt exklusiva halvdataset. Enligt guldstandarden FSC vid 0,143 motsvarar upplösningen av den slutliga 3D-kartan rekonstruerad från hela datasetet 1,6 Å. Den orange kurvan visar FSC för de maskerade 3D-rekonstruktionerna med randomiserade faser. Det snabba fallet av FSC-kurvan indikerar att den använda masken inte bidrog till den observerade FSC för de ursprungliga rekonstruerade kartorna (blå kurva) utöver ~ 2 Å upplösning. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63519/SuppFigure08_rev01_FSC_apoF.tif" target="_blank">Klicka här för att ladda ner den här filen.</a>
Kompletterande figur 9: FSC-kurvor för den slutliga rekonstruktionen av T. acidophilum 20S proteasom med olika slitsbredder på energifiltret, som rapporterats av Relion 3.1. De blå kurvorna visar FSC för maskerade 3D-kartor från två oberoende förfinade rekonstruktioner från två halva dataset av varje dataset. Guldstandarden FSC vid 0,143 indikerar de uppnådda upplösningarna för de slutliga 3D-kartorna rekonstruerade från respektive fullständiga dataset (2,3 Å, 2,2 Å respektive 2,1 Å upplösning). De röda kurvorna visar FSC av maskerade kartor med slumpmässiga faser. Den snabba nedgången i de röda FSC-kurvorna indikerar att den använda masken inte bidrog till FSC för de ursprungliga rekonstruerade kartorna utöver ~ 3 Å upplösning. De gröna kurvorna visar FSC för omaskerade 3D-kartor, som påverkas av brus i hela den rekonstruerade 3D-volymen och därför sjunker tidigare än FSC för de maskerade 3D-kartorna. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63519/SuppFigure09_rev02_T20S_FSCs.tif" target="_blank">Klicka här för att ladda ner den här filen.</a>
Tillgänglighet av data: Kryo-EM-densitetskartorna har deponerats i EM-databanken under anslutningsnummer: apoferritin: EMD 14173, EMPIAR-10973. 20S proteasom: EMD 14467, EMPIAR-10976.

Watch this Scientific Journal Video about Routine Collection of High-Resolution cryo-EM Datasets Using 200 KV Transmission Electron Microscope at JoVE.com

Routine Collection of High-Resolution cryo-EM Datasets Using 200 KV Transmission Electron Microscope

Högupplösta kryo-EM-kartor över makromolekyler kan också uppnås genom att använda 200 kV TEM-mikroskop. Detta protokoll visar de bästa metoderna för att ställa in exakta optiska inriktningar, datainsamlingsscheman och urval av bildområden som alla är väsentliga för framgångsrik insamling av högupplösta dataset med hjälp av en 200 kV TEM.

Rutinmässig insamling av högupplösta kryo-EM-dataset med 200 KV transmissionselektronmikroskop

Cryo-electron microscopy (cryo-EM) has been established as a routine method for protein structure determination during the past decade, taking an ...

Cryo-EM har blivit en standardteknik för strukturbestämning av proteiner och deras komplex. Detta protokoll beskriver bästa praxis för hur man hämtar högupplösta Cryo-EM-dataset från mellanklassen 200 kV TEM-mikroskop. Cryo-EM kan bestämma proteinstrukturen i nära inhemska förhållanden i lösning för flera konformationstillstånd och funktionella tillstånd samtidigt, vilket är svårfångat för andra strukturella tekniker.Erhållen strukturell information kan användas för att belysa molekylära mekanismer för proteinfunktion, såväl som för strukturbaserad läkemedelsdesign. Till exempel avslöjade en nyligen publicerad publikation i strukturen av amyloidfibriller flera bindningsställen för en vital ligand. I detta protokoll använder vi dock standardproverna av apoferritin och proteasom för att visa de kritiska stegen för att erhålla högupplösta Cryo-EM-data.Driften av en Cryo-TEM har blivit enklare under de senaste åren, särskilt på grund av införandet av avancerade automatiseringsfunktioner. För den första sessionen rekommenderar vi dock att du har en utbildning med mer erfarna användare. Därifrån är utvecklingen i tekniken relativt snabb.Demonstrerar proceduren kommer att vara Adrian Koh, som är senior applikationsforskare vid Thermo Fisher Scientific. Sätt i automatiska galler i kassetten för automatisk lastare under flytande kväveförhållanden. Sätt i kassetten med automatiska galler i en flytande kvävekyld överföringskapsel.Sätt vidare in kapseln i mikroskopet och klicka på Dock-knappen i mikroskopets användargränssnitt för att ladda kassetten från kapseln till mikroskopets automatiska lastare. Klicka på knappen Inventering för att kontrollera förekomsten av automatiska rutnät i den laddade kassetten. Klicka sedan på knapparna Ladda och lossa för att infoga de automatiska rutnäten i kolumnen för TEM-avbildning.Välj fliken Atlas och klicka på knappen Ny session för att öppna en ny session. Fyll i detaljer som sessionsnamn och datalagringsplats och klicka på knappen Apply. Markera rutnäten av intresse genom att markera en kryssruta bredvid motsvarande rutnätsnummer.Klicka på Start-knappen för att starta en helautomatisk samling atlaser över alla valda rutnät. När samlingen är klar klickar du på rutnätsetiketter för att granska de förvärvade atlaserna. Välj fliken EPU och gå till Ny session för att skapa en ny session i den vänstra panelen.Välj alternativet Ny session för att använda de aktuella inställda optiska förinställningarna. Fyll i sessionsnamnet. Välj den manuella typen av session för att ha kontroll över valet av enskilda hål och rutnätsrutor som valts för datainsamling senare i protokollet.Välj det snabbare förvärvsläget om du vill använda avvikelsefri bildväxling för datainsamling. Ange sedan platsen för att spara metadata. Klicka på knappen Apply för att skapa en ny session.Välj kvadratmarkeringsuppgiften i den vänstra panelen för att visa den insamlade atlasen i rutnätet. Identifiera rutnätsrutorna med intakt stödfolie utan skador, tunn glasartad is och foliehål, försumbar kristallin isförorening i rutnätstorget och minimal ljusstyrka över rutnätstorget och inom enskilda foliehål. Välj rutnätsrutorna för datainsamling, antingen i den fullständiga atlasen eller i panelbilder av hög kvalitet.Högerklicka på en rutnätsruta av intresse och välj hela urvalsuppgiften. Klicka på Auto Eucentric-knappen för att automatiskt flytta till den första valda rutnätsrutan. Justera den eucentriska höjden och skaffa en rutnätsbild för att hitta foliehål.Klicka på knappen Hitta hål för att hitta foliehål i bilden. Klicka på knappen Ta bort hål för att stänga rutnätsknappen för att avmarkera hål nära rutnätsstänger. Justera gränserna i isfiltrets ljusstyrke histogram för att ta bort alla hål med för tjock is och alla tomma hål.Högerklicka på ett hål i rutnätets fyrkantiga bild och välj flytta scen till plats flytta scenen här. Välj malldefinitionsuppgiften i den vänstra panelen. Klicka på knappen Skaffa för att få en hel bild.Ställ in värden för fördröjning efter bildförskjutning till 0,5 sekunder och fördröjning efter stegskifte till fem sekunder. Klicka på knappen Sök och mitthål för att centrera ett hål i bilden. Välj knappen Lägg till förvärvsområde och klicka på bilden för att välja platsen i det centrerade hålet där bildförvärv med hög förstoring kommer att tas.Välj knappen Lägg till autofokusområde och klicka på bilden för att välja platsen på stödfolien bredvid det centrerade hålet där bildautofokus ska utföras. Klicka på det gröna förvärvsområdet för att ställa in en sekvens av defokusvärden i defokuslistan i den övre delen av programvarufönstret. När du har ställt in de autofokusspecifika inställningarna väljer du alternativet Efter centrering för att autofokusera i början av varje AFIS-kluster.Välj alternativet Objektiv för snabbare autofokusering och minskad stegdrift. Klicka på knappen Förbered alla rutor i hålvalsuppgiften för att automatiskt ställa in datainsamling och alla andra valda rutnätsrutor enligt de använda inställningarna i denna första rutnätskvadrat. Välj malldefinitionsuppgiften, skaffa en ny bild, flytta scenen till ett rent område på kolfolie genom att högerklicka och välj menyalternativet flytta scenen här.Välj fliken Autofunktioner. När du har ställt in önskad defokusering och iterering, växla till autofokusförinställningen och klicka på startknappen för att köra autofokusfunktionen. Välj Autostigmate-uppgiften, växla till Thon Ring-förinställningen och tryck på Start-knappen.Välj Autocoma-uppgiften och tryck på Start-knappen. Flytta scenen till ett område med en trasig rutnätskvadrat. Bekräfta områdets transparens genom att ta en enda autofokusbild.Öppna Sherpa UI och välj programmet Energifilter. Klicka på centerknappen och nollförlustalternativet för att centrera nollförlustfilterslitsen. Klicka på Tune -knappen i isokromaticitetsalternativet.Klicka på alternativet Tune Magnification and Tune Distortions i de geometriska och kromatiska förvrängningarna. Gå till fliken EPU, välj uppgiften Automated Acquisition och klicka på knappen Starta körning för att starta helt automatiserad datainsamling. Figuren visar Cryo-EM-rutnät som visar en gradient av istjocklek över rutnätsytan.De nät som undantas från den fortsatta undersökningen är dåligt rutnät med tjock is och ett böjt rutnät med dålig is och förorening, medan acceptabla nät är de med god isgradient och ett typiskt rutnät med bra tunn is och liten isgradient. Figuren visar den slutliga 3D-renderingen av den rekonstruerade apoferritin Cryo-EM-kartan. Den höga stabiliteten och symmetrin gör det till ett optimalt riktmärkesprov för högupplöst Cryo-EM-avbildning och bildbehandling.Bayesiansk polering, CTF-förfining och Ewald-sfärkorrigering resulterade i en 1,63 ångströmsupplösningskarta. Figuren visar en detaljerad bild av den rekonstruerade apoferritin Cryo-EM-kartan på den individuella aminosyrasidans kedjenivå. Tätheten av aminosyras sidokedjor är väl upplöst och atommodellen kan entydigt byggas på kartan.Bilden här visar två olika dataset vid olika defokusvärden som samlats in från samma Cryo-EM-rutnät med liknande rutnätsrutor med en slits helt öppen och en 10 elektronvoltslits som indikerar att 10 elektronvoltslitsen avsevärt förbättrar bildkontrasten. Figuren här visar en översikt över 20S proteasom Cryo-EM-kartan med segmenterade underenheter som används som standard Cryo-EM-prov. Och dess zoomade vy med en monterad atommodell representerar den stabila katalytiska kärnan i proteasomkomplexet med D7-symmetrin.Protokollet innehåller två kritiska steg. En, letar efter områden med tunn glasartad is som innehåller homogena partiklar. Och två, ställa in parallell belysning för datainsamling.Med högupplösta rekonstruktioner av proteiner som uppnår två till tre ångström i upplösning kan du bättre förstå de molekylära mekanismerna för sjukdom och förbättra läkemedelsledningar. Tidigare var kristallisering nödvändig om du ville studera den strukturella grunden för biologiska fenomen. Idag med Cryo-EM är det inte längre nödvändigt.Och så med Cryo-EM gör vi det möjligt för forskare att studera ett bredare spektrum av biologiska fenomen på strukturell nivå.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Method to Visualize and Analyze Membrane Interacting Proteins by Transmission Electron Microscopy

Metod för att visualisera och analysera membraninteragerande proteiner genom transmissionselektronmikroskopi

Monotopic proteins exert their function when attached to a membrane surface, and such interactions depend on the specific lipid composition and on the ...

High-resolution Single Particle Analysis from Electron Cryo-microscopy Images Using SPHIRE

Högupplösande enkelpartikelanalys från elektronkryo-mikroskopi bilder med hjälp av SPHIRE

SPHIRE (SPARX for High-Resolution Electron Microscopy) is a novel open-source, user-friendly software suite for the semi-automated processing of single ...

Cryo-EM and Single-Particle Analysis with Scipion

Cryo-EM och enpartikelanalys med scipion

Cryo-electron microscopy has become one of the most important tools in biological research to reveal the structural information of macromolecules at ...

Preparation of Sample Support Films in Transmission Electron Microscopy using a Support Floatation Block

Förberedelse av provstödsfilmer i transmissionselektronmikroskopi med hjälp av ett stödflötblock

Structure determination by cryo-electron microscopy (cryo-EM) has rapidly grown in the last decade; however, sample preparation remains a significant ...

Preparing Lamellae from Vitreous Biological Samples Using a Dual-Beam Scanning Electron Microscope for Cryo-Electron Tomography

Förbereda lameller från glaskroppsbiologiska prover med hjälp av ett dubbelstråleskanningselektronmikroskop för kryoelektrontomografi

Presented here is a protocol for preparing cryo-lamellae from plunge-frozen grids of Plasmodium falciparum-infected&#160;human erythrocytes, which could ...

Preparation of High-Temperature Sample Grids for Cryo-EM

Beredning av högtemperaturprovgaller för kryo-EM

The sample grids for cryo-electron microscopy (cryo-EM) experiments are usually prepared at a temperature optimal for the storage of biological samples, ...

Micropatterning Transmission Electron Microscopy Grids to Direct Cell Positioning within Whole-Cell Cryo-Electron Tomography Workflows

Mikropapper transmission elektronmikroskopinät till direkt cellpositionering inom arbetsflöden för hela cell cryo-elektrontomografi

Whole-cell cryo-electron tomography (cryo-ET) is a powerful technology that is used to produce nanometer-level resolution structures of macromolecules ...

Quantification of Subcellular Glycogen Distribution in Skeletal Muscle Fibers using Transmission Electron Microscopy

Kvantifiering av subcellulär glykogenfördelning i skelettmuskelfibrer med hjälp av transmissionselektronmikroskopi

With the use of transmission electron microscopy, high-resolution images of fixed samples containing individual muscle fibers can be obtained. This ...

A Robust Single-Particle Cryo-Electron Microscopy (cryo-EM) Processing Workflow with cryoSPARC, RELION, and Scipion

A Robust Single-Particle Cryo-Electron Microscopy cryo-EM Processing Workflow with cryoSPARC, RELION, and Scipion

Ett robust arbetsflöde för bearbetning av kryo-elektronmikroskopi med en partikel (kryo-EM) med kryoSPARC, RELION och Scipion

Recent advances in both instrumentation and image processing software have made single-particle cryo-electron microscopy (cryo-EM) the preferred method ...

Advancing High-Resolution Imaging of Virus Assemblies in Liquid and Ice

Främja högupplöst avbildning av virusaggregat i vätska och is

Interest in liquid-electron microscopy (liquid-EM) has skyrocketed in recent years as scientists can now observe real-time processes at the nanoscale. It ...