Name: routine collection of high-resolution cryo-em datasets using 200 kv transmission electron microscope
Uploaded: 2022-03-16T14:00:00
Duration: 9 min 49 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Routine Collection of High-Resolution cryo-EM Datasets Using 200 KV Transmission Electron Microscope at JoVE.com

<ol>
	<li>Wang, J., Hua, T., Liu, Z. -. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+features+of+activated+GPCR+signaling+complexes.">Structural features of activated GPCR signaling complexes.</a> Current Opinions in Structural Biology. 63, 82-89 (2020).</li><li>Chen, S., Gouaux, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+mechanism+of+AMPA+receptor+-+auxiliary+protein+complexes.">Structure and mechanism of AMPA receptor - auxiliary protein complexes.</a> Current Opinions in Structural Biology. 54, 104-111 (2019).</li><li>K&#252;hlbrandt, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+mechanisms+of+F-Type+ATP+synthases.">Structure and mechanisms of F-Type ATP synthases.</a> Annual Review of Biochemistry. 88, 515-549 (2019).</li><li>Laverty, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo-EM+structure+of+the+human+&#945;1&#946;3&#947;2+GABA+A+receptor+in+a+lipid+bilayer.">Cryo-EM structure of the human &#945;1&#946;3&#947;2 GABA A receptor in a lipid bilayer.</a> Nature. 565 (7740), 516-520 (2019).</li><li>Liu, F., Zhang, Z., Csan&#225;dy, L., Gadsby, D. C., Chen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+structure+of+the+Human+CFTR+ion+channel.">Molecular structure of the Human CFTR ion channel.</a> Cell. 169 (1), 85-95 (2017).</li><li>Wrapp, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo-EM+structure+of+the+2019-nCoV+spike+in+the+prefusion+conformation.">Cryo-EM structure of the 2019-nCoV spike in the prefusion conformation.</a> Science. 367 (6483), 1260-1263 (2020).</li><li>Ke, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structures+and+distributions+of+SARS-CoV-2+spike+proteins+on+intact+virions.">Structures and distributions of SARS-CoV-2 spike proteins on intact virions.</a> Nature. 588, 498-502 (2020).</li><li>Yan, R., Zhang, Y., Li, Y., Xia, L., Guo, Y., Zhou, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+for+the+recognition+of+SARS-CoV-2+by+full-length+human+ACE2.">Structural basis for the recognition of SARS-CoV-2 by full-length human ACE2.</a> Science. 367 (6485), 1444-1448 (2020).</li><li>Walls, A. C., Park, Y. -. J., Tortorici, M. A., Wall, A., McGuire, A. T., Veesler, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure,+function,+and+antigenicity+of+the+SARS-CoV-2+spike+glycoprotein.">Structure, function, and antigenicity of the SARS-CoV-2 spike glycoprotein.</a> Cell. 180, 281-292 (2020).</li><li>Chiba, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multivalent+nanoparticle-based+vaccines+protect+hamsters+against+SARS-CoV-2+after+a+single+immunization.">Multivalent nanoparticle-based vaccines protect hamsters against SARS-CoV-2 after a single immunization.</a> Communications Biology. 4 (1), 597 (2021).</li><li>Nakane, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-particle+cryo-EM+at+atomic+resolution.">Single-particle cryo-EM at atomic resolution.</a> Nature. 587, 152-156 (2020).</li><li>Bai, X. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Seeing+atoms+by+single-particle+Cryo-EM.">Seeing atoms by single-particle Cryo-EM.</a> Trends in Biochemical Sciences. 46 (4), 253-254 (2021).</li><li>Koh, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+cryo-EM+at+200kV+enabled+by+Selectris-X+and+Falcon+4.">High-resolution cryo-EM at 200kV enabled by Selectris-X and Falcon 4.</a> Microscience Microscopy Congress 2021. , (2021).</li><li>Herzik, M. A., Wu, M., Lander, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Achieving+better-than-3-&#197;+resolution+by+single-particle+cryo-EM+at+200+keV.">Achieving better-than-3-&#197; resolution by single-particle cryo-EM at 200 keV.</a> Nature Methods. 14 (11), 1075-1078 (2017).</li><li>Herzik, M. A., Wu, M., Lander, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+structure+determination+of+sub-100+kDa+complexes+using+conventional+cryo-EM.">High-resolution structure determination of sub-100 kDa complexes using conventional cryo-EM.</a> Nature Communications. 10 (1), 1032 (2019).</li><li>Wu, M., Lander, G. C., Herzik, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sub-2+Angstrom+resolution+structure+determination+using+single-particle+cryo-EM+at+200+keV.">Sub-2 Angstrom resolution structure determination using single-particle cryo-EM at 200 keV.</a> Journal of Structural Biology X. 4, 100020-100029 (2020).</li><li>Mori, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=C-Glycoside+metabolism+in+the+gut+and+in+nature:+Identification,+characterization,+structural+analyses+and+distribution+of+C-C+bond-cleaving+enzymes.">C-Glycoside metabolism in the gut and in nature: Identification, characterization, structural analyses and distribution of C-C bond-cleaving enzymes.</a> Nature Communications. 12 (1), 6294 (2021).</li><li>Hamdi, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=2.7+&#197;+cryo-EM+structure+of+vitrified+M.+musculus+H-chain+apoferritin+from+a+compact+200+keV+cryo-microscope.">2.7 &#197; cryo-EM structure of vitrified M. musculus H-chain apoferritin from a compact 200 keV cryo-microscope.</a> PLoS One. 15 (5), 0232540 (2020).</li><li>Abbott, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EMDB+web+resources.">EMDB web resources.</a> Current Protocols in Bioinformatics. 61 (1), 1-12 (2018).</li><li>Punjani, A., Rubinstein, J. L., Fleet, D. J., Brubaker, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CryoSPARC:+algorithms+for+rapid+unsupervised+cryo-EM+structure+determination.">CryoSPARC: algorithms for rapid unsupervised cryo-EM structure determination.</a> Nature Methods. 14 (3), 290-296 (2017).</li><li>Scheres, S. H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RELION:+Implementation+of+a+Bayesian+approach+to+cryo-EM+structure+determination.">RELION: Implementation of a Bayesian approach to cryo-EM structure determination.</a> Journal of Structural Biology. 180 (3), 519-530 (2012).</li><li>G&#243;mez-Blanco, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+Scipion+for+stream+image+processing+at+Cryo-EM+facilities.">Using Scipion for stream image processing at Cryo-EM facilities.</a> Journal of Structural Biology. 204 (3), 457-463 (2018).</li><li>Tegunov, D., Cramer, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+cryo-electron+microscopy+data+preprocessing+with+Warp.">Real-time cryo-electron microscopy data preprocessing with Warp.</a> Nature Methods. 16 (11), 1146-1152 (2019).</li><li>Lander, G. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Appion:+an+integrated,+database-driven+pipeline+to+facilitate+EM+image+processing.">Appion: an integrated, database-driven pipeline to facilitate EM image processing.</a> Journal of Structural Biology. 166 (1), 95-102 (2009).</li><li>Carragher, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+outcomes+when+optimizing+'standard'+sample+preparation+for+single-particle+cryo-EM.">Current outcomes when optimizing 'standard' sample preparation for single-particle cryo-EM.</a> Journal of Microscopy. 276 (1), 39-45 (2019).</li><li>Drulyte, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Approaches+to+altering+particle+distributions+in+cryo-electron+microscopy+sample+preparation.">Approaches to altering particle distributions in cryo-electron microscopy sample preparation.</a> Acta Crystallographica. Section D, Structural Biology. 74 (6), 560-571 (2018).</li><li>Bloch, M., Santiveri, M., Taylor, N. M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+protein+Cryo-EM:+Cryo-grid+optimization+and+data+collection+with+protein+in+detergent.">Membrane protein Cryo-EM: Cryo-grid optimization and data collection with protein in detergent.</a> Methods in Molecular Biology. 2127, 227-244 (2020).</li><li>Cheng, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leginon:+New+features+and+applications.">Leginon: New features and applications.</a> Protein Science. 30 (1), 136-150 (2021).</li><li>Schorb, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Software+tools+for+automated+transmission+electron+microscopy.">Software tools for automated transmission electron microscopy.</a> Nature Methods. 16 (6), 471-477 (2019).</li><li>Li, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+counting+and+beam-induced+motion+correction+enable+near-atomic-resolution+single-particle+cryo-EM.">Electron counting and beam-induced motion correction enable near-atomic-resolution single-particle cryo-EM.</a> Nature Methods. 10 (6), 584-590 (2013).</li><li>Alewijnse, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Best+practices+for+managing+large+CryoEM+facilities.">Best practices for managing large CryoEM facilities.</a> Journal of Structural Biology. 199, 225-236 (2017).</li><li>Baldwin, P. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Big+data+in+cryoEM:+automated+collection,+processing+and+accessibility+of+EM+data.">Big data in cryoEM: automated collection, processing and accessibility of EM data.</a> Current Opinion in Microbiology. 43, 1-8 (2018).</li><li>Guo, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron-event+representation+data+enable+efficient+cryoEM+file+storage+with+full+preservation+of+spatial+and+temporal+resolution.">Electron-event representation data enable efficient cryoEM file storage with full preservation of spatial and temporal resolution.</a> International Union of Crystallography Journal. 7, 860-869 (2020).</li><li>Weis, F., Hagen, W. J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combining+high+throughput+and+high+quality+for+cryo-electron+microscopy+data+collection.">Combining high throughput and high quality for cryo-electron microscopy data collection.</a> Acta Crystallographica. Section D, Structural Biology. 76 (8), 724-728 (2020).</li><li>Zhou, H., Chiu, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+icosahedral+virus+structures+by+electron+cryomicroscopy+at+subnanometer+resolution.">Determination of icosahedral virus structures by electron cryomicroscopy at subnanometer resolution.</a> Advances in Protein Chemistry. 64, 93-124 (2005).</li><li>DeRosier, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correction+of+high-resolution+data+for+curvature+of+the+Ewald+sphere.">Correction of high-resolution data for curvature of the Ewald sphere.</a> Ultramicroscopy. 81 (2), 83-98 (2000).</li><li>Wolf, M., DeRosier, D. J., Grigorieff, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ewald+sphere+correction+for+single-particle+electron+microscopy.">Ewald sphere correction for single-particle electron microscopy.</a> Ultramicroscopy. 106 (4-5), 376-382 (2006).</li><li>Leong, P. A., Yu, X., Hong Zhou, Z., Jensen, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correcting+for+the+ewald+sphere+in+high-resolution+single-particle+reconstructions.">Correcting for the ewald sphere in high-resolution single-particle reconstructions.</a> Methods in Enzymology. 482, 369-380 (2010).</li><li>Zivanov, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+tools+for+automated+high-resolution+cryo-EM+structure+determination+in+RELION-3.">New tools for automated high-resolution cryo-EM structure determination in RELION-3.</a> eLife. 7, 42166 (2018).</li></ol>

Sagar Khavnekar çıkar çatışması olmadığını bildirdi. Diğer yazarlar, MSD-EM bölümü olan Thermo Fisher Scientific'in çalışanlarıdır.

Açıklanan protokol, kullanılan TEM mikroskobunun optiklerinin iyi hizalanmış bir durumda olduğunu varsayar. Bu Protokolde kullanılan 200 kV TEM için, bu tür sütun hizalamaları, mikroskop kurulumundan veya herhangi bir önemli servis müdahalesinden sonra deneyimli bir servis mühendisi tarafından yapılır, doğrulanır ve kaydedilir. Bu hizalama ayarları mikroskop kullanıcı arayüzünde herhangi bir zamanda geri çağrılabilir. Kullanıcılar, kritik parametreleri yeniden ayarlamak için mikroskop kullanıcı arabirimindeki Doğrudan Hizalama yordamlarını kullanabilir. Top eğimi ve top kaydırma gibi bazı hizalamalar sabittir ve kullanıcılar tarafından günlük olarak ayarlanması gerekmez. Mikroskop süpervizörü tarafından tabanca eğimi ve vites değiştirmenin kontrolleri ve yeniden hizalanması (gerekirse) yılda iki kez tavsiye edilir. Öte yandan, bazı hizalamalar kritiktir ve yukarıdaki protokolde açıklandığı gibi her veri toplamadan önce hizalanmalıdır (objektif astigmatizm ve komasız hizalama gibi). Analiz yazılımındaki Autocoma işlevi yakınsamazsa, ışın eğimli pivot noktalarının ve/veya dönme merkezinin hizalaması doğrulanmalı ve ayarlanmalı ve C2 diyafram açıklığının doğru ortalanması onaylanmalıdır. Daha sonra, koma düzeltmesi için objektif damgalayıcılar da kullanıldığından, Autostigmate işlevi çalıştırılmalıdır. Bu hizalamalar, hem Autostigmate hem de Autocomafunctions ilk yinelemelerinde başarılı olana kadar yinelenmelidir. Gerekirse, başka bir alan seçilebilir (örneğin, buzsuz karbon folyoyu destekleyebilir), görüntü bulanıklaştırma ayarlanabilir veya elde edilen görüntülerdeki sinyal-gürültü oranını optimize etmek için görüntü yakalama süresi artırılabilir ve elde edilen görüntülerin Fourier dönüşümünde birden fazla Thon halkasının görünürlüğü sağlanabilir.
Modern kriyo-EM mikroskopları, özellikle düşük simetriye sahip proteinler için yüksek çözünürlüklü 3D rekonstrüksiyonlar elde etmek için veri kümesi başına genellikle 1 TB'ı aşan çok miktarda veri üretir. Cryo-EM verileri ve sonuçları da tipik olarak her bilimsel projede yapı-işlev ilişkilerini tam olarak anlamak için ortogonal yöntemlerden elde edilen veriler ve sonuçlarla tamamlanır. Toplanan verilerin organizasyonu, bir görüntü işleme boru hattına aktarılması ve bunun sonucunda ortaya çıkan kriyo-EM rekonstrüksiyonunun ortak çalışanlar arasında paylaşılması, yerel BT altyapılarını kurmak için kriyo-EM metodolojisinin yeni uygulayıcılarına ek gereksinimler getirmektedir. Athena gibi veri yönetimi yazılımları, kayıtlı bir kullanıcı tarafından işletilen herhangi bir bağlı cihaz veya yazılım tarafından elde edilen verilerin merkezi olarak depolanmasını kolaylaştırır. Depolanan verilere ve meta verilere, oturum açma kimlik bilgilerine ve Deneme kurulumundaki veri paylaşımı tanımlarına bağlı olarak farklı erişim haklarına (sahip, ortak çalışan veya görüntüleyici olarak) sahip projede farklı rollere sahip olabilen birden çok kullanıcı tarafından basit bir web tarayıcısı arabirimi kullanılarak erişilebilir. Deneysel iş akışlarının bu şekilde dijitalleştirilmesi, gereksiz çoğaltma olmadan ortak çalışanlar arasında veri ve meta veri paylaşımı için araçlar sağlar ve kullanılan iş akışlarının üretkenliğini ve izlenebilirliğini artırır. Veri yönetimi yazılımında projelerin, deneylerin ve iş akışlarının genel ve özelleştirilebilir bir yapısının uygulanması evrenseldir ve tamamlayıcı yöntemler kullanılarak ortogonal deneylerin tek bir proje veritabanına özelleştirilmesine ve entegre edilmesine olanak tanır.
Bir kriyo-EM ızgarasında veri toplama alanlarının seçimi, yüksek çözünürlüklü veri kümelerinin başarılı bir şekilde elde edilmesi için kritik öneme sahiptir. Vitrobot (tam otomatik bir vitrifikasyon sistemi) gibi geleneksel dalma dondurma cihazlarıyla üretilen Cryo-EM ızgaraları, tipik olarak ızgara yüzeyi üzerinde bir buz kalınlığı gradyanı gösterecektir (Şekil 4). Izgara farklı buz kalınlıklarına sahip alanlar içerdiğinden bu yararlı olabilir; Bununla birlikte, veri toplama için ideal buz kalınlığına sahip alanlar, yukarıdaki protokolde açıklandığı gibi tanımlanmalıdır. Optimum bir kriyo-EM ızgarası, mümkün olduğunca az transfer buzu kirliliği içermeli ve sağlam delikli destek folyosu ile yeterli ızgara karesi içermelidir. Çatlakları veya kırık alanları olan ızgara kareleri hakkında veri toplanması önerilmez, çünkü toplanan görüntüler, sağlam destek folyosu olan ızgara karelerine kıyasla, bir elektron ışını tarafından aydınlatıldığında önemli ölçüde daha güçlü genel sürüklenmeden etkilenecektir. Kristalin buzun fazlalığı, folyo deliklerinin çoğunu tıkayabilir ve / veya otomatik odaklamaya müdahale edebilir ve bu tür ızgara karelerinden de kaçınılmalıdır. İnce buzlu ızgara kareleri genellikle Atlas ön ayarı kullanılarak çekilen bir görüntüde görülebilen geniş vitreus alanları ve birçok parlak folyo deliği sergiler. Izgara çubuklarına yakın daha kalın buz oluşumu beklenmeli ve ızgara karesinin bu alanlarındaki folyo delikleri Delik Seçimi prosedürü sırasında hariç tutulduğundan kritik değildir. Bir ızgara karesinde birkaç boş deliğin varlığı, çevredeki deliklerdeki vitreus buzunun son derece ince olduğunu ve hasarlı parçacıklar içerebileceğini veya hiç parçacık içermediğini gösterebilir. Genel olarak, hangi alanların yüksek çözünürlüklü veri toplama için en iyi koşullara sahip olduğunu anlamak ve ideal parçacık yoğunluğu ve oryantasyon dağılımını sergilemek için ilk tarama ve değerlendirme için ızgaradaki farklı bölgelerde çeşitli buz kalınlıklarına sahip ızgara karelerini seçmek akıllıca olacaktır. Bu çalışmada kullanılan apoF ve 20S proteazom örnekleri için, gözlemlenebilir en ince buza sahip alanlar, bu örneklerin yüksek çözünürlüklü görüntülenmesi için en iyi koşulları içerir.
Veri toplama yazılımını kullanarak seçilen tüm ızgara karelerinde otomatik olarak delikler seçerken, veri toplama için aşırı kalın, aşırı ince veya beklenmedik şekilde vitreus olmayan karelerin seçilmediğinden emin olmak ve kontrol etmek için her ızgara karesindeki temsili bir delikte Şablon Yürütme görevi gerçekleştirilmesi önerilir. Veri toplama sırasında, toplanan görüntülerin görüntü sürüklenmesi ve CTF uyumu gibi temel kalite göstergeleri AYÇ kullanılarak izlenebilir. Veri toplama daha sonra düşük kaliteli görüntüler veren alanlar atlanarak optimize edilebilir. Bununla birlikte, yüksek çözünürlüklü CTF uyumlarına sahip görüntüler, tercih edilen birkaç yönde parçacıklar veya çok ince bir buz tabakasında denatüre edilmiş parçacıklar içeren görüntüleri içerebilir. Toplanan görüntülerden gerçek zamanlı parçacık toplama ve 2D sınıflandırma, görüntülenen parçacıklardaki yapısal verilerin kalitesi hakkında ek bilgi sağlayacak ve buzdaki bozulmamış parçacıkların tercih edilen yönelimlerini veya (kısmen) denatüre parçacıkların tutarsız yapısını ortaya çıkaracaktır. Bu nedenle, sınıf ortalamalarının hesaplanması, daha önce uygulanmış ve diğer yazılım paketlerinde gösterildiği gibi veri toplama için uygun bölgelerin daha da iyileştirilmesine yardımcı olabilir23,28.
Büyütme, elektron doz hızı ve defokus aralığı gibi veri toplama için görüntüleme ayarlarının seçimi, hedef çözünürlük, proteinin boyutu, numune konsantrasyonu, istenen mikroskop verimi gibi çeşitli kriterlere bağlıdır. Bu deneylerde kullanılan doğrudan elektron dedektörü kamerası için, paralel aydınlatmayı korumak için uygun bir SPOT boyutu ve yoğunluğu seçilerek elektron doz hızı 4-5 e-/pix/s aralığında seçilmiştir. Tablo 1'de gösterildiği gibi, veri toplama sırasında deliklerin ortalanması için görüntüde yeterli sinyal-gürültü oranını sağlamak üzere Delik/Ösentrik Yükseklik ön ayarında farklı bir SPOT boyutu kullanılabilir. Büyütme, piksel boyutu kriyo-EM rekonstrüksiyonu için hedef çözünürlükten en az 2-3 kat daha küçük olacak şekilde seçilmelidir. Bununla birlikte, daha yüksek büyütme (yani daha küçük piksel boyutu) kullanılır, görüntülerde daha küçük görüş alanı yakalanır ve görüntü başına daha az parçacık vardır, bu da sonuçta 3D haritaları yüksek çözünürlükte yeniden oluşturmak için yeterli parçacık içeren görüntüleri toplamak için daha uzun veri toplama süresine yol açar. apoF örneği için, görüntülerdeki yüksek partikül yoğunluğu için yeterli numune konsantrasyonuna sahip olduğumuz ve rekonstrüksiyonun 2 şaltı çözünürlüğünü hedeflediğimiz için 0,43 şpiksel boyutunu kullandık. 20S proteazom örneği için, elde edilen görüntülerde daha geniş bir görüş alanını kaplamak için 0,68 şpiksel boyutunu kullandık. Tipik olarak 200 kV TEM mikroskoplar için, kriyo-EM görüntüleri 0,8 ila 2,0 μm arasındaki bulanıklaştırma aralığında elde edilir. Bununla birlikte, enerji filtresini kullanan geliştirilmiş kontrast ve sinyal-gürültü oranıyla, daha küçük sapmalar ve buna bağlı olarak CTF zarf işlevinin bozulmasının azalması nedeniyle elde edilen görüntülerdeki yüksek çözünürlüklü bilgileri daha iyi korumak için veri alımları odaklanmaya çok daha yakın yapılabilir. Ayrıca, enerji filtresi kullanılarak görüntü kontrastı zaten yeterince geliştirilirken diyafram açıklığı ek görüntü sapmalarına neden olabileceğinden, objektif bir diyafram açıklığı da kullanmıyoruz. apoF ve 20S proteazom örnekleri için 0,5 μm, 0,7μm ve 0,9 μm bulanıklaştırma ayarlarını kullandık. Daha küçük proteinler için (<200 kDa), parçacıkların kontrastını iyileştirmek ve ~2,5 şçözünürlüklü 3D haritalara (yayınlanmamış sonuçlar) yol açan 3D rekonstrüksiyonun 3D iyileştirme adımında daha kolay parçacık toplamayı ve ilk kaba hizalamayı kolaylaştırmak için -0,5 μm, -0,7 μm ve -0,9 μm'lik defokus ayarlarını kullandık.
Bir enerji filtresiyle görüntülemenin, üst düzey 300-kV TEM mikroskoplarında toplanan kriyo-EM görüntülerinde sinyal-gürültü oranını (SNR) geliştirdiğini daha önce göstermiştik11. Aslında, elektronlar bir numuneden geçtiğinde, iki ana etkileşim türü meydana gelir: i) Elastik olarak dağılmış elektronlar enerjilerini korur ve faz kontrast mekanizması aracılığıyla saçılmamış olay ışınına müdahale ederek görüntü oluşumuna katkıda bulunur ii) elastik olarak dağılmış elektronlar numunede bir miktar enerji kaybeder ve esas olarak görüntülerdeki gürültüye katkıda bulunur. Bu nedenle, SNR, gelen ışından daha düşük enerjiye ve elastik olarak dağılmış elektronlara sahip olan elastik olarak dağılmış elektronları dar bir enerji yarığı kullanarak filtreleyerek önemli ölçüde geliştirilebilir. Bununla birlikte, yüksek çözünürlüklü kriyoEM veri kümelerinin uzun (12+ saat) otomatik veri alımı boyunca çok dar (10 eV veya daha küçük) yarıklar kullanabilmek için Selectris veya Selectris-X gibi yeterince kararlı bir enerji filtresi kullanmak çok önemlidir.
300 kV TEM mikroskoplarla aynı koşullarda 200 kV TEM mikroskoplarla elde edilen kriyo-EM görüntüleri, CTF zarf fonksiyonlarının daha hızlı bozulması nedeniyle yüksek çözünürlükte (özellikle <4 Å) daha küçük SNR sergiler. Sonuç olarak, 200 kV TEM'ler kullanıldığında belirli bir çözünürlüğe ulaşmak için daha fazla sayıda parçacık (ve dolayısıyla daha fazla sayıda toplanan görüntü) gereklidir. Ek olarak, alan derinliği (2-3 şçözünürlük aralığında 10-25 nm) 200 kV görüntülerde yaklaşık% 20 daha küçüktür 35, yani buz tabakasındaki daha az parçacık (tipik olarak 20-50 nm kalınlığında) tamamen odakta olacak ve3D yeniden yapılandırma prosedürünün sonraki aşamalarında her parçacık için bağımsız olarak bulanıklaştırma değerleri rafine edilmedikçe, hesaplanan bir 3D rekonstrüksiyonun tüm yüksek çözünürlüklü özelliklerine yapıcı bir şekilde katkıda bulunacaktır. Daha büyük parçacıklar için (ikosahedral viryonlar veya diğer makromoleküler montajlar gibi), parçacık boyutu yüksek çözünürlüklerde alan derinliğini aşabilir ve standart 3D rekonstrüksiyon algoritmalarında Ewald küresinin düzlemsel yaklaşımı nedeniyle faz hatalarına neden olabilir36. Bu hatalar, yaygın kriyo-EM görüntü işleme paketlerinde zaten uygulanmakta olan gelişmiş algoritmalarla rafine edilebilir37,28,39. Ewald küresi 200 kV veride 300 kV veriden daha büyük eğriliğe sahip olduğundan, Ewald küre düzeltmesi nispeten daha düşük çözünürlüklerde ve / veya 200 kV TEM'ler kullanıldığında nispeten daha küçük makromoleküler montajlar için gereklidir. Öte yandan, 200 kV görüntüler, 200-300 keV elektron ortalama serbest yoldan (220-280 nm) önemli ölçüde daha ince olan ince buzdaki (20-50 nm) parçacıkların daha yüksek kontrastını sergiler. Daha yüksek kontrast, özellikle yapısı henüz bilinmeyen ve 3B referans modeli henüz iyi kurulmamış olan daha küçük proteinlerin zayıf bir şekilde saçılması için bireysel parçacıkların doğru küresel hizalamasını iyileştirmeye yardımcı olur.
Burada, 20S proteazom örneğinde, 200 kV TEM mikroskobu kullanıldığında görüntü kontrastı ve kalitesinin bir enerji filtresi ile benzer şekilde iyileştirilebileceğini gösterdik. Aynı sayıda parçacık kullanılarak, 20 eV yarık kullanılarak toplanan veriler, yalnızca 2.34 şçözünürlüğe yeniden yapılandırılan tamamen açık enerji yarığı ile toplanan verilere kıyasla, 2.26 şçözünürlüğe yeniden yapılandırıldı. En iyi rekonstrüksiyon, 2.14 şçözünürlüğe yeniden yapılandırılan 10 eV yarık kullanılarak toplanan verilerden elde edildi. Bu sonuçlar, elastik olarak dağılmış elektronların filtrelenmesinin, toplanan görüntülerde SNR'yi arttırdığı ve Tablo 4'te özetlendiği gibi, verilen parçacık sayısından kriyo-EM rekonstrüksiyonlarında daha yüksek çözünürlüğü kolaylaştırdığı teorik tahminiyle uyumludur. Bu sonuçlar, enerji filtreli veri kümelerinde daha yüksek görüntü kalitesini gösteren bu veri kümelerinden hesaplanan B faktörleri tarafından daha da doğrulanmıştır.
Bu nedenle, 300 kV TEM mikroskoplarının kriyo-EM rekonstrüksiyonlarında en yüksek verimi ve mümkün olan en yüksek çözünürlüğü sağlarken, 200 kV TEM mikroskoplarının da yüksek çözünürlüklü kriyo-EM rekonstrüksiyonları için yüksek kaliteli veri setleri sağladığı sonucuna varabiliriz. Burada, elde edilen görüntülerin kalitesinin ve dolayısıyla genel yapı süresinin, bir enerji filtresi ve bir doğrudan elektron dedektörü ile donatılmış 200 kV TEM kullanılarak daha da geliştirilebileceğini gösterdik. Sunulan Protokol, bu kurulumu kullanarak yüksek çözünürlüklü kriyo-EM verilerinin rutin olarak nasıl elde edileceğine dair gerekli tüm adımları açıklamakta ve yapısal biyoloji ve yapı tabanlı ilaç tasarımındaki temel yapı-işlev ilişkilerini anlamak için gerekli olan makromoleküler 3D yapıların ince yapısal ayrıntılarını ortaya koymaktadır.

Protein yapısının belirlenmesi, hücre metabolizması, sinyal iletimi veya konakçı-patojen etkileşimleri gibi anahtar hücresel süreçlerde yer alan protein komplekslerinin moleküler mimarisini, işlevini ve düzenlenmesini anlamak için kritik öneme sahiptir. Kriyo-elektron mikroskobu (kriyo-EM), X-ışını kırınımı ve NMR spektroskopisi gibi geleneksel yapısal teknikler için çok zor olan birçok proteinin ve komplekslerinin 3D yapısını çözebilen güçlü bir teknik olarak ortaya çıkmıştır. Özellikle, kriyo-EM'nin, geleneksel yapısal teknikler için kolayca kristalize edilemeyen veya yeterli miktarlarda hazırlanamayan membran proteinleri için tercih edilen yöntem olduğu kanıtlanmıştır ve önemli hücresel reseptörlerin ve iyon kanallarının yapısı ve işlevi hakkında yeni bilgiler sağlamıştır 1,2,3,4,5 . Son zamanlarda, kriyo-EM, Covid-19 hastalığının kökenlerini aydınlatan ve etkili aşıların ve terapötiklerin hızlı bir şekilde geliştirilmesine temel oluşturan moleküler düzeyde SARS-CoV-2 enfeksiyonunun mekanizmasını belirleyerek Covid-19 pandemisi ile mücadelede önemli bir rol oynamıştır 6,7,8,9,10.
Tipik olarak, üst düzey 300-kV iletim elektron mikroskopları (TEM), konformasyonlarını ve etkileşimlerini ortaya çıkarmak için kriyo-EM tek parçacık analizi (SPA) ile biyomoleküllerin yüksek çözünürlüklü yapı tayini için kullanılır. Son zamanlarda, SPA tekniği, ortak kriter kriyo-EM numunesi apo-ferritin, soğuk alan emisyon tabancası (E-CFEG), bir doğrudan elektron dedektörü ve bir enerji filtresi ile donatılmış 300 kV'luk bir TEM kullanılarak atomik çözünürlükte (1.2 Å) 11,12 yeniden yapılandırıldığında yeni bir sınıra ulaştı. Bu kararda, bireysel atomların yapıdaki konumlarını, bireysel amino asit yan zincirlerinin konformasyonunu, hidrojen bağını ve diğer etkileşimleri açık bir şekilde çözmek mümkün olmuştur; bu, yeni hedeflerin yapı tabanlı ilaç keşfi ve mevcut ilaç adaylarının optimizasyonu için yeni olanaklar açmaktadır.
Orta menzilli 200 kV TEM mikroskopları, özellikle daha büyük kriyo-EM tesislerinde, üst düzey TEM mikroskopları kullanılarak nihai yüksek çözünürlüklü veri toplamadan önce numune taraması ve numune optimizasyonu için sıklıkla kullanılır. Tipik olarak, görüntülenen örnekler, nihai veri toplama için üst düzey bir 300 kV TEM'e geçmek için yeterli olan 3-4 şçözünürlük aralığında çözümlenebilir. Sonuç olarak, 200 kV TEM kullanılarak veri toplama genellikle mümkün olan en yüksek çözünürlük sonuçları için daha fazla optimize edilmez. Dahası, birçok ilginç biyolojik soru bu kararlarda zaten cevaplanabilir ve yayınlanabilir, çünkü tüm amino asit yan zincirleri zaten çözülmüştür ve ligand bağlanma bölgelerinin doluluğu da güvenilir bir şekilde belirlenebilir13. 200-kV TEM'lerin14,15,16,17,18 numaralı numune için 3 Å'nın ötesinde çözünürlüklere ulaşabileceği zaten gösterilmiştir. 200 kV'ta çekilen görüntüler, görüntülenen parçacıkların doğal olarak daha yüksek kontrastını sergiler, bu da 300 kV TEM görüntülerine kıyasla yüksek çözünürlükte daha zayıflatılmış sinyale rağmen parçacıkların daha doğru ilk hizalanmasını bile kolaylaştırabilir. Yeniden yapılandırılmış kriyo-EM haritalarının elde edilen çözünürlüğünün, hem 200-kV hem de 300-kV rekonstrüksiyonlarını etkileyen görüntülü numunelerin yapısal esnekliği ve konformasyonel heterojenliği ile sınırlı olduğunu belirtmek önemlidir. Aslında, 300-kV sistemleri kullanılarak elde edilen kriyo-EM rekonstrüksiyonları, 3-4 şçözünürlük aralığında, daha yüksek çözünürlüklerde19'dan daha fazla çözülmüştür. 200 kV TEM mikroskoplar daha az karmaşık olduğundan ve daha küçük odalara sığdığından, bu mikroskoplar, mikroskop Otomatik Yükleyici sisteminde depolanan birden fazla numuneden uzun veri toplamanın otomasyonunu korurken, kriyo-EM ile biyolojik makromoleküllerin yapı tayini için iyi, daha düşük maliyetli bir seçeneği temsil eder.
Yüksek çözünürlüklü yapı tayini için kriyo-EM veri setlerinin toplanması, mikroskop optiklerinin doğru bir şekilde hizalanmasını gerektirir. Sütun hizalamaları, elektron kaynağından kondenser lens sistemine, objektif lense ve bir elektron dedektörü ile enerji filtresine sistematik olarak ilerler. Hizalamaların tam sırası tipik olarak gerekli değildir. Gerektiğinde, kullanıcı, mikroskop kullanıcı arayüzündeki (Doğrudan Hizalama kontrol paneli) hizalama prosedürü boyunca bağlama duyarlı bir yardım penceresindeki her adımın uygun bir açıklamasıyla yarı otomatik prosedürler aracılığıyla yönlendirilir. Mikroskop tamamen hizalandıktan sonra, elektron optikleri sabit kalır ve hizalamaların en az birkaç ay boyunca değiştirilmesi gerekmez. Yalnızca örnek düzlemin paralel aydınlatılması, nesnel astigmatizm ve komasız hizalama gibi en hassas hizalamalar, her veri kümesinin toplanmasına başlamadan hemen önce iyileştirilmelidir. Toplanan verilerin kalitesi daha sonra EPU Quality Monitor, cryoSPARC Live 20, Relion 21, Scipion 22, WARP 23 veya Appion 24 gibi farklı yazılım paketleri kullanılarak veri toplama sırasında izlenebilir.
Mikroskobun doğru hizalanmasının yanı sıra, minimum konformasyonel ve bileşimsel heterojenliğe sahip iyi saflaştırılmış numunelerin yüksek kalitesi de yüksek çözünürlüklü veri kümelerinin toplanması ve yüksek çözünürlüklü yapıların çözülmesi için bir ön koşuldur. Tipik protokoller, sık karşılaşılan zorluklar ve olası çözümler hakkında daha fazla ayrıntı, bu konuya adanmış diğer incelemelerde bulunabilir25,26,27. Temel olarak, belirli bir kriyo-EM ızgarasında, yüksek çözünürlüklü bilgileri korumak için yeterince ince buza sahip alanları bulmak çok önemlidir ve bireysel parçacıklar, örtüşmeler olmadan rastgele yönlerde yoğun bir şekilde dağıtılır. Bununla birlikte, tipik kriyo-EM ızgaraları düzgün olmayan buz kalınlığına sahiptir ve bu nedenle görüntüleme için en uygun alanları bulmak ve seçmek önemlidir. Izgaradaki buz kalınlığının tahmini için farklı araçlar, EPU 2, Leginon28 veya SerialEM29 gibi kriyo-EM veri kümelerinin otomatik olarak toplanmasına adanmış yazılım paketlerinde mevcuttur.
Hızlı ve hassas doğrudan elektron dedektörlerinin ortaya çıkışı, ışın kaynaklı hareketlerin telafisi sağlayan filmler olarak birçok fraksiyonda görüntülerin toplanmasını sağladı ve görüntü işleme ve son 3D rekonstrüksiyonda kullanılan verilerin kalitesinde ve miktarında önemli bir artışa neden oldu30. Aynı zamanda, otomasyon ve yüksek verimli veri toplama, veri depolama ve erişim için zorlukları temsil eden binlerce görüntü/film içeren devasa veri kümeleri sağlar. Onlarca ila yüzlerce kullanıcıya hizmet veren büyük cryo-EM tesislerine sahip benimsenen model, özellikle yerleşik cryo-EM boru hatlarında uygun izleme ve veri paylaşımı ile organize veri yönetimi çağrısında bulunmaktadır31,32.
Bu çalışmada, 200 kV Glacios TEM mikroskobu kullanılarak yüksek çözünürlüklü kriyo-EM veri kümelerinin rutin olarak toplanması için bir protokol açıklanmaktadır. Mikroskop optiklerinin gerekli hizalamaları, kriyo-EM numunelerinin değerlendirilmesi ve yüksek çözünürlüklü veri toplama için uygun alanların seçimi için prosedürlerle birlikte açıklanmaktadır. Toplanan verilerin ve ilgili meta verilerin örnek bilgilerle organizasyonu, örnek bilgilerin ve toplanan verilerin gözden geçirilmesini kolaylaştıran bir veri yönetimi platformu olan Athena'da gösterilmiştir. Fare apo-ferritin örneğini kullanarak, 1.6şçözünürlükte 13D rekonstrüksiyon elde etmek mümkündü. Açıklanan protokolü kullanarak, 20S proteazomunun 3D yoğunluk haritasını Thermoplasma acidophilum'dan 2.1 şçözünürlükte yeniden yapılandırdık.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>AutoGrid rings</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>1036173</td>
			<td>Package of 100x AutoGrid rings for the standard EM grids.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C-Clip</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>1036171</td>
			<td>Package of 100 clips that secure 
			the standard EM grids inside the AutoGrid rings.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Data Management Platform</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>1160939</td>
			<td>Part of the Glacios base configuraiton; includes Athena Software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EPU Quality Monitor</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>1179770</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EPU Software</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>1025080</td>
			<td>Part of the Glacios base configuration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethane 3.5</td>
			<td>Westfalen</td>
			<td>A06010110</td>
			<td>Ethane gas used for making liquid ethane (puritiy at least N35, i.e. 99.95% vol)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 4 200kV</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>1166936</td>
			<td>Direct electron detector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glacios</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>1149551</td>
			<td>200 kV TEM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GloQube Plus Glow Discharge System for TEM Grids and surface modification</td>
			<td>Quorum</td>
			<td>N/A</td>
			<td>also available via Thermo Fisher Scientific (PN 1160602)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuantiFoil grids</td>
			<td>Quantifoil</td>
			<td>N/A</td>
			<td>R-2/1, 300 mesh; carbon foil grid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Relion</td>
			<td>MRC Laboratory of Molecular Biology</td>
			<td>N/A</td>
			<td>open source software: 
			https://relion.readthedocs.io/en/release-3.1/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Selectris with Falcon 
			4 for 200 kV</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>1191753</td>
			<td>Energy filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Selectris X with Falcon 
			4 for 200 kV</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>1191755</td>
			<td>Energy filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltrAuFoil grids</td>
			<td>Quantifoil</td>
			<td>N/A</td>
			<td>R-1.2/1.2, 300 mesh; gold foil grids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vitrobot Mk. IV</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>1086439</td>
			<td>Automated vitrification system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman 595 filter paper</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AA00420S</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

routine collection of high-resolution cryo-em datasets using 200 kv transmission electron microscope

Kriyo-elektron mikroskobu (kriyo-EM), son on yılda protein yapı tayini için rutin bir yöntem olarak kurulmuş ve yayınlanan yapısal verilerin giderek artan bir payını almıştır. TEM teknolojisindeki ve otomasyondaki son gelişmeler, hem veri toplama hızını hem de elde edilen görüntülerin kalitesini artırırken, aynı zamanda 3 şaltı çözünürlüklerde kriyo-EM haritaları elde etmek için gerekli uzmanlık seviyesini azaltmıştır. Bu tür yüksek çözünürlüklü yapıların çoğu son teknoloji ürünü 300 kV kriyo-TEM sistemleri kullanılarak elde edilirken, özellikle bir enerji filtresi ile donatıldığında 200 kV kriyo-TEM sistemleri ile yüksek çözünürlüklü yapılar da elde edilebilir. Ek olarak, mikroskop hizalamalarının ve veri toplamanın gerçek zamanlı görüntü kalitesi değerlendirmesi ile otomasyonu, sistem karmaşıklığını azaltır ve optimum mikroskop ayarlarını garanti eder, bu da yüksek kaliteli görüntülerin veriminin ve veri toplamanın genel veriminin artmasına neden olur. Bu protokol, 200 kV'luk bir kriyo-transmisyonlu elektron mikroskobu üzerinde son teknolojik gelişmelerin ve otomasyon özelliklerinin uygulanmasını ve de novo atomik model oluşturma için yeterli olan 3D haritaların yeniden yapılandırılması için verilerin nasıl toplanacağını göstermektedir. Bu tür yüksek çözünürlüklü kriyo-EM veri kümelerinin rutin olarak toplanmasını sağlamak için göz önünde bulundurulması gereken en iyi uygulamalara, kritik değişkenlere ve yaygın sorunlara odaklanıyoruz. Özellikle aşağıdaki temel konular ayrıntılı olarak gözden geçirilmiştir: i) mikroskop hizalamalarının otomasyonu, ii) veri toplama için uygun alanların seçimi, iii) yüksek kaliteli, yüksek verimli veri toplama için optimum optik parametreler, iv) sıfır kayıplı görüntüleme için enerji filtresi ayarı ve v) veri yönetimi ve kalite değerlendirmesi. En iyi uygulamaların uygulanması ve bir enerji filtresi kullanılarak ulaşılabilir çözünürlüğün iyileştirilmesi, 1.6 Å'ye yeniden yapılandırılmış apo-ferritin ve bir enerji filtresi ve bir doğrudan elektron dedektörü ile donatılmış 200 kV'luk bir TEM kullanılarak 2.1-şçözünürlüğe yeniden yapılandırılmış Thermoplasma acidophilum 20S proteazom örneğinde gösterilecektir.

Watch this Scientific Journal Video about Routine Collection of High-Resolution cryo-EM Datasets Using 200 KV Transmission Electron Microscope at JoVE.com

Routine Collection of High-Resolution cryo-EM Datasets Using 200 KV Transmission Electron Microscope

Makromoleküllerin yüksek çözünürlüklü kriyo-EM haritaları da 200 kV TEM mikroskopları kullanılarak elde edilebilir. Bu protokol, 200 kV TEM kullanarak yüksek çözünürlüklü veri kümelerinin başarılı bir şekilde toplanması için gerekli olan doğru optik hizalamaları, veri toplama şemalarını ve görüntüleme alanlarının seçimini ayarlamak için en iyi uygulamaları gösterir.

200 KV İletim Elektron Mikroskobu Kullanarak Yüksek Çözünürlüklü Kriyo-EM Veri Kümelerinin Rutin Toplanması

Cryo-electron microscopy (cryo-EM) has been established as a routine method for protein structure determination during the past decade, taking an ...

Cryo-EM, proteinlerin ve komplekslerinin yapı tayini için standart bir teknik haline gelmiştir. Bu protokol, orta menzilli 200 kV TEM mikroskoplardan yüksek çözünürlüklü Cryo-EM veri kümelerinin nasıl elde edileceğine ilişkin en iyi uygulamaları açıklar. Cryo-EM, aynı anda çoklu konformasyonel durumlar ve fonksiyonel durumlar için çözelti içinde yakın doğal koşullarda protein yapısını belirleyebilir, bu da diğer yapısal teknikler için zordur.Elde edilen yapısal bilgiler, protein fonksiyonunun moleküler mekanizmalarının aydınlatılmasında ve yapı bazlı ilaç tasarımında kullanılabilir. Örneğin, amiloid fibrillerinin yapısındaki yeni bir yayın, hayati bir ligandın çoklu bağlanma bölgelerini ortaya çıkardı. Bununla birlikte, bu protokolde, yüksek çözünürlüklü Cryo-EM verilerinin elde edilmesindeki kritik adımları göstermek için standart apoferritin ve proteazom örneklerini kullanıyoruz.Bir Cryo-TEM'in çalıştırılması, özellikle gelişmiş otomasyon özelliklerinin tanıtılması nedeniyle son yıllarda daha kolay hale gelmiştir. Ancak, ilk oturum için, daha deneyimli kullanıcılarla bir eğitim almanızı tavsiye ederiz. Oradan, teknikteki ilerleme nispeten hızlıdır.Prosedürü gösteren, Thermo Fisher Scientific'te kıdemli bir uygulama bilimcisi olan Adrian Koh olacak. Otomatik ızgaraları sıvı nitrojen koşulları altında otomatik yükleyici kasetine takın. Otomatik ızgaralı kaseti sıvı azot soğutmalı transfer kapsülüne yerleştirin.Ayrıca kapsülü mikroskopa yerleştirin ve kaseti kapsülden mikroskobun otomatik yükleyicisine yüklemek için mikroskop kullanıcı arayüzündeki Dock düğmesine tıklayın. Yüklenen kasetteki otomatik ızgaraların varlığını kontrol etmek için Envanter düğmesine tıklayın. Ardından, otomatik ızgaraları TEM görüntüleme sütununa eklemek için Yükle ve Kaldır düğmelerine tıklayın.Atlas sekmesini seçin ve yeni bir oturum açmak için Yeni Oturum düğmesine tıklayın. Oturum adı ve veri depolama konumu gibi ayrıntıları doldurun ve Uygula düğmesine tıklayın. İlgili kılavuz numarasının yanındaki onay kutusunu işaretleyerek ilgilendiğiniz kılavuzları seçin.Seçilen tüm ızgaraların tam otomatik atlas koleksiyonunu başlatmak için Başlat düğmesine tıklayın. Koleksiyon tamamlandığında, alınan atlasları incelemek için ızgara etiketlerine tıklayın. EPU sekmesini seçin ve sol panelde yeni bir oturum oluşturmak için Yeni Oturum'a gidin.Geçerli ayarlanmış optik hazır ayarları kullanmak için Yeni Oturum seçeneğini belirleyin. Oturum adını girin. Protokolün ilerleyen bölümlerinde veri toplama için seçilen tek tek deliklerin ve ızgara karelerinin seçimi üzerinde denetime sahip olmak için oturumun el ile türünü seçin.Veri toplama için sapmasız görüntü kaydırmayı kullanmak üzere daha hızlı alma modunu seçin. Ardından, meta verilerin kaydedileceği konumu girin. Yeni bir oturum oluşturmak için Uygula düğmesine tıklayın.Izgaranın toplanan atlasını göstermek için sol paneldeki kare seçim görevini seçin. Izgara karelerini hasarsız destek folyosu, ince vitreus buzu ve folyo delikleri, ızgara karesinde ihmal edilebilir kristal buz kirliliği ve ızgara karesi boyunca ve bireysel folyo delikleri içinde minimum parlaklık gradyanı ile tanımlayın. Tam atlas veya yüksek kaliteli kutucuk görüntülerinde veri toplama için ızgara karelerini seçin.İlgilendiğiniz bir ızgara karesine sağ tıklayın ve tüm seçim görevini seçin. Otomatik Ösantrik düğmesine tıklayarak otomatik olarak seçilen ilk ızgara karesine gidin. Ösentrik yüksekliği ayarlayın ve folyo deliklerini bulmak için ızgara kare görüntü elde edin.Görüntüdeki folyo deliklerini bulmak için Delikleri Bul düğmesine tıklayın. Izgara çubuklarının yakınındaki deliklerin seçimini kaldırmak üzere ızgara çubuğu düğmesini kapatmak için Delikleri Kaldır düğmesine tıklayın. Çok kalın buzlu tüm delikleri ve tüm boş delikleri kaldırmak için buz filtresinin parlaklık histogramındaki sınırları ayarlayın.Izgara kare görüntüsündeki bir deliğe sağ tıklayın ve burada sahneyi konuma taşı aşamasını seçin. Sol panelde şablon tanımı görevini seçin. Tüm görüntüyü elde etmek için Al düğmesine tıklayın.Görüntü kaydırma sonrası gecikme değerlerini 0,5 saniyeye ve sahne alanı kaydırma sonrası gecikmeyi beş saniyeye ayarlayın. Görüntüdeki bir deliği ortalamak için Delik Bul ve Ortala düğmesine tıklayın. Alım Alanı Ekle düğmesini seçin ve yüksek büyütmeli görüntü alımının yapılacağı ortalanmış delikteki konumu seçmek için resme tıklayın.Otomatik Netleme Alanı Ekle düğmesini seçin ve görüntü otomatik odaklamanın gerçekleştirileceği ortalanmış deliğin yanındaki destek folyosundaki konumu seçmek için görüntüye tıklayın. Yazılım penceresinin üst kısmındaki bulanıklaştırma listesinde bir dizi bulanıklaştırma değeri ayarlamak için yeşil Edinme Alanı'na tıklayın. Otomatik netlemeye özgü ayarları yaptıktan sonra, her AFIS kümesinin başında otomatik netlemeyi Ortaladıktan Sonra seçeneğini belirleyin.Daha hızlı otomatik odaklama ve daha az sahne alanı sürüklenmesi için Hedef Lens seçeneğini belirleyin. Veri toplamayı ve seçilen diğer tüm ızgara karelerini bu ilk ızgara karesinde kullanılan ayarlara göre otomatik olarak ayarlamak için delik seçimi görevindeki Tüm Kareleri Hazırla düğmesine tıklayın. Şablon tanımı görevini seçin, yeni bir görüntü edinin, sağ tıklayarak sahne alanını karbon folyo üzerinde temiz bir alana taşıyın ve sahneyi buraya taşı menü seçeneğini seçin.Otomatik İşlevler sekmesini seçin. İstediğiniz bulanıklaştırmayı ve yinelemeyi ayarladıktan sonra, otomatik odaklama ön ayarına geçin ve otomatik odaklama işlevini çalıştırmak için Başlat Düğmesine tıklayın. Otomatik Damgalama görevini seçin, Thon Ring hazır ayarına geçin ve Başlat düğmesine basın.Otomatik Haberleşme görevini seçin ve Başlat düğmesine basın. Sahne alanını bozuk ızgara karesi olan bir alana taşıyın. Tek bir otomatik odaklama görüntüsü alarak alanın saydamlığını onaylayın.Sherpa UI'yi açın ve Enerji Filtresi uygulamasını seçin. Sıfır kayıp enerji filtresi yarığını ortalamak için Orta düğmesine ve sıfır kayıp seçeneğine tıklayın. İzokromatisite seçeneğindeki Ayarla düğmesine tıklayın.Geometrik ve kromatik bozulmalarda Ayar Büyütme ve Ayar Bozulmaları seçeneğine tıklayın. EPU sekmesine gidin, Otomatik Edinme görevini seçin ve tam otomatik veri toplamaya başlamak için Çalıştırmayı Başlat düğmesine tıklayın. Şekil, ızgara yüzeyi üzerinde buz kalınlığının bir gradyanını gösteren Cryo-EM ızgaralarını göstermektedir.Daha fazla araştırmadan hariç tutulan ızgaralar, kalın buzlu kötü ızgara ve kötü buz ve kirlenme ile bükülmüş bir ızgara iken, kabul edilebilir ızgaralar iyi buz gradyanına sahip olanlar ve iyi ince buz ve küçük buz gradyanı olan tipik bir ızgaradır. Şekil, yeniden yapılandırılmış apoferritin Cryo-EM haritasının son 3D görüntüsünü göstermektedir. Yüksek stabilite ve simetri, onu yüksek çözünürlüklü Cryo-EM görüntüleme ve görüntü işleme için en uygun referans örneği haline getirir.Bayes parlatma, CTF iyileştirme ve Ewald küre düzeltmesi 1.63 angstrom çözünürlüklü bir harita ile sonuçlandı. Şekil, bireysel amino asit yan zincir seviyesinde yeniden yapılandırılmış apoferritin Cryo-EM haritasının ayrıntılı bir görünümünü göstermektedir. Amino asit yan zincirlerinin yoğunluğu iyi çözülmüştür ve atomik model harita içinde açık bir şekilde inşa edilebilir.Buradaki görüntü, aynı Cryo-EM ızgarasından toplanan farklı bulanıklaştırma değerlerinde iki farklı veri kümesini, tamamen açık bir yarık ve 10 elektron voltluk bir yarık ile benzer ızgara kareleri ile göstermektedir; bu, 10 elektron voltluk yarığın görüntü kontrastını önemli ölçüde iyileştirdiğini göstermektedir. Buradaki şekil, standart Cryo-EM örneği olarak kullanılan segmentli alt birimlere sahip 20S proteazom Cryo-EM haritasına genel bir bakış göstermektedir. Ve takılı bir atomik modelle yakınlaştırılmış görünümü, proteazom kompleksinin D7 simetrisine sahip kararlı katalitik çekirdeğini temsil eder.Protokol iki kritik adım içerir. Birincisi, homojen parçacıklar içeren ince vitreus buzlu alanları aramak. İkincisi, veri toplama için paralel aydınlatmanın kurulması.Çözünürlükte iki ila üç angstrom elde eden proteinlerin yüksek çözünürlüklü rekonstrüksiyonlarıyla, hastalığın moleküler mekanizmalarını daha iyi anlayabilir ve ilaç kurşunlarını iyileştirebilirsiniz. Önceden, biyolojik olayların yapısal temelini incelemek istiyorsanız kristalleşme gerekliydi. Bugün Cryo-EM ile, bu artık gerekli değil.Ve böylece Cryo-EM ile, bilim adamlarının yapısal düzeyde daha geniş bir biyolojik fenomen yelpazesini incelemelerini sağlıyoruz.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Method to Visualize and Analyze Membrane Interacting Proteins by Transmission Electron Microscopy

Yöntem gözünüzde canlandırın ve Transmisyon Elektron Mikroskobu Membran Etkileşen Proteinler Analiz için

Monotopic proteins exert their function when attached to a membrane surface, and such interactions depend on the specific lipid composition and on the ...

High-resolution Single Particle Analysis from Electron Cryo-microscopy Images Using SPHIRE

SPHIRE Kullanılarak Elektron Kriyo-mikroskopi Görüntülerinden Yüksek Çözünürlüklü Tek Parçacık Analizi

SPHIRE (SPARX for High-Resolution Electron Microscopy) is a novel open-source, user-friendly software suite for the semi-automated processing of single ...

Cryo-EM and Single-Particle Analysis with Scipion

Scipion ile Kriyo-EM ve Tek Parçacık Analizi

Cryo-electron microscopy has become one of the most important tools in biological research to reveal the structural information of macromolecules at ...

Preparation of Sample Support Films in Transmission Electron Microscopy using a Support Floatation Block

Destek Yüzdürme Bloğu Kullanılarak İletim Elektron Mikroskopisinde Numune Destek Filmlerinin Hazırlanması

Structure determination by cryo-electron microscopy (cryo-EM) has rapidly grown in the last decade; however, sample preparation remains a significant ...

Preparing Lamellae from Vitreous Biological Samples Using a Dual-Beam Scanning Electron Microscope for Cryo-Electron Tomography

Kriyo-Elektron Tomografisi için Çift Işınlı Taramalı Elektron Mikroskobu Kullanarak Vitreus Biyolojik Numunelerinden Lamel Hazırlanması

Presented here is a protocol for preparing cryo-lamellae from plunge-frozen grids of Plasmodium falciparum-infected&#160;human erythrocytes, which could ...

Preparation of High-Temperature Sample Grids for Cryo-EM

Cryo-EM için Yüksek Sıcaklık Numune Izgaralarının Hazırlanması

The sample grids for cryo-electron microscopy (cryo-EM) experiments are usually prepared at a temperature optimal for the storage of biological samples, ...

Micropatterning Transmission Electron Microscopy Grids to Direct Cell Positioning within Whole-Cell Cryo-Electron Tomography Workflows

Tüm Hücreli Kriyo-Elektron Tomografi İş Akışlarında Doğrudan Hücre Konumlandırmasına Mikropatterning İletim Elektron Mikroskopi Izgaraları

Whole-cell cryo-electron tomography (cryo-ET) is a powerful technology that is used to produce nanometer-level resolution structures of macromolecules ...

Quantification of Subcellular Glycogen Distribution in Skeletal Muscle Fibers using Transmission Electron Microscopy

İskelet Kas Liflerinde Subsellüler Glikojen Dağılımının İletim Elektron Mikroskobu Kullanılarak Ölçülmesi

With the use of transmission electron microscopy, high-resolution images of fixed samples containing individual muscle fibers can be obtained. This ...

A Robust Single-Particle Cryo-Electron Microscopy (cryo-EM) Processing Workflow with cryoSPARC, RELION, and Scipion

A Robust Single-Particle Cryo-Electron Microscopy cryo-EM Processing Workflow with cryoSPARC, RELION, and Scipion

CryoSPARC, RELION ve Scipion ile Sağlam Tek Parçacıklı Kriyo-Elektron Mikroskobu (cryo-EM) İşleme İş Akışı

Recent advances in both instrumentation and image processing software have made single-particle cryo-electron microscopy (cryo-EM) the preferred method ...

Advancing High-Resolution Imaging of Virus Assemblies in Liquid and Ice

Sıvı ve Buzdaki Virüs Düzeneklerinin Yüksek Çözünürlüklü Görüntülenmesinin İlerlemesi

Interest in liquid-electron microscopy (liquid-EM) has skyrocketed in recent years as scientists can now observe real-time processes at the nanoscale. It ...