Name: layer microdissection of tricuspid valve leaflets for biaxial mechanical characterization and microstructural quantification
Uploaded: 2022-02-10T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Layer Microdissection of Tricuspid Valve Leaflets for Biaxial Mechanical Characterization and Microstructural Quantification at JoVE.com

Dit werk werd ondersteund door de American Heart Association Scientist Development Grant (16SDG27760143) en de Presbyterian Health Foundation. KMC werd gedeeltelijk ondersteund door het Undergraduate Research Opportunity Program van de University of Oklahoma (OU) en het Honors Research Apprenticeship Program. DWL werd gedeeltelijk ondersteund door de National Science Foundation Graduate Research Fellowship (GRF 2019254233) en de American Heart Association / Children's Heart Foundation Predoctoral Fellowship (Award # 821298). Al deze steun wordt dankbaar erkend.

Alle hierin beschreven methoden zijn goedgekeurd door de Institutional Animal Care and Use Committee aan de Universiteit van Oklahoma. Dierlijke weefsels werden verkregen van een usda-goedgekeurd slachthuis.
1. Biaxiale mechanische karakterisering
<ol><li>Weefselvoorbereiding<ol>
<li>Haal een tv-folder uit de vriezer, scheermesjes, een chirurgische pen, een tang, een pipet met gedeïoniseerd (DI) water en een snijmat. Ontdooi de tv-folder met 2-3 druppels DI-water op kamerte...

<ol>
	<li>Vesely, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+elastin+in+aortic+valve+mechanics.">The role of elastin in aortic valve mechanics.</a> Journal of Biomechanics. 31 (2), 115-123 (1998).</li><li>Zhang, W., Ayoub, S., Liao, J., Sacks, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+meso-scale+layer-specific+structural+constitutive+model+of+the+mitral+heart+valve+leaflets.">A meso-scale layer-specific structural constitutive model of the mitral heart valve leaflets.</a> Acta Biomaterialia. 32, 238-255 (2016).</li><li>Stella, J. A., Sacks, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+biaxial+mechanical+properties+of+the+layers+of+the+aortic+valve+leaflet.">On the biaxial mechanical properties of the layers of the aortic valve leaflet.</a> Journal of Biomechanical Engineering. 129 (5), 757-766 (2007).</li><li>Khoiy, K. A., Amini, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+biaxial+mechanical+response+of+porcine+tricuspid+valve+leaflets.">On the biaxial mechanical response of porcine tricuspid valve leaflets.</a> Journal of Biomechanical Engineering. 138 (10), 104504 (2016).</li><li>Jett, S. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+investigation+of+the+anisotropic+mechanical+properties+and+anatomical+structure+of+porcine+atrioventricular+heart+valves.">An investigation of the anisotropic mechanical properties and anatomical structure of porcine atrioventricular heart valves.</a> Journal of the Mechanical Behavior of Biomedical Materials. 87, 155-171 (2018).</li><li>Meador, W. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+detailed+mechanical+and+microstructural+analysis+of+ovine+tricuspid+valve+leaflets.">A detailed mechanical and microstructural analysis of ovine tricuspid valve leaflets.</a> Acta Biomaterialia. 102, 100-113 (2020).</li><li>Hudson, L. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+pilot+study+on+linking+tissue+mechanics+with+load-dependent+collagen+microstructures+in+porcine+tricuspid+valve+leaflets.">A pilot study on linking tissue mechanics with load-dependent collagen microstructures in porcine tricuspid valve leaflets.</a> Bioengineering. 7 (2), 60 (2020).</li><li>Pant, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pressure-induced+microstructural+changes+in+porcine+tricuspid+valve+leaflets.">Pressure-induced microstructural changes in porcine tricuspid valve leaflets.</a> Acta Biomaterialia. 67, 248-258 (2018).</li><li>Kramer, K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+investigation+of+layer-specific+tissue+biomechanics+of+porcine+atrioventricular+heart+valve+leaflets.">An investigation of layer-specific tissue biomechanics of porcine atrioventricular heart valve leaflets.</a> Acta Biomaterialia. 96, 368-384 (2019).</li><li>Ross, C. J., Laurence, D. W., Wu, Y., Lee, C. -. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biaxial+mechanical+characterizations+of+atrioventricular+heart+valves.">Biaxial mechanical characterizations of atrioventricular heart valves.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (146), e59170 (2019).</li><li>Goth, W., Lesicko, J., Sacks, M. S., Tunnell, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical-based+analysis+of+soft+tissue+structures.">Optical-based analysis of soft tissue structures.</a> Annual Review of Biomedical Engineering. 18, 357-385 (2016).</li><li>Jett, S. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integration+of+polarized+spatial+frequency+domain+imaging+(pSFDI)+with+a+biaxial+mechanical+testing+system+for+quantification+of+load-dependent+collagen+architecture+in+soft+collagenous+tissues.">Integration of polarized spatial frequency domain imaging (pSFDI) with a biaxial mechanical testing system for quantification of load-dependent collagen architecture in soft collagenous tissues.</a> Acta Biomaterialia. 102, 149-168 (2020).</li><li>Reddy, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> An Introduction to Continuum Mechanics. , (2013).</li><li>Duginski, G. A., Ross, C. J., Laurence, D. W., Johns, C. H., Lee, C. -. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+investigation+of+the+effect+of+freezing+storage+on+the+biaxial+mechanical+properties+of+excised+porcine+tricuspid+valve+anterior+leaflets.">An investigation of the effect of freezing storage on the biaxial mechanical properties of excised porcine tricuspid valve anterior leaflets.</a> Journal of the Mechanical Behavior of Biomedical Materials. 101, 103438 (2020).</li><li>Salinas, S. D., Clark, M. M., Amini, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+response+changes+in+porcine+tricuspid+valve+anterior+leaflet+under+osmotic-induced+swelling.">Mechanical response changes in porcine tricuspid valve anterior leaflet under osmotic-induced swelling.</a> Bioengineering. 6 (3), 70 (2019).</li><li>Pokutta-Paskaleva, A., Sulejmani, F., DelRocini, M., Sun, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+mechanical,+morphological,+and+microstructural+characterization+of+porcine+mitral+and+tricuspid+leaflets+and+chordae+tendineae.">Comparative mechanical, morphological, and microstructural characterization of porcine mitral and tricuspid leaflets and chordae tendineae.</a> Acta Biomaterialia. 85, 241-252 (2019).</li><li>Ross, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+investigation+of+the+glycosaminoglycan+contribution+to+biaxial+mechanical+behaviors+of+porcine+atrioventricular+heart+valve+leaflets.">An investigation of the glycosaminoglycan contribution to biaxial mechanical behaviors of porcine atrioventricular heart valve leaflets.</a> Journal of the Royal Society Interface. 16 (156), 0069 (2019).</li><li>Sommer, G., Regitnig, P., Ko&#776;ltringer, L., Holzapfel, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biaxial+mechanical+properties+of+intact+and+layer-dissected+human+carotid+arteries+at+physiological+and+supraphysiological+loadings.">Biaxial mechanical properties of intact and layer-dissected human carotid arteries at physiological and supraphysiological loadings.</a> American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 298 (3), 898-912 (2009).</li><li>Holzapfel, G. A., Sommer, G., Gasser, C., Regitnig, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+the+layer-specific+mechanical+properties+ofhuman+coronary+arteries+with+intimal+thickening,+and+related+constitutive+modelling.">Determination of the layer-specific mechanical properties ofhuman coronary arteries with intimal thickening, and related constitutive modelling.</a> American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 289 (5), 2048-2058 (2005).</li><li>Sommer, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiaxial+mechanical+response+and+constitutive+modeling+of+esophageal+tissues:+Impact+on+esophageal+tissue+engineering.">Multiaxial mechanical response and constitutive modeling of esophageal tissues: Impact on esophageal tissue engineering.</a> Acta Biomaterialia. 9 (12), 9379-9391 (2013).</li></ol>

Kritische stappen voor het protocol zijn: (i) de laagmicrodissectie, (ii) de weefselmontage, (iii) de fiduciale markerplaatsing en (iv) de pSFDI-opstelling. Passende laagmicrodissectie is het belangrijkste en moeilijkste aspect van de hierin beschreven methode. Voordat een onderzoek met behulp van deze techniek wordt gestart, moeten de dissector (en) langdurig oefenen met de microdissectietechniek en alle drie de tv-folders. De dissector moet ervoor zorgen dat de samengestelde laagmonsters voldoende groot zijn (>3,3 mm) ...

De tv bevindt zich tussen het rechter atrium en de rechter ventrikel van het hart. Gedurende de hele hartcyclus reguleert de tv de unidirectionele bloedstroom via het cyclisch openen en sluiten van de tv-anterieure folder (TVAL), de tv-posteriorfolder (TVPL) en de tv-septumfolder (TVSL). Deze blaadjes zijn complex en hebben vier verschillende anatomische lagen - de atrialis (A), de spongiosa (S), de fibrosa (F) en de ventriculaireis (V) - met unieke microstructurele bestanddelen. De elastinevezels in de atrialis en ventriculaireis helpen het weefsel te herstellen naar zijn ongevormde geometrie na mechanische belasting1. De fibrosa bevat daarentegen een dicht netwerk van golvende collageenvezels die bijdragen aan het draagvermogen van de bijsluiters2. Voornamelijk bestaande uit glycosaminoglycanen, is de spongiosa verondersteld om scheren tussen folderlagen mogelijk te maken tijdens hartklepfunctie3. Hoewel alle drie de foldertypen dezelfde anatomische lagen hebben, zijn er variaties in de diktes van de lagen en de samenstellingsverhoudingen die implicaties hebben voor folderspecifiek mechanisch gedrag.
Onderzoekers hebben de eigenschappen van de tv-folders onderzocht met behulp van vlakke mechanische karakteriseringen, histomorfologische beoordelingen en optische karakteriseringen van de collageenvezelarchitectuur. Planaire biaxiale mechanische karakteriseringen proberen bijvoorbeeld fysiologische belasting na te bootsen door loodrechte verplaatsingen op het weefsel toe te passen en de bijbehorende krachten te registreren. De resulterende krachtverplaatsing (of stress-stretch) observaties hebben aangetoond dat alle drie de tv-folders niet-lineair, richtingspecifiek mechanisch gedrag vertonen met meer duidelijke folderspecifieke reacties in de radiale weefselrichting 4,5,6. Aangenomen wordt dat dit folderspecifieke gedrag voortkomt uit verschillen in de microstructurele eigenschappen die worden waargenomen met behulp van standaard histologische technieken 6,7. Verder zijn de tweede harmonische generatie beeldvorming6, small-angle light scattering8 en polarized spatial frequency domain imaging7 (pSFDI) gericht op het begrijpen van deze microstructurele eigenschappen en hebben ze folderspecifieke verschillen aangetoond in de collageenvezeloriëntatie en vezelkrimp die implicaties hebben voor het waargenomen mechanische gedrag op weefselniveau. Deze studies hebben ons begrip van de weefselmicrostructuur en zijn rol in gedrag op weefselniveau aanzienlijk verbeterd. Er moet echter nog veel worden aangepakt bij het experimenteel verbinden van de weefselmechanica en de onderliggende microstructuur.
Onlangs heeft dit laboratorium mechanische karakteriseringen uitgevoerd van de tv-folderlagen gescheiden in twee composietlagen (A / S en F / V) met behulp van een microdissectietechniek9. Dat eerdere werk benadrukte verschillen in de mechanische eigenschappen van de lagen en hielp inzicht te geven in hoe de gelaagde microstructuur bijdraagt aan het mechanische gedrag van het weefsel. Hoewel dit onderzoek ons begrip van de microstructuur van de tv-folder verbeterde, had de techniek verschillende beperkingen. Ten eerste werden de eigenschappen van de samengestelde lagen niet direct vergeleken met het intacte weefsel, wat leidde tot een gebrek aan volledig begrip van de relatie tussen mechanica en microstructuur. Ten tweede werd de collageenvezelarchitectuur van de samengestelde lagen niet onderzocht. Ten derde werden alleen de lagen van de TVAL onderzocht vanwege problemen met het verzamelen van de samengestelde lagen uit de andere twee tv-folders. De hierin beschreven methode biedt een holistisch karakteriseringskader dat deze beperkingen overwint en volledige karakteriseringen van de tv-folders en hun samengestelde lagen biedt.
Dit artikel beschrijft de microdissectietechniek die de drie tv-folders scheidt in hun samengestelde lagen (A / S en F / V) voor biaxiale mechanische en microstructurele karakteriseringen 10,11,12. Dit iteratieve protocol omvat (i) biaxiale mechanische testen en pSFDI-karakterisering van de intacte folder, (ii) een nieuwe en reproduceerbare microdissectietechniek om op betrouwbare wijze de samengestelde tv-lagen te verkrijgen, en (iii) biaxiaal mechanisch testen en pSFDI-karakterisering van de samengestelde tv-lagen. Het weefsel werd blootgesteld aan biaxiale trekbelasting met verschillende krachtverhoudingen voor mechanisch testen. Vervolgens werd pSFDI gebruikt om de oriëntatie en uitlijning van collageenvezels bij verschillende geladen configuraties te bepalen. pSFDI behoudt de native collageenvezelarchitectuur, maakt belastingsafhankelijke analyse mogelijk en omzeilt de typische noodzaak om weefsel te fixeren of te verwijderen voor collageenvezelarchitectuuranalyse, zoals bij beeldvorming van de tweede harmonische generatie of lichtverstrooiing onder een kleine hoek. Ten slotte werden de weefsels bereid met behulp van standaard histologische technieken om de weefselmicrostructuur te visualiseren. Dit iteratieve en holistische raamwerk maakt de directe vergelijking mogelijk van de mechanische en microstructurele eigenschappen van de tv-folder met de samengestelde lagen.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10% Formalin Solution, Neutral Buffered</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>HT501128-4L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alconox Detergent</td>
			<td>Alconox</td>
			<td></td>
			<td>cleaning compound</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioTester - Biaxial Tester</td>
			<td>CellScale Biomaterials Testing</td>
			<td></td>
			<td>1.5 N Load Cell Capacity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cutting Mat</td>
			<td>Dahle</td>
			<td>B0027RS8DU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deionized Water</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine-Tipped Tool</td>
			<td>HTI INSTRUMENTS</td>
			<td>NSPLS-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps - Curved</td>
			<td>Scientific Labwares</td>
			<td>16122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps - Thick</td>
			<td>Scientific Labwares</td>
			<td>161001078</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps - Thin</td>
			<td>Scientific Labwares</td>
			<td>16127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LabJoy</td>
			<td>CellScale Biomaterials Testing</td>
			<td>Version 10.66</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser Displacement Sensor</td>
			<td>Keyence</td>
			<td>IL-030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid Cyanoacrylate Glue</td>
			<td>Loctite</td>
			<td>2436365</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MATLAB</td>
			<td>MathWorks</td>
			<td>Version 2020a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Scissors</td>
			<td>HTI Instruments</td>
			<td>CAS55C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette</td>
			<td>Belmaks</td>
			<td>360758081051Y4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polarized Spatial Frequency Domain Imaging Device</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
			<td>Made in-house using a digital light projector, linear polarizer, rotating polarizer mount, and charge-coupled device camera. 
			See doi.org/10.1016/j.actbio.2019.11.028 (PMCID: PMC8101699) for more details.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel</td>
			<td>THINKPRICE</td>
			<td>TP-SCALPEL-3010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single Edge Industrial Razor Blades (Surgical Carbon Steel)</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>H3515541105024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Pen</td>
			<td>LabAider</td>
			<td>LAB-Skin-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T-Pins</td>
			<td>Business Source</td>
			<td>BSN32351</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wax Board</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
			<td>Made in-house using modeling wax and baking tray</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Weigh Boat</td>
			<td>Pure Ponta</td>
			<td>mdo-azoc-1030</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

layer microdissection of tricuspid valve leaflets for biaxial mechanical characterization and microstructural quantification

De tricuspidalisklep (TV) regelt de unidirectionele stroom van ongeoxygeneerd bloed van het rechter atrium naar de rechter ventrikel. De tv bestaat uit drie folders, elk met uniek mechanisch gedrag. Deze variaties tussen de drie tv-folders kunnen verder worden begrepen door hun vier anatomische lagen te onderzoeken, namelijk de atrialis (A), spongiosa (S), fibrosa (F) en ventriculaireis (V). Hoewel deze lagen aanwezig zijn in alle drie de tv-folders, zijn er verschillen in hun diktes en microstructurele bestanddelen die hun respectieve mechanische gedrag verder beïnvloeden. 
Dit protocol bevat vier stappen om de laagspecifieke verschillen op te helderen: (i) het mechanische en collageenvezelarchitectuurgedrag van de intacte tv-folder karakteriseren, (ii) de samengestelde lagen (A / S en F / V) van de tv-folder scheiden, (iii) dezelfde karakteriseringen uitvoeren voor de samengestelde lagen en (iv) post-hoc uitvoeren histologische beoordeling. Dit experimentele raamwerk maakt op unieke wijze de directe vergelijking van het intacte tv-weefsel met elk van de samengestelde lagen mogelijk. Hierdoor kan met dit protocol gedetailleerde informatie over de microstructuur en biomechanische functie van de tv-folders worden verzameld. Dergelijke informatie kan mogelijk worden gebruikt om tv-computationele modellen te ontwikkelen die richtlijnen proberen te bieden voor de klinische behandeling van tv-ziekten.

De microdissectie levert A/S- en F/V-monsters op met relatief uniforme diktes die op een (commercieel) biaxiaal testapparaat kunnen worden gemonteerd. Histologische analyse van de intacte folder en de twee ontleedde lagen zal controleren of het weefsel correct werd gescheiden langs de grens tussen de spongiosa en fibrosa (figuur 7). Bovendien kunnen de histologiemicrografieën worden gebruikt om de weefsellaagdiktes en samenstellende massafracties te bepalen met behulp van ImageJ-software. E...

Watch this Scientific Journal Video about Layer Microdissection of Tricuspid Valve Leaflets for Biaxial Mechanical Characterization and Microstructural Quantification at JoVE.com

Layer Microdissection of Tricuspid Valve Leaflets for Biaxial Mechanical Characterization and Microstructural Quantification

Dit protocol beschrijft de biaxiale mechanische karakterisering, gepolariseerde spatial frequency domain imaging-based collageenkwantificering en microdissectie van tricuspidalisklepfolders. De meegeleverde methode verheldert hoe de folderlagen bijdragen aan het holistische foldergedrag.

Laagmicrodissectie van tricuspidalisklepfolders voor biaxiale mechanische karakterisering en microstructurele kwantificering

The tricuspid valve (TV) regulates the unidirectional flow of unoxygenated blood from the right atrium to the right ventricle. The TV consists of three ...

Deze methode kan de bijdragen van weefsellagen aan het algehele weefselgedrag isoleren, waardoor nieuw inzicht ontstaat in de weefselmicrostructuur. Ons microdissectie- en testraamwerk stelt ons in staat om de mechanische en microstructurele eigenschappen van hartklepfolders direct te vergelijken met hun eigen composietlagen. De microdissectie kan moeilijk onder de knie te krijgen zijn, daarom is het ten zeerste aan te raden om zoveel mogelijk te oefenen voordat je aan je studie begint.Verzamel eerst de benodigde materialen, wasbord, DI-water, pipet, scalpel, microschaar, dunne tang, gebogen tang, dikke tang en pinnen. Ontkoppel het weefsel van de biaxiale tester en meet de dikte met behulp van de laserverplaatsingssensor. Leg het doekje op de wasplank.Onderzoek de ventriculaire kant van het weefsel op grote chorda-inserties. Maak een foto ter referentie. Spreid het weefsel plat op de wasplank met de atrialis naar boven gericht.Om het weefsel aan het bord te bevestigen, plaatst u in elke hoek een pin schuin van het weefsel af, zodat het weefsel iets strak trekt. Zorg ervoor dat de pinnen zich buiten de gaten bevinden die door de tanden zijn gemaakt bij het monteren van het weefsel en dat het weefsel vierkant is en niet verschuift tijdens de microdissectie van de laag. Plaats indien nodig pinnen langs de zijkant van het weefsel tijdens de dissectie om het weefsel meer uit te rekken.Verwijder de fiduciale markers van de glaskraal. Plaats DI-water op het oppervlak van het weefsel met een pipet, zodat het het weefsel op een belachtige manier volledig bedekt. Om de eerste hoek te maken, selecteert u een hoek van het vastgepinde monster, waardoor grote chorda-inbrengingen in kwetsbare gebieden worden vermeden.Snijd vervolgens de A / S-laag door het scalpel lichtjes over het weefseloppervlak langs de montagegaten te slepen voor mechanisch testen. De randen van de snede beginnen uit elkaar te trekken, waardoor de F/V-laag eronder zichtbaar wordt. Wrijf met een stompe, dunne tang stevig langs de snede om de randen verder te scheiden.Als de snee in de A/S-laag niet uit elkaar begint te trekken, trek dan lichtjes over dezelfde snede met een scalpel. Maak een tweede snede loodrecht op de eerste snede. Als de twee sneden niet met elkaar verbonden zijn, laat u het dunne pincet onder het kleine gebied van weefsel lopen dat de twee sneden scheidt.Gebruik vervolgens voorzichtig de schaar om het weefsel te knippen. Wrijf langs de sneden van de hoek met een dunne tang totdat het weefsel zich scheidt van de F / V-laag. Zodra een klein stukje weefsel is gescheiden, pak je het vast met het grote pincet en trek je het voorzichtig om de samengestelde lagen verder te scheiden.Blijf het weefsel afpellen terwijl je het vastpakt met een groter pincet om ongewenst scheuren en scheuren van de A / S-composietlaag te voorkomen en wrijf over de naad totdat deze het einde van de twee sneden voor de hoek bereikt. Als de eerste bocht grote problemen heeft met de scheiding, probeer dan een andere hoek als uitgangspunt. Om vervolgens een tweede hoek te maken, verlengt u de twee sneden die voor de eerste hoek zijn gemaakt door de scalpelpunt aan de onderkant van elke snede te plaatsen en deze lichtjes langs het weefseloppervlak te slepen, zodat de gesneden extensies aansluiten op de oorspronkelijke sneden en de tand- of hechtgaten blijven volgen.Ga door met het verlengen van de sneden en het afpellen van de bovenste composiet A / S-laag terwijl u de naad wrijft totdat één kant klaar is. Merk op dat het weefsel volledig gescheiden zal zijn langs één snede. Maak vervolgens een tweede hoek loodrecht op het einde van de volledig afgebladderde kant.Verleng de resterende sneden terwijl u grote chorda-inbrengingen vermijdt. Sluit de chorda-inserties alleen uit van het A/S-scheidingsgebied wanneer deze uitsluiting een A/S-specimen mogelijk maakt dat groot genoeg is voor experimentele karakteriseringen. Ga door met het scheiden van de A/S- en F/V-lagen door gebruik te maken van de wrijf- en trektechnieken die voor de eerste bocht worden gebruikt.Stop onmiddellijk met het scheiden van het weefsel als zich een scheur of gat vormt. Om te voorkomen dat een pincet wordt gevangen, plaatst u de schaar in een gat dat zich vormt en snijdt u het weefsel weg van het midden. Als het defect zich vormt langs de naad van scheiding, begin dan met het scheiden van het weefsel langs een andere rand.Zoek naar tussenlaagverbindingen die kunnen optreden bij het scheiden van het weefsel en voorkom verdere weefselscheiding. Merk op dat dit dunne maar sterke strengen zijn die zorgvuldig met een schaar moeten worden geknipt. Vermijd het maken van een gat in de A/S-laag of het naar beneden snijden in de F/V-laag.Ga door met dit proces totdat het grootst mogelijke monster van de A/S-laag is gescheiden. Markeer de oriëntatie van het monster met behulp van de chirurgische pen. Knip ten slotte met de schaar langs de scheidingsnaad voor de resterende weefselrand.Leg de gescheiden A/S composietlaag plat op de snijmat. Gebruik indien nodig het scalpel om de randen van het weefsel recht te trekken en een vierkante weefselvorm te creëren die geschikt is voor biaxiaal mechanisch testen. Plaats de A/S-laag in DI-water totdat deze klaar is om te worden getest.Markeer de oriëntatie van de F/V-laag die op het wasbord achterblijft. Knip het grootst mogelijke vierkant uit het gebied waar de A/S-laag is verwijderd. Plaats het vervolgens in DI-water.Histologische analyse van de intacte folder en de twee ontleedde lagen controleerde of het weefsel correct was gescheiden langs de grens tussen de spongiosa en fibrosa. De histologiemicrografieën werden gebruikt om de dikte van de weefsellaag en de samenstellende massafracties te bepalen met behulp van ImageJ-software. De verplaatsing gecontroleerde mechanische testen en nabewerking produceerden membraanspanning versus rekgegevens van de tricuspidalisklep anterieure folder, tricuspidalisklep achterste folder en tricuspidalisklep septumfolder, die het niet-lineaire mechanische gedrag van het weefsel beschrijft.De gepolariseerde ruimtelijke frequentiedomeinbeeldvormingsgegevens leverden kleurenkaarten op van de collageenvezeloriëntatie en de mate van optische anisotropie. In het bijzonder gaven deze kleurenkaarten een uitgebreid inzicht in de collageenvezelarchitectuur in het hele weefselmonster. Het is belangrijk op te merken dat de composietlaag krimpt zodra ze zijn gescheiden van het vastgepinde weefsel.Verzamel het grootst mogelijke monster om ervoor te zorgen dat er voldoende weefsel is voor de daaropvolgende tests.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Synthetic, Multi-Layer, Self-Oscillating Vocal Fold Model Fabrication

Synthetische, Multi-Layer, Self-Oscillerende Vocal Fold Model Fabrication

Sound for the human voice is produced via flow-induced vocal fold vibration. The vocal folds consist of several layers of tissue, each with differing ...

On-chip Isotachophoresis for Separation of Ions and Purification of Nucleic Acids

On-chip Isotachophoresis voor de scheiding van ionen en zuivering van nucleïnezuren

Electrokinetic techniques are a staple of microscale applications because of their unique ability to perform a variety of fluidic and electrophoretic ...

Design of a Biaxial Mechanical Loading Bioreactor for Tissue Engineering

Ontwerp van een tweeassige Mechanische belasting Bioreactor voor Tissue Engineering

We  designed a loading device that is capable of applying uniaxial or biaxial  mechanical strain to a tissue engineered biocomposites fabricated for  ...

Fabrication and Characterization of a Conformal Skin-like Electronic System for Quantitative, Cutaneous Wound Management

Fabricage en karakterisering van een Conformal Skin-achtige Electronic System for Quantitative, Cutane Wound Management

Recent advances in the development of electronic technologies and biomedical devices offer opportunities for non-invasive, quantitative assessment of ...

Layer-by-layer Collagen Deposition in Microfluidic Devices for Microtissue Stabilization

Layer-by-layer Collageen depositie in Microfluïdische Inrichtingen voor Microtissue Stabilization

Although microfluidics provides exquisite control of the cellular microenvironment, culturing cells within microfluidic devices can be challenging. 3D ...

Quantification of Strain in a Porcine Model of Skin Expansion Using Multi-View Stereo and Isogeometric Kinematics

Kwantificering van Strain in een varkensmodel van Skin Expansion Met behulp van Multi-View Stereo en Isogeometric Kinematica

Tissue expansion is a popular technique in plastic and reconstructive surgery that grows skin in vivo for correction of large defects such as burns and ...

Imaging the Root Hair Morphology of Arabidopsis Seedlings in a Two-layer Microfluidic Platform

Imaging the Root Hair Morphology of Arabidopsis Seedlings in a Two-layer Microfluidic Platform

Beeldvorming van de morfologie van het haar van de wortel van Arabidopsis zaailingen in een twee-laag Microfluidic Platform

Root hairs increase root surface area for better water uptake and nutrient absorption by the plant. Because they are small in size and often obscured by ...

Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) Assays

Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate LAL Assays

Detectie van endotoxinen in Nano-formuleringen gebruiken Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) testen

When present in pharmaceutical products, a Gram-negative bacterial cell wall component endotoxin (often also called lipopolysaccharide) can cause ...

Assembly and Characterization of Biomolecular Memristors Consisting of Ion Channel-doped Lipid Membranes

Vergadering en karakterisering van biomoleculaire Memristors bestaande uit ionkanaal-doped lipide membranen

The ability to recreate synaptic functionalities in synthetic circuit elements is essential for neuromorphic computing systems that seek to emulate the ...

Biaxial Mechanical Characterizations of Atrioventricular Heart Valves

Biaxial mechanische karakteristieken van Atrioventriculaire hartkleppen

Extensive biaxial mechanical testing of the atrioventricular heart valve leaflets can be utilized to derive&#160;optimal parameters used in constitutive ...