Name: layer microdissection of tricuspid valve leaflets for biaxial mechanical characterization and microstructural quantification
Uploaded: 2022-02-10T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Layer Microdissection of Tricuspid Valve Leaflets for Biaxial Mechanical Characterization and Microstructural Quantification at JoVE.com

Diese Arbeit wurde durch den American Heart Association Scientist Development Grant (16SDG27760143) und die Presbyterian Health Foundation unterstützt. KMC wurde zum Teil vom Undergraduate Research Opportunity Program der University of Oklahoma (OU) und dem Honors Research Apprenticeship Program unterstützt. DWL wurde zum Teil durch das National Science Foundation Graduate Research Fellowship (GRF 2019254233) und das American Heart Association/Children's Heart Foundation Predoctoral Fellowship (Award #821298) unterstützt. All diese Unterstützung wird dankbar anerkannt.

Alle hier beschriebenen Methoden wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee an der University of Oklahoma genehmigt. Tierisches Gewebe wurde von einem USDA-zugelassenen Schlachthof erworben.
1. Biaxiale mechanische Charakterisierung
<ol><li>Gewebepräparation<ol>
<li>Holen Sie sich eine TV-Broschüre aus dem Gefrierschrank, Rasierklingen, einen chirurgischen Stift, eine Pinzette, eine Pipette mit deionisiertem (DI) Wasser und eine Schneidematte. Tauen Sie die TV-...

<ol>
	<li>Vesely, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+elastin+in+aortic+valve+mechanics.">The role of elastin in aortic valve mechanics.</a> Journal of Biomechanics. 31 (2), 115-123 (1998).</li><li>Zhang, W., Ayoub, S., Liao, J., Sacks, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+meso-scale+layer-specific+structural+constitutive+model+of+the+mitral+heart+valve+leaflets.">A meso-scale layer-specific structural constitutive model of the mitral heart valve leaflets.</a> Acta Biomaterialia. 32, 238-255 (2016).</li><li>Stella, J. A., Sacks, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+biaxial+mechanical+properties+of+the+layers+of+the+aortic+valve+leaflet.">On the biaxial mechanical properties of the layers of the aortic valve leaflet.</a> Journal of Biomechanical Engineering. 129 (5), 757-766 (2007).</li><li>Khoiy, K. A., Amini, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+biaxial+mechanical+response+of+porcine+tricuspid+valve+leaflets.">On the biaxial mechanical response of porcine tricuspid valve leaflets.</a> Journal of Biomechanical Engineering. 138 (10), 104504 (2016).</li><li>Jett, S. 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T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+pilot+study+on+linking+tissue+mechanics+with+load-dependent+collagen+microstructures+in+porcine+tricuspid+valve+leaflets.">A pilot study on linking tissue mechanics with load-dependent collagen microstructures in porcine tricuspid valve leaflets.</a> Bioengineering. 7 (2), 60 (2020).</li><li>Pant, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pressure-induced+microstructural+changes+in+porcine+tricuspid+valve+leaflets.">Pressure-induced microstructural changes in porcine tricuspid valve leaflets.</a> Acta Biomaterialia. 67, 248-258 (2018).</li><li>Kramer, K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+investigation+of+layer-specific+tissue+biomechanics+of+porcine+atrioventricular+heart+valve+leaflets.">An investigation of layer-specific tissue biomechanics of porcine atrioventricular heart valve leaflets.</a> Acta Biomaterialia. 96, 368-384 (2019).</li><li>Ross, C. J., Laurence, D. W., Wu, Y., Lee, C. -. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biaxial+mechanical+characterizations+of+atrioventricular+heart+valves.">Biaxial mechanical characterizations of atrioventricular heart valves.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (146), e59170 (2019).</li><li>Goth, W., Lesicko, J., Sacks, M. S., Tunnell, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical-based+analysis+of+soft+tissue+structures.">Optical-based analysis of soft tissue structures.</a> Annual Review of Biomedical Engineering. 18, 357-385 (2016).</li><li>Jett, S. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integration+of+polarized+spatial+frequency+domain+imaging+(pSFDI)+with+a+biaxial+mechanical+testing+system+for+quantification+of+load-dependent+collagen+architecture+in+soft+collagenous+tissues.">Integration of polarized spatial frequency domain imaging (pSFDI) with a biaxial mechanical testing system for quantification of load-dependent collagen architecture in soft collagenous tissues.</a> Acta Biomaterialia. 102, 149-168 (2020).</li><li>Reddy, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> An Introduction to Continuum Mechanics. , (2013).</li><li>Duginski, G. A., Ross, C. J., Laurence, D. W., Johns, C. H., Lee, C. -. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+investigation+of+the+effect+of+freezing+storage+on+the+biaxial+mechanical+properties+of+excised+porcine+tricuspid+valve+anterior+leaflets.">An investigation of the effect of freezing storage on the biaxial mechanical properties of excised porcine tricuspid valve anterior leaflets.</a> Journal of the Mechanical Behavior of Biomedical Materials. 101, 103438 (2020).</li><li>Salinas, S. D., Clark, M. M., Amini, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+response+changes+in+porcine+tricuspid+valve+anterior+leaflet+under+osmotic-induced+swelling.">Mechanical response changes in porcine tricuspid valve anterior leaflet under osmotic-induced swelling.</a> Bioengineering. 6 (3), 70 (2019).</li><li>Pokutta-Paskaleva, A., Sulejmani, F., DelRocini, M., Sun, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+mechanical,+morphological,+and+microstructural+characterization+of+porcine+mitral+and+tricuspid+leaflets+and+chordae+tendineae.">Comparative mechanical, morphological, and microstructural characterization of porcine mitral and tricuspid leaflets and chordae tendineae.</a> Acta Biomaterialia. 85, 241-252 (2019).</li><li>Ross, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+investigation+of+the+glycosaminoglycan+contribution+to+biaxial+mechanical+behaviors+of+porcine+atrioventricular+heart+valve+leaflets.">An investigation of the glycosaminoglycan contribution to biaxial mechanical behaviors of porcine atrioventricular heart valve leaflets.</a> Journal of the Royal Society Interface. 16 (156), 0069 (2019).</li><li>Sommer, G., Regitnig, P., Ko&#776;ltringer, L., Holzapfel, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biaxial+mechanical+properties+of+intact+and+layer-dissected+human+carotid+arteries+at+physiological+and+supraphysiological+loadings.">Biaxial mechanical properties of intact and layer-dissected human carotid arteries at physiological and supraphysiological loadings.</a> American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 298 (3), 898-912 (2009).</li><li>Holzapfel, G. A., Sommer, G., Gasser, C., Regitnig, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+the+layer-specific+mechanical+properties+ofhuman+coronary+arteries+with+intimal+thickening,+and+related+constitutive+modelling.">Determination of the layer-specific mechanical properties ofhuman coronary arteries with intimal thickening, and related constitutive modelling.</a> American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 289 (5), 2048-2058 (2005).</li><li>Sommer, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiaxial+mechanical+response+and+constitutive+modeling+of+esophageal+tissues:+Impact+on+esophageal+tissue+engineering.">Multiaxial mechanical response and constitutive modeling of esophageal tissues: Impact on esophageal tissue engineering.</a> Acta Biomaterialia. 9 (12), 9379-9391 (2013).</li></ol>

Zu den kritischen Schritten für das Protokoll gehören: (i) die Schichtmikrodissektion, (ii) die Gewebemontage, (iii) die treuhänderische Markerplatzierung und (iv) der pSFDI-Aufbau. Eine geeignete Schichtmikrodissektion ist der wichtigste und schwierigste Aspekt des hierin beschriebenen Verfahrens. Bevor eine Untersuchung mit dieser Technik eingeleitet wird, sollten die Dissektoren langfristige Praxis mit der Mikrodissektionstechnik und allen drei TV-Broschüren haben. Der Dissektor sollte sicherstellen, dass die Verb...

Der Fernseher befindet sich zwischen dem rechten Vorhof und dem rechten Ventrikel des Herzens. Während des gesamten Herzzyklus reguliert der Fernseher den unidirektionalen Blutfluss durch zyklisches Öffnen und Schließen des TV Anterior Leaflet (TVAL), des TV posterior Leaflet (TVPL) und des TV septal leaflet (TVSL). Diese Blättchen sind komplex und haben vier verschiedene anatomische Schichten - die Atrialis (A), die Spongiosa (S), die Fibrosa (F) und die Ventricularis (V) - mit einzigartigen mikrostrukturellen Bestandteilen. Die Elastinfasern in der Atrialis und im Ventrikelbereich tragen dazu bei, das Gewebe nach mechanischer Belastung wieder in seine unverformte Geometrie zu versetzen1. Im Gegensatz dazu enthält die Fibrose ein dichtes Netzwerk von wellenförmigen Kollagenfasern, die zur Tragfähigkeit der Blättchenbeitragen 2. Die Spongiosa, die hauptsächlich aus Glykosaminoglykanen besteht, wurde hypothetisch angenommen, dass sie während der Herzklappenfunktion3 das Scheren zwischen den Blattschichten ermöglicht. Während alle drei Blatttypen die gleichen anatomischen Schichten haben, gibt es Variationen in den Dicken der Schichten und den Verhältnissen der Bestandteile, die Auswirkungen auf das spezifische mechanische Verhalten von Flugblättern haben.
Forscher haben die Eigenschaften der TV-Flugblätter mit planaren mechanischen Charakterisierungen, histomorphologischen Bewertungen und optischen Charakterisierungen der Kollagenfaserarchitektur untersucht. Zum Beispiel versuchen planare biaxiale mechanische Charakterisierungen, die physiologische Belastung nachzuahmen, indem sie senkrechte Verschiebungen auf das Gewebe anwenden und die damit verbundenen Kräfte aufzeichnen. Die daraus resultierenden Kraftverschiebungs- (oder Spannungsdehnungs-) Beobachtungen haben gezeigt, dass alle drei TV-Flugblätter nichtlineares, richtungsspezifisches mechanisches Verhalten mit offensichtlicheren blattspezifischen Reaktionen in der radialen Geweberichtung 4,5,6 aufweisen. Es wird angenommen, dass diese blattspezifischen Verhaltensweisen auf Unterschiede in den mikrostrukturellen Eigenschaften zurückzuführen sind, die mit histologischen Standardtechniken beobachtet wurden 6,7. Darüber hinaus zielen die Bildgebung der zweiten harmonischen Generation 6, die Kleinwinkellichtstreuung8 und die polarisierte räumliche Frequenzbereichsabbildung 7 (pSFDI) darauf ab, diese mikrostrukturellen Eigenschaften zu verstehen und haben blattspezifische Unterschiede in der Kollagenfaserorientierung undder Fasercrimp gezeigt, die Auswirkungen auf das beobachtete mechanische Verhalten auf Gewebeebene haben. Diese Studien haben unser Verständnis der Gewebemikrostruktur und ihrer Rolle im Verhalten auf Gewebeebene erheblich verbessert. Bei der experimentellen Verbindung der Gewebemechanik und der zugrunde liegenden Mikrostruktur bleibt jedoch noch viel zu tun.
Vor kurzem führte dieses Labor mechanische Charakterisierungen der TV-Flugblattschichten durch, die in zwei Verbundschichten (A / S und F / V) unter Verwendung einer Mikrodissektionstechnikgetrennt waren 9. Diese früheren Arbeiten hoben Unterschiede in den mechanischen Eigenschaften der Schichten hervor und halfen, einen Einblick zu geben, wie die geschichtete Mikrostruktur zum mechanischen Verhalten des Gewebes beiträgt. Obwohl diese Untersuchung unser Verständnis der Mikrostruktur des TV-Flugblatts verbesserte, hatte die Technik mehrere Einschränkungen. Erstens wurden die Eigenschaften der Kompositschichten nicht direkt mit dem intakten Gewebe verglichen, was zu einem Mangel an vollständigem Verständnis der Mechanik-Mikrostruktur-Beziehung führte. Zweitens wurde die Kollagenfaserarchitektur der Verbundschichten nicht untersucht. Drittens wurden nur die Schichten des TVAL untersucht, da Schwierigkeiten beim Sammeln der zusammengesetzten Schichten aus den beiden anderen TV-Flugblättern bestanden. Die hierin beschriebene Methode bietet einen ganzheitlichen Charakterisierungsrahmen, der diese Einschränkungen überwindet und vollständige Charakterisierungen der TV-Broschüren und ihrer zusammengesetzten Schichten liefert.
Dieses Papier beschreibt die Mikrodissektionstechnik, die die drei TV-Flugblätter in ihre zusammengesetzten Schichten (A / S und F / V) für biaxiale mechanische und mikrostrukturelle Charakterisierungen 10,11,12 trennt. Dieses iterative Protokoll umfasst (i) biaxiale mechanische Tests und pSFDI-Charakterisierung der intakten Broschüre, (ii) eine neuartige und reproduzierbare Mikrodissektionstechnik zur zuverlässigen Gewinnung der zusammengesetzten TV-Schichten und (iii) biaxiale mechanische Tests und pSFDI-Charakterisierung der zusammengesetzten TV-Schichten. Das Gewebe wurde einer biaxialen Zugbelastung mit verschiedenen Kraftverhältnissen für mechanische Tests ausgesetzt. Dann wurde pSFDI verwendet, um die Kollagenfaserorientierung und -ausrichtung bei verschiedenen belasteten Konfigurationen zu bestimmen. pSFDI bewahrt die native Kollagenfaserarchitektur, ermöglicht eine lastabhängige Analyse und umgeht die typische Notwendigkeit, Gewebe für die Kollagenfaserarchitekturanalyse zu fixieren oder zu löschen, z. B. bei der Bildgebung der zweiten harmonischen Generation oder der Kleinwinkel-Lichtstreuung. Schließlich wurden die Gewebe mit Hilfe von Standard-Histologie-Techniken vorbereitet, um die Gewebemikrostruktur zu visualisieren. Dieser iterative und ganzheitliche Rahmen ermöglicht den direkten Vergleich der mechanischen und mikrostrukturellen Eigenschaften der TV-Broschüre mit ihren zusammengesetzten Schichten.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10% Formalin Solution, Neutral Buffered</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>HT501128-4L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alconox Detergent</td>
			<td>Alconox</td>
			<td></td>
			<td>cleaning compound</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioTester - Biaxial Tester</td>
			<td>CellScale Biomaterials Testing</td>
			<td></td>
			<td>1.5 N Load Cell Capacity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cutting Mat</td>
			<td>Dahle</td>
			<td>B0027RS8DU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deionized Water</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine-Tipped Tool</td>
			<td>HTI INSTRUMENTS</td>
			<td>NSPLS-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps - Curved</td>
			<td>Scientific Labwares</td>
			<td>16122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps - Thick</td>
			<td>Scientific Labwares</td>
			<td>161001078</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps - Thin</td>
			<td>Scientific Labwares</td>
			<td>16127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LabJoy</td>
			<td>CellScale Biomaterials Testing</td>
			<td>Version 10.66</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser Displacement Sensor</td>
			<td>Keyence</td>
			<td>IL-030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid Cyanoacrylate Glue</td>
			<td>Loctite</td>
			<td>2436365</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MATLAB</td>
			<td>MathWorks</td>
			<td>Version 2020a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Scissors</td>
			<td>HTI Instruments</td>
			<td>CAS55C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette</td>
			<td>Belmaks</td>
			<td>360758081051Y4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polarized Spatial Frequency Domain Imaging Device</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
			<td>Made in-house using a digital light projector, linear polarizer, rotating polarizer mount, and charge-coupled device camera. 
			See doi.org/10.1016/j.actbio.2019.11.028 (PMCID: PMC8101699) for more details.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel</td>
			<td>THINKPRICE</td>
			<td>TP-SCALPEL-3010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single Edge Industrial Razor Blades (Surgical Carbon Steel)</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>H3515541105024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Pen</td>
			<td>LabAider</td>
			<td>LAB-Skin-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T-Pins</td>
			<td>Business Source</td>
			<td>BSN32351</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wax Board</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
			<td>Made in-house using modeling wax and baking tray</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Weigh Boat</td>
			<td>Pure Ponta</td>
			<td>mdo-azoc-1030</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

layer microdissection of tricuspid valve leaflets for biaxial mechanical characterization and microstructural quantification

Die Trikuspidalklappe (TV) reguliert den unidirektionalen Fluss von sauerstofffreiem Blut vom rechten Vorhof zum rechten Ventrikel. Der Fernseher besteht aus drei Flugblättern mit jeweils einzigartigem mechanischem Verhalten. Diese Variationen zwischen den drei TV-Flugblättern können besser verstanden werden, indem ihre vier anatomischen Schichten untersucht werden, nämlich die Atrialis (Atrialis (A), Spongiosa (S), Fibrosa (F) und Ventricularis (V). Während diese Schichten in allen drei TV-Flugblättern vorhanden sind, gibt es Unterschiede in ihren Dicken und mikrostrukturellen Bestandteilen, die ihr jeweiliges mechanisches Verhalten weiter beeinflussen. 
Dieses Protokoll umfasst vier Schritte zur Erläuterung der schichtspezifischen Unterschiede: (i) Charakterisierung des mechanischen und kollagenfaserarchitektonischen Verhaltens des intakten TV-Merkblatts, (ii) Trennung der zusammengesetzten Schichten (A / S und F / V) des TV-Broschüres, (iii) Durchführung der gleichen Charakterisierungen für die zusammengesetzten Schichten und (iv) Durchführung von Post-hoc-Schichten histologische Beurteilung. Dieses experimentelle Framework ermöglicht auf einzigartige Weise den direkten Vergleich des intakten TV-Gewebes mit jeder seiner zusammengesetzten Schichten. Dadurch können mit diesem Protokoll detaillierte Informationen über die Mikrostruktur und biomechanische Funktion der TV-Prospekte gesammelt werden. Solche Informationen können möglicherweise verwendet werden, um TV-Computermodelle zu entwickeln, die Leitlinien für die klinische Behandlung von TV-Erkrankungen liefern sollen.

Die Mikrodissektion ergibt A/S- und F/V-Proben mit relativ gleichmäßigen Dicken, die an einem (kommerziellen) biaxialen Prüfgerät montiert werden können. Eine histologische Analyse des intakten Blättchens und der beiden sezierten Schichten wird überprüfen, ob das Gewebe entlang der Grenze zwischen Sppongiosa und Fibrosa korrekt getrennt wurde (Abbildung 7). Zusätzlich können die histologischen Mikroaufnahmen verwendet werden, um die Dicken der Gewebeschichten und die Massenanteile ...

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Layer Microdissection of Tricuspid Valve Leaflets for Biaxial Mechanical Characterization and Microstructural Quantification

Dieses Protokoll beschreibt die biaxiale mechanische Charakterisierung, die polarisierte Lokalfrequenzbereichs-Imaging-basierte Kollagenquantifizierung und die Mikrodissektion von Trikuspidalklappenblättern. Die bereitgestellte Methode erläutert, wie die Prospektschichten zum ganzheitlichen Verhalten der Broschüre beitragen.

Schichtmikrodissektion von Trikuspidalklappenblättern zur biaxialen mechanischen Charakterisierung und mikrostrukturellen Quantifizierung

The tricuspid valve (TV) regulates the unidirectional flow of unoxygenated blood from the right atrium to the right ventricle. The TV consists of three ...

Diese Methode kann die Beiträge von Gewebeschichten zum gesamten Gewebeverhalten isolieren und neue Einblicke in die Gewebemikrostruktur liefern. Unser Mikrodissektions- und Testrahmen ermöglicht es uns, die mechanischen und mikrostrukturellen Eigenschaften von Herzklappenblättern direkt mit ihren eigenen Verbundschichten zu vergleichen. Die Mikrodissektion kann schwierig zu meistern sein, daher wird dringend empfohlen, so viel wie möglich zu üben, bevor Sie mit der Studie beginnen.Sammeln Sie zuerst die erforderlichen Materialien, Wachsbrett, DI-Wasser, Pipette, Skalpell, Mikroschere, dünne Pinzette, gebogene Pinzette, dicke Pinzette und Stifte. Demontieren Sie das Gewebe vom biaxialen Tester und messen Sie seine Dicke mit dem Laser-Wegsensor. Legen Sie das Gewebe auf das Wachsbrett.Untersuchen Sie die ventrikuläre Seite des Gewebes auf große Chorda-Insertionen. Machen Sie ein Foto als Referenz. Verteilen Sie das Gewebe flach auf dem Wachsbrett mit dem Vorhof nach oben.Um das Gewebe an der Platte zu befestigen, platzieren Sie in jeder Ecke einen vom Gewebe abgewinkelten Stift, so dass er das Gewebe leicht strafft. Stellen Sie sicher, dass sich die Stifte bei der Montage des Gewebes außerhalb der von den Zinken erzeugten Löcher befinden und das Gewebe quadratisch ist und sich während der Schichtmikrodissektion nicht verschiebt. Platzieren Sie bei Bedarf während der Dissektion Stifte entlang der Seite des Gewebes, um das Gewebe mehr zu dehnen.Entfernen Sie die Glasperlenmarkierungen. Legen Sie DI-Wasser mit einer Pipette auf die Oberfläche des Gewebes, so dass es das Gewebe vollständig blasenartig bedeckt. Um die erste Ecke zu machen, wählen Sie eine Ecke des gepinnten Exemplars aus und vermeiden Sie große Chorda-Einfügungen in zerbrechlichen Bereichen.Schneiden Sie dann die A / S-Schicht ab, indem Sie das Skalpell für mechanische Tests leicht über die Gewebeoberfläche entlang der Montagelöcher ziehen. Die Kanten des Schnitts beginnen sich auseinander zu ziehen und enthüllen die darunter liegende F / V-Schicht. Mit stumpfen, dünnen Pinzetten fest entlang des Schnitts reiben, um seine Kanten weiter zu trennen.Wenn sich der Schnitt in der A/S-Schicht nicht auseinander zieht, ziehen Sie mit einem Skalpell noch einmal leicht über den gleichen Schnitt. Machen Sie einen zweiten Schnitt senkrecht zum ersten Schnitt. Wenn die beiden Schnitte nicht miteinander verbunden sind, führen Sie die dünne Pinzette unter den kleinen Gewebebereich, der die beiden Schnitte trennt.Verwenden Sie dann vorsichtig die Schere, um das Gewebe zu schneiden. Reiben Sie die Schnitte der Ecke mit einer dünnen Pinzette entlang, bis sich das Gewebe von der F / V-Schicht trennt. Sobald ein kleines Stück Gewebe getrennt ist, greifen Sie es mit der großen Pinzette und ziehen Sie es vorsichtig an, um die Verbundschichten weiter zu trennen.Schälen Sie das Gewebe weiter, während Sie es mit einer größeren Pinzette greifen, um ein unerwünschtes Reißen und Reißen der A / S-Verbundschicht zu verhindern, und reiben Sie die Naht, bis sie das Ende der beiden Schnitte für die Ecke erreicht. Wenn die erste Ecke größere Probleme mit der Trennung hat, versuchen Sie es mit einer anderen Ecke als Ausgangspunkt. Um dann eine zweite Ecke zu machen, verlängern Sie die beiden Schnitte für die erste Ecke, indem Sie die Skalpellspitze an der Unterseite jedes Schnitts platzieren und leicht entlang der Gewebeoberfläche ziehen, so dass die Schnittverlängerungen mit den ursprünglichen Schnitten verbunden sind und weiterhin den Zinken- oder Nahtlöchern folgen.Verlängern Sie die Schnitte weiter und schälen Sie die obere A/S-Verbundschicht zurück, während Sie die Naht reiben, bis eine Seite fertig ist. Beachten Sie, dass das Gewebe entlang eines Schnitts vollständig getrennt wird. Als nächstes erstellen Sie eine zweite Ecke senkrecht zum Ende der vollständig geschälten Seite.Verlängern Sie die verbleibenden Schnitte, während Sie große Chorda-Einfügungen vermeiden. Schließen Sie die Chorda-Insertionen nur dann aus dem A/S-Trennbereich aus, wenn dieser Ausschluss eine A/S-Probe zulässt, die groß genug für experimentelle Charakterisierungen ist. Setzen Sie die Trennung der A/S- und F/V-Schichten fort, indem Sie die für die erste Ecke verwendeten Reib- und Zugtechniken anwenden.Hören Sie sofort auf, das Gewebe zu trennen, wenn sich ein Riss oder ein Loch bildet. Um zu verhindern, dass sich eine Pinzette verfängt, legen Sie die Schere in ein sich bildendes Loch und schneiden Sie das Gewebe von der Mitte weg. Wenn sich der Defekt entlang der Trennnaht bildet, beginnen Sie, das Gewebe entlang einer anderen Kante zu trennen.Suchen Sie nach Verbindungen zwischen den Schichten, die bei der Trennung des Gewebes auftreten können, und verhindern Sie eine weitere Gewebetrennung. Beachten Sie, dass es sich um dünne, aber starke Stränge handelt, die sorgfältig mit einer Schere geschnitten werden müssen. Vermeiden Sie es, eine Bohrung in der A/S-Schicht zu erzeugen oder nach unten in die F/V-Schicht zu schneiden.Setzen Sie diesen Vorgang fort, bis die größtmögliche Probe der A/S-Schicht getrennt wurde. Markieren Sie die Ausrichtung der Probe mit dem OP-Pen. Zum Schluss mit der Schere entlang der Trennnaht für den restlichen Geweberand schneiden.Legen Sie die abgetrennte A/S-Verbundschicht flach auf die Schneidmatte. Verwenden Sie bei Bedarf das Skalpell, um die Kanten des Gewebes zu begradigen und eine quadratische Gewebeform zu schaffen, die für biaxiale mechanische Tests geeignet ist. Legen Sie die A / S-Schicht in DI-Wasser, bis sie zum Testen bereit ist.Markieren Sie die Ausrichtung der F/V-Schicht, die auf der Wachsplatte verbleibt. Schneiden Sie das größtmögliche Quadrat aus dem Bereich aus, in dem die A/S-Schicht entfernt wurde. Legen Sie es dann in DI-Wasser.Eine histologische Analyse des intakten Blättchens und der beiden sezierten Schichten bestätigte, ob das Gewebe entlang der Grenze zwischen Spongiosa und Fibrosa korrekt getrennt war. Die histologischen Mikroaufnahmen wurden verwendet, um die Dicke der Gewebeschicht und die Bestandteile der Masse mit der ImageJ-Software zu bestimmen. Die verdrängungskontrollierte mechanische Prüfung und Nachbearbeitung ergab Membranspannungs- versus Dehnungsdaten der vorderen Trikuspidalklappen-Broschüre, der Trikuspidalklappen-hinteren Packungsbeilage und der Trikuspidalklappen-Septum-Broschüre, die das nichtlineare mechanische Verhalten des Gewebes beschreiben.Die polarisierten Bildgebungsdaten des räumlichen Frequenzbereichs lieferten Farbkarten der Kollagenfaserorientierung und des Grades der optischen Anisotropie. Insbesondere lieferten diese Farbkarten ein umfassendes Verständnis der Kollagenfaserarchitektur über die gesamte Gewebeprobe hinweg. Es ist wichtig zu beachten, dass die zusammengesetzte Schicht schrumpft, sobald sie vom gepinnten Gewebe getrennt wird.Sammeln Sie die größtmögliche Probe, um sicherzustellen, dass genügend Gewebe für die anschließenden Tests vorhanden ist.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Synthetic, Multi-Layer, Self-Oscillating Vocal Fold Model Fabrication

Synthetische Multi-Layer-, Selbst-Oszillierende Stimmlippen Modell Fabrication

Sound for the human voice is produced via flow-induced vocal fold vibration. The vocal folds consist of several layers of tissue, each with differing ...

Forschung

Biotechnik

On-chip Isotachophoresis for Separation of Ions and Purification of Nucleic Acids

On-chip Isotachophorese für Separierung von Ionen und Aufreinigung von Nukleinsäuren

Electrokinetic techniques are a staple of microscale applications because of their unique ability to perform a variety of fluidic and electrophoretic ...

Design of a Biaxial Mechanical Loading Bioreactor for Tissue Engineering

Entwurf eines Biaxiale Mechanische Belastung Bioreaktor für Tissue Engineering

We  designed a loading device that is capable of applying uniaxial or biaxial  mechanical strain to a tissue engineered biocomposites fabricated for  ...

Fabrication and Characterization of a Conformal Skin-like Electronic System for Quantitative, Cutaneous Wound Management

Herstellung und Charakterisierung eines Conformal-Haut-like Electronic System for Quantitative, kutane Wundmanagement

Recent advances in the development of electronic technologies and biomedical devices offer opportunities for non-invasive, quantitative assessment of ...

Layer-by-layer Collagen Deposition in Microfluidic Devices for Microtissue Stabilization

Schicht-für-Schicht der Kollagenabscheidung in Mikrofluidik-Vorrichtungen zum Microtissue Stabilization

Although microfluidics provides exquisite control of the cellular microenvironment, culturing cells within microfluidic devices can be challenging. 3D ...

Quantification of Strain in a Porcine Model of Skin Expansion Using Multi-View Stereo and Isogeometric Kinematics

Die Quantifizierung des Stammes in einem Schweinemodell von Haut Expansion Mit Multi-View Stereo und Isogeometrische Kinematics

Tissue expansion is a popular technique in plastic and reconstructive surgery that grows skin in vivo for correction of large defects such as burns and ...

Imaging the Root Hair Morphology of Arabidopsis Seedlings in a Two-layer Microfluidic Platform

Imaging the Root Hair Morphology of Arabidopsis Seedlings in a Two-layer Microfluidic Platform

Bildgebung der Wurzelhaare Morphologie der Arabidopsis Sämlinge in einer zweischichtigen mikrofluidischen Plattform

Root hairs increase root surface area for better water uptake and nutrient absorption by the plant. Because they are small in size and often obscured by ...

Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) Assays

Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate LAL Assays

Nachweis von Endotoxin im Nano-Rezepturen mit Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) Assays

When present in pharmaceutical products, a Gram-negative bacterial cell wall component endotoxin (often also called lipopolysaccharide) can cause ...

Assembly and Characterization of Biomolecular Memristors Consisting of Ion Channel-doped Lipid Membranes

Montage und Charakterisierung der biomolekularen Memristors bestehend aus Ionenkanal-dotierte Lipidmembranen

The ability to recreate synaptic functionalities in synthetic circuit elements is essential for neuromorphic computing systems that seek to emulate the ...

Biaxial Mechanical Characterizations of Atrioventricular Heart Valves

Biaxiale mechanische Charakterisierung von ventrikulären Herzklappen

Extensive biaxial mechanical testing of the atrioventricular heart valve leaflets can be utilized to derive&#160;optimal parameters used in constitutive ...