Name: layer microdissection of tricuspid valve leaflets for biaxial mechanical characterization and microstructural quantification
Uploaded: 2022-02-10T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Layer Microdissection of Tricuspid Valve Leaflets for Biaxial Mechanical Characterization and Microstructural Quantification at JoVE.com

עבודה זו נתמכה על ידי מענק הפיתוח של איגוד הלב האמריקאי (16SDG27760143) וקרן הבריאות הפרסביטריאנית. KMC נתמך בחלקו על ידי תוכנית הזדמנויות המחקר לתואר ראשון של אוניברסיטת אוקלהומה (OU) ותוכנית החניכות למחקר בהצטיינות. DWL נתמך בחלקו על ידי מלגת המחקר לתארים מתקדמים של הקרן הלאומית למדע (GRF 2019254233) ואיגוד הלב האמריקאי / מלגת קדם-דוקטורט של קרן הלב לילדים (פרס #821298). כל התמיכה הזו זוכה להכרת תודה.

כל השיטות המתוארות כאן אושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים באוניברסיטת אוקלהומה. רקמות בעלי חיים נרכשו מבית מטבחיים שאושר על ידי USDA.
1. אפיון מכני דו-אקסיאלי
<ol><li>הכנת רקמות<ol>
<li>שלפו עלון טלוויזיה מהמקפיא, סכיני גילוח, עט כירורגי, מלקחיים, פיפטה עם ...

<ol>
	<li>Vesely, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+elastin+in+aortic+valve+mechanics.">The role of elastin in aortic valve mechanics.</a> Journal of Biomechanics. 31 (2), 115-123 (1998).</li><li>Zhang, W., Ayoub, S., Liao, J., Sacks, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+meso-scale+layer-specific+structural+constitutive+model+of+the+mitral+heart+valve+leaflets.">A meso-scale layer-specific structural constitutive model of the mitral heart valve leaflets.</a> Acta Biomaterialia. 32, 238-255 (2016).</li><li>Stella, J. A., Sacks, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+biaxial+mechanical+properties+of+the+layers+of+the+aortic+valve+leaflet.">On the biaxial mechanical properties of the layers of the aortic valve leaflet.</a> Journal of Biomechanical Engineering. 129 (5), 757-766 (2007).</li><li>Khoiy, K. A., Amini, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+biaxial+mechanical+response+of+porcine+tricuspid+valve+leaflets.">On the biaxial mechanical response of porcine tricuspid valve leaflets.</a> Journal of Biomechanical Engineering. 138 (10), 104504 (2016).</li><li>Jett, S. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+investigation+of+the+anisotropic+mechanical+properties+and+anatomical+structure+of+porcine+atrioventricular+heart+valves.">An investigation of the anisotropic mechanical properties and anatomical structure of porcine atrioventricular heart valves.</a> Journal of the Mechanical Behavior of Biomedical Materials. 87, 155-171 (2018).</li><li>Meador, W. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+detailed+mechanical+and+microstructural+analysis+of+ovine+tricuspid+valve+leaflets.">A detailed mechanical and microstructural analysis of ovine tricuspid valve leaflets.</a> Acta Biomaterialia. 102, 100-113 (2020).</li><li>Hudson, L. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+pilot+study+on+linking+tissue+mechanics+with+load-dependent+collagen+microstructures+in+porcine+tricuspid+valve+leaflets.">A pilot study on linking tissue mechanics with load-dependent collagen microstructures in porcine tricuspid valve leaflets.</a> Bioengineering. 7 (2), 60 (2020).</li><li>Pant, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pressure-induced+microstructural+changes+in+porcine+tricuspid+valve+leaflets.">Pressure-induced microstructural changes in porcine tricuspid valve leaflets.</a> Acta Biomaterialia. 67, 248-258 (2018).</li><li>Kramer, K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+investigation+of+layer-specific+tissue+biomechanics+of+porcine+atrioventricular+heart+valve+leaflets.">An investigation of layer-specific tissue biomechanics of porcine atrioventricular heart valve leaflets.</a> Acta Biomaterialia. 96, 368-384 (2019).</li><li>Ross, C. J., Laurence, D. W., Wu, Y., Lee, C. -. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biaxial+mechanical+characterizations+of+atrioventricular+heart+valves.">Biaxial mechanical characterizations of atrioventricular heart valves.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (146), e59170 (2019).</li><li>Goth, W., Lesicko, J., Sacks, M. S., Tunnell, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical-based+analysis+of+soft+tissue+structures.">Optical-based analysis of soft tissue structures.</a> Annual Review of Biomedical Engineering. 18, 357-385 (2016).</li><li>Jett, S. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integration+of+polarized+spatial+frequency+domain+imaging+(pSFDI)+with+a+biaxial+mechanical+testing+system+for+quantification+of+load-dependent+collagen+architecture+in+soft+collagenous+tissues.">Integration of polarized spatial frequency domain imaging (pSFDI) with a biaxial mechanical testing system for quantification of load-dependent collagen architecture in soft collagenous tissues.</a> Acta Biomaterialia. 102, 149-168 (2020).</li><li>Reddy, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> An Introduction to Continuum Mechanics. , (2013).</li><li>Duginski, G. A., Ross, C. J., Laurence, D. W., Johns, C. H., Lee, C. -. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+investigation+of+the+effect+of+freezing+storage+on+the+biaxial+mechanical+properties+of+excised+porcine+tricuspid+valve+anterior+leaflets.">An investigation of the effect of freezing storage on the biaxial mechanical properties of excised porcine tricuspid valve anterior leaflets.</a> Journal of the Mechanical Behavior of Biomedical Materials. 101, 103438 (2020).</li><li>Salinas, S. D., Clark, M. M., Amini, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+response+changes+in+porcine+tricuspid+valve+anterior+leaflet+under+osmotic-induced+swelling.">Mechanical response changes in porcine tricuspid valve anterior leaflet under osmotic-induced swelling.</a> Bioengineering. 6 (3), 70 (2019).</li><li>Pokutta-Paskaleva, A., Sulejmani, F., DelRocini, M., Sun, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+mechanical,+morphological,+and+microstructural+characterization+of+porcine+mitral+and+tricuspid+leaflets+and+chordae+tendineae.">Comparative mechanical, morphological, and microstructural characterization of porcine mitral and tricuspid leaflets and chordae tendineae.</a> Acta Biomaterialia. 85, 241-252 (2019).</li><li>Ross, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+investigation+of+the+glycosaminoglycan+contribution+to+biaxial+mechanical+behaviors+of+porcine+atrioventricular+heart+valve+leaflets.">An investigation of the glycosaminoglycan contribution to biaxial mechanical behaviors of porcine atrioventricular heart valve leaflets.</a> Journal of the Royal Society Interface. 16 (156), 0069 (2019).</li><li>Sommer, G., Regitnig, P., Ko&#776;ltringer, L., Holzapfel, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biaxial+mechanical+properties+of+intact+and+layer-dissected+human+carotid+arteries+at+physiological+and+supraphysiological+loadings.">Biaxial mechanical properties of intact and layer-dissected human carotid arteries at physiological and supraphysiological loadings.</a> American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 298 (3), 898-912 (2009).</li><li>Holzapfel, G. A., Sommer, G., Gasser, C., Regitnig, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+the+layer-specific+mechanical+properties+ofhuman+coronary+arteries+with+intimal+thickening,+and+related+constitutive+modelling.">Determination of the layer-specific mechanical properties ofhuman coronary arteries with intimal thickening, and related constitutive modelling.</a> American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 289 (5), 2048-2058 (2005).</li><li>Sommer, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiaxial+mechanical+response+and+constitutive+modeling+of+esophageal+tissues:+Impact+on+esophageal+tissue+engineering.">Multiaxial mechanical response and constitutive modeling of esophageal tissues: Impact on esophageal tissue engineering.</a> Acta Biomaterialia. 9 (12), 9379-9391 (2013).</li></ol>

שלבים קריטיים עבור הפרוטוקול כוללים: (i) המיקרו-דיסקציה של השכבה, (ii) הרכבת הרקמה, (iii) מיקום הסמן הפידוקיאלי, ו-(iv) הגדרת pSFDI. מיקרו-דיסקציה מתאימה של השכבה היא ההיבט החשוב והקשה ביותר של השיטה המתוארת כאן. לפני פתיחת חקירה תוך שימוש בטכניקה זו, הדיסקטור(ים) צריכים לתרגל לטווח ארוך עם טכניקת המי?...

הטלוויזיה ממוקמת בין האטריום הימני לחדר הימני של הלב. לאורך כל מחזור הלב, הטלוויזיה מווסתת את זרימת הדם החד-כיוונית באמצעות פתיחה וסגירה מחזורית של העלון הקדמי של הטלוויזיה (TVAL), העלון האחורי של הטלוויזיה (TVPL) ועלון המחיצה של הטלוויזיה (TVSL). עלונים אלה מורכבים וכוללים ארבע שכבות אנטומיות נפרדות – האטריאליס (A), הספונגיוסה (S), הפיברוסה (F) והחדר (V) – עם מרכיבים מיקרו-סטרוקטורליים ייחודיים. סיבי האלסטין באטריאליס ובחדרים מסייעים להחזיר את הרקמה לגיאומטריה הלא מעוותת שלה לאחר העמסה מכנית1. לעומת זאת, הפיברוסה מכילה רשת צפופה של סיבי קולגן גליים התורמים ליכולת נשיאת העומס של העלונים2. הספונטיוסה, המורכבת בעיקר מגליקוזאמינוגליקנים, הושער כי היא מאפשרת גזירה בין שכבות העלון במהלך תפקוד מסתם הלב3. בעוד שלכל שלושת סוגי העלונים יש את אותן שכבות אנטומיות, ישנן וריאציות בעובי השכבות וביחסים המרכיבים שיש להן השלכות על התנהגויות מכניות ספציפיות לעלון.
חוקרים חקרו את התכונות של עלוני הטלוויזיה באמצעות אפיונים מכניים מישוריים, הערכות היסטומורפיולוגיות ואפיונים אופטיים של ארכיטקטורת סיבי הקולגן. לדוגמה, אפיונים מכניים דו-אקסיאליים מישוריים מבקשים לחקות את ההעמסה הפיזיולוגית על ידי החלת תזוזות ניצבות על הרקמה ורישום הכוחות הקשורים. התצפיות שהתקבלו על תזוזת כוח (או מתח-מתיחה) גילו כי כל שלושת עלוני הטלוויזיה מפגינים התנהגויות מכניות לא ליניאריות וספציפיות לכיוון עם תגובות ספציפיות יותר לעלון בכיוון הרקמה הרדיאלית 4,5,6. מאמינים כי התנהגויות ספציפיות לכרוזים אלה נובעות מהבדלים בתכונות המיקרו-סטרוקטורליות שנצפו באמצעות טכניקות היסטולוגיות סטנדרטיות 6,7. יתר על כן, הדמיית דור הרמוני שני6, פיזור אור בזווית קטנה8, והדמיית תחום תדרים מרחבייםמקוטבים 7 (pSFDI) שואפים להבין את התכונות המיקרו-סטרוקטורליות הללו והראו הבדלים ספציפיים לעלון בכיוון סיבי הקולגן ובקימפ הסיבים שיש להם השלכות על ההתנהגויות המכניות שנצפו ברמת הרקמה. מחקרים אלה קידמו באופן משמעותי את הבנתנו את המיקרו-מבנה של הרקמות ואת תפקידו בהתנהגויות ברמת הרקמה. עם זאת, הרבה נותר לטפל בחיבור ניסיוני בין מכניקת הרקמות לבין המיקרו-מבנה הבסיסי.
לאחרונה, מעבדה זו ביצעה אפיונים מכניים של שכבות עלון הטלוויזיה המופרדות לשתי שכבות מרוכבות (A/S ו-F/V) באמצעות טכניקת מיקרו-דיסקציה9. עבודה קודמת זו הדגישה הבדלים בתכונות המכניות של השכבות ועזרה לספק תובנה כיצד המיקרו-מבנה השכבתי תורם להתנהגויות המכניות של הרקמה. למרות שחקירה זו שיפרה את הבנתנו את המיקרו-מבנה של עלון הטלוויזיה, לטכניקה היו מספר מגבלות. ראשית, התכונות של השכבות המורכבות לא הושוו ישירות לרקמה השלמה, מה שהוביל לחוסר הבנה מלאה של יחסי המכניקה-מיקרו-מבנה. שנית, ארכיטקטורת סיבי הקולגן של השכבות המורכבות לא נבדקה. שלישית, רק השכבות של ה-TVAL נחקרו בשל קשיים באיסוף השכבות המורכבות משני עלוני הטלוויזיה האחרים. השיטה המתוארת כאן מספקת מסגרת אפיון הוליסטית המתגברת על מגבלות אלה ומספקת אפיונים מלאים של עלוני הטלוויזיה והשכבות המורכבות שלהם.
מאמר זה מתאר את טכניקת המיקרו-דיסקציה המפרידה בין שלושת עלוני הטלוויזיה לשכבות המורכבות שלהם (A/S ו-F/V) עבור אפיונים מכניים דו-אקסיאליים ומיקרו-סטרוקטורליים 10,11,12. פרוטוקול איטרטיבי זה כולל (i) בדיקה מכנית דו-אקסיאלית ואפיון pSFDI של העלון השלם, (ii) טכניקת מיקרו-דיסקציה חדשנית וניתנת לשחזור כדי להשיג באופן אמין את שכבות הטלוויזיה המורכבות, ו-(iii) בדיקה מכנית דו-אקסיאלית ואפיון pSFDI של שכבות הטלוויזיה המורכבות. הרקמה נחשפה להעמסה דו-אקסיאלית של מתיחה עם יחסי כוח שונים לבדיקה מכנית. לאחר מכן, pSFDI שימש לקביעת הכיוון והיישור של סיבי הקולגן בתצורות טעונות שונות. pSFDI משמר את ארכיטקטורת סיבי הקולגן המקומית, מאפשר ניתוח תלוי עומס, ועוקף את הצורך האופייני לתקן או לנקות רקמה לניתוח ארכיטקטורת סיבי קולגן, כגון בהדמיית דור הרמוני שני או פיזור אור בזווית קטנה. לבסוף, הרקמות הוכנו באמצעות טכניקות היסטולוגיה סטנדרטיות כדי לדמיין את המיקרו-מבנה של הרקמה. מסגרת איטרטיבית והוליסטית זו מאפשרת השוואה ישירה של התכונות המכניות והמיקרו-סטרוקטורליות של עלון הטלוויזיה לשכבות המורכבות שלו.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10% Formalin Solution, Neutral Buffered</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>HT501128-4L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alconox Detergent</td>
			<td>Alconox</td>
			<td></td>
			<td>cleaning compound</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioTester - Biaxial Tester</td>
			<td>CellScale Biomaterials Testing</td>
			<td></td>
			<td>1.5 N Load Cell Capacity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cutting Mat</td>
			<td>Dahle</td>
			<td>B0027RS8DU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deionized Water</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine-Tipped Tool</td>
			<td>HTI INSTRUMENTS</td>
			<td>NSPLS-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps - Curved</td>
			<td>Scientific Labwares</td>
			<td>16122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps - Thick</td>
			<td>Scientific Labwares</td>
			<td>161001078</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps - Thin</td>
			<td>Scientific Labwares</td>
			<td>16127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LabJoy</td>
			<td>CellScale Biomaterials Testing</td>
			<td>Version 10.66</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser Displacement Sensor</td>
			<td>Keyence</td>
			<td>IL-030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid Cyanoacrylate Glue</td>
			<td>Loctite</td>
			<td>2436365</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MATLAB</td>
			<td>MathWorks</td>
			<td>Version 2020a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Scissors</td>
			<td>HTI Instruments</td>
			<td>CAS55C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette</td>
			<td>Belmaks</td>
			<td>360758081051Y4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polarized Spatial Frequency Domain Imaging Device</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
			<td>Made in-house using a digital light projector, linear polarizer, rotating polarizer mount, and charge-coupled device camera. 
			See doi.org/10.1016/j.actbio.2019.11.028 (PMCID: PMC8101699) for more details.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel</td>
			<td>THINKPRICE</td>
			<td>TP-SCALPEL-3010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single Edge Industrial Razor Blades (Surgical Carbon Steel)</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>H3515541105024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Pen</td>
			<td>LabAider</td>
			<td>LAB-Skin-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T-Pins</td>
			<td>Business Source</td>
			<td>BSN32351</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wax Board</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
			<td>Made in-house using modeling wax and baking tray</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Weigh Boat</td>
			<td>Pure Ponta</td>
			<td>mdo-azoc-1030</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

layer microdissection of tricuspid valve leaflets for biaxial mechanical characterization and microstructural quantification

המסתם הטריקוספידי (טלוויזיה) מווסת את הזרימה החד-כיוונית של דם לא מחומצן מהאטריום הימני לחדר הימני. הטלוויזיה מורכבת משלושה עלונים, כל אחד עם התנהגויות מכניות ייחודיות. ניתן להבין עוד יותר את הווריאציות הללו בין שלושת עלוני הטלוויזיה על ידי בחינת ארבע השכבות האנטומיות שלהם, שהן האטריאליס (A), ספונגיוסה (S), פיברוסה (F) וחדרים (V). בעוד ששכבות אלה נמצאות בכל שלושת עלוני הטלוויזיה, ישנם הבדלים בעוביים שלהם ובמרכיבים המיקרו-סטרוקטורליים שלהם המשפיעים עוד יותר על ההתנהגויות המכניות שלהם. 
פרוטוקול זה כולל ארבעה שלבים כדי להבהיר את ההבדלים הספציפיים לשכבה: (i) לאפיין את ההתנהגויות האדריכליות המכניות וסיבי הקולגן של עלון הטלוויזיה השלם, (ii) להפריד את השכבות המורכבות (A/S ו-F/V) של עלון הטלוויזיה, (iii) לבצע את אותם אפיונים עבור השכבות המורכבות, ו-(iv) לבצע פוסט-הוק הערכה היסטולוגית. מסגרת ניסיונית זו מאפשרת באופן ייחודי השוואה ישירה של רקמת הטלוויזיה השלמה לכל אחת מהשכבות המורכבות שלה. כתוצאה מכך, ניתן לאסוף מידע מפורט לגבי המיקרו-מבנה והתפקוד הביו-מכני של עלוני הטלוויזיה באמצעות פרוטוקול זה. מידע כזה יכול לשמש באופן פוטנציאלי לפיתוח מודלים חישוביים טלוויזיוניים המבקשים לספק הדרכה לטיפול הקליני במחלת הטלוויזיה.

המיקרו-דיסקציה תניב דגימות A/S ו-F/V בעוביים אחידים יחסית שניתן להרכיב על מכשיר בדיקה דו-אקסיאלי (מסחרי). ניתוח היסטולוגי של העלון השלם ושתי השכבות המנותחות יוודא אם הרקמה הופרדה כהלכה לאורך הגבול בין הספונטיוסה לפיברוסה (איור 7). בנוסף, ניתן להשתמש במיקרוגרפים ההיסטולוגיים כ?...

Watch this Scientific Journal Video about Layer Microdissection of Tricuspid Valve Leaflets for Biaxial Mechanical Characterization and Microstructural Quantification at JoVE.com

Layer Microdissection of Tricuspid Valve Leaflets for Biaxial Mechanical Characterization and Microstructural Quantification

פרוטוקול זה מתאר את האפיון המכני הדו-אקסיאלי, כימות קולגן מבוסס הדמיה של תחום תדרים מרחביים מקוטבים, ומיקרו-הבחנה של עלוני מסתמים טריקוספידיים. השיטה שסופקה מבהירה כיצד שכבות העלון תורמות להתנהגויות העלון ההוליסטיות.

מיקרו-דיסקציה של שכבה של עלוני שסתומים טריקוספידיים לאפיון מכני דו-אקסיאלי וכימות מיקרו-סטרוקטורלי

The tricuspid valve (TV) regulates the unidirectional flow of unoxygenated blood from the right atrium to the right ventricle. The TV consists of three ...

שיטה זו יכולה לבודד את התרומות של שכבות הרקמה להתנהגות הרקמה הכוללת, ולספק תובנה חדשה לגבי המיקרו-מבנה של הרקמה. מסגרת המיקרו-דיסקציה והבדיקה שלנו מאפשרת לנו להשוות באופן ישיר את התכונות המכניות והמיקרו-סטרוקטורליות של עלוני מסתמי הלב לשכבות המורכבות שלהם. המיקרו דיסקציה יכולה להיות קשה לשליטה, ולכן, מומלץ מאוד לתרגל כמה שיותר לפני השקת המחקר שלך.ראשית, לאסוף את החומרים הנדרשים, לוח שעווה, מים DI, פיפטה, אזמל, מיקרו מספריים, מלקחיים דקים, מלקחיים מעוקלים, מלקחיים עבים וסיכות. שחררו את הרקמה מהבודק הדו-אקסיאלי ומדדו את עוביה באמצעות חיישן תזוזת הלייזר. מניחים את הרקמה על לוח השעווה.בדוק את הצד החדרי של הרקמה עבור תוספות צ'ורדה גדולות. צלם תמונה לעיון. מורחים את הרקמה שטוחה על לוח השעווה כאשר האטריאליס פונה כלפי מעלה.כדי להצמיד את הרקמה ללוח, הניחו סיכה אחת בזווית הרחק מהרקמה בכל פינה, כך שהיא מושכת מעט את הרקמה. ודא כי הפינים נמצאים מחוץ לחורים שנוצרו על ידי הטינים בעת הרכבת הרקמה והרקמה היא מרובעת ואינה זזה במהלך המיקרו-דיסקציה של השכבה. במידת הצורך, מניחים סיכות לאורך צד הרקמה במהלך הנתיחה כדי למתוח את הרקמה יותר.הסר את סמני חרוזי הזכוכית. הניחו את מי ה-DI על פני השטח של הרקמה עם פיפטה, כך שהם מכסים לחלוטין את הרקמה באופן דמוי בועה. כדי להפוך את הפינה הראשונית, בחר פינה של הדגימה המוצמדת, תוך הימנעות מהכנסות צ'ורדה גדולות באזורים שבירים.לאחר מכן, חתכו את שכבת ה-A/S על ידי גרירה קלה של האזמל מעל משטח הרקמה לאורך חורי ההרכבה לצורך בדיקה מכנית. הקצוות של החתך מתחילים להתפרק, וחושפים את שכבת ה-F/V שמתחת. עם מלקחיים קהים ודקים, לשפשף בחוזקה לאורך החתך כדי להפריד עוד יותר את קצוותיו.אם החתך בשכבת ה-A/S אינו מתחיל להתפרק, יש לעקוב בקלילות אחר אותו חתך שוב עם אזמל. בצע חתך שני בניצב לחתך הראשון. אם שני החתכים אינם מחוברים, הפעילו את הפינצטה הדקה מתחת לאזור הרקמה הקטן המפריד בין שני החתכים.לאחר מכן, בזהירות להשתמש במספריים כדי לחתוך את הרקמה. משפשפים לאורך חתכי הפינה עם מלקחיים דקים עד שהרקמה נפרדת משכבת ה-F/V. ברגע שפיסת רקמה קטנה מופרדת, תפסו אותה בפינצטה הגדולה ומשכו אותה בעדינות כדי להפריד את השכבות המורכבות עוד יותר.ממשיכים לקלף את הרקמה תוך כדי אחיזתה בפינצטה גדולה יותר כדי למנוע קריעה וקריעה לא רצויים של השכבה המורכבת A/S, ושפשפו את התפר עד שהוא מגיע לקצה שני החתכים המיועדים לפינה. אם בפינה הראשונה יש בעיות משמעותיות בהפרדה, נסה פינה אחרת כנקודת התחלה. לאחר מכן, כדי ליצור פינה שנייה, הרחיבו את שני החתכים שנעשו עבור הפינה הראשונה על ידי הנחת קצה האזמל בתחתית כל חתך וגרירתו קלות לאורך משטח הרקמה, כך שהרחבות החתך יתחברו לחתכים המקוריים וימשיכו לעקוב אחר חורי הטין או התפר.יש להמשיך להאריך את החתכים ולקלף את שכבת ה-A/S המורכבת העליונה לאחור תוך כדי שפשוף התפר עד לסיום צד אחד. שימו לב שהרקמה תופרד לחלוטין לאורך חתך אחד. לאחר מכן, צור פינה שנייה בניצב לסוף הצד המקולף במלואו.הרחיבו את החתכים הנותרים תוך הימנעות מהכנסות צ'ורדה גדולות. אל תכלול את תוספות הכורדה מאזור ההפרדה A/S רק כאשר אי הכללה זו תאפשר דגימת A/S גדולה מספיק לאפיונים ניסיוניים. המשך להפריד בין שכבות ה-A/S וה-F/V באמצעות טכניקות השפשוף והמשיכה שבהן נעשה שימוש עבור הפינה הראשונה.יש להפסיק להפריד את הרקמה באופן מיידי אם נוצר קרע או חור. כדי למנוע לכידת פינצטה, הניחו את המספריים בכל חור שנוצר וחתכו את הרקמה מהמרכז. אם הפגם נוצר לאורך התפר של ההפרדה, ואז להתחיל להפריד את הרקמה לאורך קצה אחר.חפשו קשרים בין-שכבתיים שעשויים להופיע בעת הפרדת הרקמה ומנעו הפרדת רקמות נוספת. שימו לב שמדובר בגדילים דקים אך חזקים שיש לחתוך בזהירות באמצעות מספריים. הימנעו מיצירת חור בשכבת ה-A/S או מחיתוך כלפי מטה לשכבת ה-F/V.המשך בתהליך זה עד להפרדת הדגימה הגדולה ביותר האפשרית של שכבת ה- A/S. סמן את כיוון הדגימה באמצעות העט הכירורגי. לבסוף, חתכו לאורך תפר ההפרדה עבור קצה הרקמה הנותר עם המספריים.מניחים את השכבה המורכבת המופרדת A/S שטוחה על משטח החיתוך. במידת הצורך, השתמש באזמל כדי ליישר את קצוות הרקמה וליצור צורת רקמה מרובעת המתאימה לבדיקה מכנית דו-אקסיאלית. מניחים את שכבת ה-A/S במי DI עד שהיא מוכנה לבדיקה.סמן את הכיוון של שכבת ה-F/V שנותרה על לוח השעווה. חתכו את הריבוע הגדול ביותר האפשרי מתוך השטח שבו הוסרה שכבת ה-A/S. לאחר מכן, הניחו אותו במי DI.ניתוח היסטולוגי של העלון השלם ושתי השכבות המנותחות אימת אם הרקמה הופרדה כהלכה לאורך הגבול בין הספונטיוסה לפיברוסה. המיקרוגרפים ההיסטולוגיים שימשו לקביעת עובי שכבת הרקמה ושברי המסה המרכיבים אותה באמצעות תוכנת ImageJ. הבדיקה המכנית מבוקרת והעיבוד שלאחר העיבוד יצרו מתח ממברנה לעומת נתוני מתיחה של העלון הקדמי של המסתם הטריקוספידי, העלון האחורי של המסתם הטריקוספידי ועלון המחיצה של המסתם הטריקוספידי, המתארים את ההתנהגות המכנית הלא ליניארית של הרקמה.נתוני ההדמיה של תחום התדרים המרחביים המקוטבים הניבו מפות צבע של כיוון סיבי הקולגן ומידת האניזוטרופיה האופטית. באופן ספציפי, מפות צבע אלה סיפקו הבנה מקיפה של ארכיטקטורת סיבי הקולגן בכל דגימת הרקמה. חשוב לציין כי השכבה המורכבת מתכווצת ברגע שהם מופרדים מהרקמה המוצמדת.אסוף את הדגימה הגדולה ביותר האפשרית כדי להבטיח שיש מספיק רקמה לבדיקה הבאה.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Synthetic, Multi-Layer, Self-Oscillating Vocal Fold Model Fabrication

סינטטי, רב שכבתיים, עצמי מתנודדת ווקאלי דגם Fold ייצור

Sound for the human voice is produced via flow-induced vocal fold vibration. The vocal folds consist of several layers of tissue, each with differing ...

On-chip Isotachophoresis for Separation of Ions and Purification of Nucleic Acids

על שבב Isotachophoresis להפרדה של יוני וטיהור של חומצות גרעין

Electrokinetic techniques are a staple of microscale applications because of their unique ability to perform a variety of fluidic and electrophoretic ...

Design of a Biaxial Mechanical Loading Bioreactor for Tissue Engineering

עיצוב של Bioreactor טוען מכונות Biaxial להנדסת רקמות

We  designed a loading device that is capable of applying uniaxial or biaxial  mechanical strain to a tissue engineered biocomposites fabricated for  ...

Fabrication and Characterization of a Conformal Skin-like Electronic System for Quantitative, Cutaneous Wound Management

ייצור ואפיון של מערכת אלקטרונית כמו-עור קונפורמי לניהול כמותי, עורית פצע

Recent advances in the development of electronic technologies and biomedical devices offer opportunities for non-invasive, quantitative assessment of ...

Layer-by-layer Collagen Deposition in Microfluidic Devices for Microtissue Stabilization

קולגן שכבת הפקדת-ידי שכבה במכשירי microfluidic לMicrotissue ייצוב

Although microfluidics provides exquisite control of the cellular microenvironment, culturing cells within microfluidic devices can be challenging. 3D ...

Quantification of Strain in a Porcine Model of Skin Expansion Using Multi-View Stereo and Isogeometric Kinematics

כימות של זנים במודל חזירי של הרחבת עור באמצעות סטריאו Multi-הצגת Isogeometric קינמטיקה

Tissue expansion is a popular technique in plastic and reconstructive surgery that grows skin in vivo for correction of large defects such as burns and ...

Imaging the Root Hair Morphology of Arabidopsis Seedlings in a Two-layer Microfluidic Platform

Imaging the Root Hair Morphology of Arabidopsis Seedlings in a Two-layer Microfluidic Platform

הדמיה המורפולוגיה שורש השיער של תודרנית השתילים בשטח פלטפורמה Microfluidic דו שכבתי

Root hairs increase root surface area for better water uptake and nutrient absorption by the plant. Because they are small in size and often obscured by ...

Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) Assays

Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate LAL Assays

זיהוי של אנדוטוקסין ניסוחים-Nano באמצעות מבחני Lysate (LAL) Amoebocyte Limulus

When present in pharmaceutical products, a Gram-negative bacterial cell wall component endotoxin (often also called lipopolysaccharide) can cause ...

Assembly and Characterization of Biomolecular Memristors Consisting of Ion Channel-doped Lipid Membranes

הרכבה ואפיון של Memristors למערכות ביולוגיות המורכב ממברנות השומנים מסטול-תעלת יונים

The ability to recreate synaptic functionalities in synthetic circuit elements is essential for neuromorphic computing systems that seek to emulate the ...

Biaxial Mechanical Characterizations of Atrioventricular Heart Valves

אפיוני מכני biaxial של מסתמי הלב Atrioventricular

Extensive biaxial mechanical testing of the atrioventricular heart valve leaflets can be utilized to derive&#160;optimal parameters used in constitutive ...