Name: layer microdissection of tricuspid valve leaflets for biaxial mechanical characterization and microstructural quantification
Uploaded: 2022-02-10T15:00:00
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Este trabajo fue apoyado por la American Heart Association Scientist Development Grant (16SDG27760143) y la Presbyterian Health Foundation. KMC fue apoyado en parte por el Programa de Oportunidades de Investigación de Pregrado de la Universidad de Oklahoma (OU) y el Programa de Aprendizaje de Investigación de Honores. DWL fue apoyado en parte por la Beca de Investigación de Posgrado de la Fundación Nacional de Ciencias (GRF 2019254233) y la Beca Predoctoral de la Asociación Americana del Corazón / Fundación del Corazón de los Niños (Premio # 821298). Todo este apoyo es agradecido.

Todos los métodos descritos en este documento fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Oklahoma. Los tejidos animales fueron adquiridos de un matadero aprobado por el USDA.
1. Caracterización mecánica biaxial
<ol><li>Preparación de tejidos<ol>
<li>Recupere un folleto de TV del congelador, cuchillas de afeitar, una pluma quirúrgica, fórceps, una pipeta con agua desionizada (DI) y una estera de corte. Descongele el f...

<ol>
	<li>Vesely, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+elastin+in+aortic+valve+mechanics.">The role of elastin in aortic valve mechanics.</a> Journal of Biomechanics. 31 (2), 115-123 (1998).</li><li>Zhang, W., Ayoub, S., Liao, J., Sacks, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+meso-scale+layer-specific+structural+constitutive+model+of+the+mitral+heart+valve+leaflets.">A meso-scale layer-specific structural constitutive model of the mitral heart valve leaflets.</a> Acta Biomaterialia. 32, 238-255 (2016).</li><li>Stella, J. A., Sacks, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+biaxial+mechanical+properties+of+the+layers+of+the+aortic+valve+leaflet.">On the biaxial mechanical properties of the layers of the aortic valve leaflet.</a> Journal of Biomechanical Engineering. 129 (5), 757-766 (2007).</li><li>Khoiy, K. A., Amini, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+biaxial+mechanical+response+of+porcine+tricuspid+valve+leaflets.">On the biaxial mechanical response of porcine tricuspid valve leaflets.</a> Journal of Biomechanical Engineering. 138 (10), 104504 (2016).</li><li>Jett, S. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+investigation+of+the+anisotropic+mechanical+properties+and+anatomical+structure+of+porcine+atrioventricular+heart+valves.">An investigation of the anisotropic mechanical properties and anatomical structure of porcine atrioventricular heart valves.</a> Journal of the Mechanical Behavior of Biomedical Materials. 87, 155-171 (2018).</li><li>Meador, W. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+detailed+mechanical+and+microstructural+analysis+of+ovine+tricuspid+valve+leaflets.">A detailed mechanical and microstructural analysis of ovine tricuspid valve leaflets.</a> Acta Biomaterialia. 102, 100-113 (2020).</li><li>Hudson, L. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+pilot+study+on+linking+tissue+mechanics+with+load-dependent+collagen+microstructures+in+porcine+tricuspid+valve+leaflets.">A pilot study on linking tissue mechanics with load-dependent collagen microstructures in porcine tricuspid valve leaflets.</a> Bioengineering. 7 (2), 60 (2020).</li><li>Pant, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pressure-induced+microstructural+changes+in+porcine+tricuspid+valve+leaflets.">Pressure-induced microstructural changes in porcine tricuspid valve leaflets.</a> Acta Biomaterialia. 67, 248-258 (2018).</li><li>Kramer, K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+investigation+of+layer-specific+tissue+biomechanics+of+porcine+atrioventricular+heart+valve+leaflets.">An investigation of layer-specific tissue biomechanics of porcine atrioventricular heart valve leaflets.</a> Acta Biomaterialia. 96, 368-384 (2019).</li><li>Ross, C. J., Laurence, D. W., Wu, Y., Lee, C. -. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biaxial+mechanical+characterizations+of+atrioventricular+heart+valves.">Biaxial mechanical characterizations of atrioventricular heart valves.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (146), e59170 (2019).</li><li>Goth, W., Lesicko, J., Sacks, M. S., Tunnell, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical-based+analysis+of+soft+tissue+structures.">Optical-based analysis of soft tissue structures.</a> Annual Review of Biomedical Engineering. 18, 357-385 (2016).</li><li>Jett, S. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integration+of+polarized+spatial+frequency+domain+imaging+(pSFDI)+with+a+biaxial+mechanical+testing+system+for+quantification+of+load-dependent+collagen+architecture+in+soft+collagenous+tissues.">Integration of polarized spatial frequency domain imaging (pSFDI) with a biaxial mechanical testing system for quantification of load-dependent collagen architecture in soft collagenous tissues.</a> Acta Biomaterialia. 102, 149-168 (2020).</li><li>Reddy, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> An Introduction to Continuum Mechanics. , (2013).</li><li>Duginski, G. A., Ross, C. J., Laurence, D. W., Johns, C. H., Lee, C. -. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+investigation+of+the+effect+of+freezing+storage+on+the+biaxial+mechanical+properties+of+excised+porcine+tricuspid+valve+anterior+leaflets.">An investigation of the effect of freezing storage on the biaxial mechanical properties of excised porcine tricuspid valve anterior leaflets.</a> Journal of the Mechanical Behavior of Biomedical Materials. 101, 103438 (2020).</li><li>Salinas, S. D., Clark, M. M., Amini, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+response+changes+in+porcine+tricuspid+valve+anterior+leaflet+under+osmotic-induced+swelling.">Mechanical response changes in porcine tricuspid valve anterior leaflet under osmotic-induced swelling.</a> Bioengineering. 6 (3), 70 (2019).</li><li>Pokutta-Paskaleva, A., Sulejmani, F., DelRocini, M., Sun, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+mechanical,+morphological,+and+microstructural+characterization+of+porcine+mitral+and+tricuspid+leaflets+and+chordae+tendineae.">Comparative mechanical, morphological, and microstructural characterization of porcine mitral and tricuspid leaflets and chordae tendineae.</a> Acta Biomaterialia. 85, 241-252 (2019).</li><li>Ross, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+investigation+of+the+glycosaminoglycan+contribution+to+biaxial+mechanical+behaviors+of+porcine+atrioventricular+heart+valve+leaflets.">An investigation of the glycosaminoglycan contribution to biaxial mechanical behaviors of porcine atrioventricular heart valve leaflets.</a> Journal of the Royal Society Interface. 16 (156), 0069 (2019).</li><li>Sommer, G., Regitnig, P., Ko&#776;ltringer, L., Holzapfel, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biaxial+mechanical+properties+of+intact+and+layer-dissected+human+carotid+arteries+at+physiological+and+supraphysiological+loadings.">Biaxial mechanical properties of intact and layer-dissected human carotid arteries at physiological and supraphysiological loadings.</a> American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 298 (3), 898-912 (2009).</li><li>Holzapfel, G. A., Sommer, G., Gasser, C., Regitnig, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+the+layer-specific+mechanical+properties+ofhuman+coronary+arteries+with+intimal+thickening,+and+related+constitutive+modelling.">Determination of the layer-specific mechanical properties ofhuman coronary arteries with intimal thickening, and related constitutive modelling.</a> American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 289 (5), 2048-2058 (2005).</li><li>Sommer, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiaxial+mechanical+response+and+constitutive+modeling+of+esophageal+tissues:+Impact+on+esophageal+tissue+engineering.">Multiaxial mechanical response and constitutive modeling of esophageal tissues: Impact on esophageal tissue engineering.</a> Acta Biomaterialia. 9 (12), 9379-9391 (2013).</li></ol>

Los pasos críticos para el protocolo incluyen: (i) la microdisección de la capa, (ii) el montaje del tejido, (iii) la colocación del marcador fiduciario y (iv) la configuración de pSFDI. La microdisección de capas apropiada es el aspecto más importante y difícil del método descrito en este documento. Antes de iniciar una investigación que utilice esta técnica, el disector (s) debe tener práctica a largo plazo con la técnica de microdisección y los tres folletos de televisión. El disector debe asegurarse de ...

El televisor se encuentra entre la aurícula derecha y el ventrículo derecho del corazón. A lo largo del ciclo cardíaco, el televisor regula el flujo sanguíneo unidireccional a través de la apertura y el cierre cíclicos de la valva anterior de TV (TVAL), la valva posterior de TV (TVPL) y la valva septal de TV (TVSL). Estas valvas son complejas y tienen cuatro capas anatómicas distintas: la atrialis (A), la espongiosa (S), la fibrosa (F) y la ventricularis (V), con constituyentes microestructurales únicos. Las fibras de elastina en el atrialis y el ventricularis ayudan a restaurar el tejido a su geometría no deformada después de la carga mecánica1. Por el contrario, la fibrosa contiene una densa red de fibras de colágeno onduladas que contribuyen a la capacidad de carga de las valvas2. Compuesta principalmente de glicosaminoglicanos, la espongiosa ha sido hipotetizada para permitir el cizallamiento entre las capas de la valva durante la función de la válvula cardíaca3. Si bien los tres tipos de folíolos tienen las mismas capas anatómicas, hay variaciones en los espesores de las capas y las proporciones constituyentes que tienen implicaciones para los comportamientos mecánicos específicos de los folletos.
Los investigadores han explorado las propiedades de los folletos de TV utilizando caracterizaciones mecánicas planas, evaluaciones histomorfológicas y caracterizaciones ópticas de la arquitectura de la fibra de colágeno. Por ejemplo, las caracterizaciones mecánicas biaxiales planas buscan emular la carga fisiológica aplicando desplazamientos perpendiculares al tejido y registrando las fuerzas asociadas. Las observaciones resultantes de desplazamiento de fuerza (o estiramiento por estrés) han revelado que los tres folletos de TV exhiben comportamientos mecánicos no lineales, específicos de la dirección, con respuestas más aparentes específicas de la valva en la dirección del tejido radial 4,5,6. Se cree que estos comportamientos específicos de la valva se derivan de las diferencias en las propiedades microestructurales observadas utilizando técnicas histológicas estándar 6,7. Además, las imágenes de segunda generación armónica6, la dispersiónde luz de ángulo pequeño 8 y la imagen de dominio de frecuencia espacial polarizada7 (pSFDI) tienen como objetivo comprender estas propiedades microestructurales y han mostrado diferencias específicas en la orientación de la fibra de colágeno y el engarce de fibra que tienen implicaciones para los comportamientos mecánicos observados a nivel de tejido. Estos estudios han avanzado significativamente nuestra comprensión de la microestructura tisular y su papel en los comportamientos a nivel tisular. Sin embargo, queda mucho por abordar en la conexión experimental de la mecánica de tejidos y la microestructura subyacente.
Recientemente, este laboratorio realizó caracterizaciones mecánicas de las capas de folletos de TV separadas en dos capas compuestas (A/S y F/V) utilizando una técnica de microdisección9. Ese trabajo anterior destacó las diferencias en las propiedades mecánicas de las capas y ayudó a proporcionar información sobre cómo la microestructura en capas contribuye a los comportamientos mecánicos de los tejidos. Aunque esta investigación mejoró nuestra comprensión de la microestructura del folleto de TV, la técnica tenía varias limitaciones. En primer lugar, las propiedades de las capas compuestas no se compararon directamente con el tejido intacto, lo que llevó a una falta de comprensión completa de la relación mecánica-microestructura. En segundo lugar, no se examinó la arquitectura de la fibra de colágeno de las capas compuestas. En tercer lugar, solo se investigaron las capas del TVAL debido a las dificultades para recolectar las capas compuestas de los otros dos folletos de TV. El método descrito en este documento proporciona un marco de caracterización holística que supera estas limitaciones y proporciona caracterizaciones completas de los folletos de TV y sus capas compuestas.
Este artículo describe la técnica de microdisección que separa los tres folletos de TV en sus capas compuestas (A/S y F/V) para caracterizaciones mecánicas y microestructurales biaxiales 10,11,12. Este protocolo iterativo incluye (i) pruebas mecánicas biaxiales y caracterización pSFDI del folíolo intacto, (ii) una técnica de microdisección novedosa y reproducible para obtener de manera confiable las capas de TV compuestas, y (iii) pruebas mecánicas biaxiales y caracterización pSFDI de las capas de TV compuestas. El tejido fue expuesto a carga de tracción biaxial con varias relaciones de fuerza para pruebas mecánicas. Luego, se utilizó pSFDI para determinar la orientación y alineación de la fibra de colágeno en varias configuraciones cargadas. pSFDI conserva la arquitectura nativa de la fibra de colágeno, permite el análisis dependiente de la carga y evita la necesidad típica de fijar o limpiar el tejido para el análisis de la arquitectura de la fibra de colágeno, como en las imágenes de segunda generación armónica o la dispersión de luz de ángulo pequeño. Finalmente, los tejidos se prepararon utilizando técnicas histológicas estándar para visualizar la microestructura tisular. Este marco iterativo y holístico permite la comparación directa de las propiedades mecánicas y microestructurales del folleto de TV con sus capas compuestas.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10% Formalin Solution, Neutral Buffered</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>HT501128-4L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alconox Detergent</td>
			<td>Alconox</td>
			<td></td>
			<td>cleaning compound</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioTester - Biaxial Tester</td>
			<td>CellScale Biomaterials Testing</td>
			<td></td>
			<td>1.5 N Load Cell Capacity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cutting Mat</td>
			<td>Dahle</td>
			<td>B0027RS8DU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deionized Water</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine-Tipped Tool</td>
			<td>HTI INSTRUMENTS</td>
			<td>NSPLS-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps - Curved</td>
			<td>Scientific Labwares</td>
			<td>16122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps - Thick</td>
			<td>Scientific Labwares</td>
			<td>161001078</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps - Thin</td>
			<td>Scientific Labwares</td>
			<td>16127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LabJoy</td>
			<td>CellScale Biomaterials Testing</td>
			<td>Version 10.66</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser Displacement Sensor</td>
			<td>Keyence</td>
			<td>IL-030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid Cyanoacrylate Glue</td>
			<td>Loctite</td>
			<td>2436365</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MATLAB</td>
			<td>MathWorks</td>
			<td>Version 2020a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Scissors</td>
			<td>HTI Instruments</td>
			<td>CAS55C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette</td>
			<td>Belmaks</td>
			<td>360758081051Y4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polarized Spatial Frequency Domain Imaging Device</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
			<td>Made in-house using a digital light projector, linear polarizer, rotating polarizer mount, and charge-coupled device camera. 
			See doi.org/10.1016/j.actbio.2019.11.028 (PMCID: PMC8101699) for more details.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel</td>
			<td>THINKPRICE</td>
			<td>TP-SCALPEL-3010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single Edge Industrial Razor Blades (Surgical Carbon Steel)</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>H3515541105024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Pen</td>
			<td>LabAider</td>
			<td>LAB-Skin-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T-Pins</td>
			<td>Business Source</td>
			<td>BSN32351</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wax Board</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
			<td>Made in-house using modeling wax and baking tray</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Weigh Boat</td>
			<td>Pure Ponta</td>
			<td>mdo-azoc-1030</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

layer microdissection of tricuspid valve leaflets for biaxial mechanical characterization and microstructural quantification

La válvula tricúspide (TV) regula el flujo unidireccional de sangre no oxigenada desde la aurícula derecha hasta el ventrículo derecho. El televisor consta de tres folletos, cada uno con comportamientos mecánicos únicos. Estas variaciones entre los tres folletos de TV se pueden entender mejor examinando sus cuatro capas anatómicas, que son la atrialis (A), la espongiosa (S), la fibrosa (F) y la ventricularis (V). Si bien estas capas están presentes en los tres folletos de TV, existen diferencias en sus espesores y constituyentes microestructurales que influyen aún más en sus respectivos comportamientos mecánicos. 
Este protocolo incluye cuatro pasos para dilucidar las diferencias específicas de la capa: (i) caracterizar los comportamientos arquitectónicos mecánicos y de fibra de colágeno del folleto de TV intacto, (ii) separar las capas compuestas (A / S y F / V) del folleto de TV, (iii) llevar a cabo las mismas caracterizaciones para las capas compuestas, y (iv) realizar post-hoc evaluación histología. Este marco experimental permite de forma única la comparación directa del tejido tvnte intacto con cada una de sus capas compuestas. Como resultado, se puede recopilar información detallada sobre la microestructura y la función biomecánica de los folletos de TV con este protocolo. Dicha información se puede utilizar potencialmente para desarrollar modelos computacionales de TV que buscan proporcionar orientación para el tratamiento clínico de la enfermedad de TV.

La microdisección producirá muestras A/S y F/V con espesores relativamente uniformes que se pueden montar en un dispositivo de prueba biaxial (comercial). El análisis histológico de la valva intacta y las dos capas diseccionadas verificará si el tejido se separó correctamente a lo largo del borde entre la espongiosa y la fibrosa (Figura 7). Además, las micrografías histológicas se pueden utilizar para determinar los espesores de las capas de tejido y las fracciones de masa constituy...

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Layer Microdissection of Tricuspid Valve Leaflets for Biaxial Mechanical Characterization and Microstructural Quantification

Este protocolo describe la caracterización mecánica biaxial, la cuantificación del colágeno basada en imágenes de dominio de frecuencia espacial polarizada y la microdisección de las valvas de la válvula tricúspide. El método proporcionado aclara cómo las capas de folletos contribuyen a los comportamientos holísticos de los folletos.

Microdisección en capas de valvas de válvula tricúspide para caracterización mecánica biaxial y cuantificación microestructural

The tricuspid valve (TV) regulates the unidirectional flow of unoxygenated blood from the right atrium to the right ventricle. The TV consists of three ...

Este método puede aislar las contribuciones de las capas de tejido al comportamiento general del tejido, proporcionando una nueva visión de la microestructura del tejido. Nuestro marco de microdisección y pruebas nos permite comparar directamente las propiedades mecánicas y microestructurales de las valvas de las válvulas cardíacas con sus propias capas compuestas. La microdisección puede ser difícil de dominar, por lo tanto, es muy recomendable practicar tanto como sea posible antes de iniciar su estudio.Primero, reúna los materiales requeridos, tablero de cera, agua DI, pipeta, bisturí, micro tijeras, pinzas delgadas, pinzas curvas, pinzas gruesas y pasadores. Desmonte el tejido del probador biaxial y mida su grosor utilizando el sensor de desplazamiento láser. Coloque el pañuelo en la tabla de cera.Examine el lado ventricularis del tejido para detectar inserciones de cordas grandes. Tome una fotografía como referencia. Extienda el tejido plano sobre la tabla de cera con el auricular hacia arriba.Para fijar el tejido a la tabla, coloque un alfiler en ángulo lejos del tejido en cada esquina para que tire ligeramente del tejido tenso. Asegúrese de que los pasadores estén fuera de los orificios creados por las púas al montar el tejido y que el tejido sea cuadrado y no se desplace durante la microdisección de la capa. Si es necesario, coloque alfileres a lo largo del costado del tejido durante la disección para estirar más el tejido.Retire los marcadores fiduciarios de cuentas de vidrio. Coloque agua DI en la superficie del tejido con una pipeta para que cubra completamente el tejido de una manera similar a una burbuja. Para hacer la esquina inicial, seleccione una esquina de la muestra fijada, evitando grandes inserciones de corda en áreas frágiles.Luego, corte la capa A / S arrastrando ligeramente el bisturí sobre la superficie del tejido a lo largo de los orificios de montaje para pruebas mecánicas. Los bordes del corte comienzan a separarse, revelando la capa F / V debajo. Con pinzas romas y delgadas, frote firmemente a lo largo del corte para separar aún más sus bordes.Si el corte en la capa A / S no comienza a separarse, vuelva a trazar ligeramente sobre el mismo corte con un bisturí. Hacer un segundo corte perpendicular al primer corte. Si los dos cortes no están conectados, pase las pinzas delgadas debajo de la pequeña área de tejido que separa los dos cortes.Luego, use cuidadosamente las tijeras para cortar el tejido. Frote a lo largo de los cortes de la esquina con pinzas delgadas hasta que el tejido se separe de la capa F / V. Tan pronto como se separe un pequeño trozo de tejido, agárrelo con las pinzas grandes y tire suavemente de él para separar aún más las capas compuestas.Continúe pelando el tejido mientras lo agarra con pinzas más grandes para evitar el rasgado y desgarro no deseado de la capa compuesta A / S, y frote la costura hasta que llegue al final de los dos cortes realizados para la esquina. Si la primera esquina tiene problemas importantes con la separación, pruebe una esquina diferente como punto de partida. Luego, para hacer una segunda esquina, extienda los dos cortes realizados para la primera esquina colocando la punta del bisturí en la parte inferior de cada corte y arrastrándola ligeramente a lo largo de la superficie del tejido para que las extensiones cortadas se conecten a los cortes originales y continúen siguiendo los orificios de la tina o sutura.Continúe extendiendo los cortes y pelando la capa superior compuesta de A / S hacia atrás mientras frota la costura hasta que un lado esté terminado. Observe que el tejido estará completamente separado a lo largo de un corte. A continuación, cree una segunda esquina perpendicular al extremo del lado completamente pelado.Extienda los cortes restantes mientras evita grandes inserciones de cuerdas. Excluya las inserciones de corda del área de separación A/S solo cuando esta exclusión permita un espécimen A/S lo suficientemente grande como para caracterizaciones experimentales. Continúe separando las capas A / S y F / V utilizando las técnicas de frotamiento y tracción empleadas para la primera esquina.Deje de separar el tejido inmediatamente si se forma un desgarro o un agujero. Para evitar que las pinzas queden atrapadas, coloque las tijeras en cualquier orificio que se forme y corte el tejido lejos del centro. Si el defecto se forma a lo largo de la costura de separación, comience a separar el tejido a lo largo de otro borde.Busque las conexiones entre capas que pueden aparecer al separar el tejido y evite una mayor separación del tejido. Observe que estas son hebras delgadas pero fuertes que deben cortarse cuidadosamente con tijeras. Evite crear un orificio en la capa A/S o cortar hacia abajo en la capa F/V.Continúe este proceso hasta que se haya separado la mayor muestra posible de la capa A/S. Marque la orientación de la muestra utilizando la pluma quirúrgica. Finalmente, corte a lo largo de la costura de separación para el borde de tejido restante con las tijeras.Coloque la capa compuesta A/S separada plana sobre la estera de corte. Si es necesario, use el bisturí para enderezar los bordes del tejido y crear una forma de tejido cuadrado adecuada para las pruebas mecánicas biaxiales. Coloque la capa A / S en agua DI hasta que esté lista para ser probada.Marque la orientación de la capa F/V que permanece en la tabla de cera. Corte el cuadrado más grande posible del área donde se eliminó la capa A / S. Luego, colóquelo en agua DI.El análisis histológico de la valva intacta y las dos capas diseccionadas verificó si el tejido estaba correctamente separado a lo largo del borde entre la espongiosa y la fibrosa. Las micrografías histológicas se utilizaron para determinar el grosor de la capa tisular y las fracciones de masa constituyente utilizando el software ImageJ. Las pruebas mecánicas controladas por desplazamiento y el post-procesamiento produjeron datos de tensión de membrana versus estiramiento de la valva anterior de la válvula tricúspide, la valva posterior de la válvula tricúspide y la valva septal de la válvula tricúspide, que describen el comportamiento mecánico no lineal del tejido.Los datos de imágenes del dominio de frecuencia espacial polarizada produjeron mapas de color de la orientación de la fibra de colágeno y el grado de anisotropía óptica. Específicamente, estos mapas de color proporcionaron una comprensión integral de la arquitectura de la fibra de colágeno en toda la muestra de tejido. Es importante tener en cuenta que la capa compuesta se encoge una vez que se separan del tejido fijado.Recolecte la muestra más grande posible para asegurarse de que haya suficiente tejido para las pruebas posteriores.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

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Sintético, multi-capa, auto-oscilante Fabricación Vocal Modelo Doble

Sound for the human voice is produced via flow-induced vocal fold vibration. The vocal folds consist of several layers of tissue, each with differing ...

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Although microfluidics provides exquisite control of the cellular microenvironment, culturing cells within microfluidic devices can be challenging. 3D ...

Quantification of Strain in a Porcine Model of Skin Expansion Using Multi-View Stereo and Isogeometric Kinematics

La cuantificación de la cepa en un modelo porcino de expansión de la piel Uso de Multi-View estéreo y Isogeometric Cinemática

Tissue expansion is a popular technique in plastic and reconstructive surgery that grows skin in vivo for correction of large defects such as burns and ...

Imaging the Root Hair Morphology of Arabidopsis Seedlings in a Two-layer Microfluidic Platform

Imaging the Root Hair Morphology of Arabidopsis Seedlings in a Two-layer Microfluidic Platform

La morfología del pelo de la raíz de plántulas de Arabidopsis en una plataforma de microfluídica de dos capas de imagen

Root hairs increase root surface area for better water uptake and nutrient absorption by the plant. Because they are small in size and often obscured by ...

Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) Assays

Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate LAL Assays

Detección de endotoxinas en las formulaciones Nano mediante ensayos de Limulus Amoebocyte Lysate (LAL)

When present in pharmaceutical products, a Gram-negative bacterial cell wall component endotoxin (often also called lipopolysaccharide) can cause ...

Assembly and Characterization of Biomolecular Memristors Consisting of Ion Channel-doped Lipid Membranes

Montaje y caracterización de memristores Biomolecular consisten en membranas lipídicas dopado canal iónico

The ability to recreate synaptic functionalities in synthetic circuit elements is essential for neuromorphic computing systems that seek to emulate the ...

Biaxial Mechanical Characterizations of Atrioventricular Heart Valves

Biaxiales caracterizaciones mecánicas de válvulas auriculoventricular del corazón

Extensive biaxial mechanical testing of the atrioventricular heart valve leaflets can be utilized to derive&#160;optimal parameters used in constitutive ...