Name: layer microdissection of tricuspid valve leaflets for biaxial mechanical characterization and microstructural quantification
Uploaded: 2022-02-10T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Layer Microdissection of Tricuspid Valve Leaflets for Biaxial Mechanical Characterization and Microstructural Quantification at JoVE.com

Detta arbete stöddes av American Heart Association Scientist Development Grant (16SDG27760143) och Presbyterian Health Foundation. KMC stöddes delvis av University of Oklahoma (OU) Undergraduate Research Opportunity Program och Honors Research Apprenticeship Program. DWL stöddes delvis av National Science Foundation Graduate Research Fellowship (GRF 2019254233) och American Heart Association/Children's Heart Foundation Predoctoral Fellowship (Award #821298). Allt detta stöd erkänns tacksamt.

Alla metoder som beskrivs häri godkändes av Institutional Animal Care and Use Committee vid University of Oklahoma. Djurvävnader förvärvades från ett USDA-godkänt slakteri.
1. Biaxial mekanisk karakterisering
<ol><li>Vävnadsberedning<ol>
<li>Hämta en TV-broschyr från frysen, rakblad, en kirurgisk penna, pincett, en pipett med avjoniserat (DI) vatten och en skärmatta. Tina TV-broschyren med 2-3 droppar rumstemperatur DI-vatten. OBS: DI-vatten används istället ...

<ol>
	<li>Vesely, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+elastin+in+aortic+valve+mechanics.">The role of elastin in aortic valve mechanics.</a> Journal of Biomechanics. 31 (2), 115-123 (1998).</li><li>Zhang, W., Ayoub, S., Liao, J., Sacks, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+meso-scale+layer-specific+structural+constitutive+model+of+the+mitral+heart+valve+leaflets.">A meso-scale layer-specific structural constitutive model of the mitral heart valve leaflets.</a> Acta Biomaterialia. 32, 238-255 (2016).</li><li>Stella, J. A., Sacks, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+biaxial+mechanical+properties+of+the+layers+of+the+aortic+valve+leaflet.">On the biaxial mechanical properties of the layers of the aortic valve leaflet.</a> Journal of Biomechanical Engineering. 129 (5), 757-766 (2007).</li><li>Khoiy, K. A., Amini, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+biaxial+mechanical+response+of+porcine+tricuspid+valve+leaflets.">On the biaxial mechanical response of porcine tricuspid valve leaflets.</a> Journal of Biomechanical Engineering. 138 (10), 104504 (2016).</li><li>Jett, S. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+investigation+of+the+anisotropic+mechanical+properties+and+anatomical+structure+of+porcine+atrioventricular+heart+valves.">An investigation of the anisotropic mechanical properties and anatomical structure of porcine atrioventricular heart valves.</a> Journal of the Mechanical Behavior of Biomedical Materials. 87, 155-171 (2018).</li><li>Meador, W. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+detailed+mechanical+and+microstructural+analysis+of+ovine+tricuspid+valve+leaflets.">A detailed mechanical and microstructural analysis of ovine tricuspid valve leaflets.</a> Acta Biomaterialia. 102, 100-113 (2020).</li><li>Hudson, L. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+pilot+study+on+linking+tissue+mechanics+with+load-dependent+collagen+microstructures+in+porcine+tricuspid+valve+leaflets.">A pilot study on linking tissue mechanics with load-dependent collagen microstructures in porcine tricuspid valve leaflets.</a> Bioengineering. 7 (2), 60 (2020).</li><li>Pant, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pressure-induced+microstructural+changes+in+porcine+tricuspid+valve+leaflets.">Pressure-induced microstructural changes in porcine tricuspid valve leaflets.</a> Acta Biomaterialia. 67, 248-258 (2018).</li><li>Kramer, K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+investigation+of+layer-specific+tissue+biomechanics+of+porcine+atrioventricular+heart+valve+leaflets.">An investigation of layer-specific tissue biomechanics of porcine atrioventricular heart valve leaflets.</a> Acta Biomaterialia. 96, 368-384 (2019).</li><li>Ross, C. J., Laurence, D. W., Wu, Y., Lee, C. -. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biaxial+mechanical+characterizations+of+atrioventricular+heart+valves.">Biaxial mechanical characterizations of atrioventricular heart valves.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (146), e59170 (2019).</li><li>Goth, W., Lesicko, J., Sacks, M. S., Tunnell, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical-based+analysis+of+soft+tissue+structures.">Optical-based analysis of soft tissue structures.</a> Annual Review of Biomedical Engineering. 18, 357-385 (2016).</li><li>Jett, S. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integration+of+polarized+spatial+frequency+domain+imaging+(pSFDI)+with+a+biaxial+mechanical+testing+system+for+quantification+of+load-dependent+collagen+architecture+in+soft+collagenous+tissues.">Integration of polarized spatial frequency domain imaging (pSFDI) with a biaxial mechanical testing system for quantification of load-dependent collagen architecture in soft collagenous tissues.</a> Acta Biomaterialia. 102, 149-168 (2020).</li><li>Reddy, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> An Introduction to Continuum Mechanics. , (2013).</li><li>Duginski, G. A., Ross, C. J., Laurence, D. W., Johns, C. H., Lee, C. -. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+investigation+of+the+effect+of+freezing+storage+on+the+biaxial+mechanical+properties+of+excised+porcine+tricuspid+valve+anterior+leaflets.">An investigation of the effect of freezing storage on the biaxial mechanical properties of excised porcine tricuspid valve anterior leaflets.</a> Journal of the Mechanical Behavior of Biomedical Materials. 101, 103438 (2020).</li><li>Salinas, S. D., Clark, M. M., Amini, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+response+changes+in+porcine+tricuspid+valve+anterior+leaflet+under+osmotic-induced+swelling.">Mechanical response changes in porcine tricuspid valve anterior leaflet under osmotic-induced swelling.</a> Bioengineering. 6 (3), 70 (2019).</li><li>Pokutta-Paskaleva, A., Sulejmani, F., DelRocini, M., Sun, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+mechanical,+morphological,+and+microstructural+characterization+of+porcine+mitral+and+tricuspid+leaflets+and+chordae+tendineae.">Comparative mechanical, morphological, and microstructural characterization of porcine mitral and tricuspid leaflets and chordae tendineae.</a> Acta Biomaterialia. 85, 241-252 (2019).</li><li>Ross, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+investigation+of+the+glycosaminoglycan+contribution+to+biaxial+mechanical+behaviors+of+porcine+atrioventricular+heart+valve+leaflets.">An investigation of the glycosaminoglycan contribution to biaxial mechanical behaviors of porcine atrioventricular heart valve leaflets.</a> Journal of the Royal Society Interface. 16 (156), 0069 (2019).</li><li>Sommer, G., Regitnig, P., Ko&#776;ltringer, L., Holzapfel, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biaxial+mechanical+properties+of+intact+and+layer-dissected+human+carotid+arteries+at+physiological+and+supraphysiological+loadings.">Biaxial mechanical properties of intact and layer-dissected human carotid arteries at physiological and supraphysiological loadings.</a> American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 298 (3), 898-912 (2009).</li><li>Holzapfel, G. A., Sommer, G., Gasser, C., Regitnig, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+the+layer-specific+mechanical+properties+ofhuman+coronary+arteries+with+intimal+thickening,+and+related+constitutive+modelling.">Determination of the layer-specific mechanical properties ofhuman coronary arteries with intimal thickening, and related constitutive modelling.</a> American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 289 (5), 2048-2058 (2005).</li><li>Sommer, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiaxial+mechanical+response+and+constitutive+modeling+of+esophageal+tissues:+Impact+on+esophageal+tissue+engineering.">Multiaxial mechanical response and constitutive modeling of esophageal tissues: Impact on esophageal tissue engineering.</a> Acta Biomaterialia. 9 (12), 9379-9391 (2013).</li></ol>

Kritiska steg för protokollet inkluderar: (i) skiktmikrodissektion, (ii) vävnadsmontering, (iii) fiducialmarkörplacering och (iv) pSFDI-installationen. Lämplig skiktmikrodissektion är den viktigaste och svåraste aspekten av metoden som beskrivs häri. Innan en utredning inleds med hjälp av denna teknik bör dissekatorn/dissektorerna ha långvarig praxis med mikrodissektionstekniken och alla tre TV-broschyrerna. Dissekatorn bör säkerställa att de sammansatta skiktproverna är tillräckligt stora (>3,3 mm) och ha...

TV: n ligger mellan höger atrium och höger kammare i hjärtat. Under hela hjärtcykeln reglerar TV: n det enkelriktade blodflödet via cyklisk öppning och stängning av TV: ns främre bipacksedel (TVAL), TV: ns bakre broschyr (TVPL) och TV-septalbroschyren (TVSL). Dessa broschyrer är komplexa och har fyra distinkta anatomiska lager - atrialis (A), spongiosa (S), fibrosa (F) och ventricularis (V) - med unika mikrostrukturella beståndsdelar. Elastinfibrerna i atrialis och ventricularis hjälper till att återställa vävnaden till sin odeformerade geometri efter mekanisk belastning1. Däremot innehåller fibrosa ett tätt nätverk av undulaterade kollagenfibrer som bidrar till bipacksedelns bärförmåga2. Spongiosa består huvudsakligen av glykosaminoglykaner och har antagits möjliggöra skjuvning mellan bipacksedelskikt under hjärtklafffunktion3. Medan alla tre broschyrtyperna har samma anatomiska lager, finns det variationer i skiktens tjocklekar och beståndsdelar som har konsekvenser för broschyrspecifika mekaniska beteenden.
Forskare har undersökt egenskaperna hos TV-broschyrerna med hjälp av plana mekaniska karakteriseringar, histomorfologiska bedömningar och optiska karakteriseringar av kollagenfiberarkitekturen. Till exempel försöker plana biaxiella mekaniska karakteriseringar att emulera fysiologisk belastning genom att applicera vinkelräta förskjutningar på vävnaden och registrera de associerade krafterna. De resulterande kraftförskjutningsobservationerna (eller spänningssträckningsobservationerna) har avslöjat att alla tre TV-broschyrer uppvisar olinjära, riktningsspecifika mekaniska beteenden med mer uppenbara broschyrspecifika svar i radiell vävnadsriktning 4,5,6. Dessa broschyrspecifika beteenden tros härröra från skillnader i de mikrostrukturella egenskaper som observerats med hjälp av standard histologiska tekniker 6,7. Vidare syftar andra harmoniska generationens avbildning6, ljusspridning med liten vinkel8 och polariserad rumslig frekvensdomänavbildning7 (pSFDI) till att förstå dessa mikrostrukturella egenskaper och har visat broschyrspecifika skillnader i kollagenfiberorientering och fiberkrump som har konsekvenser för de observerade mekaniska beteendena på vävnadsnivå. Dessa studier har avsevärt förbättrat vår förståelse av vävnadsmikrostrukturen och dess roll i vävnadsnivåbeteenden. Mycket återstår dock att ta itu med när det gäller att experimentellt koppla samman vävnadsmekaniken och den underliggande mikrostrukturen.
Nyligen utförde detta laboratorium mekaniska karakteriseringar av TV-broschyrskikten separerade i två sammansatta lager (A / S och F / V) med hjälp av en mikrodissektionsteknik9. Det tidigare arbetet belyste skillnader i skiktens mekaniska egenskaper och bidrog till att ge insikt i hur den skiktade mikrostrukturen bidrar till vävnadens mekaniska beteenden. Även om denna undersökning förbättrade vår förståelse av TV-broschyrens mikrostruktur, hade tekniken flera begränsningar. För det första jämfördes inte egenskaperna hos de sammansatta skikten direkt med den intakta vävnaden, vilket ledde till brist på fullständig förståelse för förhållandet mellan mekanik och mikrostruktur. För det andra undersöktes inte kollagenfiberarkitekturen hos de sammansatta skikten. För det tredje undersöktes endast skikten i TVAL på grund av svårigheter med att samla in de sammansatta skikten från de andra två TV-broschyrerna. Metoden som beskrivs häri ger en holistisk karakteriseringsram som övervinner dessa begränsningar och ger fullständiga karakteriseringar av TV-broschyrerna och deras sammansatta lager.
Detta dokument beskriver mikrodissektionstekniken som separerar de tre TV-broschyrerna i deras sammansatta lager (A / S och F / V) för biaxiella mekaniska och mikrostrukturella karakteriseringar 10,11,12. Detta iterativa protokoll inkluderar (i) biaxiell mekanisk testning och pSFDI-karakterisering av den intakta broschyren, (ii) en ny och reproducerbar mikrodissektionsteknik för att på ett tillförlitligt sätt erhålla de sammansatta TV-skikten, och (iii) biaxiell mekanisk testning och pSFDI-karakterisering av de sammansatta TV-skikten. Vävnaden utsattes för biaxiell dragbelastning med olika kraftförhållanden för mekanisk testning. Sedan användes pSFDI för att bestämma kollagenfiberorienteringen och inriktningen vid olika laddade konfigurationer. pSFDI bevarar den inhemska kollagenfiberarkitekturen, möjliggör belastningsberoende analys och kringgår det typiska behovet av att fixa eller rensa vävnad för kollagenfiberarkitekturanalys, såsom vid andra harmoniska generationens avbildning eller ljusspridning med liten vinkel. Slutligen framställdes vävnaderna med hjälp av standard histologitekniker för att visualisera vävnadsmikrostrukturen. Denna iterativa och holistiska ram möjliggör direkt jämförelse av TV-broschyrens mekaniska och mikrostrukturella egenskaper med dess sammansatta lager.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10% Formalin Solution, Neutral Buffered</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>HT501128-4L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alconox Detergent</td>
			<td>Alconox</td>
			<td></td>
			<td>cleaning compound</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioTester - Biaxial Tester</td>
			<td>CellScale Biomaterials Testing</td>
			<td></td>
			<td>1.5 N Load Cell Capacity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cutting Mat</td>
			<td>Dahle</td>
			<td>B0027RS8DU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deionized Water</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine-Tipped Tool</td>
			<td>HTI INSTRUMENTS</td>
			<td>NSPLS-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps - Curved</td>
			<td>Scientific Labwares</td>
			<td>16122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps - Thick</td>
			<td>Scientific Labwares</td>
			<td>161001078</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps - Thin</td>
			<td>Scientific Labwares</td>
			<td>16127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LabJoy</td>
			<td>CellScale Biomaterials Testing</td>
			<td>Version 10.66</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser Displacement Sensor</td>
			<td>Keyence</td>
			<td>IL-030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid Cyanoacrylate Glue</td>
			<td>Loctite</td>
			<td>2436365</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MATLAB</td>
			<td>MathWorks</td>
			<td>Version 2020a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Scissors</td>
			<td>HTI Instruments</td>
			<td>CAS55C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette</td>
			<td>Belmaks</td>
			<td>360758081051Y4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polarized Spatial Frequency Domain Imaging Device</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
			<td>Made in-house using a digital light projector, linear polarizer, rotating polarizer mount, and charge-coupled device camera. 
			See doi.org/10.1016/j.actbio.2019.11.028 (PMCID: PMC8101699) for more details.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel</td>
			<td>THINKPRICE</td>
			<td>TP-SCALPEL-3010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single Edge Industrial Razor Blades (Surgical Carbon Steel)</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>H3515541105024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Pen</td>
			<td>LabAider</td>
			<td>LAB-Skin-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T-Pins</td>
			<td>Business Source</td>
			<td>BSN32351</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wax Board</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
			<td>Made in-house using modeling wax and baking tray</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Weigh Boat</td>
			<td>Pure Ponta</td>
			<td>mdo-azoc-1030</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

layer microdissection of tricuspid valve leaflets for biaxial mechanical characterization and microstructural quantification

Tricuspidventilen (TV) reglerar det enkelriktade flödet av ooxygenerat blod från höger atrium till höger kammare. TV: n består av tre broschyrer, var och en med unika mekaniska beteenden. Dessa variationer mellan de tre TV-broschyrerna kan förstås ytterligare genom att undersöka deras fyra anatomiska lager, som är atrialis (A), spongiosa (S), fibrosa (F) och ventricularis (V). Även om dessa lager finns i alla tre TV-broschyrerna, finns det skillnader i deras tjocklekar och mikrostrukturella beståndsdelar som ytterligare påverkar deras respektive mekaniska beteenden. 
Detta protokoll innehåller fyra steg för att belysa de lagerspecifika skillnaderna: (i) karakterisera de mekaniska och kollagenfiberarkitekturella beteendena hos den intakta TV-broschyren, (ii) separera de sammansatta skikten (A / S och F / V) i TV-broschyren, (iii) utföra samma karakteriseringar för de sammansatta skikten och (iv) utföra post-hoc histologi bedömning. Denna experimentella ram möjliggör unikt en direkt jämförelse av den intakta TV-vävnaden med vart och ett av dess sammansatta lager. Som ett resultat kan detaljerad information om tv-broschyrernas mikrostruktur och biomekaniska funktion samlas in med detta protokoll. Sådan information kan potentiellt användas för att utveckla TV-beräkningsmodeller som försöker ge vägledning för klinisk behandling av TV-sjukdom.

Mikrodissektion kommer att ge A / S- och F / V-prover med relativt enhetliga tjocklekar som kan monteras på en (kommersiell) biaxial testanordning. Histologianalys av den intakta bipacksedeln och de två dissekerade skikten kommer att verifiera om vävnaden separerades korrekt längs gränsen mellan spongiosa och fibrosa (figur 7). Dessutom kan histologimikrograferna användas för att bestämma vävnadsskiktets tjocklekar och ingående massfraktioner med hjälp av ImageJ-programvaran. En m...

Watch this Scientific Journal Video about Layer Microdissection of Tricuspid Valve Leaflets for Biaxial Mechanical Characterization and Microstructural Quantification at JoVE.com

Layer Microdissection of Tricuspid Valve Leaflets for Biaxial Mechanical Characterization and Microstructural Quantification

Detta protokoll beskriver den biaxiella mekaniska karakteriseringen, polariserad rumslig frekvensdomänavbildningsbaserad kollagenkvantifiering och mikrodissektion av tricuspidventilblad. Den tillhandahållna metoden belyser hur bipacksedellagren bidrar till de holistiska bipacksedelsbeteendena.

Layer Microdissection av Tricuspid Valve Broschyrer för biaxial mekanisk karakterisering och mikrostrukturell kvantifiering

The tricuspid valve (TV) regulates the unidirectional flow of unoxygenated blood from the right atrium to the right ventricle. The TV consists of three ...

Denna metod kan isolera vävnadsskiktens bidrag till det övergripande vävnadsbeteendet, vilket ger ny inblick i vävnadsmikrostrukturen. Vårt mikrodissektions- och testramverk gör det möjligt för oss att direkt jämföra de mekaniska och mikrostrukturella egenskaperna hos hjärtklaffblad med sina egna kompositskikt. Mikrodissektionen kan vara svår att behärska, därför rekommenderas det starkt att öva så mycket som möjligt innan du startar din studie.Samla först de nödvändiga materialen, vaxbräda, DI-vatten, pipett, skalpell, mikrosax, tunna pincett, böjda pincett, tjocka pincett och stift. Demontera vävnaden från den biaxiella testaren och mät dess tjocklek med hjälp av laserförskjutningssensorn. Placera vävnaden på vaxbrädan.Undersök ventricularis-sidan av vävnaden för stora chorda-infogningar. Ta ett fotografi som referens. Sprid vävnaden platt på vaxbrädan med atrialis uppåt.För att fästa vävnaden på brädet, placera en stift vinklad bort från vävnaden i varje hörn så att den något drar vävnaden spänd. Se till att stiften är utanför hålen som skapas av pinnarna vid montering av vävnaden och vävnaden är kvadratisk och inte förskjuts under skiktmikrodissektion. Placera vid behov stift längs vävnadens sida under dissektionen för att sträcka vävnaden mer.Ta bort glaspärlans fiduciella markörer. Placera DI-vatten på vävnadens yta med en pipett så att den helt täcker vävnaden på ett bubbelliknande sätt. För att göra det första hörnet, välj ett hörn av det fästa provet och undvik stora chorda-infogningar i bräckliga områden.Skär sedan A / S-skiktet genom att lätt dra skalpellen över vävnadsytan längs monteringshålen för mekanisk testning. Snittets kanter börjar dra isär och avslöjar F / V-lagret under. Med trubbiga, tunna pincett, gnugga ordentligt längs snittet för att ytterligare separera kanterna.Om snittet i A/S-lagret inte börjar dra isär, spåra lätt över samma snitt igen med en skalpell. Gör ett andra snitt vinkelrätt mot det första snittet. Om de två snitten inte är anslutna, kör den tunna pincetten under det lilla vävnadsområdet som skiljer de två snitten.Använd sedan saxen försiktigt för att klippa vävnaden. Gnid längs hörnens snitt med en tunn pincett tills vävnaden skiljer sig från F / V-skiktet. Så snart en liten bit vävnad är separerad, ta tag i den med den stora pincetten och dra den försiktigt för att separera kompositskikten ytterligare.Fortsätt att skala vävnaden medan du tar tag i den med större pincett för att förhindra oönskad rippning och rivning av A / S-kompositskiktet och gnugga sömmen tills den når slutet av de två snitten som gjorts för hörnet. Om det första hörnet har stora problem med separation kan du prova ett annat hörn som utgångspunkt. Sedan, för att göra ett andra hörn, förläng de två snitten som gjorts för det första hörnet genom att placera skalpellspetsen längst ner på varje snitt och dra den lätt längs vävnadsytan så att de skurna förlängningarna ansluter till de ursprungliga snitten och fortsätter att följa tine- eller suturhålen.Fortsätt att förlänga snitten och skala tillbaka det övre sammansatta A / S-lagret medan du gnuggar sömmen tills ena sidan är klar. Observera att vävnaden kommer att separeras helt längs ett snitt. Skapa sedan ett andra hörn vinkelrätt mot slutet av den helt skalade sidan.Förläng de återstående snitten samtidigt som du undviker stora chordainsättningar. Uteslut chordainsättningarna från A/S-separationsområdet endast när detta undantag tillåter ett A/S-prov som är tillräckligt stort för experimentella karakteriseringar. Fortsätt att separera A/S- och F/V-lagren med hjälp av gnidnings- och dragteknikerna som används för det första hörnet.Sluta separera vävnaden omedelbart om en tår eller ett hål bildas. För att förhindra att pincett fångas, placera saxen i alla hål som bildas och skär vävnaden bort från mitten. Om defekten bildas längs separationssömmen, börja sedan separera vävnaden längs en annan kant.Leta efter mellanskiktsanslutningar som kan uppstå vid separering av vävnaden och förhindra ytterligare vävnadsseparation. Observera att dessa är tunna men starka strängar som måste skäras noggrant med sax. Undvik att skapa ett hål i A/S-lagret eller skära nedåt i F/V-lagret.Fortsätt denna process tills det största möjliga provet av A/S-lagret har separerats. Markera provets orientering med hjälp av kirurgisk penna. Slutligen skär längs separationssömmen för den återstående vävnadskanten med saxen.Placera det separerade A/S-kompositskiktet plant på skärmattan. Använd vid behov skalpellen för att räta ut kanterna på vävnaden och skapa en fyrkantig vävnadsform som är lämplig för biaxiell mekanisk testning. Placera A/S-skiktet i DI-vatten tills det är klart att testas.Markera orienteringen för F/V-lagret som finns kvar på vaxbrädet. Klipp ut den största möjliga fyrkanten ur området där A/S-lagret togs bort. Placera den sedan i DI-vatten.Histologisk analys av den intakta bipacksedeln och de två dissekerade skikten verifierade om vävnaden var korrekt separerad längs gränsen mellan spongiosa och fibrosa. Histologimikrograferna användes för att bestämma vävnadsskiktets tjocklek och ingående massfraktioner med hjälp av ImageJ-programvaran. Den förskjutningsstyrda mekaniska testningen och efterbehandlingen producerade membranspänning kontra sträckdata för tricuspidventilens främre bipacksedel, tricuspidventil bakre broschyr och tricuspidventil septal broschyr, som beskriver vävnadens olinjära mekaniska beteende.De polariserade rumsliga frekvensdomänavbildningsdata gav färgkartor över kollagenfiberorienteringen och graden av optisk anisotropi. Specifikt gav dessa färgkartor en omfattande förståelse för kollagenfiberarkitekturen över hela vävnadsprovet. Det är viktigt att notera att kompositskiktet krymper när de har separerats från den fästa vävnaden.Samla in största möjliga prov för att säkerställa att det finns tillräckligt med vävnad för den efterföljande testningen.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Synthetic, Multi-Layer, Self-Oscillating Vocal Fold Model Fabrication

Syntetisk, Multi-Layer, Self-Oscillerande Vocal Fold Modell Fabrication

Sound for the human voice is produced via flow-induced vocal fold vibration. The vocal folds consist of several layers of tissue, each with differing ...

On-chip Isotachophoresis for Separation of Ions and Purification of Nucleic Acids

On-chip isotakofores för separation av joner och rening av nukleinsyror

Electrokinetic techniques are a staple of microscale applications because of their unique ability to perform a variety of fluidic and electrophoretic ...

Design of a Biaxial Mechanical Loading Bioreactor for Tissue Engineering

Design av en Biaxial mekanisk belastning Bioreaktor för Tissue Engineering

We  designed a loading device that is capable of applying uniaxial or biaxial  mechanical strain to a tissue engineered biocomposites fabricated for  ...

Fabrication and Characterization of a Conformal Skin-like Electronic System for Quantitative, Cutaneous Wound Management

Tillverkning och karakterisering av en Konform Skin liknande elektroniska systemet för kvantitativ hud- Sårbehandling

Recent advances in the development of electronic technologies and biomedical devices offer opportunities for non-invasive, quantitative assessment of ...

Layer-by-layer Collagen Deposition in Microfluidic Devices for Microtissue Stabilization

Skikt för skikt kollagendeponering i mikroflödessystem enheter för Microtissue Stabilization

Although microfluidics provides exquisite control of the cellular microenvironment, culturing cells within microfluidic devices can be challenging. 3D ...

Quantification of Strain in a Porcine Model of Skin Expansion Using Multi-View Stereo and Isogeometric Kinematics

Kvantifiering av spänningar i en grismodell av Skin Expansion Använda Multi-View Stereo och Isogeometric kinematik

Tissue expansion is a popular technique in plastic and reconstructive surgery that grows skin in vivo for correction of large defects such as burns and ...

Imaging the Root Hair Morphology of Arabidopsis Seedlings in a Two-layer Microfluidic Platform

Imaging the Root Hair Morphology of Arabidopsis Seedlings in a Two-layer Microfluidic Platform

Imaging rotahåret morfologi av Arabidopsis plantor i en två-lagers mikroflödessystem plattform

Root hairs increase root surface area for better water uptake and nutrient absorption by the plant. Because they are small in size and often obscured by ...

Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) Assays

Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate LAL Assays

Påvisande av Endotoxin i Nano-formuleringar använder Limulus immobiliserat Lysate (LAL) analyser

When present in pharmaceutical products, a Gram-negative bacterial cell wall component endotoxin (often also called lipopolysaccharide) can cause ...

Assembly and Characterization of Biomolecular Memristors Consisting of Ion Channel-doped Lipid Membranes

Montering och karakterisering av biomolekylär Memristors bestående av jonkanal-dopade Lipid membran

The ability to recreate synaptic functionalities in synthetic circuit elements is essential for neuromorphic computing systems that seek to emulate the ...

Biaxial Mechanical Characterizations of Atrioventricular Heart Valves

Biaxial mekaniska karakteriseringar av atrioventrikulärt hjärtklaffar

Extensive biaxial mechanical testing of the atrioventricular heart valve leaflets can be utilized to derive&#160;optimal parameters used in constitutive ...