Name: amplification of escherichia coli in a continuous-flow-pcr microfluidic chip and its detection with a capillary electrophoresis system
Uploaded: 2023-11-21T12:00:00
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这项工作得到了中国上海市科学技术委员会的支持（No.19ZR1477500和No.18441900400）。我们衷心感谢上海理工大学（No.2017KJFZ049）的资助。

注：有关本协议中使用的所有材料、试剂和设备的详细信息，请参阅 材料表 。
1. CF-PCR微流控芯片的制备
<ol><li>将硅片在200°C下加热25分钟以除去水分。</li>
	<li>每英寸晶圆分配 1 mL SU-8-2075 光刻胶。使用旋涂机以 500 rpm 的速度在硅片上旋转 5-10 秒，加速度为 100 rpm/s，然后以 2,000 rpm 的速度旋转 30 秒，加速度为 500 rpm/s。</li>
	<li>将硅片在65°C下软烘烤3...

<ol>
	<li>Li, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=All-in-one+microfluidic+device+for+on-site+diagnosis+of+pathogens+based+on+an+integrated+continuous+flow+PCR+and+electrophoresis+biochip.">All-in-one microfluidic device for on-site diagnosis of pathogens based on an integrated continuous flow PCR and electrophoresis biochip.</a> Lab on a Chip. 19 (16), 2663-2668 (2019).</li><li>Crews, N., Wittwer, C., Gale, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Continuous-flow+thermal+gradient+PCR.">Continuous-flow thermal gradient PCR.</a> Biomedical Microdevices. 10 (2), 187-195 (2008).</li><li>Li, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+and+fabrication+of+portable+continuous+flow+PCR+microfluidic+chip+for+DNA+replication.">Design and fabrication of portable continuous flow PCR microfluidic chip for DNA replication.</a> Biomedical Microdevices. 22 (1), 5 (2019).</li><li>Kim, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fabrication+and+characterization+of+a+PDMS-glass+hybrid+continuous-flow+PCR+chip.">Fabrication and characterization of a PDMS-glass hybrid continuous-flow PCR chip.</a> Biochemical Engineering Journal. 29 (1-2), 91-97 (2006).</li><li>Shen, K., Chen, X., Guo, M., Cheng, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+microchip-based+PCR+device+using+flexible+printed+circuit+technology.">A microchip-based PCR device using flexible printed circuit technology.</a> Sensors and Actuators B: Chemical. 105 (2), 251-258 (2005).</li><li>Harstad, R. K., Johnson, A. C., Weisenberger, M. M., Bowser, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capillary+Electrophoresis.">Capillary Electrophoresis.</a> Analytical Chemistry. 88 (1), 299-319 (2016).</li><li>Redman, E. A., Mellors, J. S., Starkey, J. A., Ramsey, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+intact+antibody+drug+conjugate+variants+using+microfluidic+capillary+electrophoresis-mass+spectrometry.">Characterization of intact antibody drug conjugate variants using microfluidic capillary electrophoresis-mass spectrometry.</a> Analytical Chemistry. 88 (4), 2220-2226 (2016).</li><li>Britz-Mckibbin, P., Kranack, A. R., Paprica, A., Chen, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+assay+for+epinephrine+in+dental+anesthetic+solutions+by+capillary+electrophoresis.">Quantitative assay for epinephrine in dental anesthetic solutions by capillary electrophoresis.</a> Analyst. 123 (7), 1461-1463 (1998).</li><li>Maeda, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+real-time+PCR+using+TaqMan+and+SYBR+Green+for+Actinobacillus+actinomycetemcomitans,+Porphyromonas+gingivalis,+Prevotella+intermedia,+tetQgene+and+total+bacteria.">Quantitative real-time PCR using TaqMan and SYBR Green for Actinobacillus actinomycetemcomitans, Porphyromonas gingivalis, Prevotella intermedia, tetQgene and total bacteria.</a> FEMS Immunology and Medical Microbiology. 39 (1), 81-86 (2003).</li><li>Hajba, L., Guttman, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+column+coatings+for+capillary+electrophoresis+of+proteins.">Recent advances in column coatings for capillary electrophoresis of proteins.</a> TrAC Trends in Analytical Chemistry. 90, 38-44 (2017).</li><li>Kleparnik, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+combination+of+capillary+electrophoresis+with+mass+spectrometry:+methodology+and+theory.">Recent advances in combination of capillary electrophoresis with mass spectrometry: methodology and theory.</a> Electrophoresis. 36 (1), 159-178 (2015).</li></ol>

PCR 和 CE 都是核酸分析中两种流行的生物技术。本文介绍了使用CF-PCR和CE系统进行 大肠杆 菌扩增和PCR产物检测，两者均由内部构建。由于大肠杆菌的传热速率高，在10 min内成功扩增了 大肠杆 菌的靶基因。小于 1,500 bp 的 DNA 片段在 8 分钟内分离（图 5）。这两种技术的最大优点是，与传统的PCR和平板凝胶电泳方法相比，它可以大大节省时间。研究人员应该记住，...

聚合酶链反应（PCR）是一种分子生物学技术，用于扩增特定的DNA片段，从而扩增痕量的DNA，数亿次。已广泛应用于临床诊断、医学研究、食品安全、法医鉴定等领域。PCR过程主要包括三个步骤：90-95°C变性，50-60°C退火，72-77°C延伸。 热循环是PCR过程的重要组成部分;然而，传统的PCR热循环仪不仅体积庞大，而且效率低下，大约需要40分钟才能完成25个循环。为了克服这些局限性，在内部建立了一个基于微流控芯片的连续流PCR（CF-PCR）系统。CF-PCR通过将PCR溶液驱动到放置在不同温度下的加热器上的微通道中，可以大大节省时间1,2,3,4,5。
由于毛细管电泳（CE）具有高分辨率、高速和优异的重现性6,7,8,9,10,11等诸多优点，因此已成为实验室中用于分析核酸和蛋白质的常用工具。然而，由于CE仪器价格高昂，大多数实验室，尤其是发展中国家的实验室，负担不起这项技术。在此，我们概述了如何制造CF-PCR微流控芯片以及如何在实验室中构建多功能CE系统的协议。我们还演示了该CF-PCR系统扩增大肠杆菌的过程以及CE系统对PCR产物的检测。通过遵循本协议中描述的程序，用户应该能够制造微流控芯片，制备PCR溶液，构建用于核酸扩增的CF-PCR系统，并建立简单的CE系统，即使资源有限，也可以分离DNA片段。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>100 bp DNA ladder</td>
			<td>Takara Bio Inc.</td>
			<td>3422A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x Fast Buffer I</td>
			<td>Takara Bio Inc.</td>
			<td>RR070A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x TBE</td>
			<td>Beijing Solarbio Science &#38; Technology Co., Ltd.</td>
			<td>T1051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>developer solution</td>
			<td>Alfa Aesar, USA</td>
			<td>L15459</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTP mixture (2.5 &#956;M)</td>
			<td>Takara Bio Inc.</td>
			<td>RR070A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EC-F</td>
			<td>Sangon Biotech, Shanghai, China</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EC-R</td>
			<td>Sangon Biotech, Shanghai, China</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEC,1300K</td>
			<td>Sigma-Aldrich, USA</td>
			<td>9004-62-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>isopropanol</td>
			<td>Aladdin, Shanghai, China</td>
			<td>67-63-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microscope</td>
			<td>Olympus, Japan</td>
			<td>BX51</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>photolithography&#160;</td>
			<td>SUSS MicroTec, Germany</td>
			<td>MJB4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>photomultiplier tube&#160;</td>
			<td>Hamamatsu Photonics, Japan</td>
			<td>R928</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>photoresist</td>
			<td>MicroChem, USA</td>
			<td>SU-8 2075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PID temperature controllers&#160;</td>
			<td>Shanghai, China</td>
			<td>XH-W2023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>plasma cleaner&#160;</td>
			<td>Harrick Plasma</td>
			<td>PDC-32G-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>polyvinyl pyrrolidone (PVP)</td>
			<td>Aladdin, Shanghai, China</td>
			<td>P110608</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pump</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>PHD2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>silicone tubing&#160;</td>
			<td>BIO-RAD,USA</td>
			<td>7318210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>solid-state relays</td>
			<td>KZLTD, China</td>
			<td>KS1-25LA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SpeedSTAR HS DNA Polymerase&#160;</td>
			<td>Takara Bio Inc.</td>
			<td>RR070A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>steel needle</td>
			<td>zhongxinqiheng,Suzhou,China</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYBR GREEN <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/63523/63523eq01.jpg" style="margin: auto;" /></td>
			<td>Solarbio, Beijing, China</td>
			<td>SY1020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>temperature sensors</td>
			<td>EasyShining Technology, Chengdu, China</td>
			<td>TCM-M207</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Template (E. coli)</td>
			<td>Takara Bio Inc.</td>
			<td>AK601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Aladdin, Shanghai, China</td>
			<td>T104863</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>voltage power supply&#160;</td>
			<td>Medina, NY, USA</td>
			<td>TREK MODEL 610E</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

amplification of escherichia coli in a continuous-flow-pcr microfluidic chip and its detection with a capillary electrophoresis system

聚合酶链反应（PCR）是一种用于扩增靶基因的传统方法，在生物分子诊断中发挥着重要作用。然而，传统的PCR由于温度变化效率低，非常耗时。该工作提出了一种基于微流控芯片的连续流PCR（CF-PCR）系统。通过将PCR溶液运行到放置在不同温度的加热器上的微通道中，可以大大缩短扩增时间。此外，由于毛细管电泳（CE）是区分阳性和假阳性PCR产物的理想方法，因此构建了CE系统以实现DNA片段的高效分离。本文介绍了通过内部构建的CF-PCR系统扩增大 肠杆菌 （大肠杆菌）的过程以及CE对PCR产物的检测。结果表明， 大肠杆菌 的靶基因在10 min内成功扩增，表明这两个系统可用于核酸的快速扩增和检测。

图5显示了PCR产物和DNA标记物的电泳图。痕量（图5A）是CF-PCR扩增产物的CE结果，痕量（图5B）是通过热循环扩增产物的CE结果，痕量（图5C）是100 bp DNA分子量标准的CE结果。我们首先在CF-PCR系统中扩增了大肠杆菌的靶基因;PCR溶液从芯片入口到出口需要~10分钟30秒。大肠杆菌靶标扩增子大小为544 bp?...

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Amplification of Escherichia coli in a Continuous-Flow-PCR Microfluidic Chip and Its Detection with a Capillary Electrophoresis System

该协议描述了如何构建基于微流控芯片的连续流聚合酶链系统以及如何在实验室中构建毛细管电泳系统。它提供了一种在实验室中分析核酸的简单方法。

连续流PCR微流控芯片中 大肠杆 菌的扩增及毛细管电泳系统的检测

Polymerase chain reaction (PCR) is a traditional method employed for the amplification of a target gene that has played an important role in biomolecular ...

该协议描述了如何构建基于微流控芯片的连续流聚合酶链系统，以及如何在实验室中构建毛细管电泳系统。它提供了一种在实验室中分析核酸的简单方法。聚合酶链反应是用于扩增靶基因的传统方法。然而，传统的PCR由于温度变化效率低，非常耗时。该工作提出了一种基于微流控芯片的连续流PCR系统。通过将PCR溶液运行到放置在不同温度的加热器上的微通道中，可以大大缩短扩增时间。由于CE具有高分辨率、高速度和出色的重现性等许多优点，因此它成为实验室中用于分析核酸和蛋白质的常用工具。然而，由于CE仪器价格高昂，大多数实验室，尤其是发展中国家的实验室，负担不起这项技术。在此，我们概述了如何制造CF-PCR微流控芯片以及如何在实验室中构建多功能CE系统的协议。我们还演示了CF-PCR系统扩增大肠杆菌的过程，以及CE系统检测PCR产物的过程。通过遵循本协议中描述的程序，用户应该能够制造微流控芯片，制备PCR溶液，构建用于核酸扩增的CF-PCR系统，并建立简单的CE系统，即使资源有限，也可以分离DNA片段。将硅片在 200 摄氏度下加热 25 分钟以去除水分。每英寸晶圆分配一毫升 SU-8 2075 光刻胶。使用旋涂机以 500 rpm 的速度在硅晶圆上旋转 5 到 10 秒，以每秒 100 rpm 的速度旋转，然后以 2， 000 rpm 的速度旋转 30 秒，以每秒 500 rpm 的速度旋转。在 65 摄氏度下软烤 3 分钟，在 95 摄氏度下烘烤 15 分钟。将每平方厘米150至215毫焦耳设置为光刻机的曝光能量，并用光刻掩模将设计的图案雕刻在光刻胶上。放置硅晶圆和掩模，准备曝光。曝光后，将晶圆在 65 摄氏度下烘烤两分钟，在 95 摄氏度下烘烤七分钟。将硅晶圆浸入显影液中以去除多余的光刻胶，并在可以看到微通道时将其取出。然后用异丙醇冲洗掉残留的显影液。将聚二甲基硅氧烷预聚物和固化剂以 10 比 1 的比例混合。将混合的PDMS溶液倒入复制模具中，在80摄氏度下固化60分钟。使用等离子清洗机激活后将PDMS微流控芯片粘合在载玻片上，并尽快在80°C下固化30分钟。使用涡旋混合器和离心机确保试剂充分混合。准备离心管。首先向离心管中加水。然后加入DNA模板、引物、缓冲液、dNTP混合物、吐温20、PVP，最后加入DNA聚合酶。最后，通过涡旋混合溶液。准备两个PTC陶瓷加热器、两个固态继电器、两个温度控制器、两个温度传感器和一根电源线。将加热器连接到固态继电器。将固态继电器连接到PID温度控制器。然后将温度传感器探头连接到两个加热器的底部，并将端子连接到PID温度控制器。最后，将两个固态继电器串联起来，并连接电源线。3D打印两个加热器的插槽，并将加热器保持在同一平面上。将微流控芯片放在两个加热器上。准备注射器泵和注射器，然后将注射器固定在注射器泵上。用注射器连接硅胶管，并将钢针连接到硅胶管的顶部。将钢针插入微流控芯片的入口。将移液器吸头放在芯片的出口处以收集PCR产物。使用高压电源产生脉冲场电场。看，这是一个高压电源。这些是正极和负极。使用汞灯作为光源，通过滤光片过滤汞灯的激发波长。将毛细管放在显微镜载物台上。用物镜收集荧光发射，然后通过光电倍增管检测。这是我们的显微镜，这是我们的毛细管。现在我们在黑暗的房间条件下打开灯。激发光由物镜收集。使用自主研发的LABVIEW软件控制电源，完成数据采集。将CF-PCR系统的加热器温度预设为65°C和95°C。将微流控芯片放在两个加热块上。将硅胶管的尖端插入含有50微升PCR溶液的离心管中。拉动注射器柱塞以缓慢抽出溶液。将注射器固定在注射泵上。将钢针插入微流控芯片的入口。将泵的流量设置为每分钟 10 微升，然后按下启动按钮将溶液推入微芯片入口处的微通道中。在微流控芯片的出口处收集PCR产物。准备总长度为 8 厘米、有效长度为 6 厘米的毛细管。通过混合 100 微升 1%HEC、2 微升 100x SYBR Green 和 98 微升超纯水来制备分离缓冲液，以获得含有 1x SYBR Green 的 0.5%HEC。 使用真空泵用准备好的分离缓冲液填充毛细管。在软件界面输入进样电压和进样时间，点击开始按钮，等待PCR产物被电动力引入毛细管。在软件界面输入直流电压，点击开始按钮，以每厘米100伏的电场强度进行电泳。在毛细管中分离所有 DNA 片段后，单击停止按钮。每次运行后用消毒水冲洗毛细管一分钟。这张图片代表了PCR产物和DNA标记物的电泳图。我们首先在CF-PCR系统中扩增了大肠杆菌的靶基因，PCR溶液从芯片的入口到出口大约需要10分30秒。大肠杆菌靶扩增子的大小为544 bp。之后，我们分析了毛细管电泳系统中扩增的PCR产物。此外，我们还在相同的实验条件下对100 bp DNA分子量标准进行了毛细管电泳。PCR产物的大小可以根据DNA分子量标准的电泳图进行评估。为了重现性，每个实验进行三次。该图数据显示，分离后观察到大肠杆菌PCR产物对应的峰，微流控芯片中PCR产物的迁移时间与热循环仪中的迁移时间一致。PCR 和 CE 都是核酸分析中两种流行的生物技术。本文介绍了使用内部构建的CF-PCR和CE系统扩增大肠杆菌和PCR产物检测。大肠杆菌靶基因在10 min内成功扩增，8 min内分离出小于1， 500 bp的DNA片段。此外，本文介绍的基于微流控芯片的CF-PCR系统和CE系统易于制造，可以为实验室中核酸的分析提供一种简单的方法。它一次只能扩增和检测一个样品，这限制了它的广泛应用。因此，用于病原体高通量检测的集成CF-PCR和CE微流控芯片阵列的开发仍在进行中。

Research

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Bioengineering

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