Name: amplification of escherichia coli in a continuous-flow-pcr microfluidic chip and its detection with a capillary electrophoresis system
Uploaded: 2023-11-21T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Amplification of Escherichia coli in a Continuous-Flow-PCR Microfluidic Chip and Its Detection with a Capillary Electrophoresis System at JoVE.com

עבודה זו נתמכה על ידי ועדת המדע והטכנולוגיה של עיריית שנחאי, סין (מס '19ZR1477500 ומס '18441900400). אנו מודים בהכרת תודה על תמיכה כספית מאוניברסיטת שנחאי למדע וטכנולוגיה (No.2017KJFZ049).

הערה: עיין בטבלת החומרים לקבלת פרטים הקשורים לכל החומרים, הריאגנטים והציוד המשמשים בפרוטוקול זה.
1. ייצור שבב מיקרופלואידי CF-PCR
<ol><li>חממו את פרוסת הסיליקון בטמפרטורה של 200°C למשך 25 דקות כדי להסיר את הלחות.</li>
	<li>יש להוציא 1 מ"ל של SU-8-2075 photoresist לכל אינץ' של רקיק. ...

<ol>
	<li>Li, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=All-in-one+microfluidic+device+for+on-site+diagnosis+of+pathogens+based+on+an+integrated+continuous+flow+PCR+and+electrophoresis+biochip.">All-in-one microfluidic device for on-site diagnosis of pathogens based on an integrated continuous flow PCR and electrophoresis biochip.</a> Lab on a Chip. 19 (16), 2663-2668 (2019).</li><li>Crews, N., Wittwer, C., Gale, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Continuous-flow+thermal+gradient+PCR.">Continuous-flow thermal gradient PCR.</a> Biomedical Microdevices. 10 (2), 187-195 (2008).</li><li>Li, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+and+fabrication+of+portable+continuous+flow+PCR+microfluidic+chip+for+DNA+replication.">Design and fabrication of portable continuous flow PCR microfluidic chip for DNA replication.</a> Biomedical Microdevices. 22 (1), 5 (2019).</li><li>Kim, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fabrication+and+characterization+of+a+PDMS-glass+hybrid+continuous-flow+PCR+chip.">Fabrication and characterization of a PDMS-glass hybrid continuous-flow PCR chip.</a> Biochemical Engineering Journal. 29 (1-2), 91-97 (2006).</li><li>Shen, K., Chen, X., Guo, M., Cheng, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+microchip-based+PCR+device+using+flexible+printed+circuit+technology.">A microchip-based PCR device using flexible printed circuit technology.</a> Sensors and Actuators B: Chemical. 105 (2), 251-258 (2005).</li><li>Harstad, R. K., Johnson, A. C., Weisenberger, M. M., Bowser, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capillary+Electrophoresis.">Capillary Electrophoresis.</a> Analytical Chemistry. 88 (1), 299-319 (2016).</li><li>Redman, E. A., Mellors, J. S., Starkey, J. A., Ramsey, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+intact+antibody+drug+conjugate+variants+using+microfluidic+capillary+electrophoresis-mass+spectrometry.">Characterization of intact antibody drug conjugate variants using microfluidic capillary electrophoresis-mass spectrometry.</a> Analytical Chemistry. 88 (4), 2220-2226 (2016).</li><li>Britz-Mckibbin, P., Kranack, A. R., Paprica, A., Chen, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+assay+for+epinephrine+in+dental+anesthetic+solutions+by+capillary+electrophoresis.">Quantitative assay for epinephrine in dental anesthetic solutions by capillary electrophoresis.</a> Analyst. 123 (7), 1461-1463 (1998).</li><li>Maeda, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+real-time+PCR+using+TaqMan+and+SYBR+Green+for+Actinobacillus+actinomycetemcomitans,+Porphyromonas+gingivalis,+Prevotella+intermedia,+tetQgene+and+total+bacteria.">Quantitative real-time PCR using TaqMan and SYBR Green for Actinobacillus actinomycetemcomitans, Porphyromonas gingivalis, Prevotella intermedia, tetQgene and total bacteria.</a> FEMS Immunology and Medical Microbiology. 39 (1), 81-86 (2003).</li><li>Hajba, L., Guttman, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+column+coatings+for+capillary+electrophoresis+of+proteins.">Recent advances in column coatings for capillary electrophoresis of proteins.</a> TrAC Trends in Analytical Chemistry. 90, 38-44 (2017).</li><li>Kleparnik, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+combination+of+capillary+electrophoresis+with+mass+spectrometry:+methodology+and+theory.">Recent advances in combination of capillary electrophoresis with mass spectrometry: methodology and theory.</a> Electrophoresis. 36 (1), 159-178 (2015).</li></ol>

הן PCR והן CE הן שתי ביוטכנולוגיות פופולריות בניתוח חומצות גרעין. מאמר זה מתאר את ההגברה של E. coli ואת זיהוי מוצרי PCR באמצעות מערכות CF-PCR ו- CE, שתיהן מובנות בתוך החברה. גן המטרה של E. coli הוגבר בהצלחה תוך 10 דקות בגלל קצבי העברת החום הגבוהים. מקטעי דנ"א קטנים מ-1,500 bp הופרדו תוך 8 דקות (<strong class="xfi...

תגובת שרשרת פולימראז (PCR) היא טכניקה ביולוגית מולקולרית המשמשת להגברת מקטעי DNA ספציפיים, ובכך מגבירה כמויות זעירות של DNA מאות מיליוני פעמים. הוא נמצא בשימוש נרחב באבחון קליני, מחקר רפואי, בטיחות מזון, זיהוי פורנזי ותחומים אחרים. תהליך ה- PCR מורכב בעיקר משלושה שלבים: דנטורציה ב 90-95 ° C, חישול ב 50-60 ° C, והרחבה ב 72-77 ° C. מחזור תרמי הוא חלק חשוב בתהליך ה- PCR; עם זאת, המחזור התרמי המסורתי PCR הוא לא רק מגושם אלא גם לא יעיל, ודורש כ -40 דקות כדי להשלים 25 מחזורים. כדי להתגבר על מגבלות אלה, נבנתה בתוך החברה מערכת PCR (CF-PCR) בעלת זרימה רציפה, המבוססת על שבב מיקרופלואידי. CF-PCR יכול לחסוך זמן רב על ידי הנעת פתרון ה- PCR למיקרו-ערוצים הממוקמים על תנורי חימום בטמפרטורות שונות 1,2,3,4,5.
מכיוון שלאלקטרופורזה נימית (CE) יתרונות רבים, כגון רזולוציה גבוהה, מהירות גבוהה ויכולת שחזור מצוינת 6,7,8,9,10,11, היא הפכה לכלי פופולרי במעבדה לניתוח חומצות גרעין וחלבונים. עם זאת, רוב המעבדות, במיוחד מעבדות בעולם המתפתח, אינן יכולות להרשות לעצמן טכנולוגיה זו בגלל מחירו הגבוה של מכשיר CE. במאמר זה, תיארנו פרוטוקולים כיצד לייצר את השבב המיקרופלואידי CF-PCR וכיצד לבנות מערכת CE רב-תכליתית במעבדה. אנו גם מדגימים את תהליך ההגברה של E. coli על ידי מערכת CF-PCR זו ואת זיהוי מוצרי PCR על ידי מערכת CE. על ידי ביצוע ההליכים המתוארים בפרוטוקול זה, משתמשים צריכים להיות מסוגלים לייצר שבבים מיקרופלואידים, להכין פתרונות PCR, לבנות מערכת CF-PCR להגברת חומצות גרעין, ולהקים מערכת CE פשוטה, אפילו עם משאבים מוגבלים, כדי להפריד מקטעי DNA.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>100 bp DNA ladder</td>
			<td>Takara Bio Inc.</td>
			<td>3422A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x Fast Buffer I</td>
			<td>Takara Bio Inc.</td>
			<td>RR070A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x TBE</td>
			<td>Beijing Solarbio Science &#38; Technology Co., Ltd.</td>
			<td>T1051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>developer solution</td>
			<td>Alfa Aesar, USA</td>
			<td>L15459</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTP mixture (2.5 &#956;M)</td>
			<td>Takara Bio Inc.</td>
			<td>RR070A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EC-F</td>
			<td>Sangon Biotech, Shanghai, China</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EC-R</td>
			<td>Sangon Biotech, Shanghai, China</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEC,1300K</td>
			<td>Sigma-Aldrich, USA</td>
			<td>9004-62-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>isopropanol</td>
			<td>Aladdin, Shanghai, China</td>
			<td>67-63-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microscope</td>
			<td>Olympus, Japan</td>
			<td>BX51</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>photolithography&#160;</td>
			<td>SUSS MicroTec, Germany</td>
			<td>MJB4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>photomultiplier tube&#160;</td>
			<td>Hamamatsu Photonics, Japan</td>
			<td>R928</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>photoresist</td>
			<td>MicroChem, USA</td>
			<td>SU-8 2075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PID temperature controllers&#160;</td>
			<td>Shanghai, China</td>
			<td>XH-W2023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>plasma cleaner&#160;</td>
			<td>Harrick Plasma</td>
			<td>PDC-32G-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>polyvinyl pyrrolidone (PVP)</td>
			<td>Aladdin, Shanghai, China</td>
			<td>P110608</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pump</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>PHD2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>silicone tubing&#160;</td>
			<td>BIO-RAD,USA</td>
			<td>7318210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>solid-state relays</td>
			<td>KZLTD, China</td>
			<td>KS1-25LA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SpeedSTAR HS DNA Polymerase&#160;</td>
			<td>Takara Bio Inc.</td>
			<td>RR070A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>steel needle</td>
			<td>zhongxinqiheng,Suzhou,China</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYBR GREEN <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/63523/63523eq01.jpg" style="margin: auto;" /></td>
			<td>Solarbio, Beijing, China</td>
			<td>SY1020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>temperature sensors</td>
			<td>EasyShining Technology, Chengdu, China</td>
			<td>TCM-M207</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Template (E. coli)</td>
			<td>Takara Bio Inc.</td>
			<td>AK601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Aladdin, Shanghai, China</td>
			<td>T104863</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>voltage power supply&#160;</td>
			<td>Medina, NY, USA</td>
			<td>TREK MODEL 610E</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

amplification of escherichia coli in a continuous-flow-pcr microfluidic chip and its detection with a capillary electrophoresis system

תגובת שרשרת פולימראז (PCR) היא שיטה מסורתית המשמשת להגברה של גן מטרה שמילא תפקיד חשוב באבחון ביומולקולרי. עם זאת, PCR מסורתי גוזל זמן רב בגלל יעילות השונות בטמפרטורה נמוכה. עבודה זו מציעה מערכת CONTINUOUS-FLOW-PCR (CF-PCR) המבוססת על שבב מיקרופלואידי. ניתן לקצר מאוד את זמן ההגברה על ידי הפעלת פתרון ה- PCR למיקרו-ערוץ הממוקם על תנורי חימום המוגדרים בטמפרטורות שונות. יתר על כן, מכיוון שאלקטרופורזה נימית (CE) היא דרך אידיאלית להבדיל בין מוצרי PCR חיוביים וחיוביים כוזבים, מערכת CE נבנתה כדי להשיג הפרדה יעילה של מקטעי ה- DNA. מאמר זה מתאר את תהליך ההגברה של Escherichia coli (E. coli) על ידי מערכת CF-PCR המובנית בתוך החברה ואת זיהוי מוצרי PCR על ידי CE. התוצאות מראות כי גן המטרה של E. coli הוגבר בהצלחה תוך 10 דקות, מה שמצביע על כך ששתי מערכות אלה יכולות לשמש להגברה מהירה וזיהוי של חומצות גרעין.

איור 5 מייצג את האלקטרופרוגרמה של תוצרי PCR ואת סמני הדנ"א. עקבות (איור 5A) הן תוצאת CE של המוצר המוגבר CF-PCR, עקבות (איור 5B) הן תוצאת CE של המוצר המוגבר על-ידי מחזור תרמי, ועקבות (איור 5C) הן תוצאת CE של סולם הדנ"א של 100 bp. תחילה הגברנו את גן...

Watch this Scientific Journal Video about Amplification of Escherichia coli in a Continuous-Flow-PCR Microfluidic Chip and Its Detection with a Capillary Electrophoresis System at JoVE.com

Amplification of Escherichia coli in a Continuous-Flow-PCR Microfluidic Chip and Its Detection with a Capillary Electrophoresis System

פרוטוקול זה מתאר כיצד לבנות מערכת שרשרת זרימה רציפה פולימראז המבוססת על שבב מיקרופלואידי וכיצד לבנות מערכת אלקטרופורזה נימית במעבדה. הוא מציג שיטה פשוטה לניתוח חומצות גרעין במעבדה.

הגברה של Escherichia coli בשבב מיקרופלואידי PCR בזרימה רציפה וגילויו באמצעות מערכת אלקטרופורזה נימית

Polymerase chain reaction (PCR) is a traditional method employed for the amplification of a target gene that has played an important role in biomolecular ...

פרוטוקול זה מתאר כיצד לבנות מערכת שרשרת פולימראז זרימה רציפה המבוססת על השבב המיקרופלואידי, וכיצד לבנות מערכת אלקטרופורזה נימית במעבדה. הוא מציג דרך פשוטה לניתוח חומצות גרעין במעבדה. תגובת שרשרת פולימראז היא שיטה מסורתית המשמשת להגברה של גן המטרה.עם זאת, PCR מסורתי גוזל זמן רב בגלל יעילות השונות בטמפרטורה נמוכה. עבודה זו מציעה מערכת PCR זרימה רציפה המבוססת על שבב microfluidic. ניתן לקצר מאוד את זמן ההגברה על ידי הפעלת פתרון ה- PCR למיקרו-ערוץ הממוקם על תנורי חימום המוגדרים בטמפרטורות שונות.מכיוון של- CE יתרונות רבים, כגון רזולוציה גבוהה, מהירות גבוהה ויכולת שחזור מעולה, הוא הפך לכלי פופולרי במעבדה לניתוח חומצות גרעין וחלבונים. עם זאת, רוב המעבדות, במיוחד המעבדות בעולם המתפתח, אינן יכולות להרשות לעצמן טכנולוגיה זו בגלל מחירו הגבוה של מכשיר CE. במאמר זה, תיארנו פרוטוקולים כיצד לייצר את השבב המיקרופלואידי CF-PCR וכיצד לבנות מערכת CE רב-תכליתית במעבדה.כמו כן, אנו מדגימים את תהליך ההגברה של Escherichia coli על ידי מערכת CF-PCR, ואת איתור מוצרי ה-PCR על ידי מערכת CE. על ידי ביצוע ההליכים המתוארים בפרוטוקול זה, משתמשים צריכים להיות מסוגלים לייצר שבבים מיקרופלואידים, להכין פתרון PCR, לבנות מערכת CF-PCR להגברת חומצות גרעין, ולהקים מערכת CE פשוטה, אפילו עם משאבים מוגבלים, כדי להפריד מקטעי DNA. חממו את פרוסת הסיליקון בטמפרטורה של 200 מעלות צלזיוס למשך 25 דקות כדי להסיר את הלחות.יש להוציא מיליליטר אחד של SU-8 2075 photoresist לכל אינץ' של רקיק. סובב אותו על פרוסת הסיליקון באמצעות מעיל ספין ב 500 סל"ד במשך 5 עד 10 שניות עם תאוצה של 100 סל"ד לשנייה, ולאחר מכן ב 2, 000 סל"ד במשך 30 שניות עם תאוצה של 500 סל"ד לשנייה. אופים אותו ברכות, בטמפרטורה של 18 מעלות צלזיוס במשך שלוש דקות, ו-95 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות.הגדר 150 עד 215 מיליג'ול לסמ"ר כאנרגיית החשיפה של מכונת הפוטוליתוגרפיה, וחרוט את התבנית המעוצבת על התנגדות הפוטו עם מסיכת פוטוליתוגרפיה. מניחים את פרוסת הסיליקון והמסכה מוכנים לחשיפה. לאחר החשיפה, אופים את הוופל בטמפרטורה של 18 מעלות במשך שתי דקות, ו-95 מעלות צלזיוס במשך שבע דקות.טבלו את פרוסת הסיליקון בפתרון פיתוח כדי להסיר עודפי פוטו-התנגדות, והוציאו אותו כאשר ניתן לראות את המיקרו-ערוצים. לאחר מכן השתמש באיזופרופנול כדי לשטוף את פתרון המפתח השיורי. מערבבים את פולידימתילסילוקסאן פרפולימר וסוכן ריפוי ביחס של 10 ל -1.יוצקים את תמיסת PDMS המעורבת לתבנית המשוכפלת וממצקים אותה בחום של 80 מעלות צלזיוס למשך 60 דקות. חבר את השבב המיקרופלואידי PDMS על שקופית לאחר ההפעלה באמצעות שואב פלזמה, ומצק אותם ב 80 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות בהקדם האפשרי. השתמש מערבול מערבולת וצנטריפוגה כדי להבטיח שהריאגנטים מעורבבים היטב.הכינו צינור צנטריפוגה. ראשית להוסיף מים לצינור הצנטריפוגה. לאחר מכן הוסף את תבנית ה- DNA, פריימר, חיץ, תערובת dNTP, Tween 20, PVP, ולבסוף הוסף את ה- DNA פולימראז.לבסוף, מערבבים את התמיסה על ידי מערבולת. הכינו שני תנורי חימום קרמיים PTC, שני ממסרי מצב מוצק, שני בקרי טמפרטורה, שני חיישני טמפרטורה וכבל חשמל. חבר את תנור החימום לממסר מצב מוצק.חבר את ממסר מצב מוצק לבקר הטמפרטורה PID. לאחר מכן חבר את בדיקת חיישן הטמפרטורה לתחתית שני תנורי החימום, וחבר את המסוף לבקר הטמפרטורה PID. לבסוף, חבר שני ממסרי מצב מוצק בסדרה, וחבר את כבל החשמל.הדפס בתלת-ממד חריץ עבור שני תנורי החימום ושמור את תנורי החימום באותו מישור. מניחים את השבב המיקרופלואידי על שני תנורי החימום. הכינו משאבת מזרק ומזרק, ולאחר מכן תקנו את המזרק על משאבת המזרק.חברו צינור סיליקון באמצעות מזרק, וחברו מחט פלדה לחלק העליון של צינור הסיליקון. הכנס את מחט הפלדה לתוך הכניסה של שבב microfluidic. מניחים קצה פיפטה בשקע השבב כדי לאסוף את מוצרי ה- PCR.השתמש בספק כוח במתח גבוה כדי ליצור שדה חשמלי פועם. תראה, זה ספק כוח מתח גבוה. אלה אלקטרודות חיוביות ושליליות.השתמש במנורת כספית כמקור אור וסנן את אורך גל העירור ממנורת הכספית דרך מסנן. מניחים את הנימים על במת המיקרוסקופ. לאסוף את פליטת פלואורסצנטיות עם המטרה, ולאחר מכן לזהות אותו על ידי צינור photomultiplier.זה המיקרוסקופ שלנו וזה הנימים שלנו. עכשיו אנחנו מדליקים את האור בתנאי חדר חשוך. אור עירור נאסף על ידי המטרה.השתמש בתוכנת LABVIEW שפותחה בעצמה כדי לשלוט בספק הכוח ולהשלים את איסוף הנתונים. הגדר מראש את הטמפרטורה של תנורי החימום של מערכת CF-PCR ב 65 מעלות צלזיוס ו 95 מעלות צלזיוס. מניחים את השבב המיקרופלואידי על שני גושי החימום.הכנס את קצה צינור הסיליקון לצינור צנטריפוגה המכיל 50 מיקרוליטר של תמיסת PCR. משוך את בוכנת המזרק כדי למשוך לאט את התמיסה. תקן את המזרק על משאבת מזרק.הכנס את מחט הפלדה לתוך הכניסה של שבב microfluidic. הגדר את קצב הזרימה של המשאבה ל -10 מיקרוליטר לדקה ולחץ על לחצן התחל כדי לדחוף את התמיסה במיקרו-ערוץ בכניסת השבב. לאסוף את מוצרי PCR בשקע של שבב microfluidic.הכינו נימים באורך כולל של 8 ס"מ ובאורך אפקטיבי של 6 ס"מ. הכינו את מאגר ההפרדה על ידי ערבוב של 100 מיקרוליטר של 1% HEC, שני מיקרוליטרים של 100x SYBR Green ו-98 מיקרוליטר של מים אולטרה-טהורים כדי לקבל 0.5% HEC המכיל 1x SYBR Green. מלאו את הנימים במאגר ההפרדה המוכן באמצעות משאבת ואקום.הזן את מתח ההזרקה ואת זמן ההזרקה בממשק התוכנה, לחץ על לחצן התחל והמתן עד שמוצרי ה- PCR יוכנסו אלקטרודינמית לנימים. הזן את מתח ה- DC בממשק התוכנה, לחץ על לחצן התחל והפעל את האלקטרופורזה בחוזק שדה חשמלי של 100 וולט לסנטימטר. לחץ על לחצן העצירה לאחר שכל מקטעי ה- DNA מופרדים בנימים.שטפו את הנימים במים מעוקרים למשך דקה לאחר כל ריצה. תמונה זו מייצגת את האלקטרופרוגרמה של מוצרי PCR וסמני DNA. תחילה הגברנו את גן המטרה של Escherichia coli במערכת CF-PCR, ותמיסת ה-PCR ארכה כ-10 דקות ו-30 שניות מהכניסה ליציאת השבב.גודל אמפליקון המטרה של Escherichia coli היה 544 bp. לאחר מכן, ניתחנו את מוצרי ה- PCR המוגברים במערכת האלקטרופורזה הנימית. בנוסף, ביצענו גם אלקטרופורזה נימית של סולם DNA של 100 bp באותם תנאי ניסוי.ניתן להעריך את גודל מוצר ה- PCR על פי האלקטרופרוגרמה של סולם ה- DNA. כל ניסוי בוצע שלוש פעמים לצורך שחזור. הנתונים בתמונה זו מראים כי השיא המתאים למוצרי PCR של Escherichia coli נצפה לאחר ההפרדה, וזמן הנדידה של מוצרי PCR בשבב המיקרופלואידי היה עקבי עם זה שבמחזור תרמי.הן PCR והן CE הן שתי ביוטכנולוגיות פופולריות בניתוח חומצות גרעין. מאמר זה מתאר את ההגברה של Escherichia coli ואת הזיהוי של מוצרי PCR באמצעות מערכות CF-PCR ו- CE, שתיהן מובנות בתוך החברה. גן המטרה של Escherichia coli הוגבר בהצלחה תוך 10 דקות, ומקטעי ה- DNA הקטנים מ -1, 500 bp הופרדו תוך שמונה דקות.כמו כן, מערכת CF-PCR המבוססת על השבב המיקרופלואידי ומערכת CE שהוצגה בעבודה זו קלה לייצור, ועשויה להציע דרך פשוטה לניתוח חומצות גרעין במעבדה. הוא יכול להגביר ולזהות רק דגימה אחת בכל פעם, מה שמגביל את היישום הרחב שלו. לכן, הפיתוח של מערך שבבים משולב CF-PCR ו- CE microfluidic לזיהוי תפוקה גבוהה של פתוגנים עדיין בדרך.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Amplification of Escherichia coli in a Continuous-Flow-PCR Microfluidic Chip and Its Detection with a Capillary Electrophoresis System

Fluorescence detection methods for microfluidic droplet platforms

שיטות גילוי הקרינה לפלטפורמות אגל microfluidic

The development of microfluidic platforms for performing chemistry and biology has in large part been driven by a range of potential benefits that ...

A Microfluidic Chip for the Versatile Chemical Analysis of Single Cells

שבב microfluidic לניתוח הכימי תכליתי של תאים בודדים

We present a microfluidic device that enables the quantitative determination of intracellular biomolecules in multiple single cells in parallel. For this ...

Microfluidic Fabrication of Polymeric and Biohybrid Fibers with Predesigned Size and Shape

ייצור מיקרופלואידי של סיבים פולימריים וביוהיברידים עם גודל וצורה מעוצבים מראש

A &#8220;sheath&#8221; fluid passing through a microfluidic channel at low Reynolds number can be directed around another &#8220;core&#8221; stream and ...

A Microfluidic Chip for ICPMS Sample Introduction

שבב microfluidic למבוא לדוגמא ICPMS

This protocol discusses the fabrication and usage of a disposable low cost microfluidic chip as sample introduction system for inductively coupled plasma ...

Electrotaxis Studies of Lung Cancer Cells using a Multichannel Dual-electric-field Microfluidic Chip

Electrotaxis מחקרים של תאי סרטן ריאות באמצעות רב-ערוצי דו-חשמלי-שדה שבב microfluidic

The behavior of directional cell migration under a direct current electric-field (dcEF) is referred to as electrotaxis. The significant role of ...

Co-culture of Living Microbiome with Microengineered Human Intestinal Villi in a Gut-on-a-Chip Microfluidic Device

עמית תרבות Microbiome חי עם Microengineered אדם המעיים villi בתוך גוט-על-שבב מכשיר microfluidic

Here, we describe a protocol to perform long-term co-culture of multi-species human gut microbiome with microengineered intestinal villi in a human ...

Microfluidic Platform with Multiplexed Electronic Detection for Spatial Tracking of Particles

פלטפורמת microfluidic עם איתור Multiplexed אלקטרוני למערכות מעקב מרחבית של חלקיקים

Microfluidic processing of biological samples typically involves differential manipulations of suspended particles under various force fields in order to ...

Dry Film Photoresist-based Electrochemical Microfluidic Biosensor Platform: Device Fabrication, On-chip Assay Preparation, and System Operation

פלטפורמה מבוססת Photoresist ביוסנסור אלקטרוכימי Microfluidic הסרט יבש: ייצור המכשיר, הכנה על שבב Assay, ותפעול המערכת

In recent years, biomarker diagnostics became an indispensable tool for the diagnosis of human disease, especially for the point-of-care diagnostics. An ...

Fabrication and Validation of an Organ-on-chip System with Integrated Electrodes to Directly Quantify Transendothelial Electrical Resistance

ייצור ואימות מערכת איברים על שבב עם אלקטרודות משולבת ישירות לכמת התנגדות חשמלית Transendothelial

Organs-on-chips, in vitro models involving the culture of (human) tissues inside microfluidic devices, are rapidly emerging and promise to provide useful ...

Visual Detection of Multiple Nucleic Acids in a Capillary Array

זיהוי ויזואלי של מספר חומצות גרעין ב מערך נימי

Multi-target, short time, and resource-affordable methodologies for the detection of multiple nucleic acids in a single, easy to operate test are urgently ...