Name: amplification of escherichia coli in a continuous-flow-pcr microfluidic chip and its detection with a capillary electrophoresis system
Uploaded: 2023-11-21T12:00:00
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本研究は、中国上海市科学技術委員会(No.19ZR1477500、No.18441900400)の支援を受けて行われました。上海大学科学技術支援(No.2017KJFZ049)の助成に感謝します。

注:このプロトコルで使用されるすべての材料、試薬、および機器の詳細については、 材料表 を参照してください。
1. CF-PCRマイクロ流体チップの作製
<ol><li>シリコンウェーハを200°Cで25分間加熱し、水分を除去します。</li>
	<li>ウェーハの1インチあたり1mLのSU-8-2075フォトレジストを分注します。スピンコーターを使用してシリコンウェーハ上で...

<ol>
	<li>Li, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=All-in-one+microfluidic+device+for+on-site+diagnosis+of+pathogens+based+on+an+integrated+continuous+flow+PCR+and+electrophoresis+biochip.">All-in-one microfluidic device for on-site diagnosis of pathogens based on an integrated continuous flow PCR and electrophoresis biochip.</a> Lab on a Chip. 19 (16), 2663-2668 (2019).</li><li>Crews, N., Wittwer, C., Gale, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Continuous-flow+thermal+gradient+PCR.">Continuous-flow thermal gradient PCR.</a> Biomedical Microdevices. 10 (2), 187-195 (2008).</li><li>Li, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+and+fabrication+of+portable+continuous+flow+PCR+microfluidic+chip+for+DNA+replication.">Design and fabrication of portable continuous flow PCR microfluidic chip for DNA replication.</a> Biomedical Microdevices. 22 (1), 5 (2019).</li><li>Kim, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fabrication+and+characterization+of+a+PDMS-glass+hybrid+continuous-flow+PCR+chip.">Fabrication and characterization of a PDMS-glass hybrid continuous-flow PCR chip.</a> Biochemical Engineering Journal. 29 (1-2), 91-97 (2006).</li><li>Shen, K., Chen, X., Guo, M., Cheng, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+microchip-based+PCR+device+using+flexible+printed+circuit+technology.">A microchip-based PCR device using flexible printed circuit technology.</a> Sensors and Actuators B: Chemical. 105 (2), 251-258 (2005).</li><li>Harstad, R. K., Johnson, A. C., Weisenberger, M. M., Bowser, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capillary+Electrophoresis.">Capillary Electrophoresis.</a> Analytical Chemistry. 88 (1), 299-319 (2016).</li><li>Redman, E. A., Mellors, J. S., Starkey, J. A., Ramsey, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+intact+antibody+drug+conjugate+variants+using+microfluidic+capillary+electrophoresis-mass+spectrometry.">Characterization of intact antibody drug conjugate variants using microfluidic capillary electrophoresis-mass spectrometry.</a> Analytical Chemistry. 88 (4), 2220-2226 (2016).</li><li>Britz-Mckibbin, P., Kranack, A. R., Paprica, A., Chen, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+assay+for+epinephrine+in+dental+anesthetic+solutions+by+capillary+electrophoresis.">Quantitative assay for epinephrine in dental anesthetic solutions by capillary electrophoresis.</a> Analyst. 123 (7), 1461-1463 (1998).</li><li>Maeda, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+real-time+PCR+using+TaqMan+and+SYBR+Green+for+Actinobacillus+actinomycetemcomitans,+Porphyromonas+gingivalis,+Prevotella+intermedia,+tetQgene+and+total+bacteria.">Quantitative real-time PCR using TaqMan and SYBR Green for Actinobacillus actinomycetemcomitans, Porphyromonas gingivalis, Prevotella intermedia, tetQgene and total bacteria.</a> FEMS Immunology and Medical Microbiology. 39 (1), 81-86 (2003).</li><li>Hajba, L., Guttman, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+column+coatings+for+capillary+electrophoresis+of+proteins.">Recent advances in column coatings for capillary electrophoresis of proteins.</a> TrAC Trends in Analytical Chemistry. 90, 38-44 (2017).</li><li>Kleparnik, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+combination+of+capillary+electrophoresis+with+mass+spectrometry:+methodology+and+theory.">Recent advances in combination of capillary electrophoresis with mass spectrometry: methodology and theory.</a> Electrophoresis. 36 (1), 159-178 (2015).</li></ol>

PCRとCEはどちらも、核酸の分析において人気のある2つのバイオテクノロジーです。本稿では、自社で構築したCF-PCRシステムとCEシステムを用いた 大腸菌 の増幅とPCR産物の検出について述べる。 大腸菌 の標的遺伝子は、熱伝達率が高いため、10分以内に増幅することに成功しました。1,500 bp 未満の DNA 断片は 8 分以内に分離されました(図 5)。これら2つの技?...

ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)は、特定のDNA断片を増幅するために使用される分子生物学的手法であり、それによって微量のDNAを数億倍に増幅します。臨床診断、医学研究、食品安全、法医学的識別などの分野で広く使用されています。PCRプロセスは、主に90〜95°Cでの変性、50〜60°Cでのアニーリング、72〜77°Cでの伸長の3つのステップで構成されています。 サーマルサイクリングはPCRプロセスの重要な部分です。しかし、従来のPCRサーマルサイクラーはかさばるだけでなく、非効率的でもあり、25サイクルを完了するのに約40分かかります。これらの制限を克服するために、マイクロ流体チップをベースにした連続フローPCR(CF-PCR)システムが社内で構築されました。CF-PCRは、異なる温度のヒーターに配置されたマイクロチャネルにPCR溶液を駆動することにより、時間を大幅に節約できます1,2,3,4,5。
キャピラリー電気泳動(CE)は、高分解能、高速、優れた再現性6,7,8,9,10,11など、多くの利点があるため、核酸やタンパク質の分析にラボで人気のあるツールとなっています。しかし、ほとんどのラボ、特に発展途上国のラボでは、CE機器の価格が高いため、この技術を購入する余裕がありません。ここでは、CF-PCRマイクロ流体チップの製造方法と、ラボで汎用性の高いCEシステムを構築する方法のプロトコルを概説しました。また、このCF-PCRシステムによる大腸菌の増幅プロセスとCEシステムによるPCR産物の検出についても説明します。このプロトコルに記載されている手順に従うことで、ユーザーはマイクロ流体チップを製造し、PCR溶液を調製し、核酸増幅用のCF-PCRシステムを構築し、限られたリソースでもDNA断片を分離するための簡単なCEシステムをセットアップできるはずです。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>100 bp DNA ladder</td>
			<td>Takara Bio Inc.</td>
			<td>3422A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x Fast Buffer I</td>
			<td>Takara Bio Inc.</td>
			<td>RR070A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x TBE</td>
			<td>Beijing Solarbio Science &#38; Technology Co., Ltd.</td>
			<td>T1051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>developer solution</td>
			<td>Alfa Aesar, USA</td>
			<td>L15459</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTP mixture (2.5 &#956;M)</td>
			<td>Takara Bio Inc.</td>
			<td>RR070A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EC-F</td>
			<td>Sangon Biotech, Shanghai, China</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EC-R</td>
			<td>Sangon Biotech, Shanghai, China</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEC,1300K</td>
			<td>Sigma-Aldrich, USA</td>
			<td>9004-62-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>isopropanol</td>
			<td>Aladdin, Shanghai, China</td>
			<td>67-63-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microscope</td>
			<td>Olympus, Japan</td>
			<td>BX51</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>photolithography&#160;</td>
			<td>SUSS MicroTec, Germany</td>
			<td>MJB4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>photomultiplier tube&#160;</td>
			<td>Hamamatsu Photonics, Japan</td>
			<td>R928</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>photoresist</td>
			<td>MicroChem, USA</td>
			<td>SU-8 2075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PID temperature controllers&#160;</td>
			<td>Shanghai, China</td>
			<td>XH-W2023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>plasma cleaner&#160;</td>
			<td>Harrick Plasma</td>
			<td>PDC-32G-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>polyvinyl pyrrolidone (PVP)</td>
			<td>Aladdin, Shanghai, China</td>
			<td>P110608</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pump</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>PHD2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>silicone tubing&#160;</td>
			<td>BIO-RAD,USA</td>
			<td>7318210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>solid-state relays</td>
			<td>KZLTD, China</td>
			<td>KS1-25LA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SpeedSTAR HS DNA Polymerase&#160;</td>
			<td>Takara Bio Inc.</td>
			<td>RR070A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>steel needle</td>
			<td>zhongxinqiheng,Suzhou,China</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYBR GREEN <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/63523/63523eq01.jpg" style="margin: auto;" /></td>
			<td>Solarbio, Beijing, China</td>
			<td>SY1020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>temperature sensors</td>
			<td>EasyShining Technology, Chengdu, China</td>
			<td>TCM-M207</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Template (E. coli)</td>
			<td>Takara Bio Inc.</td>
			<td>AK601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Aladdin, Shanghai, China</td>
			<td>T104863</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>voltage power supply&#160;</td>
			<td>Medina, NY, USA</td>
			<td>TREK MODEL 610E</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

amplification of escherichia coli in a continuous-flow-pcr microfluidic chip and its detection with a capillary electrophoresis system

ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)は、生体分子診断において重要な役割を果たしてきた標的遺伝子の増幅に用いられる従来の方法です。しかし、従来のPCRは温度変化効率が低いため、非常に時間がかかります。本研究では、マイクロ流体チップを用いた連続フローPCR(CF-PCR)システムを提案します。増幅時間は、異なる温度に設定されたヒーターに配置されたマイクロチャネルにPCR溶液を流すことで大幅に短縮できます。さらに、キャピラリー電気泳動(CE)は、陽性および偽陽性のPCR産物を区別するための理想的な方法であるため、DNA断片の効率的な分離を達成するためにCEシステムが構築されました。本稿では、自社構築のCF-PCR装置による大腸菌の増幅過程と、CEによるPCR産物の検出について述べる。その結果、大腸菌の標的遺伝子を10分以内に増幅することに成功し、核酸の迅速な増幅・検出に利用できることが示されました。

図5は、PCR産物とDNAマーカーのエレクトロフェログラムを表しています。トレース(図 5A)は CF-PCR 増幅産物の CE 結果、トレース(図 5B)はサーマルサイクルで増幅した産物の CE 結果、トレース(図 5C)は 100 bp DNA ラダーの CE 結果です。まず、CF-PCRシステムで大腸菌の標的遺伝子を増幅しました。PCR溶液?...

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Amplification of Escherichia coli in a Continuous-Flow-PCR Microfluidic Chip and Its Detection with a Capillary Electrophoresis System

このプロトコルでは、マイクロ流体チップに基づいて連続フローポリメラーゼ鎖システムを構築する方法と、ラボでキャピラリー電気泳動システムを構築する方法について説明します。ラボでの核酸分析のための簡単な方法を紹介します。

連続フローPCRマイクロ流体チップにおける大 腸菌 の増幅とキャピラリー電気泳動システムによる検出

Polymerase chain reaction (PCR) is a traditional method employed for the amplification of a target gene that has played an important role in biomolecular ...

このプロトコルでは、マイクロ流体チップをベースにした連続フローポリメラーゼ連鎖システムを構築する方法と、ラボでキャピラリー電気泳動システムを構築する方法について説明します。これは、ラボで核酸を分析するための簡単な方法を提供します。ポリメラーゼ連鎖反応は、標的遺伝子の増幅に用いられる伝統的な方法です。しかし、従来のPCRは温度変化効率が低いため、非常に時間がかかります。本研究は、マイクロ流体チップをベースとした連続フローPCRシステムを提案している。増幅時間は、異なる温度に設定されたヒーターに配置されたマイクロチャネルにPCR溶液を流すことで大幅に短縮できます。CEは、高分解能、高速、優れた再現性など、多くの利点があるため、核酸やタンパク質の分析のためのラボで人気のあるツールになりました。しかし、ほとんどのラボ、特に発展途上国のラボでは、CE機器の価格が高いため、この技術を購入する余裕がありません。ここでは、CF-PCRマイクロ流体チップの製造方法と、ラボで汎用性の高いCEシステムを構築する方法のプロトコルを概説しました。また、CF-PCRシステムによる大腸菌の増幅プロセスと、CEシステムによるPCR産物の検出についても説明します。このプロトコルに記載されている手順に従うことで、ユーザーはマイクロ流体チップを製造し、PCR溶液を調製し、核酸増幅用のCF-PCRシステムを構築し、限られたリソースでもDNA断片を分離するための単純なCEシステムをセットアップできるはずです。シリコンウェーハを摂氏200度で25分間加熱して水分を取り除きます。ウェーハの1インチあたり1ミリリットルのSU-8 2075フォトレジストをディスペンスします。スピンコーターを使用してシリコンウェーハ上でスピンコーターを使用して、毎秒100rpmの加速度で5〜10秒間、次に2, 000rpmで毎秒500rpmの加速度で30秒間スピンします。65°Cで3分、95°Cで15分ソフト焼きます。フォトリソグラフィ装置の露光エネルギーを150〜215ミリジュール/平方センチメートルに設定し、フォトリソグラフィマスクでフォトレジストにデザインしたパターンを彫刻します。シリコンウェーハとマスクを露光の準備を整えます。露光後、ウェーハを65°Cで2分間、95°Cで7分間焼きます。シリコンウェーハを現像液に浸漬して余分なフォトレジストを除去し、マイクロ流路が見えたら取り出します。次に、イソプロパノールを使用して、残留現像液を洗い流します。ポリジメチルシロキサンプレポリマーと硬化剤を10対1の割合で混合します。混合したPDMS溶液をレプリカ型に流し込み、80°Cで60分間固化させます。PDMSマイクロ流体チップは、プラズマクリーナーで活性化後、スライド上に貼り合わせ、できるだけ早く80°Cで30分間固化させます。ボルテックスミキサーと遠心分離機を使用して、試薬が十分に混合されていることを確認します。遠心チューブを準備します。まず、遠心分離管に水を加えます。次に、DNAテンプレート、プライマー、バッファー、dNTP混合物、Tween 20、PVPを添加し、最後にDNAポリメラーゼを添加します。最後に、溶液を渦で混合します。PTCセラミックヒーター2個、ソリッドステートリレー2個、温度コントローラー2個、温度センサー2個、電源コードを用意します。ヒーターをソリッドステートリレーに接続します。ソリッドステートリレーをPID温度コントローラに接続します。次に、温度センサープローブを2つのヒーターの下部に取り付け、端子をPID温度コントローラーに接続します。最後に、2つのソリッドステートリレーを直列に接続し、電源コードを接続します。2つのヒーター用のスロットを3Dプリントし、ヒーターを同じ平面に保ちます。マイクロ流体チップを2つのヒーターに置きます。シリンジポンプとシリンジを用意し、シリンジポンプにシリンジを固定します。シリコーンチューブをシリンジで接続し、シリコーンチューブの上部にスチールニードルを接続します。スチールニードルをマイクロ流体チップの入口に挿入します。チップの出口にピペットチップを置き、PCR産物を回収します。高電圧電源を使用して、パルス電界電界を生成します。ほら、これは高圧電源です。これらは正極と負極です。水銀ランプを光源として使用し、水銀ランプからの励起波長をフィルターでフィルタリングします。キャピラリーを顕微鏡ステージに置きます。蛍光発光を対物レンズで捕集し、光電子増倍管で検出します。これが私たちの顕微鏡で、これが私たちのキャピラリーです。次に、暗い部屋の条件下でライトをオンにします。励起光は対物レンズによって収集されます。自社開発のLABVIEWソフトウェアを使用して電源を制御し、データ集録を完了します。CF-PCRシステムのヒーターの温度を65°Cと95°Cにプリセットします。マイクロ流体チップを2つの加熱ブロックの上に置きます。シリコンチューブの先端を50マイクロリットルのPCR溶液が入った遠心分離チューブに挿入します。シリンジプランジャーを引いて、溶液をゆっくりと引き出します。シリンジをシリンジポンプに固定します。スチールニードルをマイクロ流体チップの入口に挿入します。ポンプの流量を毎分10マイクロリットルに設定し、スタートボタンを押して、マイクロチップの入口にあるマイクロチャネルに溶液を押し込みます。マイクロ流体チップの出口でPCR産物を回収します。全長8センチ、有効長6センチのキャピラリーを用意します。100マイクロリットルの1%HEC、2マイクロリットルの100x SYBR Green、および98マイクロリットルの超純水を混合して分離バッファーを調製し、1x SYBR Greenを含む0.5%HECを得ます。 真空ポンプを使用して、調製した分離バッファーをキャピラリーに充填します。ソフトウェアインターフェースで注入電圧と注入時間を入力し、スタートボタンをクリックして、PCR産物がキャピラリーに電気力学的に導入されるのを待ちます。ソフトウェアインターフェースにDC電圧を入力し、スタートボタンをクリックして、100ボルト/センチメートルの電界強度で電気泳動を実行します。すべてのDNA断片がキャピラリーで分離されたら、停止ボタンをクリックします。各実行後、キャピラリーを滅菌水で1分間洗い流します。この写真は、PCR産物とDNAマーカーのエレクトロフェログラムを表しています。まず、CF-PCRシステムで大腸菌の標的遺伝子を増幅し、チップの入口から出口まで約10分30秒でPCR溶液を導きました。大腸菌の標的アンプリコンのサイズは544bpであった。その後、増幅したPCR産物をキャピラリー電気泳動システムで分析しました。また、100 bpのDNAラダーのキャピラリー電気泳動も同様の実験条件で行いました。PCR産物のサイズは、DNAラダーのエレクトロフェログラムに従って評価できます。各実験は再現性のために3回行った。この写真のデータは、分離後に大腸菌のPCR産物に対応するピークが観察され、マイクロ流体チップ内のPCR産物の移動時間がサーマルサイクラーのものと一致していることを示しています。PCRとCEはどちらも、核酸の分析において人気のある2つのバイオテクノロジーです。この論文では、自社で構築したCF-PCRおよびCEシステムを使用した大腸菌の増幅とPCR産物の検出について説明します。大腸菌の標的遺伝子は10分以内に増幅され、1, 500 bp未満のDNA断片は8分以内に分離されました。また、本研究で紹介したマイクロ流体チップをベースとしたCF-PCRシステムやCEシステムは、作製が容易であり、実験室での核酸分析を簡便に行うことができる可能性があります。一度に1つのサンプルしか増幅して検出できないため、幅広い用途が制限されます。そのため、病原体をハイスループットで検出するためのCF-PCRとCEマイクロ流体チップアレイの統合開発はまだ進行中です。

Research

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