Name: amplification of escherichia coli in a continuous-flow-pcr microfluidic chip and its detection with a capillary electrophoresis system
Uploaded: 2023-11-21T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Amplification of Escherichia coli in a Continuous-Flow-PCR Microfluidic Chip and Its Detection with a Capillary Electrophoresis System at JoVE.com

Bu çalışma, Çin'in Şanghay Belediyesi Bilim ve Teknoloji Komisyonu tarafından desteklenmiştir (No. 19ZR1477500 ve No.18441900400). Şanghay Bilim ve Teknoloji Üniversitesi'nin (No.2017KJFZ049) mali desteğini minnetle kabul ediyoruz.

NOT: Bu protokolde kullanılan tüm malzemeler, reaktifler ve ekipmanlarla ilgili ayrıntılar için Malzeme Tablosuna bakın.
1. CF-PCR mikroakışkan çipinin üretimi
<ol><li>Nemi gidermek için silikon gofreti 200 °C'de 25 dakika ısıtın.</li>
	<li>Gofretin inç başına 1 mL SU-8-2075 fotorezist dağıtın. 100 rpm/s ivme ile 5-10 s boyunca 500 rpm'de ve ardından 500 rpm/s hızlanma ile 30 s boyunca 2.000 rpm'de bir spin kaplayıcı kullanarak silik...

<ol>
	<li>Li, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=All-in-one+microfluidic+device+for+on-site+diagnosis+of+pathogens+based+on+an+integrated+continuous+flow+PCR+and+electrophoresis+biochip.">All-in-one microfluidic device for on-site diagnosis of pathogens based on an integrated continuous flow PCR and electrophoresis biochip.</a> Lab on a Chip. 19 (16), 2663-2668 (2019).</li><li>Crews, N., Wittwer, C., Gale, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Continuous-flow+thermal+gradient+PCR.">Continuous-flow thermal gradient PCR.</a> Biomedical Microdevices. 10 (2), 187-195 (2008).</li><li>Li, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+and+fabrication+of+portable+continuous+flow+PCR+microfluidic+chip+for+DNA+replication.">Design and fabrication of portable continuous flow PCR microfluidic chip for DNA replication.</a> Biomedical Microdevices. 22 (1), 5 (2019).</li><li>Kim, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fabrication+and+characterization+of+a+PDMS-glass+hybrid+continuous-flow+PCR+chip.">Fabrication and characterization of a PDMS-glass hybrid continuous-flow PCR chip.</a> Biochemical Engineering Journal. 29 (1-2), 91-97 (2006).</li><li>Shen, K., Chen, X., Guo, M., Cheng, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+microchip-based+PCR+device+using+flexible+printed+circuit+technology.">A microchip-based PCR device using flexible printed circuit technology.</a> Sensors and Actuators B: Chemical. 105 (2), 251-258 (2005).</li><li>Harstad, R. K., Johnson, A. C., Weisenberger, M. M., Bowser, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capillary+Electrophoresis.">Capillary Electrophoresis.</a> Analytical Chemistry. 88 (1), 299-319 (2016).</li><li>Redman, E. A., Mellors, J. S., Starkey, J. A., Ramsey, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+intact+antibody+drug+conjugate+variants+using+microfluidic+capillary+electrophoresis-mass+spectrometry.">Characterization of intact antibody drug conjugate variants using microfluidic capillary electrophoresis-mass spectrometry.</a> Analytical Chemistry. 88 (4), 2220-2226 (2016).</li><li>Britz-Mckibbin, P., Kranack, A. R., Paprica, A., Chen, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+assay+for+epinephrine+in+dental+anesthetic+solutions+by+capillary+electrophoresis.">Quantitative assay for epinephrine in dental anesthetic solutions by capillary electrophoresis.</a> Analyst. 123 (7), 1461-1463 (1998).</li><li>Maeda, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+real-time+PCR+using+TaqMan+and+SYBR+Green+for+Actinobacillus+actinomycetemcomitans,+Porphyromonas+gingivalis,+Prevotella+intermedia,+tetQgene+and+total+bacteria.">Quantitative real-time PCR using TaqMan and SYBR Green for Actinobacillus actinomycetemcomitans, Porphyromonas gingivalis, Prevotella intermedia, tetQgene and total bacteria.</a> FEMS Immunology and Medical Microbiology. 39 (1), 81-86 (2003).</li><li>Hajba, L., Guttman, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+column+coatings+for+capillary+electrophoresis+of+proteins.">Recent advances in column coatings for capillary electrophoresis of proteins.</a> TrAC Trends in Analytical Chemistry. 90, 38-44 (2017).</li><li>Kleparnik, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+combination+of+capillary+electrophoresis+with+mass+spectrometry:+methodology+and+theory.">Recent advances in combination of capillary electrophoresis with mass spectrometry: methodology and theory.</a> Electrophoresis. 36 (1), 159-178 (2015).</li></ol>

Hem PCR hem de CE, nükleik asitlerin analizinde iki popüler biyoteknolojidir. Bu makale, her ikisi de şirket içinde yerleşik olan CF-PCR ve CE sistemleri kullanılarak E. coli'nin amplifikasyonunu ve PCR ürünlerinin tespitini açıklamaktadır. E. coli'nin hedef geni, yüksek ısı transfer hızları nedeniyle 10 dakika içinde başarılı bir şekilde amplifiye edildi. 1.500 bp'den küçük DNA parçaları 8 dakika içinde ayrıldı (Şekil 5). Bu iki tekniğin en b...

Polimeraz zincir reaksiyonu (PCR), spesifik DNA fragmanlarını çoğaltmak için kullanılan bir moleküler biyoloji tekniğidir, böylece eser miktarda DNA'yı yüz milyonlarca kez çoğaltır. Klinik tanı, tıbbi araştırma, gıda güvenliği, adli kimlik tespiti ve diğer alanlarda yaygın olarak kullanılmaktadır. PCR işlemi temel olarak üç adımdan oluşur: 90-95 °C'de denatürasyon, 50-60 °C'de tavlama ve 72-77 °C'de uzatma. Termal döngü, PCR sürecinin önemli bir parçasıdır; bununla birlikte, geleneksel PCR termal döngüleyici yalnızca hantal değil, aynı zamanda verimsizdir ve 25 döngüyü tamamlamak için yaklaşık 40 dakika gerektirir. Bu sınırlamaların üstesinden gelmek için, şirket içinde mikroakışkan bir çipe dayalı sürekli akışlı bir PCR (CF-PCR) sistemi kuruldu. CF-PCR, PCR solüsyonunu farklı sıcaklıklardaısıtıcılara yerleştirilen mikro kanallara sürerek zamandan büyük ölçüde tasarruf sağlayabilir 1,2,3,4,5.
Kapiler elektroforez (CE), yüksek çözünürlük, yüksek hız ve mükemmel tekrarlanabilirlik 6,7,8,9,10,11 gibi birçok avantaja sahip olduğundan, laboratuvarda nükleik asitlerin ve proteinlerin analizi için popüler bir araç haline gelmiştir. Bununla birlikte, çoğu laboratuvar, özellikle gelişmekte olan dünyadaki laboratuvarlar, CE cihazının yüksek fiyatı nedeniyle bu teknolojiyi karşılayamaz. Burada, CF-PCR mikroakışkan çipinin nasıl üretileceğine ve laboratuvarda çok yönlü bir CE sisteminin nasıl oluşturulacağına ilişkin protokolleri özetledik. Ayrıca, bu CF-PCR sistemi ile E. coli'nin amplifikasyon sürecini ve PCR ürünlerinin CE sistemi tarafından tespit edilmesini de gösteriyoruz. Bu protokolde açıklanan prosedürleri izleyerek, kullanıcılar mikroakışkan çipler üretebilmeli, PCR çözeltileri hazırlayabilmeli, nükleik asit amplifikasyonu için bir CF-PCR sistemi oluşturabilmeli ve DNA parçalarını ayırmak için sınırlı kaynaklarla bile basit bir CE sistemi kurabilmelidir.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>100 bp DNA ladder</td>
			<td>Takara Bio Inc.</td>
			<td>3422A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x Fast Buffer I</td>
			<td>Takara Bio Inc.</td>
			<td>RR070A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x TBE</td>
			<td>Beijing Solarbio Science &#38; Technology Co., Ltd.</td>
			<td>T1051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>developer solution</td>
			<td>Alfa Aesar, USA</td>
			<td>L15459</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTP mixture (2.5 &#956;M)</td>
			<td>Takara Bio Inc.</td>
			<td>RR070A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EC-F</td>
			<td>Sangon Biotech, Shanghai, China</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EC-R</td>
			<td>Sangon Biotech, Shanghai, China</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEC,1300K</td>
			<td>Sigma-Aldrich, USA</td>
			<td>9004-62-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>isopropanol</td>
			<td>Aladdin, Shanghai, China</td>
			<td>67-63-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microscope</td>
			<td>Olympus, Japan</td>
			<td>BX51</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>photolithography&#160;</td>
			<td>SUSS MicroTec, Germany</td>
			<td>MJB4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>photomultiplier tube&#160;</td>
			<td>Hamamatsu Photonics, Japan</td>
			<td>R928</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>photoresist</td>
			<td>MicroChem, USA</td>
			<td>SU-8 2075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PID temperature controllers&#160;</td>
			<td>Shanghai, China</td>
			<td>XH-W2023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>plasma cleaner&#160;</td>
			<td>Harrick Plasma</td>
			<td>PDC-32G-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>polyvinyl pyrrolidone (PVP)</td>
			<td>Aladdin, Shanghai, China</td>
			<td>P110608</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pump</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>PHD2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>silicone tubing&#160;</td>
			<td>BIO-RAD,USA</td>
			<td>7318210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>solid-state relays</td>
			<td>KZLTD, China</td>
			<td>KS1-25LA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SpeedSTAR HS DNA Polymerase&#160;</td>
			<td>Takara Bio Inc.</td>
			<td>RR070A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>steel needle</td>
			<td>zhongxinqiheng,Suzhou,China</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYBR GREEN <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/63523/63523eq01.jpg" style="margin: auto;" /></td>
			<td>Solarbio, Beijing, China</td>
			<td>SY1020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>temperature sensors</td>
			<td>EasyShining Technology, Chengdu, China</td>
			<td>TCM-M207</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Template (E. coli)</td>
			<td>Takara Bio Inc.</td>
			<td>AK601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Aladdin, Shanghai, China</td>
			<td>T104863</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>voltage power supply&#160;</td>
			<td>Medina, NY, USA</td>
			<td>TREK MODEL 610E</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

amplification of escherichia coli in a continuous-flow-pcr microfluidic chip and its detection with a capillary electrophoresis system

Polimeraz zincir reaksiyonu (PCR), biyomoleküler tanıda önemli bir rol oynayan bir hedef genin amplifikasyonu için kullanılan geleneksel bir yöntemdir. Bununla birlikte, geleneksel PCR, düşük sıcaklık varyasyon verimliliği nedeniyle çok zaman alıcıdır. Bu çalışma, mikroakışkan bir çipe dayalı bir sürekli akış-PCR (CF-PCR) sistemi önermektedir. Amplifikasyon süresi, PCR solüsyonunun farklı sıcaklıklara ayarlanmış ısıtıcılara yerleştirilen bir mikro kanala çalıştırılmasıyla büyük ölçüde azaltılabilir. Ayrıca, kapiler elektroforez (CE), pozitif ve yanlış pozitif PCR ürünlerini ayırt etmenin ideal bir yolu olduğundan, DNA fragmanlarının verimli bir şekilde ayrılmasını sağlamak için bir CE sistemi inşa edilmiştir. Bu makale, Escherichia coli'nin (E. coli) şirket içinde oluşturulan CF-PCR sistemi ile amplifikasyon sürecini ve PCR ürünlerinin CE ile tespitini açıklamaktadır. Sonuçlar, E. coli'nin hedef geninin 10 dakika içinde başarılı bir şekilde amplifiye edildiğini göstermektedir, bu da bu iki sistemin nükleik asitlerin hızlı amplifikasyonu ve tespiti için kullanılabileceğini göstermektedir.

Şekil 5, PCR ürünlerinin elektroferogramını ve DNA belirteçlerini temsil etmektedir. İz (Şekil 5A), CF-PCR ile çoğaltılmış ürünün CE sonucudur, iz (Şekil 5B), termal döngü ile çoğaltılan ürünün CE sonucudur ve iz (Şekil 5C), 100 bp DNA merdiveninin CE sonucudur. İlk olarak CF-PCR sisteminde E. coli'nin hedef genini çoğalttık; PCR çözeltisi, çipin girişinden ç?...

Watch this Scientific Journal Video about Amplification of Escherichia coli in a Continuous-Flow-PCR Microfluidic Chip and Its Detection with a Capillary Electrophoresis System at JoVE.com

Amplification of Escherichia coli in a Continuous-Flow-PCR Microfluidic Chip and Its Detection with a Capillary Electrophoresis System

Bu protokol, bir mikroakışkan çipe dayalı bir sürekli akışlı polimeraz zincir sisteminin nasıl oluşturulacağını ve laboratuvarda bir kapiler elektroforez sisteminin nasıl oluşturulacağını açıklar. Laboratuvarda nükleik asitlerin analizi için basit bir yöntem sunar.

Escherichia coli'nin Sürekli Akış-PCR Mikroakışkan Çipinde Amplifikasyonu ve Kapiler Elektroforez Sistemi ile Tespiti

Polymerase chain reaction (PCR) is a traditional method employed for the amplification of a target gene that has played an important role in biomolecular ...

Bu protokol, mikroakışkan çipe dayalı bir sürekli akışlı polimeraz zincir sisteminin nasıl oluşturulacağını ve laboratuvarda bir kapiler elektroforez sisteminin nasıl oluşturulacağını açıklar. Laboratuvarda nükleik asitlerin analizi için basit bir yol sunar. Polimeraz zincir reaksiyonu, hedef genin amplifikasyonu için kullanılan geleneksel bir yöntemdir.Bununla birlikte, geleneksel PCR, düşük sıcaklık varyasyon verimliliği nedeniyle çok zaman alıcıdır. Bu çalışma, mikroakışkan çipe dayalı bir sürekli akış-PCR sistemi önermektedir. Amplifikasyon süresi, PCR solüsyonunun farklı sıcaklıklara ayarlanmış ısıtıcılara yerleştirilen bir mikro kanala çalıştırılmasıyla büyük ölçüde azaltılabilir.CE, yüksek çözünürlük, yüksek hız ve mükemmel tekrarlanabilirlik gibi birçok avantaja sahip olduğundan, laboratuvarda nükleik asitlerin ve proteinlerin analizi için popüler bir araç haline geldi. Bununla birlikte, çoğu laboratuvar, özellikle gelişmekte olan dünyadaki laboratuvarlar, CE cihazının yüksek fiyatı nedeniyle bu teknolojiyi karşılayamamaktadır. Burada, CF-PCR mikroakışkan çipinin nasıl üretileceğine ve laboratuvarda çok yönlü bir CE sisteminin nasıl oluşturulacağına ilişkin protokolleri özetledik.Ayrıca Escherichia coli'nin CF-PCR sistemi ile amplifikasyon sürecini ve PCR ürünlerinin CE sistemi tarafından tespit edilmesini de gösteriyoruz. Bu protokolde açıklanan prosedürleri izleyerek, kullanıcılar mikroakışkan çipler üretebilmeli, PCR çözeltisi hazırlayabilmeli, nükleik asit amplifikasyonu için bir CF-PCR sistemi oluşturabilmeli ve DNA parçalarını ayırmak için sınırlı kaynaklarla bile basit bir CE sistemi kurabilmelidir. Nemi gidermek için silikon gofreti 200 santigrat derecede 25 dakika ısıtın.Gofretin inç başına bir mililitre SU-8 2075 fotorezist dağıtın. Saniyede 100 rpm'lik bir ivme ile 5 ila 10 saniye boyunca 500 rpm'de ve ardından saniyede 500 rpm'lik bir ivme ile 30 saniye boyunca 2.000 rpm'de bir sıkma kaplayıcı kullanarak silikon gofret üzerinde döndürün. 65 santigrat derecede üç dakika ve 95 santigrat derecede 15 dakika pişirin.Fotolitografi makinesi için pozlama enerjisi olarak santimetre kare başına 150 ila 215 milijoule ayarlayın ve tasarlanan deseni bir fotolitografi maskesi ile fotorezist üzerine kazıyın. Silikon gofret ve maskeyi pozlamaya hazır hale getirin. Maruz kaldıktan sonra, gofreti 65 santigrat derecede iki dakika ve 95 santigrat derecede yedi dakika pişirin.Fazla fotorezisti çıkarmak için silikon gofreti geliştirici solüsyonuna daldırın ve mikrokanallar görülebildiğinde çıkarın. Ardından, kalan geliştirici çözeltisini durulamak için izopropanol kullanın. Polidimetilsiloksan prepolimerini ve sertleştirici maddeyi 10 ila 1 oranında karıştırın.Karışık PDMS çözeltisini replika kalıba dökün ve 80 santigrat derecede 60 dakika katılaştırın. PDMS mikroakışkan çipini bir plazma temizleyici kullanarak aktivasyondan sonra bir slayt üzerine yapıştırın ve mümkün olan en kısa sürede 30 dakika boyunca 80 santigrat derecede katılaştırın. Reaktiflerin iyice karıştığından emin olmak için bir vorteks karıştırıcı ve santrifüj kullanın.Bir santrifüj tüpü hazırlayın. İlk önce santrifüj tüpüne su ekleyin. Ardından DNA şablonunu, primeri, tamponu, dNTP karışımını, Tween 20'yi, PVP'yi ekleyin ve son olarak DNA polimerazı ekleyin.Son olarak, çözeltiyi girdap ile karıştırın. İki PTC seramik ısıtıcı, iki katı hal rölesi, iki sıcaklık kontrol cihazı, iki sıcaklık sensörü ve bir güç kablosu hazırlayın. Isıtıcıyı yarıiletken röleye bağlayın.Katı hal rölesini PID sıcaklık kontrol cihazına bağlayın. Ardından sıcaklık sensörü probunu iki ısıtıcının altına takın ve terminali PID sıcaklık kontrol cihazına bağlayın. Son olarak, iki katı hal rölesini seri olarak bağlayın ve güç kablosunu bağlayın.İki ısıtıcı için bir yuvayı 3D yazdırın ve ısıtıcıları aynı düzlemde tutun. Mikroakışkan çipi iki ısıtıcının üzerine yerleştirin. Bir şırınga pompası ve bir şırınga hazırlayın, ardından şırıngayı şırınga pompasına sabitleyin.Bir şırınga ile bir silikon boru bağlayın ve silikon borunun üstüne çelik bir iğne bağlayın. Çelik iğneyi mikroakışkan çipin girişine yerleştirin. PCR ürünlerini toplamak için çipin çıkışına bir pipet ucu yerleştirin.Darbeli alanlı bir elektrik alanı oluşturmak için yüksek voltajlı bir güç kaynağı kullanın. Bakın, bu yüksek voltajlı bir güç kaynağı. Bunlar pozitif ve negatif elektrotlardır.Işık kaynağı olarak bir cıva lambası kullanın ve cıva lambasından gelen uyarma dalga boyunu bir filtreden geçirin. Kılcal damarı mikroskop tablasına yerleştirin. Floresan emisyonunu objektifle toplayın ve ardından bir fotoçoğaltıcı tüp ile tespit edin.Bu bizim mikroskobumuz ve bu bizim kılcal damarımız. Şimdi karanlık oda koşullarında ışığı açıyoruz. Uyarma ışığı objektif tarafından toplanır.Güç kaynağını kontrol etmek ve veri toplamayı tamamlamak için kendi geliştirdiği LABVIEW yazılımını kullanın. CF-PCR sisteminin ısıtıcılarının sıcaklığını 65 santigrat derece ve 95 santigrat derece olarak önceden ayarlayın. Mikroakışkan çipi iki ısıtma bloğuna yerleştirin.Silikon tüpün ucunu 50 mikrolitre PCR solüsyonu içeren bir santrifüj tüpüne yerleştirin. Çözeltiyi yavaşça çekmek için şırınga pistonunu çekin. Şırıngayı bir şırınga pompasına sabitleyin.Çelik iğneyi mikroakışkan çipin girişine yerleştirin. Pompanın akış hızını dakikada 10 mikrolitreye ayarlayın ve çözeltiyi mikroçipin girişindeki mikrokanala itmek için başlat düğmesine basın. PCR ürünlerini mikroakışkan çipin çıkışında toplayın.Toplam uzunluğu 8 santimetre ve etkili uzunluğu 6 santimetre olan bir kılcal damar hazırlayın. 100 mikrolitre %1 HEC, iki mikrolitre 100x SYBR Green ve 98 mikrolitre ultra saf suyu karıştırarak 1x SYBR Green içeren %0,5 HEC elde ederek ayırma tamponunu hazırlayın. Kılcal damarı bir vakum pompası kullanarak hazırlanan ayırma tamponu ile doldurun.Yazılım arayüzüne enjeksiyon voltajını ve enjeksiyon süresini girin, başlat düğmesine tıklayın ve PCR ürünlerinin elektrodinamik olarak kılcal damara girmesini bekleyin. Yazılım arayüzüne DC voltajını girin, başlat düğmesine tıklayın ve elektroforezi elektrik alan şiddetinin santimetresi başına 100 voltta çalıştırın. Tüm DNA parçaları kılcal damarda ayrıldıktan sonra durdur düğmesine tıklayın.Kılcal damarı her çalıştırmadan sonra bir dakika sterilize suyla yıkayın. Bu resim, PCR ürünlerinin ve DNA belirteçlerinin elektroferogramını temsil etmektedir. İlk olarak Escherichia coli'nin hedef genini CF-PCR sisteminde çoğalttık ve PCR solüsyonu çipin girişinden çıkışına kadar yaklaşık 10 dakika 30 saniye sürdü.Escherichia coli'nin hedef amplikonunun büyüklüğü 544 bp idi. Daha sonra amplifiye edilmiş PCR ürünlerini kapiler elektroforez sisteminde analiz ettik. Ayrıca 100 bp'lik DNA merdiveninin kapiler elektroforezini de aynı deney koşullarında gerçekleştirdik.PCR ürününün boyutu, DNA merdiveninin elektroferogramına göre değerlendirilebilir. Tekrarlanabilirlik için her deney üç kez gerçekleştirildi. Bu resimdeki veriler, Escherichia coli'nin PCR ürünlerine karşılık gelen pik değerin ayrılmadan sonra gözlendiğini ve mikroakışkan çipteki PCR ürünlerinin migrasyon süresinin bir termal döngüleyicideki ile tutarlı olduğunu göstermektedir.Hem PCR hem de CE, nükleik asitlerin analizinde iki popüler biyoteknolojidir. Bu makale, Escherichia coli'nin amplifikasyonunu ve her ikisi de şirket içinde yerleşik olan CF-PCR ve CE sistemleri kullanılarak PCR ürünlerinin tespitini açıklamaktadır. Escherichia coli'nin hedef geni 10 dakika içinde başarılı bir şekilde amplifiye edildi ve 1.500 bp'den küçük DNA fragmanları sekiz dakika içinde ayrıldı.Ayrıca, mikroakışkan çipe dayanan CF-PCR sistemi ve bu çalışmada tanıtılan CE sisteminin üretilmesi kolaydır ve laboratuvarda nükleik asitlerin analizi için basit bir yol sunabilir. Bir seferde yalnızca bir numuneyi büyütebilir ve tespit edebilir, bu da geniş uygulamasını sınırlar. Bu nedenle, patojenlerin yüksek verimli tespiti için entegre bir CF-PCR ve CE mikroakışkan çip dizisinin geliştirilmesi hala yoldadır.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Amplification of Escherichia coli in a Continuous-Flow-PCR Microfluidic Chip and Its Detection with a Capillary Electrophoresis System

Fluorescence detection methods for microfluidic droplet platforms

Mikroakışkan damlacık platformları için Floresan algılama yöntemleri

The development of microfluidic platforms for performing chemistry and biology has in large part been driven by a range of potential benefits that ...

A Microfluidic Chip for the Versatile Chemical Analysis of Single Cells

Tek Hücrelerinin yönlü Kimyasal Analiz için mikroakışkan Chip

We present a microfluidic device that enables the quantitative determination of intracellular biomolecules in multiple single cells in parallel. For this ...

Microfluidic Fabrication of Polymeric and Biohybrid Fibers with Predesigned Size and Shape

Önceden Tasarlanmış Boyut ve Şekle Sahip Polimerik ve Biyohidred Elyafların Mikroakışkan İmalatı

A &#8220;sheath&#8221; fluid passing through a microfluidic channel at low Reynolds number can be directed around another &#8220;core&#8221; stream and ...

A Microfluidic Chip for ICPMS Sample Introduction

ICPMS Numune Giriş için mikroakışkan Chip

This protocol discusses the fabrication and usage of a disposable low cost microfluidic chip as sample introduction system for inductively coupled plasma ...

Electrotaxis Studies of Lung Cancer Cells using a Multichannel Dual-electric-field Microfluidic Chip

Bir Çok Kanallı Çift elektrik alan mikroakışkan Chip kullanarak Akciğer Kanseri Hücreleri Electrotaxis Çalışmaları

The behavior of directional cell migration under a direct current electric-field (dcEF) is referred to as electrotaxis. The significant role of ...

Co-culture of Living Microbiome with Microengineered Human Intestinal Villi in a Gut-on-a-Chip Microfluidic Device

içinde Microengineered İnsan Bağırsak Villi Oturma mikrobiyomu Co-kültür, bir Gut-on-a-Chip mikroakışkan Aygıt

Here, we describe a protocol to perform long-term co-culture of multi-species human gut microbiome with microengineered intestinal villi in a human ...

Microfluidic Platform with Multiplexed Electronic Detection for Spatial Tracking of Particles

Parçacıkların Mekansal Takip için Çoklanmış Elektronik Algılama ile mikroakışkan Platformu

Microfluidic processing of biological samples typically involves differential manipulations of suspended particles under various force fields in order to ...

Dry Film Photoresist-based Electrochemical Microfluidic Biosensor Platform: Device Fabrication, On-chip Assay Preparation, and System Operation

Kuru zar elektrokimyasal mikrosıvısal Biyoalgılayıcı fotorezist tabanlı Platform: Cihaz imalat, On-chip tahlil hazırlama ve sistemin çalışması

In recent years, biomarker diagnostics became an indispensable tool for the diagnosis of human disease, especially for the point-of-care diagnostics. An ...

Fabrication and Validation of an Organ-on-chip System with Integrated Electrodes to Directly Quantify Transendothelial Electrical Resistance

İmalat ve Organ-on-chip sistemin doğrudan Transendothelial elektrik direncini ölçmek için entegre elektrotlar ile doğrulama

Organs-on-chips, in vitro models involving the culture of (human) tissues inside microfluidic devices, are rapidly emerging and promise to provide useful ...

Visual Detection of Multiple Nucleic Acids in a Capillary Array

Birden çok nükleik asit kapiller bir dizi görsel algılama

Multi-target, short time, and resource-affordable methodologies for the detection of multiple nucleic acids in a single, easy to operate test are urgently ...