Name: isolation of group 2 innate lymphoid cells from mouse nasal mucosa to detect the expression of cd226
Uploaded: 2022-05-10T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Group 2 Innate Lymphoid Cells from Mouse Nasal Mucosa to Detect the Expression of CD226 at JoVE.com

R.Z. was supported by the National Natural Science Foundation of China (No. 81871258) and funds provided by Fourth Military Medical University (No.2020rcfczr). Y.Z. was supported by the Natural Science Basic Research Program of Shaanxi (No. 2021JM-081).

All experiments were performed in accordance with the Care and Use of Laboratory Animals Guidelines. All procedures and protocols were approved by the Scientific Research Ethics Committee of the Fourth Military Medical University (No. 20211008).
1. Murine AR model establishment
<ol>
	<li>House male and female wild-type (WT) C57BL/6 mice aged 8-12 weeks under specific pathogen-free conditions and provide standard laboratory chow and water.</li>
	<li>Emulsify 50 &#181;g of ova...

ILC2s are closely associated with type 2 inflammation and inflammatory disorders, as demonstrated by an increasing number of studies. Both mouse models and human observation contribute to a better understanding of its function in the upper airway. In asthma pathophysiology, ILC2s are activated through thymic stromal lymphopoietin, IL-25, and IL-33, which are mostly produced by epithelial cells. Then mirroring Th2 cells, ILC2s produce IL-4, IL-5, and IL-13 to aggravate type 2 inflammation32. Furthe...

Group 2 innate lymphoid cells (ILC2s) were first discovered in the peritoneal cavity tissues of mice and were subsequently demonstrated to be present in the blood and other peripheral tissues such as the lungs, skin, and nasal cavity1,2,3. As tissue-resident cells, ILC2s are mainly maintained and proliferated locally and function as the first guards responding to exogenous harmful stimuli through producing numerous type 2 cytokines and inducing type 2 immunity4,5,6. ILC2s can also exert their effects by trafficking toward the infected tissues7,8.
Similar to T-helper 2 (Th2) cells, the complicated regulatory networks of ILC2s ensure their significant involvement in the progression of various type 2 inflammatory diseases, including airway allergic diseases8,9. In asthma, epithelial cell-derived alarmins can activate ILC2s, which further promote pulmonary inflammation through the secretion of interleukin (IL)-4, IL-5, and IL-1310. Clinical studies have also indicated that ILC2 levels were significantly elevated in the sputum and blood of patients with severe asthma, suggesting an association of ILC2s with asthma severity and their function as a predictor of asthma progression11.
Allergic rhinitis (AR) is a common chronic inflammatory disease that affects millions of people annually, and effective treatments for this disease are limited12,13. ILC2s play crucial roles in the pathophysiology of AR, whether in the sensitization phase or symptom generation and inflammation phase14. In patients with AR, the levels of ILC2 in the peripheral blood have been reported to be elevated both locally and systemically15. However, certain effects and the underlying mechanisms of ILC2s on the pathophysiology and progression of AR still require further exploration.
CD226 - a transmembrane glycoprotein that serves as a costimulatory molecule - is primarily expressed on natural killer (NK) cells, T cells, and other inflammatory monocytes16,17. The interaction of CD226 and its ligands (CD155 and/or CD112) or competitor (TIGIT) allows it to participate in the biological functions of various immune cells18. The binding of the ligands on antigen-presenting cells to CD226 on cytotoxic lymphocyte (CTL) promotes the activation of both cells simultaneously, while the activation of CTL can be further suppressed by TIGIT (T cell immunoreceptor with Ig and ITIM domains), the competitor of CD22619,20. A human ex vivo study revealed that CD226 and CD155 on T cells regulate the balance between Th1/Th17 and Th2 through differentially modulating Th subsets21. CD226 can likewise mediate platelet adhesion and NK tumor-killing activity22,23. Meanwhile, CD226 is well-studied in the pathogenesis of various infectious diseases, autoimmune diseases, and tumors18,24,25. At present, CD226 has become a new bright spot for immunotherapy. Studies have found that extracellular vesicles can reverse CD226 expression on NK cells to reinstate their cytotoxic activity and intervene in the progression of lung cancer26. A recent study has revealed a subcluster of fetal intestinal group 3 ILCs characterized with high CD226 expression by single-cell RNA sequencing27, which indicated that CD226 might exert roles in the innate lymphoid cell-mediated immunity.
Our knowledge about ILC2s in airway inflammation is primarily based on studies on asthma; however, little is known about their functions in nasal mucosal immunity. Thus, a protocol was established to isolate and identify ILC2s from the nasal mucosa. The study focuses on the expression of CD226 on ILC2s in nasal tissues and its variation between healthy and AR mice. This may provide novel insights into the underlying mechanisms of ILC2-mediated regulation in the local immunity and serve as a basis for developing new approaches for AR treatment.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Aluminum hydroxide</td>
			<td>Meilun biological Technology</td>
			<td>21645-51-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD11b</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>11-0112-82</td>
			<td>Used in antibody coctail</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD11c</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>117306</td>
			<td>Used in antibody coctail</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD16/32</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>101302</td>
			<td>Clone: 93; Dilution 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD226</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>128812</td>
			<td>Used in antibody coctail</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD3e</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>100306</td>
			<td>Used in antibody coctail</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD45</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>103128</td>
			<td>Used in antibody coctail</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD45R</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>11-0452-82</td>
			<td>Used in antibody coctail</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD90.2</td>
			<td>BD Pharmingen</td>
			<td>553014</td>
			<td>Used in antibody coctail</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase IV</td>
			<td>DIYIBio</td>
			<td>DY40128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CountBright absolute counting beads</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C36950</td>
			<td>absolute counting beads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dnase <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/63525/63525eq01v2.jpg" style="margin: auto;" /></td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>D7076</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>gibco</td>
			<td>10270-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fixable Viability Dye eFluor 520 (FITC)</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>65-0867-14</td>
			<td>FVD</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS, calcium, magnesium</td>
			<td>Servicebio</td>
			<td>G4204-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KLRG1</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>17-5893-81</td>
			<td>Used in antibody coctail</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaN3</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>S2002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NovoExpress software</td>
			<td>AgilentTechnologies</td>
			<td>Version 1.5.0</td>
			<td>flow cytometry (FCM) analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OVA</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>9006-59-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS, 1x</td>
			<td>Servicebio</td>
			<td>G4202-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS, 10x</td>
			<td>Servicebio</td>
			<td>G4207-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Percoll</td>
			<td>Yeasen</td>
			<td>40501ES60</td>
			<td>density gradient media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 culture media</td>
			<td>Corning</td>
			<td>10-040-CVRV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectral cell analyzer</td>
			<td>SONY</td>
			<td>SA3800</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of group 2 innate lymphoid cells from mouse nasal mucosa to detect the expression of cd226

With abundant research on group 2 innate lymphoid cells (ILC2s) published over the years, ILC2s are widely known to be implicated in regulating various pathological processes, including anti-helminth immunity, tissue repair, thermogenesis, and autoimmune diseases such as asthma and allergic rhinitis (AR). ILC2s permanently reside in peripheral tissues such as the skin, gut, lungs, and nasal cavity; however, there is limited information about their exact functions in nasal mucosal immunity. CD226 is an activating costimulatory molecule, mainly expressed on natural killer (NK) cells, T cells, and inflammatory monocytes. However, whether ILC2s express CD226 or play a role in the pathogenesis of ILC2s-related diseases remains unknown. Here, we established a method to isolate and identify ILC2s from the nasal mucosa and detected CD226 expression on ILC2s obtained from healthy and AR mice. Herein, we describe this protocol for the isolation and identification of ILC2s from mouse nasal mucosa, which will help explore the internal pathological mechanism of immunological disorders in nasal mucosal diseases.

An OVA-induced murine model was developed to explore the role of ILC2s in AR. The construction of AR murine model was based on previous studies with slight modifications28,29,30,31. A 10 min video was captured to measure the frequency of sneezing and nasal scratching after the last nasal challenge. Allergic symptoms of the OVA-induced-AR mice were presented in Figure 1</str...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Group 2 Innate Lymphoid Cells from Mouse Nasal Mucosa to Detect the Expression of CD226 at JoVE.com

Isolation of Group 2 Innate Lymphoid Cells from Mouse Nasal Mucosa to Detect the Expression of CD226

Group 2 innate lymphoid cells (ILC2s), implicated in type 2 inflammation, mainly participate in response to helminth infection, allergic diseases, metabolic homeostasis, and tissue repair. In this study, a procedure to isolate ILC2s from murine nasal mucosa and detect the expression of CD226 is demonstrated.

With abundant research on group 2 innate lymphoid cells (ILC2s) published over the years, ILC2s are widely known to be implicated in regulating various ...

이 프로토콜은 쥐 비강 점막에서 그룹 2 선천성 림프 세포를 분리 및 식별하고 비강 질환에서 ILC 2의 특정 효과 및 기본 메커니즘을 탐색하기 위해 확립되었습니다. 이 기술을 통해 연구자들은 국소 중피에서 ILC 2를 분리하고 유세포 분석을 통해 표면 항원의 발현을 노출시킬 수 있습니다. 우리의 기술에는 복잡한 작업이 포함되지 않습니다.그러나, 한 가지 중요한 것은 다른 주변 조직의 영향을 피하기 위해 작은 뼈에 붙어있는 살을 완전히 제거하려고 노력하는 것입니다 실험을 시작하기 전에, 8 내지 12 주령의 야생형 C57 검정 6 마리의 수컷 및 암컷 마우스를 표준 실험실 차우와 물이 제공된 특정 병원체가없는 조건 하에서 집어 넣었다. 알레르기성 비염 모델을 확립하기 위해, 2mg의 수산화알루미늄을 함유한 0.2 밀리리터의 멸균 PBS에 50 마이크로그램의 오브알부민을 유화시키고, 0일, 7 및 14일에 각 마우스에 50 마이크로그램의 유화된 오브알부민을 복강 주사한다. 21일, 22일, 23일, 24일 및 25일에 30마이크로리터의 멸균 PBS에 용해된 50마이크로그램의 오브알부민을 마우스에 비강 내 주입한 다음, 마지막 챌린지 후 24시간 후에 마우스를 안락사시켰다.안락사된 쥐의 머리를 75% 에탄올에 5분 동안 담그고 에탄올이 외부 콧구멍으로 들어가지 않도록 합니다. 복부를 수술대에 아래쪽으로 놓습니다. 4 개의 치아를 잘라 내고 머리의 정중선을 절개하고 가위로 피부를 자릅니다.그런 다음 아래턱을 제거하고 입천장 끝을 따라 코 전체를 잘라낸 다음 5리터의 얼음처럼 차가운 PBS가 들어 있는 60mm 페트리 접시에 조직을 넣습니다. 가위와 집게를 사용하여 뼈에 붙어있는 살과 근육을 제거하십시오. 다음으로, 5 밀리리터의 얼음처럼 차가운 PBS가 들어있는 새로운 60 밀리미터 페트리 접시에 마우스 코를 옮기고 뼈를 씻으십시오.두 번째 세척 후 코를 1.5 밀리리터 마이크로 원심 분리기 튜브로 옮깁니다. 조직을 충분히 부수고 2 밀리리터의 예열 된 소화 완충액이 들어있는 15 밀리리터 튜브로 옮깁니다. 뚜껑을 덮고 튜브를 섭씨 37도, 120-150RPM의 궤도 셰이커에 수직으로 40분 동안 놓습니다.다음으로, 소화를 멈추기 위해 10% 소 태아 혈청을 함유한 얼음처럼 차가운 RPMI 1640 배지 5밀리리터를 추가합니다. 그런 다음 70미크론 셀 스트레이너를 통해 내용물을 여과하여 고체 조각을 제거합니다. 여과액을 500G에서 5분 동안 원심분리한 후, 상층액을 부드럽게 버리고 펠릿을 얼음처럼 차가운 RPMI 1640 배지에 재현탁시켰다.앞에서 설명한 대로 원심분리를 반복하려면 40% 밀도 구배 배지 4밀리리터에 세포 펠릿을 재현탁합니다. 그런 다음 파스퇴르 피펫을 튜브 바닥에 부드럽게 삽입하여 2.5ml의 80% 밀도 구배 매체를 추가합니다. 튜브를 400G에서 실온에서 15분 동안 원심분리하고 가속 및 감속 속도를 3단 기어보다 낮게 설정합니다.계면에서 셀을 배출하기 전에 잠재적인 오염을 방지하기 위해 불순물의 최상층을 제거하십시오. 그런 다음 피펫을 사용하여 40% x 80% 밀도 구배 매체 계면의 단핵 세포층을 2밀리리터의 얼음이 들어 있는 15밀리리터 튜브로 배출합니다. 세포를 얼음처럼 차가운 PBS로 2회 세척한다.세포를 수확하고 섭씨 4도에서 500G에서 5분 동안 원심분리합니다. 세포 펠렛을 염색 완충액에 재현탁하고 500G에서 5분 동안 다시 원심분리하여 상층액을 버립니다. 세포를 80 마이크로리터 차단 용액에 재현탁하고 어두운 조건에서 섭씨 4도에서 30분 동안 배양한다.적절한 희석액의 20 마이크로리터의 표면 염색 항체 칵테일을 샘플에 첨가하기 직전에 1 마이크로리터의 고정가능한 생존성 염료 520을 첨가한다. 또한 일치하는 이소타입 항체와 형광 마이너스 1을 음성 대조군으로 설정합니다. 다음으로, 섭씨 4도에서 5분 동안 500배 G에서 원심분리하여 500 마이크로리터의 염색 완충액으로 세포를 세척한다.그런 다음 세포 펠릿을 200 마이크로리터의 염색 완충액에 재현탁합니다. 마지막으로, 50 마이크로리터의 와류된 절대 계수 비드를 염색된 세포에 추가합니다. 교반하고 유세포 분석 대상에 적용합니다.그룹 2 선천성 림프 세포의 역할을 탐색하기 위해 개발된 난자 유도 쥐 모델은 알레르기성 비염 마우스에서 비강 마찰 및 재채기 빈도가 대조군보다 유의하게 더 높은 것으로 나타났습니다. 건강한 대조군 마우스의 코 점막에서 약 2 내지 3%의 계통 음성 및 CD 45 양성 세포가 확인되었다. 그룹 2 선천성 림프 세포의 절대 수는 2, 000에서 4, 000까지 다양했습니다.유세포 분석 결과, 알러지성 비염 코 점막에서 건강한 대조군 마우스에 비해 그룹 2 선천성 림프 세포의 총 수가 현저하게 증가한 것으로 나타났습니다. CD 226의 더 높은 발현은 대조군 마우스에서보다 알러지성 비염 마우스에서 2개의 선천성 림프 세포군에서 검출되었다. 또한, CD 226의 평균 형광 강도는 AR 마우스에서 유의하게 상향 조절되었다.비강 뼈에 부착 된 살을 제거하고, 배지를 원심 분리하고, 단핵 세포를 배출 할 때 가속 및 감속 속도를 설정하는 단계를 알고 있어야합니다. 확인된 ILC 2는 세포 배양을 위해 분류되거나 시험관 내에서 자극되는 유세포 분석 특성 분석을 위한 스탠드가 될 수 있으며, 이는 비강 조직에서 ILC 2의 특정 위험을 탐색하는 데 도움이 될 것입니다. 특히 비강 점막의 선천성 림프 세포에서 림프구를 분리하고 특성화하는 이 절차는 이 프로토콜을 국소 비강 면역 환경을 탐구하는 연구자들을 위한 예비 참고 자료로 만듭니다.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Isolation of Mouse Lung Dendritic Cells

마우스 폐에 돌기 세포의 분리

Lung dendritic cells (DC) play a fundamental role in sensing invading pathogens 1,2 as well as in the control of tolerogenic responses 3 in the ...

연구

면역학 및 감염병학

Isolation and Characterization of Dendritic Cells and Macrophages from the Mouse Intestine

마우스 소장에서 돌기 세포 및 Macrophages의 분리 및 특성화

Within the intestine reside unique populations of innate and adaptive immune cells that are involved in promoting tolerance towards commensal flora and ...

Differentiating Functional Roles of Gene Expression from Immune and Non-immune Cells in Mouse Colitis by Bone Marrow Transplantation

골수 이식으로 마우스 대장염에서 면역 및 비 면역 세포에서 유전자 발현의 기능 역할을 차별화

To understand the role of a gene in the development of colitis, we compared the responses of wild-type mice and gene-of-interest deficient knockout mice ...

Isolation of Lymphocytes from Mouse Genital Tract Mucosa

마우스 성기 요로 점막에서 림프구의 분리

Mucosal surfaces, including in the gastrointestinal, urogenital, and respiratory tracts, provide portals of entry for pathogens, such as viruses and ...

Using RNA-interference to Investigate the Innate Immune Response in Mouse Macrophages

마우스 대 식세포의 타고난 면역 반응을 조사하기 위해 RNA 간섭을 사용하여

Macrophages are key phagocytic innate immune cells.  When macrophages encounter a pathogen, they produce antimicrobial proteins and compounds to kill the ...

In Vitro Generation of Murine Plasmacytoid Dendritic Cells from Common Lymphoid Progenitors using the AC-6 Feeder System

In Vitro Generation of Murine Plasmacytoid Dendritic Cells from Common Lymphoid Progenitors using the AC-6 Feeder System

AC-6 공급 시스템을 사용하여 일반 림프 전구 세포에서 쥐 형질 수지상 세포의 체외 세대

Plasmacytoid dendritic cells (pDCs) are powerful type I interferon (IFN-I) producing cells that are activated in response to infection or during ...

Nasal Wipes for Influenza A Virus Detection and Isolation from Swine

돼지에서 인플루엔자 바이러스 탐지 및 격리를위한 코 닦음

Surveillance for influenza A viruses in swine is critical to human and animal health because influenza A virus rapidly evolves in swine populations and ...

Isolation and Flow Cytometric Analysis of Immune Cells from the Ischemic Mouse Brain

허혈성 마우스 뇌에서 면역 세포의 분리 및 유세포 분석

Ischemic stroke initiates a robust inflammatory response that starts in the intravascular compartment and involves rapid activation of brain resident ...

Mouse Models Of Helicobacter Infection And Gastric Pathologies

Mouse Models Of Helicobacter Infection And Gastric Pathologies

헬리코박터 감염과 위 Pathologies의 마우스 모델

Helicobacter pylori is a gastric pathogen that is present in half of the global population and is a significant cause of morbidity and mortality in ...