Name: flexible organic electronic devices for pulsed electric field therapy of glioblastoma
Uploaded: 2022-08-09T13:00:00
Duration: 11 min 2 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Flexible Organic Electronic Devices for Pulsed Electric Field Therapy of Glioblastoma at JoVE.com

Det arbejde, der rapporteres her, blev støttet af det franske nationale forskningsagentur (ANR-18-CE19-0029). Forfatterne takker varmt S.M. Bardet for hendes bidrag til genereringen af en stabil GCaMP6f-cellelinje og D. O'Connor for hendes hjælp med in ovo-modellen .

<ol>
	<li>Koshy, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+survival+time+trends+for+glioblastoma+using+the+SEER+17+population-based+registries.">Improved survival time trends for glioblastoma using the SEER 17 population-based registries.</a> Journal of Neuro-Oncology. 107 (1), 207-212 (2012).</li><li>Davis, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glioblastoma:+Overview+of+disease+and+treatment.">Glioblastoma: Overview of disease and treatment.</a> Clinical Journal of Oncology Nursing. 20, 2-8 (2016).</li><li>Edd, J. F., Horowitz, L., Davalos, R. V., Mir, L. M., Rubinsky, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+results+of+a+new+focal+tissue+ablation+technique:+irreversible+electroporation.">In vivo results of a new focal tissue ablation technique: irreversible electroporation.</a> IEEE transactions on Bio-Medical Engineering. 53 (7), 1409-1415 (2006).</li><li>Breton, M., Mir, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microsecond+and+nanosecond+electric+pulses+in+cancer+treatments.">Microsecond and nanosecond electric pulses in cancer treatments.</a> Bioelectromagnetics. 33 (2), 106-123 (2012).</li><li>Frandsen, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+therapeutic+applications+of+calcium+electroporation+to+effectively+induce+tumor+necrosis.">Direct therapeutic applications of calcium electroporation to effectively induce tumor necrosis.</a> Cancer Research. 72 (6), 1336-1341 (2012).</li><li>Lee, J. H., Kim, H., Kim, J. H., Lee, S. -. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Soft+implantable+microelectrodes+for+future+medicine:+prosthetics,+neural+signal+recording+and+neuromodulation.">Soft implantable microelectrodes for future medicine: prosthetics, neural signal recording and neuromodulation.</a> Lab on a Chip. 16 (6), 959-976 (2016).</li><li>Lee, H., Bellamkonda, R. V., Sun, W., Levenston, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomechanical+analysis+of+silicon+microelectrode-induced+strain+in+the+brain.">Biomechanical analysis of silicon microelectrode-induced strain in the brain.</a> Journal of Neural Engineering. 2 (4), 81-89 (2005).</li><li>Fattahi, P., Yang, G., Kim, G., Abidian, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+review+of+organic+and+inorganic+biomaterials+for+neural+interfaces.">A review of organic and inorganic biomaterials for neural interfaces.</a> Advanced Materials. 26 (12), 1846-1885 (2014).</li><li>Lecomte, A., Degache, A., Descamps, E., Dahan, L., Bergaud, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+and+in+vivo+biostability+assessment+of+chronically-implanted+Parylene+C+neural+sensors.">In vitro and in vivo biostability assessment of chronically-implanted Parylene C neural sensors.</a> Sensors and Actuators B: Chemical. 251, 1001-1008 (2017).</li><li>Dijk, G., Ruigrok, H. J., O'Connor, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PEDOT:PSS-coated+stimulation+electrodes+attenuate+irreversible+electrochemical+events+and+reduce+cell+electropermeabilization.">PEDOT:PSS-coated stimulation electrodes attenuate irreversible electrochemical events and reduce cell electropermeabilization.</a> Advanced Materials Interfaces. 8 (19), 2100214 (2021).</li><li>Chen, T. -. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultra-sensitive+fluorescent+proteins+for+imaging+neuronal+activity.">Ultra-sensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity.</a> Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).</li><li>Ribatti, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+5+Chick+embryo+chorioallantoic+membrane+as+a+useful+tool+to+study+angiogenesis.">Chapter 5 Chick embryo chorioallantoic membrane as a useful tool to study angiogenesis.</a> International Review of Cell and Molecular Biology. 270, 181-224 (2008).</li><li>Valdes, T. I., Kreutzer, D., Moussy, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chick+chorioallantoic+membrane+as+a+novel+in+vivo+model+for+the+testing+of+biomaterials.">The chick chorioallantoic membrane as a novel in vivo model for the testing of biomaterials.</a> Journal of Biomedical Materials Research. 62 (2), 273-282 (2002).</li><li>Ricard, C., Stanchi, F., Rougon, G., Debarbieux, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+orthotopic+glioblastoma+mouse+model+maintaining+brain+parenchymal+physical+constraints+and+suitable+for+intravital+two-photon+microscopy.">An orthotopic glioblastoma mouse model maintaining brain parenchymal physical constraints and suitable for intravital two-photon microscopy.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (86), e51108 (2014).</li><li>Lefevre, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrating+flexible+electronics+for+pulsed+electric+field+delivery+in+a+vascularized+3D+glioblastoma+model.">Integrating flexible electronics for pulsed electric field delivery in a vascularized 3D glioblastoma model.</a> npj Flexible Electronics. 5, 19 (2021).</li><li>Perry, J. L., Ramachandran, N. K., Utama, B., Hyser, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+genetically-encoded+calcium+indicators+for+live+cell+calcium+imaging+and+localization+in+virus-infected+cells.">Use of genetically-encoded calcium indicators for live cell calcium imaging and localization in virus-infected cells.</a> Methods. 90, 28-38 (2015).</li><li>Bl&#246;mer, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+and+sustained+gene+transfer+in+adult+neurons+with+a+lentivirus+vector.">Highly efficient and sustained gene transfer in adult neurons with a lentivirus vector.</a> Journal of Virology. 71 (9), 6641-6649 (1997).</li><li>Lenting, K., Verhaak, R., ter Laan, M., Wesseling, P., Leenders, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glioma:+experimental+models+and+reality.">Glioma: experimental models and reality.</a> Acta Neuropathologica. 133 (2), 263-282 (2017).</li><li>Hickman, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+models+of+cancer+for+pharmacology+and+cancer+cell+biology:+Capturing+tumor+complexity+in+vitro/ex+vivo.">Three-dimensional models of cancer for pharmacology and cancer cell biology: Capturing tumor complexity in vitro/ex vivo.</a> Biotechnology Journal. 9 (9), 1115-1128 (2014).</li><li>Tay, S. L. M., Heng, P. W. S., Chan, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+CAM-LDPI+method:+a+novel+platform+for+the+assessment+of+drug+absorption.">The CAM-LDPI method: a novel platform for the assessment of drug absorption.</a> Journal of Pharmacy and Pharmacology. 64 (4), 517-529 (2012).</li><li>Kundekov&#225;, B., M&#225;&#269;ajov&#225;, M., Meta, M., &#268;avarga, I., Bil&#269;&#237;k, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chorioallantoic+Membrane+Models+of+Various+Avian+Species:+Differences+and+Applications.">Chorioallantoic Membrane Models of Various Avian Species: Differences and Applications.</a> Biology. 10 (4), 301 (2021).</li><li>Ricard, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+dynamics+of+microglial+and+monocyte-derived+cells+in+glioblastoma-bearing+mice.">Phenotypic dynamics of microglial and monocyte-derived cells in glioblastoma-bearing mice.</a> Scientific Reports. 6 (1), 26381 (2016).</li></ol>

Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen konkurrerende økonomiske interesser.

Den tilgang, der beskrives i dette arbejde, gør det muligt for hjernetumormodeller med et integreret PEF-leveringssystem at studere effekten af PEF'er på forskellige niveauer af biologisk organisation. Mikrofabrikationsprotokollen består af standard tyndfilmsprocesser, som giver en stor grad af frihed i elektrodedesign, der kan tilpasses den specifikke applikation. Nogle gange kan et ekstra termisk udglødningstrin være nyttigt i slutningen af fremstillingen for at reducere bøjning af elektroderne, der opstod under fremstillingen.
Anvendelsen af en stabil glioblastomcellelinje, der udtrykker en fluorescerende calciumindikator, undgår alle komplikationer forbundet med farvestofafgivelse og tilbageholdelse, især i 3D-tumorer, der er meget tætte16. Faktisk observeres et højt ekspressionsniveau over en lang periode sammenlignet med standard kemiske fluorescerende calciumindikatorer17. Denne protokol kan anvendes på forskellige cellelinjer, da den almindeligvis bruges til billeddannelse af neural aktivitet11. Her blev humane og murine cellelinjer anvendt (U87 og Gl261 til implantation i henholdsvis immundeficiente eller immunkompetente mus). Faktisk viste nylige undersøgelser, at U87-cellelinjen er forskellig fra de oprindelige celler, da mange mutationer blev erhvervet over mange års cellekultur, hvilket påvirker eksperimentel reproducerbarhed18. Metoden, der anvendes til fremstilling af 3D-tumorer, er høj gennemstrømning, reproducerbar og tillader generering af sfæroider af en bestemt størrelse afhængigt af cellelinjen, antallet af celler ved såning og væksttidspunktet19. Imidlertid er disse sfæroider tætte, hvilket giver en ulempe ved billeddannelse i kernen af tumoren.
In ovo-modellen er nyttig som en første tilgang til at studere effekten af PEF på 3D-tumorer og deres vaskulatur uden interaktioner med andre celletyper, der er til stede i hjernen. Denne model er billig, hurtig, høj gennemstrømning og rejser færre etiske spørgsmål end dyremodeller. Det er vigtigt at bevare embryonets integritet under hele forsøget, da det kan påvirke dets overlevelse og billeddannelsens kvalitet. Der skal udvises særlig forsigtighed ved åbning af vagtelæget for at undgå skader på embryonmembranen. Transplantatet og placeringen af de fleksible elektroder skal også udføres omhyggeligt for at undgå blødning, der kan dræbe embryoet. Injektion af fluorescerende farvestof i blodkarrene muliggør samtidig visualisering af tumorcellerne og vaskularisering med fluorescensmikroskopi. Den intraokulære injektion skal udføres omhyggeligt for at undgå, at farvestof lækker ind i den embryonale væske, hvilket kan forårsage en resterende fluorescens i baggrunden, der forringer billeddannelsens kvalitet. Denne model kan også bruges til at følge lægemiddeloptagelse, da den giver adgang til kredsløbssystemet. Forsøgene er imidlertid begrænset af embryoets 12-dages overlevelsestid, hvilket giver mulighed for 7 dages observation, hvilket er betydeligt kortere end in vivo-modellen 21.
In vivo hjernetumormodellen kan overvåges i 4 til 5 uger, før dyr når et etisk eksperimentelt endepunkt bestemt af et pludseligt vægttab på 20%. Det tolereres godt og forbliver på plads, hvis elektrodens forbindelseshale ikke er for lang. Ellers har dyr en tendens til at ridse flipping-stikket, som i sidste ende kan blive revet og dermed forhindre efterfølgende forbindelse til stimulatoren. Denne 4-ugers periode er ikke desto mindre værdifuld for at dække de forskellige stadier af glioblastomudvikling. Ved sammenligning af tumorcelletæthederne i samme interessevolumen ved forskellige tidsintervaller kan udviklingen af tumorvækstkinetikken observeres. Især blev forbedret tumorvækst observeret på tidspunktet for immunkontakten22. En lignende undersøgelse i nærvær af en stimulerende elektrode ville informere om virkningen af PEF på tumorproliferation hastighed og tumorfølsomhed over for immunelimination. I sammenligning med in ovo-modellen kan in vivo-modellen ses som en værdifuld præklinisk model til at studere immuncellers indvirkning på tumorprogression og deres bidrag til den terapeutiske effekt af PEF. Denne protokol er tilpasset fra en tidligere artikel med tilsætning af en fleksibel elektrodeanordning på tumoren, inden der placeres et kranievindue14. Både de akutte og kroniske bioelektriske behandlinger af tumorer kan karakteriseres ved direkte og efterfølgende observationer med to-fotonmikroskopi, da indledende stimulering forventes at fremkalde celledød og udløse varig dysregulering af immunresponset.
Forbindelserne af den fleksible sonde er let tilgængelige under to-fotonmikroskopet. Elektriske stimuleringsparametre kan således justeres i realtid baseret på den observerede effekt på det neurale væv og / eller de målrettede celler, svarende til hvordan en læge ville udføre interventionelle procedurer, mens han observerede MR- eller CT-billeder af sin patient. En sidste overvejelse er vigtigheden af omhyggelig forsegling af elektroden på hjernen med superlim og silikonelim for at forhindre vævsgenvækst.
Afslutningsvis repræsenterer protokollen beskrevet her en innovativ model til undersøgelse af effekten af PEF-terapi med fleksible organiske polymerelektroder til glioblastomtumormodeller. De to modeller udviser forskellige niveauer af kompleksitet, således at cellulære, vaskulære eller immuneffekter kan adskilles for en bedre forståelse af virkningsmekanismerne. Konforme, overfladiske elektroder reducerer iatrogen skade, samtidig med at de muliggør forstyrrelse af tumormikromiljøet, hvilket udløser vasokonstriktion eller dysregulering af intracellulært calcium15.

Glioblastoma multiforme (GBM) er en meget invasiv tumor og derfor vanskelig at udrydde med standardbehandlinger såsom resektion, strålebehandling og kemoterapi. På trods af multimodale behandlinger er prognosen fortsat meget dårlig, og de fleste patienter oplever sygdomsprogression inden for 1 år efter diagnose 1,2. For nylig har udviklingen af bioelektriske behandlinger vist stort potentiale for at forbedre eksisterende terapier. Disse terapier bruger levering af pulserende elektriske felter (PEF), typisk i en enkelt behandlingssession, for at forstyrre cellulær membranintegritet og mikromiljøet af tumorer. Denne cellemembranforstyrrelse, også kendt som elektroporation, kan være reversibel eller irreversibel afhængigt af den elektriske feltintensitet og antallet af impulser. Irreversibel elektroporation (IRE) anvendes som en ikke-termisk vævsablationsteknik, hvor elektriske impulser forårsager dødelig skade på cellemembraner, der fører til celledød3. Reversibel elektroporation anvendes i elektrokemoterapi (ECT), en etableret teknik, der består af levering af PEF'er i kombination med kemoterapilægemidler for at forbedre lægemiddeloptagelsen i kræftceller4. Desuden viste nylige undersøgelser calciumelektroporation som et alternativ til ECT med høj effektivitet til kræftbehandling, hvilket også er billigt og fremkalder færre bivirkninger5. På trods af disse lovende fremskridt anvendes PEF'er generelt ved hjælp af stive, metalliske elektroder, som vides at forårsage skade på blødt væv6. Hjernen er særlig følsom over for sådanne invasive enheder, hvor det mekaniske mismatch fremkalder betændelse og astroglial ardannelse7.
I denne sammenhæng præsenteres et fleksibelt PEF-leveringssystem i kombination med 3D-modeller af glioblastomtumorer, fra mikrofabrikation til en murinmodel. Konforme elektroder fremstilles med standard tyndfilmsmikrofabrikationsprocesser, herunder brugen af bløde og biokompatible materialer såsom parylen-C, guld og PEDOT:PSS 8,9. Et interdigiteret elektrodedesign bruges til at dække et stort overfladeareal, samtidig med at der opretholdes tilstrækkelig gennemsigtighed til billeddannelse mellem elektrodefingrene10. Til tumormodellen fremstilles 3D-sfæroider af glioblastomceller, der udtrykker en genetisk kodet fluorescensreporter, ved anvendelse af en variation af væske-overlay 96-brøndplademetoden11. Sfæroiderne podes ind i chorioallantoic membranen i et vagtelembryo, hvilket resulterer i en in ovo-model, der i vid udstrækning er blevet brugt til at studere angiogenese eller lægemiddeltoksikologi12,13. Tumorer kan podes og vaskulariseres af embryoets vaskulatur i fravær af et immunsystem på dette stadium af embryonal udvikling12. Fleksible elektroder placeres derefter oven på den vaskulariserede tumor for at studere effekten af PEF-levering på sfæroiden og dens vaskulatur. Endelig undersøges disse virkninger på en komplet levende organisme, herunder tumormikromiljø og immunsystem, ved at implantere konstruerede sfæroider i hjernens parenchyma af murine modeller14. Fleksible elektroder placeres oven på indsættelsesstedet, og kraniotomien forsegles med et glasvindue, hvilket muliggør gentagen to-fotonbilleddannelse over flere uger.
Disse metoder vil være nyttige for folk, der er interesseret i forskellige domæner lige fra mikroelektronikteknik til onkologiske applikationer. Mikrofabrikationsprotokollen kan bruges og tilpasses til enhver applikation, der kræver tyndfilmsmetalelektroder belagt med PEDOT: PSS. Endvidere vil de biologiske modeller, der er udviklet til evaluering af antitumorelektriske behandlinger, være af almen interesse for undersøgelsen af differentieringen af cellulært, vaskulært og immunrespons på implanterede materialer.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>(3-Glycidyloxypropyl)trimethoxysilane</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>440167</td>
			<td>GOPS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.25% Trypsin-EDTA (1X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25200-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-Dodecylbenzenesulfonic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>44198</td>
			<td>DBSA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plate</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Technic</td>
			<td>530</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrylic resin</td>
			<td>Fischer scientific</td>
			<td>NC1455685</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>agarose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9539</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>autoclave</td>
			<td>Tuttnauer</td>
			<td>3150 EL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AZ 10XT</td>
			<td>Microchemicals</td>
			<td></td>
			<td>Positive photoresist</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AZ 826 MIF Developer</td>
			<td>Merck</td>
			<td>10056124960</td>
			<td>Metal-ion-free developer for the negative photoresist</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AZ Developer</td>
			<td>Merck</td>
			<td>10054224960</td>
			<td>Metal-ion-free developer for the positive photoresist</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AZ nLof 2070</td>
			<td>Microchemicals</td>
			<td></td>
			<td>Negative photoresist</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buprenorphine</td>
			<td>Axience</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carprofen</td>
			<td>Rimadyl</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge Sorvall Legend X1R</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>75004260</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CMOS camera Prime 95B</td>
			<td>Photometrics</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 incubator HERAcell 150i</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAC board</td>
			<td>National Instruments</td>
			<td>USB 6259</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D&#233;co spray P&#233;b&#233;o</td>
			<td>Cultura</td>
			<td>3167860937307</td>
			<td>Black acrylic paint</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextran Texas Red 70.000</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>D1830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Die bonding paste &#34;Epinal&#34;</td>
			<td>Hitachi</td>
			<td>EN-4900GC</td>
			<td>Silver paste</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D2438</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispensing machine</td>
			<td>Tianhao</td>
			<td>TH-2004C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Modified Eagle&#8217;s Medium + GlutaMAX&#8482;-I</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10567-014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D6429</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Egg incubator COUVAD&#39;OR 160</td>
			<td>lafermedemanon.com</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylene glycol</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>6881.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fertilized eggs of Japanese quail</td>
			<td>Japocaille</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>VWR</td>
			<td>S181BH</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flask</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>658170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence macroscope</td>
			<td>Leica MZFLIII</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gl261</td>
			<td>DSMZ</td>
			<td>ACC 802</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gold pellets - Dia 3 mm x 6 mm th</td>
			<td>Neyco</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Handheld automated cell counter</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>PHCC00000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating and drying oven</td>
			<td>Memmert</td>
			<td>UF110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hexadimethrine Bromide Sequa-brene</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S2667</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hot plate Delta 6 HP 350</td>
			<td>S&#252;ss Microtec</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Illumination system pE-4000</td>
			<td>CoolLed</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Infrared tunable femtosecond laser (Ma&#239;-Ta&#239;)</td>
			<td>Spectra Physics (USA)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ionomycin calcium salt</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I3909</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kapton tape SCOTCH 92 33x19</td>
			<td>3M</td>
			<td></td>
			<td>Polyimide protection tape</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lab made pulse generator</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Labcoter 2 Parylene Deposition system PDS 2010</td>
			<td>SCS</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lenti-X 293 T cell line</td>
			<td>Takara Bio</td>
			<td>63218</td>
			<td>HEK 293T-derived cell line optimized for lentivirus production</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lenti-X GoStix Plus</td>
			<td>Takara Bio</td>
			<td>631280</td>
			<td>Quantitative lentiviral titer test</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mask aligner MJB4</td>
			<td>S&#252;ss Microtec</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro-90 Concentrated cleaning solution</td>
			<td>International Products</td>
			<td>M9050-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slides 76 x 52 x 1 mm</td>
			<td>Marienfeld</td>
			<td>1100420</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needles 30G</td>
			<td>BD Microlance 3</td>
			<td>304000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PalmSens4 potentiostat</td>
			<td>PalmSens</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>parylene-c : dichloro-p-cyclophane</td>
			<td>SCS</td>
			<td>300073</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCB Processing Tanks</td>
			<td>Mega Electronics</td>
			<td>PA104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEDOT:PSS Clevios PH 1000</td>
			<td>Heraeus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>penicillin / streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>351029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pGP-CMV-GCaMP6f</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>40755</td>
			<td>plasmid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffer Saline solution</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>D8537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasma treatment system PE-100</td>
			<td>Plasma Etch</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PlasmaLab 80 Reactive Ion Etcher</td>
			<td>Oxford Instruments</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic mask</td>
			<td>Selba</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic weigh boat 64 x 51 x 19 mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10770-454</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-dimethylsiloxane: SYLGARD 184 Silicone Elastomer Kit</td>
			<td>Dow chemicals</td>
			<td>1673921</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyimide copper film 60 &#181;m (Kapton)</td>
			<td>Goodfellow</td>
			<td>IM301522</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propan-2-ol</td>
			<td>Technic</td>
			<td>574</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protolaser S</td>
			<td>LPKF</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>puromycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A11103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Round cover glass 5 mm diameter</td>
			<td>Fischer scientific</td>
			<td>50-949-439</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scepter Sensors - 60 &#181;m</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>PHCC60050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone adhesive Kwik-Sil</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>spin coater</td>
			<td>S&#252;ss Microtec</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spin Coater</td>
			<td>Laurell</td>
			<td>WS-650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Super glue</td>
			<td>Office depot</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tetracycline-free f&#339;tal bovine Serum</td>
			<td>Takara Bio</td>
			<td>631105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermal evaporator Auto 500</td>
			<td>Boc Edwards</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Two-photon microscope</td>
			<td>Zeiss LSM 7MP</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>U87-MG</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>HTB-14</td>
			<td>Human glioblastoma cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonic cleaner</td>
			<td>VWR</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex VTX-3000L</td>
			<td>LMS</td>
			<td>VTX100323410</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xfect single shots reagent</td>
			<td>Takara Bio</td>
			<td>631447</td>
			<td>Transfection reagent</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

flexible organic electronic devices for pulsed electric field therapy of glioblastoma

Glioblastom er vanskeligt at udrydde med standard onkologiske terapier på grund af dets høje grad af invasivitet. Bioelektriske behandlinger baseret på pulserende elektriske felter (PEF'er) er lovende for forbedring af behandlingseffektiviteten. De er dog afhængige af stive elektroder, der forårsager akut og kronisk skade, især i blødt væv som hjernen. I dette arbejde blev fleksibel elektronik brugt til at levere PEF'er til tumorer, og det biologiske respons blev evalueret med fluorescerende mikroskopi. Interdigiterede guldelektroder på et tyndt, gennemsigtigt parylen-C-substrat blev belagt med den ledende polymer PEDOT: PSS, hvilket resulterede i en konform og biokompatibel enhed. Virkningerne af PEF'er på tumorer og deres mikromiljø blev undersøgt ved hjælp af forskellige biologiske modeller. Først blev monolag af glioblastomceller dyrket oven på elektroderne for at undersøge fænomener in vitro. Som et mellemliggende trin blev der udviklet en in ovo-model , hvor konstruerede tumorsfæroider blev podet i den embryonale membran i en vagtel. På grund af fraværet af et immunsystem førte dette til stærkt vaskulariserede tumorer. På dette tidlige udviklingsstadium har embryoner intet immunsystem, og tumorer anerkendes ikke som fremmedlegemer. Således kan de udvikle sig hurtigt, mens de udvikler deres egne kar fra det eksisterende embryovaskulære system, hvilket repræsenterer en værdifuld 3D-kræftmodel. Endelig blev fleksibel elektrodeafgivelse af PEF'er evalueret i en komplet organisme med et funktionelt immunsystem ved hjælp af en syngenic, ortograft (intrakraniel) musemodel. Tumorsfæroider blev podet ind i hjernen hos transgene multifluorescerende mus før implantation af fleksible organiske elektrodeindretninger. Et forseglet kranievindue muliggjorde multifotonbilleddannelse af tumoren og dens mikromiljø under behandling med PEF'er over en periode på flere uger.

Denne protokol gør det muligt at anvende to glioblastommodeller, hvori et fleksibelt PEF-leveringssystem er integreret. Efter mikrofabrikations- og emballeringstrin karakteriseres fleksible elektroder i saltopløsning ved elektrokemisk impedansspektroskopi (EIS) for at vurdere og validere deres ydeevne. PEDOT:PSS-coatede elektroder viser de typiske kapacitive og resistive dominerede områder adskilt af en afskæringsfrekvens, mens de ubelagte elektroder kun udviser kapacitiv adfærd (figur 2).
En variation af væske-overlay 96-brønd plademetoden bruges til at dyrke 3D-tumorer lavet af transfekterede glioblastomceller, der stabilt udtrykker en fluorescerende intracellulær calciumreporter. Væksten af sfæroiderne kan observeres med et lysfeltmikroskop (figur 3; ED 0). Mindst 2 eller 3 dage er nødvendige for at opnå sfæriske og tætte sfæroider afhængigt af cellelinjen og antallet af celler, der er podet.
I in ovo-modellen podes sfæroider i chorioallantoic membranen i et vagtelembryo (figur 3; ED 6). Transplantatets succes kan vurderes ved fluorescensmikroskopi et par dage senere, da levende celler har intracellulært calcium og dermed er fluorescerende (figur 3; ED 9). Vaskulariseringen af tumoren kan observeres under et fluorescensmikroskop ved at injicere et fluorescerende farvestof i blodkarrene (figur 3; ED9). Det kan dog ikke altid være muligt at visualisere blodkarrene inde i tumoren, da sfæroiden er meget tæt. De fleksible interdigiterede elektroder placeres oven på den vaskulariserede tumor (figur 3; ED 9) og tilsluttet en pulsgenerator. Sonden skal placeres forsigtigt for at undgå blødning af embryoet; Ellers kan det fluorescerende farvestof sprede sig, hvilket forhindrer enhver observation ved billeddannelse. Korrekt levering af pulsen til det biologiske miljø kan verificeres ved at måle strømmen, der går gennem kredsløbet. Billeddannelse af disse i ovo-modeller muliggør realtidsovervågning af effekten af PEF'er på det intracellulære calcium i en 3D-glioblastomtumor samt vasokonstriktionen induceret på tumorens vaskulatur, idet man undgår enhver indflydelse fra andre celletyper, herunder immunsystemet15.
Undersøgelsen af PEF-effekten på glioblastom kan også udføres i en mere komplet og prædiktiv model. Faktisk består in vivo-modellen beskrevet ovenfor14 af podning af en 3D glioblastomtumor i hjernens parenchyma hos en mus (figur 4). Injektionsstedet for tumoren er tilsluttet af en tværbundet dextrangel hemi-perle for at rekapitulere de fysiologiske biofysiske begrænsninger under tumorens vækst. Selvom det er beskrevet i reference14, er det værd at understrege, at det er kritisk vigtigt, at dextran hemi-perlen er nøjagtigt superlimet til dura mater; Ellers kan tumoren undslippe gennem den åbne dura og helt dække hjernen, hvilket gør billeddannelsen umulig. For enhver kronisk billeddannelse udgør vævsindvækst, der finder sted, når kranievinduet heler, en alvorlig barriere, da det nye væv er uigennemsigtigt og gør billederne tågede eller ikke-anvendelige. Derfor, efter indsættelse og limning af hemi-perlen, skal sidevæggene i det åbne kranievindue forsegles med et tyndt lag superlim, der omhyggeligt placeres rundt om hulrumsvæggen uden at lade superlimen glide eller strømme på duraen. Når den fleksible sonde placeres oven på tumorinjektionsstedet, kan ingen bobler forblive under sonden af to grunde. For det første kan billeddannelse ikke fortsætte, når bobler er til stede. For det andet tjener bobler som isolatorer og ændrer dermed de elektriske stimuleringsegenskaber. Efter at have taget de ovenfor beskrevne forholdsregler forsegles kraniotomien med et glasvindue cementeret til kraniet for at muliggøre kronisk billeddannelse over uger. Da tumoren består af GCaMP eller DsRed, der udtrykker celler, kan injektionen bekræftes med et fluorescensmikroskop. Elektrodernes elektrokemiske impedans skal måles for at validere ydeevnen efter implantation. Sammenlignet med impedansen i saltopløsning forventes en stigning i impedansen in vivo ved frekvenser over 100 Hz på grund af tilstedeværelsen af et biologisk miljø (figur 5). Vaskulariseret neuralt parenkym og tumorinfiltration kan observeres og karakteriseres gennem det gennemsigtige substrat over uger ved to-fotonmikroskopi (figur 6). Anvendelsen af transgene dyr, der udtrykker fluorescerende proteiner i celler af interesse (immunceller og neuroner), kan f.eks. muliggøre påvisning af den minimale inflammatoriske proces, der induceres ved elektrodeimplantation alene (figur 6A), eller vise tilstedeværelsen af mikroglia og monocytter 26 dage efter implantation af en PEF-stimuleret elektrode implanteret oven på en voksende GBM-tumor (figur 6B1 ). I sidstnævnte tilfælde blev både perifere-monocytafledte celler og hjerneresidente mikrogliale celler fundet omkring og inde i tumoren (figur 6B2). På dagen for levering af PEF kan kontaktpuder af de fleksible elektroder tilsluttes pulsgeneratoren direkte under to-fotonmikroskopet. Samlet set kan denne model bruges til at undersøge effekten af bioelektriske behandlinger over tid ved hjælp af forskellige typer celler, der er involveret i hjernetumorudvikling, op til en dybde på omkring 500 μm.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63527/63527fig01.jpg"> Figur 1: Mikrofabrikation af fleksible elektroder . (A) Guldelektrodemønster og Parylen C-substrat. (B) Skitseåbning. (C) PEDOT:PSS-belægning. (D) Tilslutninger og emballage. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63527/63527fig01large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63527/63527fig02.jpg"> Figur 2: Elektrokemisk impedansspektroskopi af fleksible guldelektroder og PEDOT:PSS-belagte kolde elektroder i en saltopløsning. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63527/63527fig02large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63527/63527fig03.jpg"> Figur 3: In ovo-modellen af glioblastom. ED 0: Sfæroid observeret med et lysfeltmikroskop. ED 3: Shell mindre kultur af et vagtelembryo 3 dage efter åbning. ED 6: Tumor implanteret i CAM observeret med et lysfeltmikroskop. ED 9: Fleksibel enhed placeret på den vaskulariserede tumor (tumor i grønt og blodkar i rødt). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63527/63527fig03large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63527/63527fig04.jpg"> Figur 4: In vivo-anvendelsen . (A) Skema for in vivo-forsøg . (B) Sondeplacering inden påføring af dækglas og akrylharpiks. C) Afsluttet implantation af sonde. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63527/63527fig04large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63527/63527fig05.jpg"> Figur 5: Elektrokemisk impedansspektroskopi af fleksible guldelektroder i en saltopløsning sammenlignet med en implanteret sonde. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63527/63527fig05large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63527/63527fig06.jpg"> Figur 6: Intravital multispektral to-foton-billeddannelse gennem elektroder . (A) Flisebelagt billede af den sunde hjerneoverflade i en kontrol multifluorescerende AMU-Neuroinflam mus 3 dage efter elektrodeimplantation. Cyan viser dendritisk arborisering af lag 5 pyramidale neuroner, grøn viser rekrutterede granulocytter og monocytter, og gul viser aktiverede mikroglia og dendritiske celler. Pink viser infrarød diffusion på grund af varmeakkumulering. (B1) Lignende billede som i A , men 26 dage efter tumorsfæroidimplantation 200 μm dybt inde i cortex umiddelbart efterfulgt af elektrodeimplantation. Bemærk akkumuleringen af grønne og gule immunceller. (B2) Lignende billede som i B1 , men 100 μm under elektrodernes overflade. Bemærk tilstedeværelsen af blå neuronal dendritisk arborisering i periferien af selve den røde tumormasse infiltreret af gule mikroglia og dendritiske celler. Dyb blå viser et andet harmonisk signal fra det peritumorale kollagen. (B3) Zoomet billede af B2 , der viser tilstedeværelsen af interneuron somas (angivet med pile) i nærheden af tumoren. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63527/63527fig06large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Flexible Organic Electronic Devices for Pulsed Electric Field Therapy of Glioblastoma at JoVE.com

Flexible Organic Electronic Devices for Pulsed Electric Field Therapy of Glioblastoma

Dette arbejde beskriver udviklingen af fleksible interdigiterede elektroder til implementering i 3D hjernetumormodeller, nemlig in vitro kultur, in ovo model og in vivo murin model. Den foreslåede metode kan anvendes til at evaluere virkningerne af pulserende elektriske felter på tumorer på forskellige niveauer af kompleksitet.

Fleksible organiske elektroniske enheder til pulserende elektrisk feltterapi af glioblastom

Glioblastoma is difficult to eradicate with standard oncology therapies due to its high degree of invasiveness. Bioelectric treatments based on pulsed ...

Denne protokol tillader levering af pulselektriske felter med fleksibel elektronik til at studere deres terapeutiske virkninger på glioblastom. Vi gør dette ved at visualisere tumormikromiljøet in vivo med billeddannelse. Bioelektronikken integreres i denne protokol ved hjælp af flere forskellige modeller af stigende kompleksitet for at studere effekten af pulserende felter på kræft.De mikrofabrikationsteknikker, der præsenteres i dette arbejde, kan også testes som et middel til behandling af andre typer kræftformer, herunder patientafledte xenotransplantater. Dette bevæger sig mod ideen om præcisionsmedicin, der er skræddersyet til hver enkelt patient. Disse sonder er lavet med standard mikrofabrikationsteknikker, så fremstillingen er ligetil, og alle med et rent rum kan lave dem.Til guldelektrodemønster deponeres et tre mikrometer lag parylen C med et parylenaflejringssystem ved at placere de rene glasskinner i aflejringskammeret. Vej seks gram parylen C i en aluminiumsbåd, læg den i ovnen, evakuer maskinen, og start aflejringen med de parametre, der er beskrevet i manuskriptet. Når aflejringen er færdig, og fordampertemperaturen er under 40 grader Celsius, skal du slukke for køleren, fordamperen, ovnen.Udluftning af maskinen og indsamling af prøverne. Spin coat de plasmabehandlede prøver med en negativ fotoresist ved 1.000 gange G i 40 sekunder. Udsæt fotoresisten gennem en maske, der har det interdigiterede elektrodedesign.Nedsænk derefter prøver i en metalionfri udvikler i tre minutter for at fjerne den ikke-eksponerede fotoresist. For at deponere et 20 nanometer vedhæftningslag af krom og et 300 nanometer lag guld med en termisk fordamper, udluftning af fordampermaskinen og klip prøverne på den øverste runde plade med metalskruer. Fyld de dedikerede digler med henholdsvis krom og guld.Forsegl og evakuer maskinen, og start rotationen af prøveholderen. Vælg diglen, der indeholder krom, og øg langsomt strømmen, indtil aflejringshastigheden når 0,2 angstroms pr. Sekund. Åbn lukkeren, vent til aflejringen af 20 nanometer krom, luk lukkeren, og skramp langsomt strømmen ned indtil nul milliampere.Vælg den guldholdige digel og øg langsomt strømmen indtil en aflejringshastighed på 0,2 angstroms per sekund. Åbn lukkeren for at fordampe guldet, vent til aflejringen af 10 nanometer guld, og øg derefter aflejringshastigheden til 1,5 angstroms per sekund, indtil ca. 300 nanometer er deponeret. Luk lukkeren, og skru langsomt strømmen ned til nul milliampere.Prøverne nedsænkes i et bægerglas indeholdende acetone. Skyl derefter prøverne med isopropanol og tør dem med en luftpistol. Drej fire lag PEDOT: PSS-opløsning ved 150 gange G i 35 sekunder.Det saciterende parylen C-lag fjernes ved at nedsænke prøverne i vand. Dyp prøverne i deioniseret vand i 30 minutter for at fjerne den resterende sæbe og forbindelser med lav molekylvægt i PEDOT: PSS-filmen og løsn prøverne fra glassubstratet. Tilsæt 75 mikroliter smeltet 1%agaroseopløsning i hvert hul i 96-brøndpladen forsigtigt og lad den størkne i 15 minutter ved stuetemperatur.Fjern de transducerede glioblastomceller opnået under den stabile cellelinjegenerering. Tilsæt 10.000 glioblastomceller pr. Brønd og opgør det samlede volumen til 150 mikroliter pr. Brønd ved hjælp af DMEM indeholdende et gram pr. Liter glucose, L-glutamin, natriumpyruvat og natriumbicarbonat, 10% føtalt bovint serum, 100 enheder pr. Mikroliter penicillin og 100 mikrogram pr. Mikroliter streptomycin. Udskift halvdelen af mediet med friske medier hver anden dag indtil yderligere eksperimenter, mens pipettespidsen holdes i den øverste del af brønden for at undgå beskadigelse af agarose eller selve kugleformen.Placer de befrugtede æg af japansk vagtel, Coturnix japonica, i en inkubator på bakker med en automatisk rotator, der vender æg hver anden time. Denne dag betragtes som embryonal dag nul. På den tredje dag åbnes æggene forsigtigt med en pincet med tynde spidser, der er forvasket med 70% ethanol.Hæld embryoet i en plastikbåd, dæk det med en anden vejebåd og læg det i en standard befugtet inkubator ved 37 grader Celsius i tre dage. På embryonal dag seks laves et lille snit i chorioallantoic membranen med en 23 gauge nål. Placer en syv-dages sfæroid på snittet ved hjælp af en pipette og returner embryoet til inkubatoren i tre dage indtil yderligere forsøg.Placer en dråbe DPBS for at dække kraniotomien. Placer den fleksible elektrode på dråben af DPBS, og placer forsigtigt bagsiden af sonden med kontaktpuderne på musens ryg. Absorber DPBS-dråben med et lille stykke papir, indtil sonden kan ligge fladt på dura og følge hjernens krumning, hvilket sikrer, at det lille lag saltvand forbliver under elektroderne for at fungere som en barriere mod limudslip.Placer en lille dråbe silikoneklæbemiddel på sonden og dæk den med et fem millimeter rundt dækglas. Skub dækglasset ned, indtil silikonen er jævnt fordelt, og afstanden mellem dækglasset og sonden er minimal. Vent derefter 30 sekunder på, at silikonen størkner.For at fastgøre dækglasset skal du hurtigt påføre superlim på siderne og skubbe det ned, indtil limen bliver fast. Påfør superlim ved sondens hals ved hjælp af en tandstikker, og pas på, at superlimen trækkes under nakken for at give stabil støtte. Dæk kraniet med tandcement for at opbygge en kronisk hætte, og vær særlig omhyggelig med kun at dække kanterne på dækglasset.Løft bagsiden af sonden og påfør cement under sondens hals. Resten af sonden på cementen, før den hærder. Skub forsigtigt sondens hals ned for at placere overfladen på samme niveau som dækglasset og ikke i vejen for mikroskopmålet under eksperimentet.Dæk toppen af sondehalsen med højst 1,5 millimeter tandcementlag for at opnå et fast greb om sonden. Byg en cementbrønd, der præsenterer en 1,5 millimeter højderyg på en til to millimeter omkring dækglasset for at skabe et bassin til nedsænkningsvæsken til de to fotonbilleddannelser. Når cementen er hærdet, skal du administrere postkirurgisk analgesi og holde dyret varmt indtil genopretning ved at pakke det ind i et papirhåndklæde og placere det tæt på en infrarød pære.PEDOT: PSS-coatede elektroder viser de typiske kapacitive og resistive dominerede områder adskilt af en afskæringsfrekvens, mens de ubelagte elektroder kun viser kapacitiv adfærd. Væksten af sfæroider observeret med et brightfieldmikroskop afslørede, at der er behov for mindst to eller tre dage for at opnå sfæriske og tætte sfæroider afhængigt af cellelinjen og antallet af podede celler. I in ovo-modellen kan transplantatet af sfæroider i chorioallantoic membranen vurderes ved fluorescensmikroskopi, da levende celler har intracellulært calcium, og vaskulariseringen af tumoren kan vurderes ved at injicere et fluorescerende farvestof i blodkarrene.Sammenlignet med impedansen i saltopløsning forventes en stigning i impedansen in vivo ved frekvenser over 100 hertz på grund af tilstedeværelsen af et biologisk miljø. Vaskulariseret neuralt parenkym og tumorinfiltrationen kan observeres og karakteriseres gennem det gennemsigtige substrat over uger ved to fotonmikroskopi. Anvendelsen af transgene dyr, der udtrykker fluorescerende proteiner i celler af interesse, kan demonstrere den minimale inflammatoriske proces induceret af elektrodeimplantation alene.Det kan vise tilstedeværelsen af mikroglia og monocytter 26 dage efter implantation pulserende elektriske felter stimuleret elektrode. Både perifere monocytafledte og hjerneresonante mikrogliale celler blev fundet omkring og inde i tumoren. Det kritiske punkt for succes i implantatproceduren er at sikre forseglingen og fladheden af kranievinduet og optimere kvaliteten af kontakten med sonden.Ud over den intravitale billeddannelse, hvad kunne overveje at kombinere vores protokol med andre foranstaltninger og teknikker som prøveudtagninger og målinger af blodarbejde for cytokiner, immunstatus ved flowcytometri eller endda adfærdsanalyse. Dette arbejde baner vejen for brugen af fleksible implanterbare anordninger til kræft og åbner nye perspektiver for brugen af bioelektronisk medicin til denne kroniske sygdom.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Coculture Assays to Study Macrophage and Microglia Stimulation of Glioblastoma Invasion

Cokultur Analyser til Undersøgelse makrofag og Mikroglia Stimulering af glioblastoma Invasion

Glioblastoma multiforme (grade IV glioma) is a very aggressive human cancer with a median survival of 1 year post diagnosis. Despite the increased ...

Moving Upwards: A Simple and Flexible In Vitro Three-dimensional Invasion Assay Protocol

Moving Upwards: A Simple and Flexible In Vitro Three-dimensional Invasion Assay Protocol

Bevæger sig opad: En enkel og fleksibel In Vitro tredimensionale Invasion Assay protokol

Although 3D invasion assays have been developed, the challenge remains to study cells without affecting the integrity of their microenvironment. ...

Fluorescence Molecular Tomography for In Vivo Imaging of Glioblastoma Xenografts

Fluorescence Molecular Tomography for In Vivo Imaging of Glioblastoma Xenografts

Fluorescens molekylære tomografi for In Vivo billeddannelse af glioblastom Xenografts

Tumorigenicity is the capability of cancer cells to form a tumor mass. A widely used approach to determine if the cells are tumorigenic is by injecting ...

Live-Cell Imaging Assays to Study Glioblastoma Brain Tumor Stem Cell Migration and Invasion

Live-celle Imaging Assays til undersøgelse glioblastom hjerne Tumor stamcelle Migration og Invasion

Glioblastoma (GBM) is an aggressive brain tumor that is poorly controlled with the currently available treatment options. Key features of GBMs include ...

The Clinical Application of Tumor Treating Fields Therapy in Glioblastoma

Den kliniske anvendelse af Tumor behandling af felter terapi i glioblastom

Glioblastoma is the most common and lethal form of brain cancer, with a median survival of 15 months after diagnosis and a 5 year survival rate of only 5% ...

A 3D Spheroid Model for Glioblastoma

En 3D Sfæroide model for Glioblastoma

Two-dimensional (2D) cell cultures do not mimic in vivo tumor growth satisfactorily. Therefore, three-dimensional (3D) culture spheroid models were ...

Co-culture of Glioblastoma Stem-like Cells on Patterned Neurons to Study Migration and Cellular Interactions

Co-kultur af Glioblastoma Stamceller på mønstrede neuroner til at studere migration og cellulære interaktioner

Glioblastomas (GBMs), grade IV malignant gliomas, are one of the deadliest types of human cancer because of their aggressive characteristics. Despite ...

Positron Emission Tomography-based Dose Painting Radiation Therapy in a Glioblastoma Rat Model using the Small Animal Radiation Research Platform

Positronemissionstomografibaseret dosismalingsstrålebehandling i en glioblastomrottemodel ved hjælp af Small Animal Radiation Research Platform

A rat glioblastoma model to mimic chemo-radiation treatment of human glioblastoma in the clinic was previously established. Similar to the clinical ...

Application of Hemostatic Devices in Laparoscopic Hepatectomy

Anvendelse af hæmostatiske enheder i laparoskopisk hepatektomi

Laparoscopic hepatectomy is considered a conventional method for treating benign and malignant liver diseases because it is a minimally invasive method. ...

Translational Orthotopic Models of Glioblastoma Multiforme

Translationelle ortopiske modeller af glioblastom multiforme

Genetically engineered mouse (GEM) models for human glioblastoma multiforme (GBM) are critical to understanding the development and progression of brain ...