Name: flexible organic electronic devices for pulsed electric field therapy of glioblastoma
Uploaded: 2022-08-09T13:00:00
Duration: 11 min 2 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Flexible Organic Electronic Devices for Pulsed Electric Field Therapy of Glioblastoma at JoVE.com

Het hier gerapporteerde werk werd ondersteund door het Franse Nationale Onderzoeksbureau (ANR-18-CE19-0029). De auteurs bedanken S.M. Bardet hartelijk voor haar bijdrage aan het genereren van een stabiele GCaMP6f cellijn en D. O'Connor voor haar hulp bij het in ovo model.

<ol>
	<li>Koshy, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+survival+time+trends+for+glioblastoma+using+the+SEER+17+population-based+registries.">Improved survival time trends for glioblastoma using the SEER 17 population-based registries.</a> Journal of Neuro-Oncology. 107 (1), 207-212 (2012).</li><li>Davis, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glioblastoma:+Overview+of+disease+and+treatment.">Glioblastoma: Overview of disease and treatment.</a> Clinical Journal of Oncology Nursing. 20, 2-8 (2016).</li><li>Edd, J. F., Horowitz, L., Davalos, R. V., Mir, L. M., Rubinsky, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+results+of+a+new+focal+tissue+ablation+technique:+irreversible+electroporation.">In vivo results of a new focal tissue ablation technique: irreversible electroporation.</a> IEEE transactions on Bio-Medical Engineering. 53 (7), 1409-1415 (2006).</li><li>Breton, M., Mir, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microsecond+and+nanosecond+electric+pulses+in+cancer+treatments.">Microsecond and nanosecond electric pulses in cancer treatments.</a> Bioelectromagnetics. 33 (2), 106-123 (2012).</li><li>Frandsen, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+therapeutic+applications+of+calcium+electroporation+to+effectively+induce+tumor+necrosis.">Direct therapeutic applications of calcium electroporation to effectively induce tumor necrosis.</a> Cancer Research. 72 (6), 1336-1341 (2012).</li><li>Lee, J. H., Kim, H., Kim, J. H., Lee, S. -. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Soft+implantable+microelectrodes+for+future+medicine:+prosthetics,+neural+signal+recording+and+neuromodulation.">Soft implantable microelectrodes for future medicine: prosthetics, neural signal recording and neuromodulation.</a> Lab on a Chip. 16 (6), 959-976 (2016).</li><li>Lee, H., Bellamkonda, R. V., Sun, W., Levenston, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomechanical+analysis+of+silicon+microelectrode-induced+strain+in+the+brain.">Biomechanical analysis of silicon microelectrode-induced strain in the brain.</a> Journal of Neural Engineering. 2 (4), 81-89 (2005).</li><li>Fattahi, P., Yang, G., Kim, G., Abidian, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+review+of+organic+and+inorganic+biomaterials+for+neural+interfaces.">A review of organic and inorganic biomaterials for neural interfaces.</a> Advanced Materials. 26 (12), 1846-1885 (2014).</li><li>Lecomte, A., Degache, A., Descamps, E., Dahan, L., Bergaud, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+and+in+vivo+biostability+assessment+of+chronically-implanted+Parylene+C+neural+sensors.">In vitro and in vivo biostability assessment of chronically-implanted Parylene C neural sensors.</a> Sensors and Actuators B: Chemical. 251, 1001-1008 (2017).</li><li>Dijk, G., Ruigrok, H. J., O'Connor, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PEDOT:PSS-coated+stimulation+electrodes+attenuate+irreversible+electrochemical+events+and+reduce+cell+electropermeabilization.">PEDOT:PSS-coated stimulation electrodes attenuate irreversible electrochemical events and reduce cell electropermeabilization.</a> Advanced Materials Interfaces. 8 (19), 2100214 (2021).</li><li>Chen, T. -. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultra-sensitive+fluorescent+proteins+for+imaging+neuronal+activity.">Ultra-sensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity.</a> Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).</li><li>Ribatti, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+5+Chick+embryo+chorioallantoic+membrane+as+a+useful+tool+to+study+angiogenesis.">Chapter 5 Chick embryo chorioallantoic membrane as a useful tool to study angiogenesis.</a> International Review of Cell and Molecular Biology. 270, 181-224 (2008).</li><li>Valdes, T. I., Kreutzer, D., Moussy, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chick+chorioallantoic+membrane+as+a+novel+in+vivo+model+for+the+testing+of+biomaterials.">The chick chorioallantoic membrane as a novel in vivo model for the testing of biomaterials.</a> Journal of Biomedical Materials Research. 62 (2), 273-282 (2002).</li><li>Ricard, C., Stanchi, F., Rougon, G., Debarbieux, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+orthotopic+glioblastoma+mouse+model+maintaining+brain+parenchymal+physical+constraints+and+suitable+for+intravital+two-photon+microscopy.">An orthotopic glioblastoma mouse model maintaining brain parenchymal physical constraints and suitable for intravital two-photon microscopy.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (86), e51108 (2014).</li><li>Lefevre, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrating+flexible+electronics+for+pulsed+electric+field+delivery+in+a+vascularized+3D+glioblastoma+model.">Integrating flexible electronics for pulsed electric field delivery in a vascularized 3D glioblastoma model.</a> npj Flexible Electronics. 5, 19 (2021).</li><li>Perry, J. L., Ramachandran, N. K., Utama, B., Hyser, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+genetically-encoded+calcium+indicators+for+live+cell+calcium+imaging+and+localization+in+virus-infected+cells.">Use of genetically-encoded calcium indicators for live cell calcium imaging and localization in virus-infected cells.</a> Methods. 90, 28-38 (2015).</li><li>Bl&#246;mer, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+and+sustained+gene+transfer+in+adult+neurons+with+a+lentivirus+vector.">Highly efficient and sustained gene transfer in adult neurons with a lentivirus vector.</a> Journal of Virology. 71 (9), 6641-6649 (1997).</li><li>Lenting, K., Verhaak, R., ter Laan, M., Wesseling, P., Leenders, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glioma:+experimental+models+and+reality.">Glioma: experimental models and reality.</a> Acta Neuropathologica. 133 (2), 263-282 (2017).</li><li>Hickman, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+models+of+cancer+for+pharmacology+and+cancer+cell+biology:+Capturing+tumor+complexity+in+vitro/ex+vivo.">Three-dimensional models of cancer for pharmacology and cancer cell biology: Capturing tumor complexity in vitro/ex vivo.</a> Biotechnology Journal. 9 (9), 1115-1128 (2014).</li><li>Tay, S. L. M., Heng, P. W. S., Chan, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+CAM-LDPI+method:+a+novel+platform+for+the+assessment+of+drug+absorption.">The CAM-LDPI method: a novel platform for the assessment of drug absorption.</a> Journal of Pharmacy and Pharmacology. 64 (4), 517-529 (2012).</li><li>Kundekov&#225;, B., M&#225;&#269;ajov&#225;, M., Meta, M., &#268;avarga, I., Bil&#269;&#237;k, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chorioallantoic+Membrane+Models+of+Various+Avian+Species:+Differences+and+Applications.">Chorioallantoic Membrane Models of Various Avian Species: Differences and Applications.</a> Biology. 10 (4), 301 (2021).</li><li>Ricard, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+dynamics+of+microglial+and+monocyte-derived+cells+in+glioblastoma-bearing+mice.">Phenotypic dynamics of microglial and monocyte-derived cells in glioblastoma-bearing mice.</a> Scientific Reports. 6 (1), 26381 (2016).</li></ol>

De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen hebben.

De in dit werk beschreven aanpak stelt hersentumormodellen met een geïntegreerd PEF-toedieningssysteem in staat om het effect van PEF's op verschillende niveaus van biologische organisatie te bestuderen. Het microfabricageprotocol bestaat uit standaard dunnefilmprocessen, die een grote mate van vrijheid bieden in het elektrodeontwerp dat kan worden aangepast aan de specifieke toepassing. Soms kan een extra thermische gloeistap nuttig zijn aan het einde van de fabricage, om het buigen van de elektroden tijdens de productie te verminderen.
Het gebruik van een stabiele glioblastoomcellijn die een fluorescerende calciumindicator tot expressie brengt, vermijdt alle complicaties die verband houden met de afgifte en retentie van kleurstoffen, vooral in 3D-tumoren die zeer dicht zijn16. Inderdaad, een hoog expressieniveau wordt waargenomen over een lange periode in vergelijking met standaard chemische fluorescerende calciumindicatoren17. Dit protocol kan worden toegepast op verschillende cellijnen, omdat het vaak wordt gebruikt voor het afbeelden van neurale activiteit11. Hier werden menselijke en muizencellijnen gebruikt (U87 en Gl261 voor implantatie in respectievelijk immunodeficiënte of immunocompetente muizen). Recente studies toonden inderdaad aan dat de U87-cellijn verschilt van die van de oorspronkelijke cellen, omdat veel mutaties werden verworven gedurende jaren van celkweek, waardoor experimentele reproduceerbaarheid18 werd beïnvloed. De methode die wordt gebruikt voor de bereiding van 3D-tumoren is met een hoge doorvoer, reproduceerbaar en maakt het mogelijk om sferoïden van een specifieke grootte te genereren, afhankelijk van de cellijn, het aantal cellen bij het zaaien en de tijd van groei19. Deze sferoïden zijn echter dicht, wat een nadeel oplevert bij het beeldvorming in de kern van de tumor.
Het in ovo-model is nuttig als eerste benadering om het effect van PEF op 3D-tumoren en hun vasculatuur te bestuderen, zonder interacties met andere celtypen die in de hersenen aanwezig zijn. Dit model is goedkoop, snel, high-throughput en roept minder ethische vragen op dan diermodellen. Het is belangrijk om de integriteit van het embryo gedurende het hele experiment te behouden, omdat dit de overleving en de kwaliteit van de beeldvorming kan beïnvloeden. Speciale zorg moet worden genomen bij het openen van het kwarteleit, om schade aan het embryonale membraan te voorkomen. Het transplantaat en de plaatsing van de flexibele elektroden moeten ook zorgvuldig worden uitgevoerd om bloedingen te voorkomen die het embryo zouden kunnen doden. Injectie van fluorescerende kleurstof in de bloedvaten maakt gelijktijdige visualisatie van de tumorcellen en vascularisatie met fluorescentiemicroscopie mogelijk. De intraoculaire injectie moet zorgvuldig worden uitgevoerd om te voorkomen dat kleurstof in de embryonale vloeistof lekt, wat een resterende fluorescentie op de achtergrond kan veroorzaken die de kwaliteit van de beeldvorming verslechtert. Dit model kan ook worden gebruikt voor het volgen van medicijnopname, omdat het toegang geeft tot de bloedsomloop. Experimenten worden echter beperkt door de 12-daagse overlevingstijd van het embryo, waardoor 7 dagen observatie mogelijk is, wat aanzienlijk korter is dan het in vivo model21.
Het in vivo hersentumormodel kan gedurende 4 tot 5 weken worden gevolgd voordat dieren een ethisch experimenteel eindpunt bereiken dat wordt bepaald door een plotseling gewichtsverlies van 20%. Het wordt goed verdragen en blijft op zijn plaats als de verbindingsstaart van de elektrode niet te lang is. Anders hebben dieren de neiging om de omdraaiende connector te krassen, die uiteindelijk kan worden gescheurd, waardoor een latere verbinding met de stimulator wordt voorkomen. Deze periode van 4 weken is niettemin waardevol om de verschillende stadia van de ontwikkeling van glioblastoom te dekken. Bij het vergelijken van de tumorceldichtheden in hetzelfde volume van belang op verschillende tijdsintervallen, kan de evolutie van de tumorgroeikinetiek worden waargenomen. In het bijzonder werd een verhoogde tumorgroei waargenomen op het moment van de immuunschakelaar22. Een soortgelijke studie in aanwezigheid van een stimulerende elektrode zou informatie verstrekken over het effect van PEF op de proliferatiesnelheid van tumoren en de gevoeligheid van de tumor voor immuun-eliminatie. In vergelijking met het in ovo-model kan het in vivo-model worden gezien als een waardevol preklinisch model om de impact van immuuncellen op tumorprogressie en hun bijdrage aan het therapeutische effect van PEF te bestuderen. Dit protocol is aangepast van een vorig artikel met de toevoeging van een flexibel elektrode-apparaat op de tumor voordat een schedelvenster wordt geplaatst14. Zowel de acute als chronische bio-elektrische behandelingen van tumoren kunnen worden gekenmerkt door directe en daaropvolgende observaties met twee-fotonenmicroscopie, aangezien initiële stimulatie naar verwachting celdood zal induceren en blijvende ontregeling van de immuunrespons zal veroorzaken.
De aansluitingen van de flexibele sonde zijn gemakkelijk toegankelijk onder de twee-foton microscoop. Elektrische stimulatieparameters kunnen dus in realtime worden aangepast op basis van het waargenomen effect op het neurale weefsel en / of de beoogde cellen, vergelijkbaar met hoe een arts interventionele procedures zou uitvoeren tijdens het observeren van MRI- of CT-beelden van zijn patiënt. Een laatste overweging is het belang van zorgvuldige afdichting van de elektrode op de hersenen met secondelijm en siliconenlijm om weefselhergroei te voorkomen.
Kortom, het hier beschreven protocol vertegenwoordigt een innovatief model om het effect van PEF-therapie met flexibele organische polymeerelektroden voor glioblastoomtumormodellen te bestuderen. De twee modellen vertonen verschillende niveaus van complexiteit, zodat cellulaire, vasculaire of immuuneffecten kunnen worden gescheiden voor een beter begrip van de werkingsmechanismen. Conformale, oppervlakkige elektroden verminderen de iatrogene schade terwijl ze verstoring van de micro-omgeving van de tumor mogelijk maken, waardoor vasoconstrictie of ontregeling van intracellulair calcium15 wordt veroorzaakt.

Glioblastoma multiforme (GBM) is een zeer invasieve tumor en daarom moeilijk uit te roeien met standaardbehandelingen zoals resectie, radiotherapie en chemotherapie. Ondanks multimodale behandelingen blijft de prognose zeer slecht en ervaren de meeste patiënten ziekteprogressie binnen 1 jaar na diagnose 1,2. Onlangs heeft de ontwikkeling van bio-elektrische behandelingen een groot potentieel getoond om bestaande therapieën te verbeteren. Deze therapieën maken gebruik van de levering van gepulseerde elektrische velden (PEF), meestal in een enkele behandelingssessie, om de integriteit van het cellulaire membraan en de micro-omgeving van tumoren te verstoren. Deze celmembraanverstoring, ook bekend als elektroporatie, kan omkeerbaar of onomkeerbaar zijn, afhankelijk van de intensiteit van het elektrische veld en het aantal pulsen. Irreversibele elektroporatie (IRE) wordt toegepast als een niet-thermische weefselablatietechniek waarbij elektrische pulsen fatale schade aan celmembranen veroorzaken, wat leidt tot celdood3. Reversibele elektroporatie wordt toegepast in elektrochemotherapie (ECT), een gevestigde techniek die bestaat uit de toediening van PEF's in combinatie met chemotherapiegeneesmiddelen om de opname van geneesmiddelen in kankercellen te verbeteren4. Bovendien toonden recente studies calciumelektroporatie aan als een alternatief voor ECT met een hoge efficiëntie voor de behandeling van kanker, wat ook goedkoop is en minder bijwerkingen veroorzaakt5. Ondanks deze veelbelovende vooruitgang worden PEF's over het algemeen toegepast met behulp van stijve, metalen elektroden waarvan bekend is dat ze schade aan zacht weefsel veroorzaken6. De hersenen zijn bijzonder gevoelig voor dergelijke invasieve apparaten waarbij de mechanische mismatch ontstekingen en astrogliale littekens veroorzaakt7.
In deze context wordt een flexibel PEF-toedieningssysteem in combinatie met 3D-modellen van glioblastoomtumoren gepresenteerd, van microfabricage tot een muizenmodel. Conformale elektroden worden gemaakt met standaard dunne-film microfabricageprocessen, inclusief het gebruik van zachte en biocompatibele materialen zoals paryleen-C, goud en PEDOT:PSS 8,9. Een geïndigiteerd elektrodeontwerp wordt gebruikt om een groot oppervlak te bedekken met behoud van voldoende transparantie voor beeldvorming tussen de elektrodevingers10. Voor het tumormodel worden 3D-sferoïden van glioblastoomcellen die een genetisch gecodeerde fluorescentiereporter tot expressie brengen, geproduceerd met behulp van een variatie van de vloeistof-overlay 96-well plaatmethode11. De sferoïden worden geënt in het chorioallantoïsche membraan van een kwartelembryo, wat resulteert in een in ovo-model dat uitgebreid is gebruikt om angiogenese of medicijntoxicologie te bestuderen12,13. Tumoren kunnen worden geënt en gevasculariseerd door de vasculatuur van het embryo bij afwezigheid van een immuunsysteem in dit stadium van de embryonale ontwikkeling12. Flexibele elektroden worden vervolgens bovenop de gevasculariseerde tumor geplaatst om het effect van PEF-toediening op de sferoïde en zijn vasculatuur te bestuderen. Ten slotte worden deze effecten onderzocht op een compleet levend organisme, inclusief tumormicro-omgeving en immuunsysteem, door gemanipuleerde sferoïden te implanteren in het hersenparenchym van muizenmodellen14. Flexibele elektroden worden bovenop de inbrengplaats geplaatst en de craniotomie wordt afgesloten met een glazen venster, waardoor herhaalde beeldvorming van twee fotonen gedurende meerdere weken mogelijk is.
Deze methoden zullen nuttig zijn voor mensen die geïnteresseerd zijn in verschillende domeinen, variërend van micro-elektronica engineering tot oncologische toepassingen. Het microfabricageprotocol kan worden gebruikt en aangepast voor elke toepassing waarvoor dunne-film metaalelektroden vereist die zijn gecoat met PEDOT: PSS. Verder zullen de biologische modellen die zijn ontwikkeld voor de evaluatie van antitumor elektrische behandelingen van algemeen belang zijn voor het onderzoek naar de differentiatie van cellulaire, vasculaire en immuunrespons op geïmplanteerde materialen.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>(3-Glycidyloxypropyl)trimethoxysilane</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>440167</td>
			<td>GOPS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.25% Trypsin-EDTA (1X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25200-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-Dodecylbenzenesulfonic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>44198</td>
			<td>DBSA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plate</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Technic</td>
			<td>530</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrylic resin</td>
			<td>Fischer scientific</td>
			<td>NC1455685</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>agarose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9539</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>autoclave</td>
			<td>Tuttnauer</td>
			<td>3150 EL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AZ 10XT</td>
			<td>Microchemicals</td>
			<td></td>
			<td>Positive photoresist</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AZ 826 MIF Developer</td>
			<td>Merck</td>
			<td>10056124960</td>
			<td>Metal-ion-free developer for the negative photoresist</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AZ Developer</td>
			<td>Merck</td>
			<td>10054224960</td>
			<td>Metal-ion-free developer for the positive photoresist</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AZ nLof 2070</td>
			<td>Microchemicals</td>
			<td></td>
			<td>Negative photoresist</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buprenorphine</td>
			<td>Axience</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carprofen</td>
			<td>Rimadyl</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge Sorvall Legend X1R</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>75004260</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CMOS camera Prime 95B</td>
			<td>Photometrics</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 incubator HERAcell 150i</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAC board</td>
			<td>National Instruments</td>
			<td>USB 6259</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D&#233;co spray P&#233;b&#233;o</td>
			<td>Cultura</td>
			<td>3167860937307</td>
			<td>Black acrylic paint</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextran Texas Red 70.000</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>D1830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Die bonding paste &#34;Epinal&#34;</td>
			<td>Hitachi</td>
			<td>EN-4900GC</td>
			<td>Silver paste</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D2438</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispensing machine</td>
			<td>Tianhao</td>
			<td>TH-2004C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Modified Eagle&#8217;s Medium + GlutaMAX&#8482;-I</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10567-014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D6429</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Egg incubator COUVAD&#39;OR 160</td>
			<td>lafermedemanon.com</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylene glycol</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>6881.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fertilized eggs of Japanese quail</td>
			<td>Japocaille</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>VWR</td>
			<td>S181BH</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flask</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>658170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence macroscope</td>
			<td>Leica MZFLIII</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gl261</td>
			<td>DSMZ</td>
			<td>ACC 802</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gold pellets - Dia 3 mm x 6 mm th</td>
			<td>Neyco</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Handheld automated cell counter</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>PHCC00000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating and drying oven</td>
			<td>Memmert</td>
			<td>UF110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hexadimethrine Bromide Sequa-brene</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S2667</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hot plate Delta 6 HP 350</td>
			<td>S&#252;ss Microtec</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Illumination system pE-4000</td>
			<td>CoolLed</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Infrared tunable femtosecond laser (Ma&#239;-Ta&#239;)</td>
			<td>Spectra Physics (USA)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ionomycin calcium salt</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I3909</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kapton tape SCOTCH 92 33x19</td>
			<td>3M</td>
			<td></td>
			<td>Polyimide protection tape</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lab made pulse generator</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Labcoter 2 Parylene Deposition system PDS 2010</td>
			<td>SCS</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lenti-X 293 T cell line</td>
			<td>Takara Bio</td>
			<td>63218</td>
			<td>HEK 293T-derived cell line optimized for lentivirus production</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lenti-X GoStix Plus</td>
			<td>Takara Bio</td>
			<td>631280</td>
			<td>Quantitative lentiviral titer test</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mask aligner MJB4</td>
			<td>S&#252;ss Microtec</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro-90 Concentrated cleaning solution</td>
			<td>International Products</td>
			<td>M9050-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slides 76 x 52 x 1 mm</td>
			<td>Marienfeld</td>
			<td>1100420</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needles 30G</td>
			<td>BD Microlance 3</td>
			<td>304000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PalmSens4 potentiostat</td>
			<td>PalmSens</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>parylene-c : dichloro-p-cyclophane</td>
			<td>SCS</td>
			<td>300073</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCB Processing Tanks</td>
			<td>Mega Electronics</td>
			<td>PA104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEDOT:PSS Clevios PH 1000</td>
			<td>Heraeus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>penicillin / streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>351029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pGP-CMV-GCaMP6f</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>40755</td>
			<td>plasmid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffer Saline solution</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>D8537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasma treatment system PE-100</td>
			<td>Plasma Etch</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PlasmaLab 80 Reactive Ion Etcher</td>
			<td>Oxford Instruments</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic mask</td>
			<td>Selba</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic weigh boat 64 x 51 x 19 mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10770-454</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-dimethylsiloxane: SYLGARD 184 Silicone Elastomer Kit</td>
			<td>Dow chemicals</td>
			<td>1673921</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyimide copper film 60 &#181;m (Kapton)</td>
			<td>Goodfellow</td>
			<td>IM301522</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propan-2-ol</td>
			<td>Technic</td>
			<td>574</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protolaser S</td>
			<td>LPKF</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>puromycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A11103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Round cover glass 5 mm diameter</td>
			<td>Fischer scientific</td>
			<td>50-949-439</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scepter Sensors - 60 &#181;m</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>PHCC60050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone adhesive Kwik-Sil</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>spin coater</td>
			<td>S&#252;ss Microtec</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spin Coater</td>
			<td>Laurell</td>
			<td>WS-650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Super glue</td>
			<td>Office depot</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tetracycline-free f&#339;tal bovine Serum</td>
			<td>Takara Bio</td>
			<td>631105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermal evaporator Auto 500</td>
			<td>Boc Edwards</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Two-photon microscope</td>
			<td>Zeiss LSM 7MP</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>U87-MG</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>HTB-14</td>
			<td>Human glioblastoma cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonic cleaner</td>
			<td>VWR</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex VTX-3000L</td>
			<td>LMS</td>
			<td>VTX100323410</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xfect single shots reagent</td>
			<td>Takara Bio</td>
			<td>631447</td>
			<td>Transfection reagent</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

flexible organic electronic devices for pulsed electric field therapy of glioblastoma

Glioblastoom is moeilijk uit te roeien met standaard oncologische therapieën vanwege de hoge mate van invasiviteit. Bio-elektrische behandelingen op basis van gepulseerde elektrische velden (PEF's) zijn veelbelovend voor de verbetering van de behandelingsefficiëntie. Ze vertrouwen echter op stijve elektroden die acute en chronische schade veroorzaken, vooral in zachte weefsels zoals de hersenen. In dit werk werd flexibele elektronica gebruikt om PEF's aan tumoren af te leveren en de biologische respons werd geëvalueerd met fluorescerende microscopie. Geinterdigiteerde gouden elektroden op een dun, transparant paryleen-C-substraat werden gecoat met het geleidende polymeer PEDOT:PSS, wat resulteerde in een conformeerbaar en biocompatibel apparaat. De effecten van PEF's op tumoren en hun micro-omgeving werden onderzocht met behulp van verschillende biologische modellen. Eerst werden monolagen van glioblastoomcellen bovenop de elektroden gekweekt om verschijnselen in vitro te onderzoeken. Als tussenstap werd een in ovo-model ontwikkeld waarbij gemanipuleerde tumorsferoïden werden geënt in het embryonale membraan van een kwartel. Door de afwezigheid van een immuunsysteem leidde dit tot sterk gevasculariseerde tumoren. In dit vroege stadium van ontwikkeling hebben embryo's geen immuunsysteem en worden tumoren niet herkend als vreemde lichamen. Zo kunnen ze zich snel ontwikkelen terwijl ze hun eigen bloedvaten ontwikkelen vanuit het bestaande embryovasculaire systeem, dat een waardevol 3D-kankermodel vertegenwoordigt. Ten slotte werd flexibele elektrodetoediening van PEF's geëvalueerd in een compleet organisme met een functioneel immuunsysteem, met behulp van een syngene, orthograft (intracraniaal) muismodel. Tumorsferoïden werden geënt in de hersenen van transgene multi-fluorescerende muizen voorafgaand aan de implantatie van flexibele organische elektrode-apparaten. Een afgesloten schedelvenster maakte multifotonenbeeldvorming van de tumor en zijn micro-omgeving mogelijk tijdens de behandeling met PEF's gedurende een periode van enkele weken.

Dit protocol maakt de toepassing mogelijk op twee glioblastoommodellen waarin een flexibel PEF-toedieningssysteem is geïntegreerd. Na microfabricage- en verpakkingsstappen worden flexibele elektroden gekarakteriseerd in zoutoplossing door elektrochemische impedantiespectroscopie (EIS) om hun prestaties te beoordelen en te valideren. De PEDOT:PSS-gecoate elektroden tonen de typische capacitieve en resistieve gedomineerde gebieden gescheiden door een afsnijfrequentie, terwijl de ongecoate elektroden alleen capacitief gedrag vertonen (figuur 2).
Een variatie op de vloeistof-overlay 96-well plaatmethode wordt gebruikt om 3D-tumoren te laten groeien die zijn gemaakt van getransfecteerde glioblastoomcellen die stabiel een fluorescerende intracellulaire calciumreporter tot expressie brengen. De groei van de sferoïden kan worden waargenomen met een helderveldmicroscoop (figuur 3; ED 0). Ten minste 2 of 3 dagen zijn nodig om bolvormige en dichte sferoïden te verkrijgen, afhankelijk van de cellijn en het aantal gezaaide cellen.
In het in ovo-model worden sferoïden geënt in het chorioallantoïsche membraan van een kwartelembryo (figuur 3; ED 6). Het succes van het transplantaat kan enkele dagen later worden beoordeeld met fluorescentiemicroscopie, omdat levende cellen intracellulair calcium hebben en dus fluorescerend zijn (figuur 3; ED 9). De vascularisatie van de tumor kan worden waargenomen onder een fluorescentiemicroscoop door een fluorescerende kleurstof in de bloedvaten te injecteren (figuur 3; ED9). Het is echter niet altijd mogelijk om de bloedvaten in de tumor te visualiseren, omdat de sferoïde erg dicht is. De flexibele interdigitated elektroden worden bovenop de gevasculariseerde tumor geplaatst (figuur 3; ED 9) en aangesloten op een pulsgenerator. De sonde moet voorzichtig worden geplaatst om bloedingen van het embryo te voorkomen; Anders kan de fluorescerende kleurstof zich verspreiden, wat elke waarneming door beeldvorming belemmert. De juiste afgifte van de puls aan de biologische omgeving kan worden geverifieerd door de stroom te meten die door het circuit gaat. Beeldvorming hiervan in ovo-modellen maakt real-time monitoring mogelijk van het effect van PEF's op het intracellulaire calcium in een 3D-glioblastoomtumor, evenals de vasoconstrictie geïnduceerd op de vasculatuur van de tumor, waarbij elke invloed van andere celtypen, waaronder het immuunsysteem, wordt vermeden15.
De studie van het PEF-effect op glioblastoom kan ook worden uitgevoerd in een completer en voorspellender model. Het hierboven beschreven in vivo model14 bestaat inderdaad uit het enten van een 3D-glioblastoomtumor in het hersenparenchym van een muis (figuur 4). De injectieplaats van de tumor wordt afgesloten door een verknoopte dextran gel hemi-kraal, om de fysiologische biofysische beperkingen tijdens de groei van de tumor samen te vatten. Hoewel beschreven in referentie14, is het de moeite waard om nogmaals te benadrukken dat het van cruciaal belang is dat de dextran hemi-kraal precies op de dura mater wordt gelijmd; Anders kan de tumor ontsnappen door de open dura en de hersenen volledig bedekken, waardoor de beeldvorming onmogelijk wordt. Voor elke chronische beeldvorming vormt weefselingroei die plaatsvindt als het schedelvenster geneest een ernstige barrière, omdat het nieuwe weefsel niet-transparant is en beelden mistig of niet-bruikbaar maakt. Daarom moeten na het inbrengen en lijmen van de hemi-kraal de zijwanden van het geopende schedelvenster worden afgedicht met een dunne laag secondelijm die zorgvuldig rond de spouwmuur is geplaatst, zonder de secondelijm te laten glijden of op de dura te laten stromen. Wanneer de flexibele sonde bovenop de tumorinjectieplaats wordt geplaatst, kunnen er om twee redenen geen bellen onder de sonde blijven. Ten eerste kan beeldvorming niet doorgaan wanneer er bubbels aanwezig zijn. Ten tweede dienen bellen als isolatoren, waardoor de elektrische stimulatie-eigenschappen veranderen. Na het nemen van de hierboven beschreven voorzorgsmaatregelen, wordt de craniotomie verzegeld met een glazen venster dat aan de schedel is gecementeerd om chronische beeldvorming gedurende weken mogelijk te maken. Omdat de tumor bestaat uit GCaMP- of DsRed-expressiecellen, kan de injectie worden bevestigd met een fluorescentiemicroscoop. De elektrochemische impedantie van de elektroden moet worden gemeten om de prestaties na implantatie te valideren. Vergeleken met de impedantie in zoutoplossing wordt in vivo een toename van de impedantie verwacht bij frequenties boven 100 Hz als gevolg van de aanwezigheid van een biologische omgeving (figuur 5). Gevasculariseerd neuraal parenchym en tumorinfiltratie kunnen gedurende weken worden waargenomen en gekarakteriseerd door het transparante substraat door middel van tweefotonenmicroscopie (figuur 6). Het gebruik van transgene dieren die fluorescerende eiwitten tot expressie brengen in cellen van belang (immuuncellen en neuronen) kan bijvoorbeeld het mogelijk maken om het minimale ontstekingsproces aan te tonen dat wordt geïnduceerd door elektrode-implantatie alleen (figuur 6A) of de aanwezigheid van microglia en monocyten aantonen 26 dagen na implantatie van een PEF-gestimuleerde elektrode geïmplanteerd bovenop een groeiende GBM-tumor (figuur 6B1 ). In het laatste geval werden zowel van perifere monocyten afgeleide cellen als van de hersenen residente microgliale cellen rond en in de tumor gevonden (figuur 6B2). Op de dag van PEF-levering kunnen contactpads van de flexibele elektroden worden aangesloten op de pulsgenerator, direct onder de tweefotonenmicroscoop. Over het algemeen kan dit model worden gebruikt om het effect van bio-elektrische behandelingen in de loop van de tijd te onderzoeken met behulp van verschillende soorten cellen die betrokken zijn bij de ontwikkeling van hersentumoren, tot een diepte van ongeveer 500 μm.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63527/63527fig01.jpg"> Figuur 1: Microfabricage van flexibele elektroden . (A) Gouden elektrodepatronen en Paryleen C-substraat. (B) Omtrekopening. (C) PEDOT:PSS-coating. (D) Aansluitingen en verpakking. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63527/63527fig01large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63527/63527fig02.jpg"> Figuur 2: Elektrochemische impedantiespectroscopie van flexibele goudelektroden en PEDOT:PSS gecoate koude elektroden in een zoutoplossing. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63527/63527fig02large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63527/63527fig03.jpg"> Figuur 3: Het in ovo model van glioblastoom. ED 0: Sferoïde waargenomen met een helderveldmicroscoop. ED 3: Schelp minder kweek van een kwartelembryo 3 dagen na opening. ED 6: Tumor geïmplanteerd in de CAM waargenomen met een helderveldmicroscoop. ED 9: Flexibel apparaat geplaatst op de gevasculariseerde tumor (tumor in groen en bloedvaten in rood). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63527/63527fig03large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63527/63527fig04.jpg"> Figuur 4: De in vivo toepassing. (A) Schema voor in vivo experimenten. (B) Plaatsing van de sonde vóór het aanbrengen van afdekglas en acrylhars. (C) Voltooide implantatie van de sonde. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63527/63527fig04large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63527/63527fig05.jpg"> Figuur 5: Elektrochemische impedantiespectroscopie van flexibele goudelektroden in een zoutoplossing in vergelijking met een geïmplanteerde sonde. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63527/63527fig05large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63527/63527fig06.jpg"> Figuur 6: Intravitale multispectrale beeldvorming van twee fotonen door middel van elektroden . (A) Betegeld beeld van het gezonde hersenoppervlak in een controle multifluorescente AMU-Neuroinflam muis 3 dagen na elektrode-implantatie. Cyaan toont dendritische arborisatie van laag 5 piramidale neuronen, groen toont gerekruteerde granulocyten en monocyten, en geel toont geactiveerde microglia en dendritische cellen. Roze toont infrarooddiffusie als gevolg van warmteaccumulatie. (B1) Vergelijkbaar beeld als in A, maar 26 dagen na tumor sferoïde implantatie 200 μm diep in de cortex onmiddellijk gevolgd door elektrode-implantatie. Let op de accumulatie van groene en gele immuuncellen. (B2) Vergelijkbaar beeld als in B1 , maar 100 μm onder het oppervlak van de elektroden. Let op de aanwezigheid van blauwe neuronale dendritische arborisatie in de periferie van de rode tumormassa zelf geïnfiltreerd door gele microglia en dendritische cellen. Diepblauw toont een tweede harmonisch signaal van het peritumorale collageen. (B3) Ingezoomde weergave van B2 met de aanwezigheid van interneuron soma's (aangegeven met pijlen) in de buurt van de tumor. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63527/63527fig06large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Flexible Organic Electronic Devices for Pulsed Electric Field Therapy of Glioblastoma at JoVE.com

Flexible Organic Electronic Devices for Pulsed Electric Field Therapy of Glioblastoma

Dit werk beschrijft de ontwikkeling van flexibele interdigitated elektroden voor implementatie in 3D hersentumormodellen, namelijk in vitro cultuur, in ovo model en in vivo murine model. De voorgestelde methode kan worden gebruikt om de effecten van gepulseerde elektrische velden op tumoren op verschillende niveaus van complexiteit te evalueren.

Flexibele organische elektronische apparaten voor gepulseerde elektrische veldtherapie van glioblastoom

Glioblastoma is difficult to eradicate with standard oncology therapies due to its high degree of invasiveness. Bioelectric treatments based on pulsed ...

Dit protocol maakt de levering van pulselektrische velden door flexibele elektronica mogelijk om hun therapeutische effecten op glioblastoom te bestuderen. Dit doen we door de micro-omgeving van de tumor in vivo te visualiseren met beeldvorming. De bio-elektronica integreert in dit protocol met behulp van verschillende modellen van toenemende complexiteit om het effect van pulserende velden op kanker te bestuderen.De microfabricagetechnieken die in dit werk worden gepresenteerd, kunnen ook worden getest als een middel om andere soorten kanker te behandelen, waaronder van patiënten afgeleide xenografts. Dit gaat in de richting van het idee van precisiegeneeskunde op maat van elke individuele patiënt. Deze sondes zijn gemaakt met standaard microfabricagetechnieken, dus de productie is eenvoudig en iedereen met een cleanroom kan ze maken.Voor goudelektrodepatronen deponeert u een laag van drie micrometer paryleen C met een paryleenafzettingssysteem door de schone glasglaasjes in de afzettingskamer te plaatsen. Weeg zes gram paryleen C in een aluminium boot, plaats het in de oven, evacueer de machine en begin de afzetting met de parameters die in het manuscript worden beschreven. Wanneer de afzetting is voltooid en de temperatuur van de vaporizer lager is dan 40 graden Celsius, zet je de koelmachine, verdamper, oven uit.Ontlucht de machine en verzamel de monsters. Spin coat de plasmabehandelde monsters met een negatieve fotoresist op 1.000 maal G gedurende 40 seconden. Belicht de fotoresist door een masker met het geïnterdigiteerde elektrodeontwerp.Dompel vervolgens monsters gedurende drie minuten onder in een metaalionvrije ontwikkelaar om de niet-belichte fotoresist te verwijderen. Om een hechtingslaag van 20 nanometer chroom en een laag goud van 300 nanometer af te zetten met een thermische verdamper, ontlucht u de verdampermachine en klemt u de monsters op de bovenste ronde plaat met metalen schroeven. Vul de speciale kroezen met respectievelijk chroom en goud.Verzegel en evacueer de machine en start de rotatie van de monsterhouder. Selecteer de kroes die chroom bevat en verhoog langzaam de stroom totdat de afzettingssnelheid 0,2 angstroms per seconde bereikt. Open de sluiter, wacht tot de afzetting van 20 nanometer chroom, sluit de sluiter en verlaag langzaam de stroom tot nul milliamperes.Selecteer de goudhoudende smeltkroes en verhoog langzaam de stroom tot een afzettingssnelheid van 0,2 angstroms per seconde. Open de sluiter om het goud te verdampen, wacht tot de afzetting van 10 nanometer goud en verhoog vervolgens de afzettingssnelheid tot 1,5 angstroms per seconde totdat ongeveer 300 nanometer is afgezet. Sluit de sluiter en verlaag de stroom langzaam naar nul milliamperes.Dompel de monsters onder in een bekerglas met aceton. Spoel de monsters vervolgens af met isopropanol en droog ze af met een luchtbuks. Spin coat vier lagen PEDOT:PSS-oplossing op 150 maal G gedurende 35 seconden.Verwijder de opofferende paryleen C-laag door de monsters onder te dompelen in water. Dompel de monsters gedurende 30 minuten onder in gedeïoniseerd water om de resterende zeep en verbindingen met een laag molecuulgewicht in de PEDOT:PSS-film te verwijderen en maak de monsters los van het glazen substraat. Voeg 75 microliter gesmolten 1% agarose-oplossing toe in elk putje van de 96-putplaat en laat het 15 minuten stollen bij kamertemperatuur.Maak de getransduceerde glioblastoomcellen los die zijn verkregen tijdens de stabiele cellijngeneratie. Voeg 10.000 glioblastoomcellen per put toe en maak het totale volume tot 150 microliter per put met DMEM met één gram per liter glucose, L-glutamine, natriumpyruvaat en natriumbicarbonaat, 10% foetaal runderserum, 100 eenheden per microliter penicilline en 100 microgram per microliter streptomycine. Vervang de helft van de media om de twee dagen door verse media tot verdere experimenten terwijl u de pipetpunt in het bovenste deel van de put houdt om schade aan de agarose of de sferoïde zelf te voorkomen.Plaats de bevruchte eieren van de Japanse kwartel, Coturnix japonica, in een broedmachine op trays met een automatische rotator die om de twee uur eieren draait. Deze dag wordt beschouwd als embryonale dag nul. Open op de embryonale dag drie de eieren voorzichtig met een pincet met dunne uiteinden voorgewassen met 70% ethanol.Giet het embryo in een plastic weegboot, bedek het met een andere weegboot en plaats het gedurende drie dagen in een standaard bevochtigde couveuse bij 37 graden Celsius. Maak op embryonale dag zes een kleine incisie in het chorioallantoïsche membraan met een naald van 23 gauge. Plaats een zevendaagse sferoïde op de incisie met behulp van een pipet en breng het embryo gedurende drie dagen terug naar de couveuse tot verdere experimenten.Plaats een druppel DPBS om de craniotomie te bedekken. Plaats de flexibele elektrode op de druppel DPBS en plaats voorzichtig de achterkant van de sonde met de contactpads op de rug van de muis. Absorbeer de DPBS-druppel met een klein stukje papier totdat de sonde plat op de dura kan liggen en de kromming van de hersenen kan volgen, zodat de kleine laag zoutoplossing onder de elektroden blijft om als een barrière te fungeren tegen lijmspillover.Plaats een kleine druppel siliconenlijm op de sonde en bedek deze met een rond dekglas van vijf millimeter. Duw het afdekglas naar beneden totdat de siliconen gelijkmatig zijn verdeeld en de afstand tussen het afdekglas en de sonde minimaal is. Wacht vervolgens 30 seconden tot de siliconen zijn gestold.Om het afdekglas vast te zetten, brengt u snel secondelijm aan de zijkanten aan en duwt u het naar beneden totdat de lijm stevig wordt. Breng superlijm aan op de nek van de sonde met behulp van een tandenstoker en zorg ervoor dat de superlijm onder de nek wordt getrokken om stabiele ondersteuning te bieden. Bedek de schedel met tandcement om een chronische dop te bouwen en zorg er speciaal voor dat alleen de randen van het afdekglas worden bedekt.Til de achterkant van de sonde op en breng cement aan onder de hals van de sonde. Rest van de sonde op het cement voordat het uithardt. Duw de hals van de sonde voorzichtig naar beneden om het oppervlak op hetzelfde niveau te plaatsen als het dekglas en niet in de weg van het microscoopobjectief tijdens het experiment.Bedek de bovenkant van de sondehals met niet meer dan 1,5 millimeter tandcementlaag om een stevige grip op de sonde te krijgen. Bouw een cementput met een richel van 1,5 millimeter op één tot twee millimeter rond het dekglas om een bassin te creëren voor de onderdompelingsvloeistof voor de beeldvorming van twee fotonen. Nadat het cement is uitgehard, dient u postoperatieve analgesie toe en houdt u het dier warm tot herstel door het in een papieren handdoek te wikkelen en dicht bij een infraroodlamp te plaatsen.De PEDOT:PSS-gecoate elektroden tonen de typische capacitieve en resistieve gedomineerde gebieden gescheiden door een afsnijfrequentie, terwijl de ongecoate elektroden alleen capacitief gedrag vertonen. De groei van de sferoïden waargenomen met een brightfieldmicroscoop onthulde dat er minstens twee of drie dagen nodig zijn om bolvormige en dichte sferoïden te verkrijgen, afhankelijk van de cellijn en het aantal gezaaide cellen. In het in ovo-model kan het transplantaat van sferoïden in het chorioallantoïsche membraan worden beoordeeld door fluorescentiemicroscopie, omdat levende cellen intracellulair calcium hebben en de vascularisatie van de tumor kan worden beoordeeld door een fluorescerende kleurstof in de bloedvaten te injecteren.Vergeleken met de impedantie in zoutoplossing wordt in vivo een toename van de impedantie verwacht bij frequenties boven 100 hertz als gevolg van de aanwezigheid van een biologische omgeving. Gevasculariseerd neuraal parenchym en de tumorinfiltratie kunnen gedurende weken worden waargenomen en gekarakteriseerd door het transparante substraat door twee fotonenmicroscopie. Het gebruik van transgene dieren die fluorescerende eiwitten tot expressie brengen in cellen van belang kan het minimale ontstekingsproces aantonen dat alleen door elektrode-implantatie wordt geïnduceerd.Het kan de aanwezigheid van microglia en monocyten aantonen 26 dagen na implantatie gepulseerde elektrische velden gestimuleerde elektrode. Zowel perifere monocyten afgeleide als hersenen resonerende microgliale cellen werden gevonden rond en in de tumor. Het kritieke punt voor succes in de implantaatprocedure is om de afdichting en de vlakheid van het schedelvenster te waarborgen en de kwaliteit van het contact met de sonde te optimaliseren.Naast de intravitale beeldvorming, wat zou kunnen overwegen om ons protocol te combineren met andere metingen en technieken zoals de monsters en metingen van bloedwerk voor cytokines, immuunstatus door flowcytometrie of zelfs gedragsanalyse. Dit werk maakt de weg vrij voor het gebruik van flexibele implanteerbare hulpmiddelen voor kanker en opent nieuwe perspectieven voor het gebruik van bio-elektronische geneeskunde voor deze chronische ziekte.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Coculture Assays to Study Macrophage and Microglia Stimulation of Glioblastoma Invasion

Coculture Testen om te studeren macrofagen en microglia Stimulatie van glioblastoma Invasion

Glioblastoma multiforme (grade IV glioma) is a very aggressive human cancer with a median survival of 1 year post diagnosis. Despite the increased ...

Moving Upwards: A Simple and Flexible In Vitro Three-dimensional Invasion Assay Protocol

Moving Upwards: A Simple and Flexible In Vitro Three-dimensional Invasion Assay Protocol

Verplaatsen naar boven: Een eenvoudig en flexibel In Vitro driedimensionale invasie Assay Protocol

Although 3D invasion assays have been developed, the challenge remains to study cells without affecting the integrity of their microenvironment. ...

Fluorescence Molecular Tomography for In Vivo Imaging of Glioblastoma Xenografts

Fluorescence Molecular Tomography for In Vivo Imaging of Glioblastoma Xenografts

Fluorescentie moleculaire tomografie voor In Vivo Imaging van Glioblastoma Xenografts

Tumorigenicity is the capability of cancer cells to form a tumor mass. A widely used approach to determine if the cells are tumorigenic is by injecting ...

Live-Cell Imaging Assays to Study Glioblastoma Brain Tumor Stem Cell Migration and Invasion

Live-cel Imaging tests studie Glioblastoma Brain Tumor stamcel migratie en invasie

Glioblastoma (GBM) is an aggressive brain tumor that is poorly controlled with the currently available treatment options. Key features of GBMs include ...

The Clinical Application of Tumor Treating Fields Therapy in Glioblastoma

De klinische toepassing van Tumor velden therapie behandelen in Glioblastoma

Glioblastoma is the most common and lethal form of brain cancer, with a median survival of 15 months after diagnosis and a 5 year survival rate of only 5% ...

A 3D Spheroid Model for Glioblastoma

Een 3D Spheroid Model voor Glioblastoom

Two-dimensional (2D) cell cultures do not mimic in vivo tumor growth satisfactorily. Therefore, three-dimensional (3D) culture spheroid models were ...

Co-culture of Glioblastoma Stem-like Cells on Patterned Neurons to Study Migration and Cellular Interactions

Co-cultuur van Glioblastoom Stam-achtige cellen op patroonneuronen om migratie en cellulaire interacties te bestuderen

Glioblastomas (GBMs), grade IV malignant gliomas, are one of the deadliest types of human cancer because of their aggressive characteristics. Despite ...

Positron Emission Tomography-based Dose Painting Radiation Therapy in a Glioblastoma Rat Model using the Small Animal Radiation Research Platform

Positronemissie Tomografie-gebaseerde dosis schilderen Bestralingstherapie in een glioblastoom rat model met behulp van het Small Animal Radiation Research Platform

A rat glioblastoma model to mimic chemo-radiation treatment of human glioblastoma in the clinic was previously established. Similar to the clinical ...

Application of Hemostatic Devices in Laparoscopic Hepatectomy

Toepassing van hemostatische apparaten bij laparoscopische hepatectomie

Laparoscopic hepatectomy is considered a conventional method for treating benign and malignant liver diseases because it is a minimally invasive method. ...

Translational Orthotopic Models of Glioblastoma Multiforme

Translationele orthotopische modellen van glioblastoom multiforme

Genetically engineered mouse (GEM) models for human glioblastoma multiforme (GBM) are critical to understanding the development and progression of brain ...