Name: flexible organic electronic devices for pulsed electric field therapy of glioblastoma
Uploaded: 2022-08-09T13:00:00
Duration: 11 min 2 s
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Les travaux rapportés ici ont été soutenus par l’Agence Nationale de la Recherche (ANR-18-CE19-0029). Les auteurs remercient chaleureusement S.M. Bardet pour sa contribution à la génération d’une lignée cellulaire GCaMP6f stable et D. O’Connor pour son aide avec le modèle in ovo .

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Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêts financiers concurrents.

L’approche décrite dans ce travail permet aux modèles de tumeurs cérébrales avec un système intégré d’administration de PEF d’étudier l’effet des PEF à différents niveaux de l’organisation biologique. Le protocole de microfabrication se compose de procédés standard à couche mince, qui offrent un grand degré de liberté dans la conception des électrodes qui peut être adapté à l’application spécifique. Parfois, une étape supplémentaire de recuit thermique peut être utile à la fin de la fabrication, pour réduire la flexion des électrodes qui s’est produite pendant la fabrication.
L’utilisation d’une lignée cellulaire de glioblastome stable exprimant un indicateur de calcium fluorescent évite toutes les complications liées à l’administration et à la rétention du colorant, en particulier dans les tumeurs 3D très denses16. En effet, un niveau d’expression élevé est observé sur une longue période par rapport aux indicateurs chimiques fluorescents standardde calcium 17. Ce protocole peut être appliqué à diverses lignées cellulaires, car il est couramment utilisé pour l’imagerie de l’activité neuronale11. Ici, des lignées cellulaires humaines et murines ont été utilisées (U87 et Gl261 pour l’implantation chez des souris immunodéficientes ou immunocompétentes, respectivement). En effet, des études récentes ont montré que la lignée cellulaire U87 est différente de celle des cellules d’origine car de nombreuses mutations ont été acquises au cours d’années de culture cellulaire, affectant la reproductibilité expérimentale18. La méthode utilisée pour la préparation des tumeurs 3D est à haut débit, reproductible, et permet la génération de sphéroïdes d’une taille spécifique en fonction de la lignée cellulaire, du nombre de cellules à l’ensemencement et du temps de croissance19. Cependant, ces sphéroïdes sont denses, ce qui présente un inconvénient lors de l’imagerie au cœur de la tumeur.
Le modèle in ovo est utile comme première approche pour étudier l’effet du PEF sur les tumeurs 3D et leur système vasculaire, sans interactions avec d’autres types de cellules présentes dans le cerveau. Ce modèle est peu coûteux, rapide, à haut débit et soulève moins de questions éthiques que les modèles animaux. Il est important de maintenir l’intégrité de l’embryon tout au long de l’expérience, car cela pourrait affecter sa survie et la qualité de l’imagerie. Des précautions particulières doivent être prises lors de l’ouverture de l’œuf de caille, pour éviter d’endommager la membrane embryonnaire. La greffe et la mise en place des électrodes flexibles doivent également être effectuées avec soin, afin d’éviter les saignements qui pourraient tuer l’embryon. L’injection de colorant fluorescent dans les vaisseaux sanguins permet la visualisation simultanée des cellules tumorales et la vascularisation par microscopie à fluorescence. L’injection intraoculaire doit être effectuée avec précaution pour éviter que le colorant ne s’échappe dans le liquide embryonnaire, ce qui pourrait provoquer une fluorescence résiduelle en arrière-plan qui dégrade la qualité de l’imagerie. Ce modèle peut également être utilisé pour suivre l’absorption du médicament, car il permet l’accès au système circulatoire. Cependant, les expériences sont limitées par le temps de survie de 12 jours de l’embryon, permettant ainsi 7 jours d’observation, ce qui est nettement plus court que le modèle in vivo 21.
Le modèle de tumeur cérébrale in vivo peut être surveillé pendant 4 à 5 semaines avant que les animaux n’atteignent un critère expérimental éthique déterminé par une perte de poids soudaine de 20%. Il est bien toléré et reste en place si la queue de connexion de l’électrode n’est pas trop longue. Sinon, les animaux ont tendance à rayer le connecteur retournant, qui pourrait finalement être déchiré, empêchant ainsi la connexion ultérieure au stimulateur. Cette période de 4 semaines est néanmoins précieuse pour couvrir les différentes étapes du développement du glioblastome. En comparant les densités de cellules tumorales dans le même volume d’intérêt à différents intervalles de temps, l’évolution de la cinétique de croissance tumorale peut être observée. En particulier, une croissance tumorale accrue a été observée au moment de l’interrupteur immunitaire22. Une étude similaire en présence d’une électrode stimulante informerait sur l’effet du PEF sur le taux de prolifération tumorale et la sensibilité tumorale à l’élimination immunitaire. Par rapport au modèle in ovo , le modèle in vivo peut être considéré comme un modèle préclinique précieux pour étudier l’impact des cellules immunitaires sur la progression tumorale et leur contribution à l’effet thérapeutique du PEF. Ce protocole est adapté d’un précédent article avec l’ajout d’un dispositif d’électrode flexible sur la tumeur avant de placer une fenêtre crânienne14. Les traitements bioélectriques aigus et chroniques des tumeurs peuvent être caractérisés par des observations directes et ultérieures avec la microscopie à deux photons, étant donné que la stimulation initiale devrait induire la mort cellulaire et déclencher une dérégulation durable de la réponse immunitaire.
Les connexions de la sonde flexible sont facilement accessibles au microscope à deux photons. Les paramètres de stimulation électrique peuvent ainsi être ajustés en temps réel en fonction de l’effet observé sur le tissu neural et/ou les cellules ciblées, de la même manière qu’un médecin effectuerait des procédures interventionnelles tout en observant des images IRM ou CT de son patient. Une dernière considération est l’importance de sceller soigneusement l’électrode sur le cerveau avec de la superglue et de la colle de silicone pour empêcher la repousse des tissus.
En conclusion, le protocole décrit ici représente un modèle innovant pour étudier l’effet de la thérapie PEF avec des électrodes en polymère organique flexible pour les modèles tumoraux de glioblastome. Les deux modèles présentent différents niveaux de complexité, de sorte que les effets cellulaires, vasculaires ou immunitaires peuvent être séparés pour une meilleure compréhension des mécanismes d’action. Les électrodes superficielles et conformes réduisent les dommages iatrogènes tout en permettant de perturber le microenvironnement tumoral, déclenchant une vasoconstriction ou un dérèglement du calcium intracellulaire15.

Le glioblastome multiforme (GBM) est une tumeur très invasive et donc difficile à éradiquer avec des traitements standard tels que la résection, la radiothérapie et la chimiothérapie. Malgré les traitements multimodaux, le pronostic reste très sombre et la plupart des patients connaissent une progression de la maladie dans l’année 1 suivant le diagnostic 1,2. Récemment, le développement de traitements bioélectriques a montré un grand potentiel pour améliorer les thérapies existantes. Ces thérapies utilisent l’administration de champs électriques pulsés (PEF), généralement en une seule séance de traitement, pour perturber l’intégrité de la membrane cellulaire et le microenvironnement des tumeurs. Cette perturbation de la membrane cellulaire, également appelée électroporation, peut être réversible ou irréversible en fonction de l’intensité du champ électrique et du nombre d’impulsions. L’électroporation irréversible (IRE) est appliquée comme une technique d’ablation tissulaire non thermique dans laquelle les impulsions électriques causent des dommages mortels aux membranes cellulaires conduisant à la mort cellulaire3. L’électroporation réversible est appliquée à l’électrochimiothérapie (ECT), une technique établie qui consiste à administrer des PEF en combinaison avec des médicaments de chimiothérapie pour améliorer l’absorption du médicament dans les cellules cancéreuses4. De plus, des études récentes ont démontré que l’électroporation du calcium était une alternative à l’ECT avec une efficacité élevée pour le traitement du cancer, qui est également peu coûteuse et induit moins d’effets secondaires5. Malgré ces avancées prometteuses, les EEP sont généralement appliqués à l’aide d’électrodes métalliques rigides connues pour endommager les tissus mous6. Le cerveau est particulièrement sensible à ces dispositifs invasifs où le décalage mécanique induit une inflammation et des cicatrices astrogliales7.
Dans ce contexte, un système flexible d’administration de PEF en combinaison avec des modèles 3D de tumeurs de glioblastome est présenté, de la microfabrication à un modèle murin. Les électrodes conformes sont fabriquées avec des procédés de microfabrication à couche mince standard, y compris l’utilisation de matériaux souples et biocompatibles tels que le parylène-C, l’or et le PEDOT:PSS 8,9. Une conception d’électrode interdigitée est utilisée pour couvrir une grande surface tout en maintenant une transparence adéquate pour l’imagerie entre les doigts de l’électrode10. Pour le modèle tumoral, des sphéroïdes 3D de cellules de glioblastome exprimant un rapporteur de fluorescence génétiquement codé sont produits en utilisant une variante de la méthode de plaque de 96 puits à recouvrement de liquide11. Les sphéroïdes sont greffés dans la membrane chorio-allantoïdienne d’un embryon de caille, ce qui donne un modèle in ovo qui a été largement utilisé pour étudier l’angiogenèse ou la toxicologie médicamenteuse12,13. Les tumeurs peuvent être greffées et vascularisées par le système vasculaire de l’embryon en l’absence de système immunitaire à ce stade du développement embryonnaire12. Des électrodes flexibles sont ensuite placées sur le dessus de la tumeur vascularisée pour étudier l’effet de l’administration de PEF sur le sphéroïde et son système vasculaire. Enfin, ces effets sont étudiés sur un organisme vivant complet, y compris le microenvironnement tumoral et le système immunitaire, en implantant des sphéroïdes modifiés dans le parenchyme cérébral de modèles murins14. Des électrodes flexibles sont placées sur le site d’insertion et la craniotomie est scellée avec une fenêtre en verre, permettant une imagerie répétée à deux photons sur plusieurs semaines.
Ces méthodes seront utiles pour les personnes intéressées par divers domaines allant de l’ingénierie microélectronique aux applications en oncologie. Le protocole de microfabrication peut être utilisé et adapté pour toute application nécessitant des électrodes métalliques à couche mince revêtues de PEDOT:PSS. De plus, les modèles biologiques développés pour l’évaluation des traitements électriques antitumoraux seront d’intérêt général pour l’étude de la différenciation de la réponse cellulaire, vasculaire et immunitaire aux matériaux implantés.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>(3-Glycidyloxypropyl)trimethoxysilane</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>440167</td>
			<td>GOPS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.25% Trypsin-EDTA (1X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25200-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-Dodecylbenzenesulfonic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>44198</td>
			<td>DBSA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plate</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Technic</td>
			<td>530</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrylic resin</td>
			<td>Fischer scientific</td>
			<td>NC1455685</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>agarose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9539</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>autoclave</td>
			<td>Tuttnauer</td>
			<td>3150 EL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AZ 10XT</td>
			<td>Microchemicals</td>
			<td></td>
			<td>Positive photoresist</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AZ 826 MIF Developer</td>
			<td>Merck</td>
			<td>10056124960</td>
			<td>Metal-ion-free developer for the negative photoresist</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AZ Developer</td>
			<td>Merck</td>
			<td>10054224960</td>
			<td>Metal-ion-free developer for the positive photoresist</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AZ nLof 2070</td>
			<td>Microchemicals</td>
			<td></td>
			<td>Negative photoresist</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buprenorphine</td>
			<td>Axience</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carprofen</td>
			<td>Rimadyl</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge Sorvall Legend X1R</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>75004260</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CMOS camera Prime 95B</td>
			<td>Photometrics</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 incubator HERAcell 150i</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAC board</td>
			<td>National Instruments</td>
			<td>USB 6259</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D&#233;co spray P&#233;b&#233;o</td>
			<td>Cultura</td>
			<td>3167860937307</td>
			<td>Black acrylic paint</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextran Texas Red 70.000</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>D1830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Die bonding paste &#34;Epinal&#34;</td>
			<td>Hitachi</td>
			<td>EN-4900GC</td>
			<td>Silver paste</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D2438</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispensing machine</td>
			<td>Tianhao</td>
			<td>TH-2004C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Modified Eagle&#8217;s Medium + GlutaMAX&#8482;-I</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10567-014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D6429</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Egg incubator COUVAD&#39;OR 160</td>
			<td>lafermedemanon.com</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylene glycol</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>6881.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fertilized eggs of Japanese quail</td>
			<td>Japocaille</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>VWR</td>
			<td>S181BH</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flask</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>658170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence macroscope</td>
			<td>Leica MZFLIII</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gl261</td>
			<td>DSMZ</td>
			<td>ACC 802</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gold pellets - Dia 3 mm x 6 mm th</td>
			<td>Neyco</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Handheld automated cell counter</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>PHCC00000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating and drying oven</td>
			<td>Memmert</td>
			<td>UF110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hexadimethrine Bromide Sequa-brene</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S2667</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hot plate Delta 6 HP 350</td>
			<td>S&#252;ss Microtec</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Illumination system pE-4000</td>
			<td>CoolLed</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Infrared tunable femtosecond laser (Ma&#239;-Ta&#239;)</td>
			<td>Spectra Physics (USA)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ionomycin calcium salt</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I3909</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kapton tape SCOTCH 92 33x19</td>
			<td>3M</td>
			<td></td>
			<td>Polyimide protection tape</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lab made pulse generator</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Labcoter 2 Parylene Deposition system PDS 2010</td>
			<td>SCS</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lenti-X 293 T cell line</td>
			<td>Takara Bio</td>
			<td>63218</td>
			<td>HEK 293T-derived cell line optimized for lentivirus production</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lenti-X GoStix Plus</td>
			<td>Takara Bio</td>
			<td>631280</td>
			<td>Quantitative lentiviral titer test</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mask aligner MJB4</td>
			<td>S&#252;ss Microtec</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro-90 Concentrated cleaning solution</td>
			<td>International Products</td>
			<td>M9050-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slides 76 x 52 x 1 mm</td>
			<td>Marienfeld</td>
			<td>1100420</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needles 30G</td>
			<td>BD Microlance 3</td>
			<td>304000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PalmSens4 potentiostat</td>
			<td>PalmSens</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>parylene-c : dichloro-p-cyclophane</td>
			<td>SCS</td>
			<td>300073</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCB Processing Tanks</td>
			<td>Mega Electronics</td>
			<td>PA104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEDOT:PSS Clevios PH 1000</td>
			<td>Heraeus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>penicillin / streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>351029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pGP-CMV-GCaMP6f</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>40755</td>
			<td>plasmid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffer Saline solution</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>D8537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasma treatment system PE-100</td>
			<td>Plasma Etch</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PlasmaLab 80 Reactive Ion Etcher</td>
			<td>Oxford Instruments</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic mask</td>
			<td>Selba</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic weigh boat 64 x 51 x 19 mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10770-454</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-dimethylsiloxane: SYLGARD 184 Silicone Elastomer Kit</td>
			<td>Dow chemicals</td>
			<td>1673921</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyimide copper film 60 &#181;m (Kapton)</td>
			<td>Goodfellow</td>
			<td>IM301522</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propan-2-ol</td>
			<td>Technic</td>
			<td>574</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protolaser S</td>
			<td>LPKF</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>puromycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A11103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Round cover glass 5 mm diameter</td>
			<td>Fischer scientific</td>
			<td>50-949-439</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scepter Sensors - 60 &#181;m</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>PHCC60050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone adhesive Kwik-Sil</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>spin coater</td>
			<td>S&#252;ss Microtec</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spin Coater</td>
			<td>Laurell</td>
			<td>WS-650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Super glue</td>
			<td>Office depot</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tetracycline-free f&#339;tal bovine Serum</td>
			<td>Takara Bio</td>
			<td>631105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermal evaporator Auto 500</td>
			<td>Boc Edwards</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Two-photon microscope</td>
			<td>Zeiss LSM 7MP</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>U87-MG</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>HTB-14</td>
			<td>Human glioblastoma cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonic cleaner</td>
			<td>VWR</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex VTX-3000L</td>
			<td>LMS</td>
			<td>VTX100323410</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xfect single shots reagent</td>
			<td>Takara Bio</td>
			<td>631447</td>
			<td>Transfection reagent</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

flexible organic electronic devices for pulsed electric field therapy of glioblastoma

Le glioblastome est difficile à éradiquer avec les thérapies oncologiques standard en raison de son degré élevé d’invasivité. Les traitements bioélectriques basés sur les champs électriques pulsés (PEF) sont prometteurs pour l’amélioration de l’efficacité du traitement. Cependant, ils reposent sur des électrodes rigides qui causent des dommages aigus et chroniques, en particulier dans les tissus mous tels que le cerveau. Dans ce travail, l’électronique flexible a été utilisée pour délivrer des PEF aux tumeurs et la réponse biologique a été évaluée par microscopie fluorescente. Des électrodes en or interdigitées sur un substrat mince et transparent de parylène-C ont été recouvertes du polymère conducteur PEDOT:PSS, résultant en un dispositif conformable et biocompatible. Les effets des PEF sur les tumeurs et leur microenvironnement ont été examinés à l’aide de divers modèles biologiques. Tout d’abord, des monocouches de cellules de glioblastome ont été cultivées au-dessus des électrodes pour étudier les phénomènes in vitro. Comme étape intermédiaire, un modèle in ovo a été développé où des sphéroïdes tumoraux modifiés ont été greffés dans la membrane embryonnaire d’une caille. En raison de l’absence d’un système immunitaire, cela a conduit à des tumeurs hautement vascularisées. À ce stade précoce de développement, les embryons n’ont pas de système immunitaire et les tumeurs ne sont pas reconnues comme des corps étrangers. Ainsi, ils peuvent se développer rapidement tout en développant leurs propres vaisseaux à partir du système vasculaire embryonnaire existant, ce qui représente un modèle de cancer 3D précieux. Enfin, l’administration d’électrodes flexibles de PEF a été évaluée dans un organisme complet doté d’un système immunitaire fonctionnel, à l’aide d’un modèle murin syngénique d’orthogreffe (intracrânienne). Des sphéroïdes tumoraux ont été greffés dans le cerveau de souris multi-fluorescentes transgéniques avant l’implantation de dispositifs d’électrodes organiques flexibles. Une fenêtre crânienne scellée a permis l’imagerie multiphotonique de la tumeur et de son microenvironnement pendant le traitement par PEF sur une période de plusieurs semaines.

Ce protocole permet l’application à deux modèles de glioblastome dans lesquels un système d’administration de PEF flexible est intégré. Après les étapes de microfabrication et d’emballage, les électrodes flexibles sont caractérisées en solution saline par spectroscopie d’impédance électrochimique (EIS) afin d’évaluer et de valider leurs performances. Les électrodes revêtues de PEDOT:PSS montrent les régions dominées capacitives et résistives typiques séparées par une fréquence de coupure, tandis que les électrodes non revêtues n’affichent qu’un comportement capacitif (Figure 2).
Une variante de la méthode de la plaque de 96 puits en recouvrement de liquide est utilisée pour développer des tumeurs 3D constituées de cellules de glioblastome transfectées exprimant de manière stable un rapporteur de calcium intracellulaire fluorescent. La croissance des sphéroïdes peut être observée avec un microscope à fond clair (Figure 3; ED 0). Au moins 2 ou 3 jours sont nécessaires pour obtenir des sphéroïdes sphériques et denses, en fonction de la lignée cellulaire et du nombre de cellules ensemencées.
Dans le modèle in ovo , des sphéroïdes sont greffés dans la membrane chorio-allantoïdienne d’un embryon de caille (Figure 3 ; ED 6). Le succès de la greffe peut être évalué par microscopie à fluorescence quelques jours plus tard, car les cellules vivantes ont du calcium intracellulaire et sont donc fluorescentes (Figure 3; ED 9). La vascularisation de la tumeur peut être observée au microscope à fluorescence en injectant un colorant fluorescent dans les vaisseaux sanguins (Figure 3 ; ED9). Cependant, il n’est pas toujours possible de visualiser les vaisseaux sanguins à l’intérieur de la tumeur car le sphéroïde est très dense. Les électrodes interdigitées flexibles sont placées au-dessus de la tumeur vascularisée (Figure 3 ; ED 9) et connecté à un générateur d’impulsions. La sonde doit être placée doucement pour éviter le saignement de l’embryon; Sinon, le colorant fluorescent peut se propager, ce qui obstrue toute observation par imagerie. La livraison correcte de l’impulsion à l’environnement biologique peut être vérifiée en mesurant le courant traversant le circuit. L’imagerie de ces modèles in ovo permet de suivre en temps réel l’effet des PEF sur le calcium intracellulaire dans une tumeur de glioblastome 3D, ainsi que la vasoconstriction induite sur le système vasculaire de la tumeur, en évitant toute influence d’autres types cellulaires dont le système immunitaire15.
L’étude de l’effet PEF sur le glioblastome peut également être réalisée dans un modèle plus complet et prédictif. En effet, le modèle in vivo décrit ci-dessus14 consiste à greffer une tumeur de glioblastome 3D dans le parenchyme cérébral d’une souris (Figure 4). Le site d’injection de la tumeur est bouché par un hémi-bille de gel de dextrane réticulé, pour récapituler les contraintes biophysiques physiologiques lors de la croissance de la tumeur. Bien que décrit dans la référence14, il convient de souligner à nouveau qu’il est extrêmement important que l’hémiperle de dextran soit précisément supercollée à la dure-mère; Sinon, la tumeur peut s’échapper par la dure-mère ouverte et couvrir complètement le cerveau, rendant l’imagerie impossible. Pour toute imagerie chronique, la croissance tissulaire qui a lieu lorsque la fenêtre crânienne guérit pose un obstacle sérieux, car le nouveau tissu n’est pas transparent et rend les images brumeuses ou inutilisables. Par conséquent, après avoir inséré et collé l’hémi-bille, les parois latérales de la fenêtre crânienne ouverte doivent être scellées avec une fine couche de superglue méticuleusement placée tout autour de la paroi de la cavité, sans laisser la superglue glisser ou couler sur la dure-mère. Lorsque la sonde flexible est placée au-dessus du site d’injection de la tumeur, aucune bulle ne peut rester sous la sonde, pour deux raisons. Tout d’abord, l’imagerie ne peut pas se poursuivre lorsque des bulles sont présentes. Deuxièmement, les bulles servent d’isolants, modifiant ainsi les propriétés de stimulation électrique. Après avoir pris les précautions décrites ci-dessus, la craniotomie est scellée avec une fenêtre en verre cimentée au crâne pour permettre une imagerie chronique sur plusieurs semaines. Comme la tumeur est constituée de cellules exprimant GCaMP ou DsRed, l’injection peut être confirmée avec un microscope à fluorescence. L’impédance électrochimique des électrodes doit être mesurée pour valider la performance après l’implantation. Par rapport à l’impédance en solution saline, une augmentation de l’impédance est attendue in vivo à des fréquences supérieures à 100 Hz en raison de la présence d’un environnement biologique (Figure 5). Le parenchyme neural vascularisé et l’infiltration tumorale peuvent être observés et caractérisés à travers le substrat transparent pendant des semaines par microscopie à deux photons (Figure 6). L’utilisation d’animaux transgéniques exprimant des protéines fluorescentes dans des cellules d’intérêt (cellules immunitaires et neurones) peut, par exemple, permettre la mise en évidence du processus inflammatoire minimal induit par l’implantation d’électrodes seules (Figure 6A) ou montrer la présence de microglies et de monocytes 26 jours après l’implantation d’une électrode stimulée par PEF implantée au-dessus d’une tumeur GBM en croissance (Figure 6B1 ). Dans ce dernier cas, des cellules dérivées de monocytes périphériques et des cellules microgliales résidant dans le cerveau ont été trouvées autour et à l’intérieur de la tumeur (Figure 6B2). Le jour de la livraison du PEF, les pastilles de contact des électrodes flexibles peuvent être connectées au générateur d’impulsions, directement sous le microscope à deux photons. Dans l’ensemble, ce modèle peut être utilisé pour étudier l’effet des traitements bioélectriques au fil du temps en utilisant différents types de cellules impliquées dans le développement des tumeurs cérébrales, jusqu’à une profondeur d’environ 500 μm.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63527/63527fig01.jpg"> Figure 1 : Microfabrication d’électrodes flexibles. (A) Motif d’électrode en or et substrat de parylène C. B) Ouverture des grandes lignes. (C) PEDOT:revêtement PSS. (D) Connexions et emballage. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63527/63527fig01large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63527/63527fig02.jpg"> Figure 2 : Spectroscopie d’impédance électrochimique d’électrodes en or flexible et électrodes froides revêtues de PEDOT:PSS dans une solution saline. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63527/63527fig02large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63527/63527fig03.jpg"> Figure 3 : Le modèle in ovo du glioblastome. ED 0: Sphéroïde observé avec un microscope à fond clair. ED 3: Culture sans coquille d’un embryon de caille 3 jours après ouverture. ED 6: Tumeur implantée dans le CAM observée avec un microscope à fond clair. ED 9 : Dispositif souple placé sur la tumeur vascularisée (tumeur en vert et vaisseaux sanguins en rouge). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63527/63527fig03large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63527/63527fig04.jpg"> Figure 4: Application in vivo. (A) Schéma pour les expériences in vivo. (B) Mise en place de la sonde avant l’application du verre de couverture et de la résine acrylique. (C) Implantation de la sonde terminée. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63527/63527fig04large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63527/63527fig05.jpg"> Figure 5 : Spectroscopie d’impédance électrochimique d’électrodes d’or flexibles dans une solution saline par rapport à une sonde implantée. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63527/63527fig05large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63527/63527fig06.jpg"> Figure 6 : Imagerie multispectrale intravitale à deux photons à travers des électrodes. (A) Image en mosaïque de la surface saine du cerveau chez une souris témoin multifluorescente AMU-Neuroinflam 3 jours après l’implantation de l’électrode. Le cyan montre l’arborisation dendritique des neurones pyramidaux de la couche 5, le vert montre les granulocytes et les monocytes recrutés, et le jaune montre la microglie activée et les cellules dendritiques. Le rose montre la diffusion infrarouge due à l’accumulation de chaleur. (B1) Image similaire à celle de A mais 26 jours après l’implantation du sphéroïde tumoral à 200 μm de profondeur dans le cortex immédiatement suivie de l’implantation de l’électrode. Notez l’accumulation de cellules immunitaires vertes et jaunes. (B2) Image similaire à celle de B1 mais à 100 μm sous la surface des électrodes. Notons la présence d’arborisation dendritique neuronale bleue à la périphérie de la masse tumorale rouge elle-même infiltrée par la microglie jaune et les cellules dendritiques. Le bleu profond montre un deuxième signal harmonique du collagène péritumoral. (B3) Vue agrandie de B2 montrant la présence de somas interneuronaux (indiqués par des flèches) à proximité de la tumeur. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63527/63527fig06large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>

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Flexible Organic Electronic Devices for Pulsed Electric Field Therapy of Glioblastoma

Ce travail décrit le développement d’électrodes interdigitées flexibles pour la mise en œuvre dans des modèles 3D de tumeurs cérébrales, à savoir la culture in vitro , le modèle in ovo et le modèle murin in vivo . La méthode proposée peut être utilisée pour évaluer les effets des champs électriques pulsés sur les tumeurs à différents niveaux de complexité.

Dispositifs électroniques organiques flexibles pour la thérapie par champs électriques pulsés du glioblastome

Glioblastoma is difficult to eradicate with standard oncology therapies due to its high degree of invasiveness. Bioelectric treatments based on pulsed ...

Ce protocole permet l’émission de champs électriques pulsés par électronique flexible pour étudier leurs effets thérapeutiques sur le glioblastome. Pour ce faire, nous visualisons le microenvironnement tumoral in vivo avec l’imagerie. La bioélectronique s’intègre dans ce protocole en utilisant plusieurs modèles différents de complexité croissante afin d’étudier l’effet des champs pulsés sur le cancer.Les techniques de microfabrication présentées dans ce travail peuvent également être testées comme moyen de traiter d’autres types de cancers, y compris les xénogreffes dérivées de patients. Cela va vers l’idée d’une médecine de précision adaptée à chaque patient. Ces sondes sont fabriquées avec des techniques de microfabrication standard, de sorte que la fabrication est simple et que toute personne disposant d’une salle blanche peut les fabriquer.Pour la structuration des électrodes en or, déposer une couche de trois micromètres de parylène C avec un système de dépôt de parylène en plaçant les lames de verre propres dans la chambre de dépôt. Pesez six grammes de parylène C dans un bateau en aluminium, placez-le dans le four, évacuez la machine et commencez le dépôt avec les paramètres décrits dans le manuscrit. Lorsque le dépôt est terminé et que la température du vaporisateur est inférieure à 40 degrés Celsius, éteignez le refroidisseur, le vaporisateur, le four.Ventilez la machine et prélevez les échantillons. Enduire les échantillons traités au plasma d’une résine photosensible négative à 1 000 fois G pendant 40 secondes. Exposez la résine photosensible à travers un masque qui présente la conception de l’électrode interdigitée.Ensuite, immergez les échantillons dans un révélateur sans ions métalliques pendant trois minutes pour retirer la résine photosensible non exposée. Pour déposer une couche d’adhérence de chrome de 20 nanomètres et une couche d’or de 300 nanomètres avec un évaporateur thermique, aérez l’évaporateur et clipsez les échantillons sur la plaque ronde supérieure avec des vis métalliques. Remplissez les creusets dédiés respectivement avec du chrome et de l’or.Scellez et évacuez la machine et lancez la rotation du porte-échantillon. Sélectionnez le creuset contenant du chrome et augmentez lentement le courant jusqu’à ce que le taux de dépôt atteigne 0,2 angström par seconde. Ouvrez l’obturateur, attendez le dépôt de 20 nanomètres de chrome, fermez l’obturateur et réduisez lentement le courant jusqu’à zéro milliampère.Sélectionnez le creuset contenant de l’or et augmentez lentement le courant jusqu’à un taux de dépôt de 0,2 angström par seconde. Ouvrez l’obturateur pour évaporer l’or, attendez le dépôt de 10 nanomètres d’or, puis augmentez le taux de dépôt à 1,5 angström par seconde jusqu’à ce qu’environ 300 nanomètres soient déposés. Fermez l’obturateur et abaissez lentement le courant jusqu’à zéro milliampère.Plongez les échantillons dans un bécher contenant de l’acétone. Ensuite, rincez les échantillons avec de l’isopropanol et séchez-les avec un pistolet à air comprimé. Enduire quatre couches de solution PEDOT:PSS à 150 fois G pendant 35 secondes.Retirez la couche C de parylène sacrificiel en immergeant les échantillons dans l’eau. Immerger les échantillons dans de l’eau désionisée pendant 30 minutes pour éliminer le savon restant et les composés de faible poids moléculaire dans le film PEDOT:PSS et détacher les échantillons du substrat de verre. Ajouter soigneusement 75 microlitres de solution d’agarose à 1% fondue dans chaque puits de la plaque de 96 puits et laisser se solidifier pendant 15 minutes à température ambiante.Détacher les cellules de glioblastome transduites obtenues lors de la génération de la lignée cellulaire stable. Ajouter 10 000 cellules de glioblastome par puits et compléter le volume total à 150 microlitres par puits en utilisant DMEM contenant un gramme par litre de glucose, de L-glutamine, de pyruvate de sodium et de bicarbonate de sodium, 10% de sérum bovin fœtal, 100 unités par microlitres de pénicilline et 100 microgrammes par microlitres de streptomycine. Remplacer la moitié du média par un média frais tous les deux jours jusqu’à ce que d’autres expériences soient effectuées tout en gardant l’embout de la pipette dans la partie supérieure du puits pour éviter d’endommager l’agarose ou le sphéroïde lui-même.Placez les œufs fécondés de caille japonaise, Coturnix japonica, dans un incubateur sur des plateaux munis d’un rotateur automatique qui retourne les œufs toutes les deux heures. Ce jour est considéré comme le jour embryonnaire zéro. Le troisième jour embryonnaire, ouvrez doucement les œufs à l’aide d’une pince à épiler à pointes minces prélavées avec de l’éthanol à 70%.Versez l’embryon dans un bateau de pesage en plastique, recouvrez-le d’un autre bateau de pesage et placez-le dans un incubateur humidifié standard à 37 degrés Celsius pendant trois jours. Le sixième jour embryonnaire, faites une petite incision dans la membrane chorio-allantoïdienne avec une aiguille de calibre 23. Placez un sphéroïde de sept jours sur l’incision à l’aide d’une pipette et remettez l’embryon dans l’incubateur pendant trois jours jusqu’à ce que d’autres expériences soient effectuées.Placez une goutte de DPBS pour couvrir la craniotomie. Placez l’électrode flexible sur la goutte de DPBS et placez doucement l’arrière de la sonde avec les coussinets de contact sur le dos de la souris. Absorbez la goutte DPBS avec un petit morceau de papier jusqu’à ce que la sonde puisse reposer à plat sur la dure-mère et suivre la courbure du cerveau, en veillant à ce que la petite couche de solution saline reste sous les électrodes pour agir comme une barrière contre les débordements de colle.Placez une petite goutte d’adhésif silicone sur la sonde et recouvrez-la d’un verre à couvercle rond de cinq millimètres. Poussez le verre de couverture vers le bas jusqu’à ce que le silicone soit réparti uniformément et que la distance entre le verre de couverture et la sonde soit minimale. Attendez ensuite 30 secondes que le silicone se solidifie.Pour fixer le verre de couverture, appliquez rapidement de la superglue sur ses côtés et poussez-la vers le bas jusqu’à ce que la colle devienne solide. Appliquez de la super colle au cou de la sonde à l’aide d’un cure-dent en veillant à ce que la super colle soit aspirée sous le cou pour fournir un soutien stable. Couvrez le crâne avec du ciment dentaire pour construire un capuchon chronique et prenez soin de couvrir les bords du verre de couverture seulement.Soulevez l’arrière de la sonde et appliquez du ciment sous le col de la sonde. Reste de la sonde sur le ciment avant qu’il ne durcisse. Poussez doucement le col de la sonde pour placer sa surface au même niveau que le verre de couverture et non sur le chemin de l’objectif du microscope pendant l’expérience.Couvrez le haut du col de la sonde avec pas plus de 1,5 millimètre de couche de ciment dentaire pour obtenir une prise ferme sur la sonde. Construire un puits de ciment présentant une crête de 1,5 millimètre à un à deux millimètres autour du verre de couverture pour créer un bassin pour le fluide d’immersion pour l’imagerie à deux photons. Une fois le ciment durci, administrez une analgésie postchirurgicale et gardez l’animal au chaud jusqu’à sa guérison en l’enveloppant dans une serviette en papier et en le plaçant près d’une ampoule infrarouge.Les électrodes revêtues de PEDOT:PSS montrent les régions dominées capacitives et résistives typiques séparées par une fréquence de coupure, tandis que les électrodes non revêtues n’affichent qu’un comportement capacitif. La croissance des sphéroïdes observée avec un microscope à fond clair a révélé qu’au moins deux ou trois jours sont nécessaires pour obtenir des sphéroïdes sphériques et denses en fonction de la lignée cellulaire et du nombre de cellules ensemencées. Dans le modèle in ovo, la greffe de sphéroïdes dans la membrane chorio-allantoïdienne peut être évaluée par microscopie à fluorescence car les cellules vivantes ont du calcium intracellulaire et la vascularisation de la tumeur peut être évaluée en injectant un colorant fluorescent dans les vaisseaux sanguins.Par rapport à l’impédance en solution saline, une augmentation de l’impédance est attendue in vivo à des fréquences supérieures à 100 hertz en raison de la présence d’un environnement biologique. Le parenchyme neural vascularisé et l’infiltration tumorale peuvent être observés et caractérisés à travers le substrat transparent pendant des semaines par deux microscopies à photons. L’utilisation d’animaux transgéniques exprimant des protéines fluorescentes dans des cellules d’intérêt peut démontrer le processus inflammatoire minimal induit par l’implantation d’électrodes seules.Il peut montrer la présence de microglies et de monocytes 26 jours après l’implantation de champs électriques pulsés stimulés par électrode. Des cellules microgliales dérivées de monocytes périphériques et résonantes cérébrales ont été trouvées autour et à l’intérieur de la tumeur. Le point critique pour le succès de la procédure implantaire est d’assurer l’étanchéité et la planéité de la fenêtre crânienne et d’optimiser la qualité du contact avec la sonde.En plus de l’imagerie intravitale, quoi que ce soit envisager de combiner notre protocole avec d’autres mesures et techniques comme les prélèvements et les mesures des analyses sanguines pour les cytokines, le statut immunitaire par cytométrie de flux, ou encore l’analyse comportementale. Ces travaux ouvrent la voie à l’utilisation de dispositifs implantables flexibles pour le cancer et ouvrent de nouvelles perspectives pour l’utilisation de la médecine bioélectronique pour cette maladie chronique.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Coculture Assays to Study Macrophage and Microglia Stimulation of Glioblastoma Invasion

Coculture Assays pour étudier macrophage et microglie Stimulation de glioblastome Invasion

Glioblastoma multiforme (grade IV glioma) is a very aggressive human cancer with a median survival of 1 year post diagnosis. Despite the increased ...

Recherche

Recherche en cancérologie

Moving Upwards: A Simple and Flexible In Vitro Three-dimensional Invasion Assay Protocol

Moving Upwards: A Simple and Flexible In Vitro Three-dimensional Invasion Assay Protocol

Déplacement vers le haut : Un Simple et Flexible In Vitro Invasion en trois dimensions Assay protocole

Although 3D invasion assays have been developed, the challenge remains to study cells without affecting the integrity of their microenvironment. ...

Fluorescence Molecular Tomography for In Vivo Imaging of Glioblastoma Xenografts

Fluorescence Molecular Tomography for In Vivo Imaging of Glioblastoma Xenografts

Fluorescence moléculaire tomographie pour l’imagerie In Vivo des xénogreffes de glioblastome

Tumorigenicity is the capability of cancer cells to form a tumor mass. A widely used approach to determine if the cells are tumorigenic is by injecting ...

Live-Cell Imaging Assays to Study Glioblastoma Brain Tumor Stem Cell Migration and Invasion

Épreuves d’imagerie de cellules vivantes pour étude glioblastome Brain Tumor Stem Cell Migration et Invasion

Glioblastoma (GBM) is an aggressive brain tumor that is poorly controlled with the currently available treatment options. Key features of GBMs include ...

The Clinical Application of Tumor Treating Fields Therapy in Glioblastoma

L’Application clinique de la tumeur, traitement de thérapie de champs dans le glioblastome

Glioblastoma is the most common and lethal form of brain cancer, with a median survival of 15 months after diagnosis and a 5 year survival rate of only 5% ...

A 3D Spheroid Model for Glioblastoma

Un modèle sphéroïde 3D pour le Glioblastome

Two-dimensional (2D) cell cultures do not mimic in vivo tumor growth satisfactorily. Therefore, three-dimensional (3D) culture spheroid models were ...

Co-culture of Glioblastoma Stem-like Cells on Patterned Neurons to Study Migration and Cellular Interactions

Co-culture de cellules souches de glioblastome sur des neurones à motifs pour étudier la migration et les interactions cellulaires

Glioblastomas (GBMs), grade IV malignant gliomas, are one of the deadliest types of human cancer because of their aggressive characteristics. Despite ...

Positron Emission Tomography-based Dose Painting Radiation Therapy in a Glioblastoma Rat Model using the Small Animal Radiation Research Platform

Radiothérapie par peinture de dose basée sur la tomographie par émission de positons dans un modèle de rat de glioblastome à l’aide de la plate-forme de recherche sur les rayonnements de petits animaux

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Application of Hemostatic Devices in Laparoscopic Hepatectomy

Application de dispositifs hémostatiques dans l’hépatectomie laparoscopique

Laparoscopic hepatectomy is considered a conventional method for treating benign and malignant liver diseases because it is a minimally invasive method. ...

Translational Orthotopic Models of Glioblastoma Multiforme

Modèles orthotopiques translationnels de glioblastome multiforme

Genetically engineered mouse (GEM) models for human glioblastoma multiforme (GBM) are critical to understanding the development and progression of brain ...