Name: flexible organic electronic devices for pulsed electric field therapy of glioblastoma
Uploaded: 2022-08-09T13:00:00
Duration: 11 min 2 s
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Die hier berichtete Arbeit wurde von der französischen Nationalen Forschungsagentur (ANR-18-CE19-0029) unterstützt. Die Autoren danken S.M. Bardet herzlich für ihren Beitrag zur Generierung einer stabilen GCaMP6f-Zelllinie und D. O'Connor für ihre Hilfe beim In-ovo-Modell .

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W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultra-sensitive+fluorescent+proteins+for+imaging+neuronal+activity.">Ultra-sensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity.</a> Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).</li><li>Ribatti, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+5+Chick+embryo+chorioallantoic+membrane+as+a+useful+tool+to+study+angiogenesis.">Chapter 5 Chick embryo chorioallantoic membrane as a useful tool to study angiogenesis.</a> International Review of Cell and Molecular Biology. 270, 181-224 (2008).</li><li>Valdes, T. 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A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+models+of+cancer+for+pharmacology+and+cancer+cell+biology:+Capturing+tumor+complexity+in+vitro/ex+vivo.">Three-dimensional models of cancer for pharmacology and cancer cell biology: Capturing tumor complexity in vitro/ex vivo.</a> Biotechnology Journal. 9 (9), 1115-1128 (2014).</li><li>Tay, S. L. M., Heng, P. W. S., Chan, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+CAM-LDPI+method:+a+novel+platform+for+the+assessment+of+drug+absorption.">The CAM-LDPI method: a novel platform for the assessment of drug absorption.</a> Journal of Pharmacy and Pharmacology. 64 (4), 517-529 (2012).</li><li>Kundekov&#225;, B., M&#225;&#269;ajov&#225;, M., Meta, M., &#268;avarga, I., Bil&#269;&#237;k, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chorioallantoic+Membrane+Models+of+Various+Avian+Species:+Differences+and+Applications.">Chorioallantoic Membrane Models of Various Avian Species: Differences and Applications.</a> Biology. 10 (4), 301 (2021).</li><li>Ricard, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+dynamics+of+microglial+and+monocyte-derived+cells+in+glioblastoma-bearing+mice.">Phenotypic dynamics of microglial and monocyte-derived cells in glioblastoma-bearing mice.</a> Scientific Reports. 6 (1), 26381 (2016).</li></ol>

Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.

Der in dieser Arbeit beschriebene Ansatz ermöglicht es Hirntumormodellen mit einem integrierten PEF-Verabreichungssystem, die Wirkung von PEFs auf verschiedenen Ebenen der biologischen Organisation zu untersuchen. Das Mikrofabrikationsprotokoll besteht aus Standard-Dünnschichtprozessen, die einen großen Freiheitsgrad beim Elektrodendesign bieten, der an die spezifische Anwendung angepasst werden kann. Manchmal kann ein zusätzlicher thermischer Glühschritt am Ende der Herstellung nützlich sein, um die Biegung der Elektroden zu reduzieren, die während der Herstellung aufgetreten ist.
Die Verwendung einer stabilen Glioblastom-Zelllinie, die einen fluoreszierenden Calciumindikator exprimiert, vermeidet alle Komplikationen, die mit der Abgabe und Retention von Farbstoffen verbunden sind, insbesondere bei 3D-Tumoren, die sehr dicht sind16. In der Tat wird über einen langen Zeitraum ein hohes Expressionsniveau im Vergleich zu chemischen Fluoreszenz-Calcium-Standardindikatoren beobachtet17. Dieses Protokoll kann auf verschiedene Zelllinien angewendet werden, da es üblicherweise für die Bildgebung neuronaler Aktivitätverwendet wird 11. Hier wurden humane und murine Zelllinien verwendet (U87 und Gl261 zur Implantation in immundefiziente bzw. immunkompetente Mäuse). In der Tat zeigten neuere Studien, dass sich die U87-Zelllinie von der der ursprünglichen Zellen unterscheidet, da viele Mutationen über Jahre der Zellkultur erworben wurden, was die experimentelle Reproduzierbarkeit beeinträchtigt18. Das Verfahren zur Präparation von 3D-Tumoren ist hochdurchsatzfähig, reproduzierbar und ermöglicht die Erzeugung von Sphäroiden einer bestimmten Größe in Abhängigkeit von der Zelllinie, der Anzahl der Zellen bei der Aussaat und dem Zeitpunkt des Wachstums19. Diese Sphäroide sind jedoch dicht, was bei der Bildgebung im Kern des Tumors einen Nachteil darstellt.
Das In-ovo-Modell eignet sich als erster Ansatz, um die Wirkung von PEF auf 3D-Tumore und deren Gefäße zu untersuchen, ohne Wechselwirkungen mit anderen Zelltypen, die im Gehirn vorhanden sind. Dieses Modell ist kostengünstig, schnell, durchsatzreich und wirft weniger ethische Fragen auf als Tiermodelle. Es ist wichtig, die Integrität des Embryos während des gesamten Experiments zu erhalten, da dies sein Überleben und die Qualität der Bildgebung beeinträchtigen könnte. Beim Öffnen des Wachteleis ist besondere Vorsicht geboten, um Schäden an der embryonalen Membran zu vermeiden. Das Transplantat und die Platzierung der flexiblen Elektroden müssen ebenfalls sorgfältig durchgeführt werden, um Blutungen zu vermeiden, die den Embryo töten könnten. Die Injektion von Fluoreszenzfarbstoff in die Blutgefäße ermöglicht die gleichzeitige Visualisierung der Tumorzellen und die Vaskularisierung mit Fluoreszenzmikroskopie. Die intraokulare Injektion muss sorgfältig durchgeführt werden, um zu vermeiden, dass Farbstoff in die embryonale Flüssigkeit austritt, was zu einer Restfluoreszenz im Hintergrund führen könnte, die die Qualität der Bildgebung beeinträchtigt. Dieses Modell kann auch zur Nachverfolgung der Medikamentenaufnahme verwendet werden, da es den Zugang zum Kreislaufsystem ermöglicht. Die Experimente sind jedoch durch die 12-tägige Überlebenszeit des Embryos begrenzt, so dass eine Beobachtungszeit von 7 Tagen möglich ist, was deutlich kürzer ist als das In-vivo-Modell 21.
Das In-vivo-Hirntumormodell kann 4 bis 5 Wochen lang überwacht werden, bevor die Tiere einen ethischen experimentellen Endpunkt erreichen, der durch einen plötzlichen Gewichtsverlust von 20% bestimmt wird. Es ist gut verträglich und bleibt an Ort und Stelle, wenn der Verbindungsende der Elektrode nicht zu lang ist. Andernfalls neigen Tiere dazu, den Flipping-Stecker zu zerkratzen, der letztendlich gerissen werden kann, wodurch eine spätere Verbindung mit dem Stimulator verhindert wird. Dieser Zeitraum von 4 Wochen ist dennoch wertvoll, um die verschiedenen Stadien der Glioblastomentwicklung abzudecken. Beim Vergleich der Tumorzelldichten im gleichen interessierenden Volumen in unterschiedlichen Zeitintervallen kann die Entwicklung der Tumorwachstumskinetik beobachtet werden. Insbesondere wurde zum Zeitpunkt des Immunschalters ein verstärktes Tumorwachstum beobachtet22. Eine ähnliche Studie in Gegenwart einer stimulierenden Elektrode würde Aufschluss über die Wirkung von PEF auf die Tumorproliferationsrate und die Empfindlichkeit des Tumors gegenüber der Immunelimination geben. Im Vergleich zum In-ovo-Modell kann das In-vivo-Modell als wertvolles präklinisches Modell angesehen werden, um den Einfluss von Immunzellen auf die Tumorprogression und ihren Beitrag zur therapeutischen Wirkung von PEF zu untersuchen. Dieses Protokoll wird aus einem früheren Artikel mit der Hinzufügung einer flexiblen Elektrodenvorrichtung auf dem Tumor angepasst, bevor ein Schädelfenster14 platziert wird. Sowohl die akute als auch die chronische bioelektrische Behandlung von Tumoren können durch direkte und nachfolgende Beobachtungen mit Zwei-Photonen-Mikroskopie charakterisiert werden, da erwartet wird, dass die anfängliche Stimulation den Zelltod induziert und eine dauerhafte Fehlregulation der Immunantwort auslöst.
Die Anschlüsse der flexiblen Sonde sind unter dem Zwei-Photonen-Mikroskop leicht zugänglich. Die Parameter der elektrischen Stimulation können so in Echtzeit auf der Grundlage der beobachteten Wirkung auf das Nervengewebe und/oder die Zielzellen angepasst werden, ähnlich wie ein Arzt interventionelle Eingriffe bei der Beobachtung von MRT- oder CT-Bildern seines Patienten durchführen würde. Eine letzte Überlegung ist, wie wichtig es ist, die Elektrode am Gehirn sorgfältig mit Sekundenkleber und Silikonkleber abzudichten, um das Nachwachsen des Gewebes zu verhindern.
Zusammenfassend stellt das hier beschriebene Protokoll ein innovatives Modell dar, um die Wirkung der PEF-Therapie mit flexiblen organischen Polymerelektroden für Glioblastom-Tumormodelle zu untersuchen. Die beiden Modelle weisen unterschiedliche Komplexitätsgrade auf, so dass zelluläre, vaskuläre oder immunologische Effekte getrennt werden können, um die Wirkmechanismen besser zu verstehen. Konforme, oberflächliche Elektroden reduzieren die iatrogene Schädigung und ermöglichen gleichzeitig eine Störung der Tumormikroumgebung, wodurch eine Vasokonstriktion oder Dysregulation von intrazellulärem Calcium15 ausgelöst wird.

Glioblastoma multiforme (GBM) ist ein hochinvasiver Tumor und daher mit Standardbehandlungen wie Resektion, Strahlentherapie und Chemotherapie schwer auszurotten. Trotz multimodaler Behandlungen bleibt die Prognose sehr schlecht und bei den meisten Patienten kommt es innerhalb von 1 Jahr nach der Diagnose zu einem Fortschreiten der Erkrankung 1,2. In jüngster Zeit hat die Entwicklung bioelektrischer Behandlungen ein großes Potenzial zur Verbesserung bestehender Therapien gezeigt. Diese Therapien nutzen die Abgabe von gepulsten elektrischen Feldern (PEF), typischerweise in einer einzigen Behandlungssitzung, um die Integrität der Zellmembran und die Mikroumgebung von Tumoren zu stören. Diese Zellmembranstörung, auch Elektroporation genannt, kann je nach Intensität des elektrischen Feldes und der Anzahl der Impulse reversibel oder irreversibel sein. Die irreversible Elektroporation (IRE) wird als nicht-thermische Gewebeablationstechnik angewendet, bei der elektrische Impulse eine tödliche Schädigung der Zellmembranen verursachen, die zum Zelltod führen3. Die reversible Elektroporation wird in der Elektrochemotherapie (ECT) angewendet, einer etablierten Technik, die aus der Verabreichung von PEFs in Kombination mit Chemotherapeutika besteht, um die Medikamentenaufnahme in Krebszellen zu verbessern4. Darüber hinaus haben neuere Studien gezeigt, dass die Calcium-Elektroporation eine Alternative zur ECT mit hoher Effizienz für die Krebsbehandlung darstellt, die auch kostengünstig ist und weniger Nebenwirkungen hervorruft5. Trotz dieser vielversprechenden Fortschritte werden PEFs in der Regel mit starren, metallischen Elektroden aufgetragen, von denen bekannt ist, dass sie das Weichgewebe schädigen6. Das Gehirn reagiert besonders empfindlich auf solche invasiven Geräte, bei denen die mechanische Fehlanpassung Entzündungen und astrogliale Narben hervorruft7.
In diesem Zusammenhang wird ein flexibles PEF-Verabreichungssystem in Kombination mit 3D-Modellen von Glioblastom-Tumoren vorgestellt, von der Mikrofabrikation bis zum Mausmodell. Konforme Elektroden werden mit Standard-Dünnschicht-Mikrofabrikationsprozessen hergestellt, einschließlich der Verwendung weicher und biokompatibler Materialien wie Parylene-C, Gold und PEDOT:PSS 8,9. Ein interdigitalisiertes Elektrodendesign wird verwendet, um eine große Oberfläche abzudecken und gleichzeitig eine ausreichende Transparenz für die Bildgebung zwischen den Elektrodenfingern10 aufrechtzuerhalten. Für das Tumormodell werden 3D-Sphäroide von Glioblastomzellen, die einen genetisch kodierten Fluoreszenzreporter exprimieren, unter Verwendung einer Variation der Liquid-Overlay-96-Well-Plattenmethode11 hergestellt. Die Sphäroide werden in die Chorioallantoismembran eines Wachtelembryos eingepfropft, was zu einem In-ovo-Modell führt, das ausgiebig zur Untersuchung der Angiogenese oder der Arzneimitteltoxikologie verwendet wurde12,13. Tumore können durch das Gefäßsystem des Embryos transplantiert und vaskularisiert werden, wenn in diesem Stadium der Embryonalentwicklung kein Immunsystem vorhanden ist12. Flexible Elektroden werden dann auf den vaskularisierten Tumor gelegt, um die Wirkung der PEF-Abgabe auf das Sphäroid und sein Gefäßsystem zu untersuchen. Schließlich werden diese Effekte auf einen vollständigen lebenden Organismus, einschließlich der Tumormikroumgebung und des Immunsystems, untersucht, indem künstlich hergestellte Sphäroide in das Hirnparenchym von Mausmodellen implantiertwerden 14. Flexible Elektroden werden auf der Einstichstelle platziert und die Kraniotomie wird mit einem Glasfenster versiegelt, was eine wiederholte Zwei-Photonen-Bildgebung über mehrere Wochen ermöglicht.
Diese Methoden werden für Menschen nützlich sein, die sich für verschiedene Bereiche interessieren, die von der Mikroelektronik bis hin zu onkologischen Anwendungen reichen. Das Mikrofabrikationsprotokoll kann für jede Anwendung verwendet und angepasst werden, die Dünnschicht-Metallelektroden erfordert, die mit PEDOT:PSS beschichtet sind. Darüber hinaus werden die biologischen Modelle, die für die Evaluierung von elektrischen Antitumorbehandlungen entwickelt wurden, von allgemeinem Interesse für die Untersuchung der Differenzierung der zellulären, vaskulären und Immunantwort auf implantierte Materialien sein.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>(3-Glycidyloxypropyl)trimethoxysilane</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>440167</td>
			<td>GOPS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.25% Trypsin-EDTA (1X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25200-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-Dodecylbenzenesulfonic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>44198</td>
			<td>DBSA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plate</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Technic</td>
			<td>530</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrylic resin</td>
			<td>Fischer scientific</td>
			<td>NC1455685</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>agarose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9539</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>autoclave</td>
			<td>Tuttnauer</td>
			<td>3150 EL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AZ 10XT</td>
			<td>Microchemicals</td>
			<td></td>
			<td>Positive photoresist</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AZ 826 MIF Developer</td>
			<td>Merck</td>
			<td>10056124960</td>
			<td>Metal-ion-free developer for the negative photoresist</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AZ Developer</td>
			<td>Merck</td>
			<td>10054224960</td>
			<td>Metal-ion-free developer for the positive photoresist</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AZ nLof 2070</td>
			<td>Microchemicals</td>
			<td></td>
			<td>Negative photoresist</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buprenorphine</td>
			<td>Axience</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carprofen</td>
			<td>Rimadyl</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge Sorvall Legend X1R</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>75004260</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CMOS camera Prime 95B</td>
			<td>Photometrics</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 incubator HERAcell 150i</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAC board</td>
			<td>National Instruments</td>
			<td>USB 6259</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D&#233;co spray P&#233;b&#233;o</td>
			<td>Cultura</td>
			<td>3167860937307</td>
			<td>Black acrylic paint</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextran Texas Red 70.000</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>D1830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Die bonding paste &#34;Epinal&#34;</td>
			<td>Hitachi</td>
			<td>EN-4900GC</td>
			<td>Silver paste</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D2438</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispensing machine</td>
			<td>Tianhao</td>
			<td>TH-2004C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Modified Eagle&#8217;s Medium + GlutaMAX&#8482;-I</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10567-014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D6429</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Egg incubator COUVAD&#39;OR 160</td>
			<td>lafermedemanon.com</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylene glycol</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>6881.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fertilized eggs of Japanese quail</td>
			<td>Japocaille</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>VWR</td>
			<td>S181BH</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flask</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>658170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence macroscope</td>
			<td>Leica MZFLIII</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gl261</td>
			<td>DSMZ</td>
			<td>ACC 802</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gold pellets - Dia 3 mm x 6 mm th</td>
			<td>Neyco</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Handheld automated cell counter</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>PHCC00000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating and drying oven</td>
			<td>Memmert</td>
			<td>UF110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hexadimethrine Bromide Sequa-brene</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S2667</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hot plate Delta 6 HP 350</td>
			<td>S&#252;ss Microtec</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Illumination system pE-4000</td>
			<td>CoolLed</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Infrared tunable femtosecond laser (Ma&#239;-Ta&#239;)</td>
			<td>Spectra Physics (USA)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ionomycin calcium salt</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I3909</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kapton tape SCOTCH 92 33x19</td>
			<td>3M</td>
			<td></td>
			<td>Polyimide protection tape</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lab made pulse generator</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Labcoter 2 Parylene Deposition system PDS 2010</td>
			<td>SCS</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lenti-X 293 T cell line</td>
			<td>Takara Bio</td>
			<td>63218</td>
			<td>HEK 293T-derived cell line optimized for lentivirus production</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lenti-X GoStix Plus</td>
			<td>Takara Bio</td>
			<td>631280</td>
			<td>Quantitative lentiviral titer test</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mask aligner MJB4</td>
			<td>S&#252;ss Microtec</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro-90 Concentrated cleaning solution</td>
			<td>International Products</td>
			<td>M9050-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slides 76 x 52 x 1 mm</td>
			<td>Marienfeld</td>
			<td>1100420</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needles 30G</td>
			<td>BD Microlance 3</td>
			<td>304000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PalmSens4 potentiostat</td>
			<td>PalmSens</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>parylene-c : dichloro-p-cyclophane</td>
			<td>SCS</td>
			<td>300073</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCB Processing Tanks</td>
			<td>Mega Electronics</td>
			<td>PA104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEDOT:PSS Clevios PH 1000</td>
			<td>Heraeus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>penicillin / streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>351029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pGP-CMV-GCaMP6f</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>40755</td>
			<td>plasmid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffer Saline solution</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>D8537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasma treatment system PE-100</td>
			<td>Plasma Etch</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PlasmaLab 80 Reactive Ion Etcher</td>
			<td>Oxford Instruments</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic mask</td>
			<td>Selba</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic weigh boat 64 x 51 x 19 mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10770-454</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-dimethylsiloxane: SYLGARD 184 Silicone Elastomer Kit</td>
			<td>Dow chemicals</td>
			<td>1673921</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyimide copper film 60 &#181;m (Kapton)</td>
			<td>Goodfellow</td>
			<td>IM301522</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propan-2-ol</td>
			<td>Technic</td>
			<td>574</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protolaser S</td>
			<td>LPKF</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>puromycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A11103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Round cover glass 5 mm diameter</td>
			<td>Fischer scientific</td>
			<td>50-949-439</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scepter Sensors - 60 &#181;m</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>PHCC60050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone adhesive Kwik-Sil</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>spin coater</td>
			<td>S&#252;ss Microtec</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spin Coater</td>
			<td>Laurell</td>
			<td>WS-650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Super glue</td>
			<td>Office depot</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tetracycline-free f&#339;tal bovine Serum</td>
			<td>Takara Bio</td>
			<td>631105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermal evaporator Auto 500</td>
			<td>Boc Edwards</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Two-photon microscope</td>
			<td>Zeiss LSM 7MP</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>U87-MG</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>HTB-14</td>
			<td>Human glioblastoma cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonic cleaner</td>
			<td>VWR</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex VTX-3000L</td>
			<td>LMS</td>
			<td>VTX100323410</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xfect single shots reagent</td>
			<td>Takara Bio</td>
			<td>631447</td>
			<td>Transfection reagent</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

flexible organic electronic devices for pulsed electric field therapy of glioblastoma

Das Glioblastom ist aufgrund seiner hohen Invasivität mit onkologischen Standardtherapien schwer auszurotten. Bioelektrische Behandlungen, die auf gepulsten elektrischen Feldern (PEFs) basieren, sind vielversprechend für die Verbesserung der Behandlungseffizienz. Sie sind jedoch auf starre Elektroden angewiesen, die akute und chronische Schäden verursachen, insbesondere in Weichteilen wie dem Gehirn. In dieser Arbeit wurde flexible Elektronik verwendet, um PEFs an Tumore abzugeben, und die biologische Reaktion wurde mit Fluoreszenzmikroskopie bewertet. Interdigitierte Goldelektroden auf einem dünnen, transparenten Parylene-C-Substrat wurden mit dem leitenden Polymer PEDOT:PSS beschichtet, was zu einem anpassungsfähigen und biokompatiblen Gerät führte. Die Auswirkungen von PEFs auf Tumore und deren Mikroumgebung wurden anhand verschiedener biologischer Modelle untersucht. Zunächst wurden Monoschichten von Glioblastomzellen auf den Elektroden kultiviert, um Phänomene in vitro zu untersuchen. Als Zwischenschritt wurde ein In-ovo-Modell entwickelt, bei dem gentechnisch veränderte Tumorsphäroide in die embryonale Membran einer Wachtel transplantiert wurden. Aufgrund des Fehlens eines Immunsystems führte dies zu stark vaskularisierten Tumoren. In diesem frühen Stadium der Entwicklung haben Embryonen kein Immunsystem und Tumore werden nicht als Fremdkörper erkannt. So können sie sich schnell entwickeln und gleichzeitig ihre eigenen Gefäße aus dem vorhandenen embryonalen Gefäßsystem entwickeln, was ein wertvolles 3D-Krebsmodell darstellt. Schließlich wurde die flexible Elektrodenabgabe von PEFs in einem vollständigen Organismus mit einem funktionierenden Immunsystem unter Verwendung eines syngenen, orthograften (intrakraniellen) Mausmodells untersucht. Tumorsphäroide wurden vor der Implantation flexibler organischer Elektrodenvorrichtungen in das Gehirn von transgenen multifluoreszierenden Mäusen transplantiert. Ein verschlossenes Schädelfenster ermöglichte die Multiphotonen-Bildgebung des Tumors und seiner Mikroumgebung während der Behandlung mit PEFs über einen Zeitraum von mehreren Wochen.

Dieses Protokoll ermöglicht die Anwendung auf zwei Glioblastommodelle, in die ein flexibles PEF-Verabreichungssystem integriert ist. Nach Mikrofabrikations- und Verpackungsschritten werden flexible Elektroden in Kochsalzlösung durch elektrochemische Impedanzspektroskopie (EIS) charakterisiert, um ihre Leistung zu bewerten und zu validieren. Die PEDOT:PSS-beschichteten Elektroden zeigen die typischen kapazitiven und resistiv dominierten Bereiche, die durch eine Grenzfrequenz getrennt sind, während die unbeschichteten Elektroden nur kapazitives Verhalten zeigen (Abbildung 2).
Eine Variation der Liquid-Overlay-96-Well-Plattenmethode wird verwendet, um 3D-Tumore aus transfizierten Glioblastomzellen zu züchten, die einen fluoreszierenden intrazellulären Calciumreporter stabil exprimieren. Das Wachstum der Sphäroide kann mit einem Hellfeldmikroskop beobachtet werden (Abbildung 3; ED 0). Mindestens 2 oder 3 Tage sind erforderlich, um sphärische und dichte Sphäroide zu erhalten, abhängig von der Zelllinie und der Anzahl der ausgesäten Zellen.
Im In-ovo-Modell werden Sphäroide in die Chorioallantoismembran eines Wachtelembryos gepfropft (Abbildung 3; ED 6). Der Erfolg des Transplantats kann einige Tage später durch Fluoreszenzmikroskopie beurteilt werden, da lebende Zellen intrazelluläres Kalzium aufweisen und somit fluoreszieren (Abbildung 3; ED 9). Die Vaskularisierung des Tumors kann unter einem Fluoreszenzmikroskop beobachtet werden, indem ein Fluoreszenzfarbstoff in die Blutgefäße injiziert wird (Abbildung 3; ED9). Es ist jedoch nicht immer möglich, die Blutgefäße im Tumor sichtbar zu machen, da das Sphäroid sehr dicht ist. Die flexiblen interdigitalisierten Elektroden werden auf dem vaskularisierten Tumor platziert (Abbildung 3; ED 9) und an einen Impulsgeber angeschlossen. Die Sonde muss vorsichtig platziert werden, um Blutungen des Embryos zu vermeiden. Andernfalls kann sich der Fluoreszenzfarbstoff ausbreiten, was jede Beobachtung durch Bildgebung behindert. Die korrekte Abgabe des Impulses an die biologische Umgebung kann durch Messung des Stroms, der durch den Stromkreis fließt, überprüft werden. Die Bildgebung dieser In-ovo-Modelle ermöglicht eine Echtzeitüberwachung der Wirkung von PEFs auf das intrazelluläre Calcium in einem 3D-Glioblastom-Tumor sowie der Vasokonstriktion, die auf das Gefäßsystem des Tumors induziert wird, wodurch jeglicher Einfluss anderer Zelltypen, einschließlich des Immunsystems, vermiedenwird 15.
Die Untersuchung der PEF-Wirkung auf das Glioblastom kann auch in einem vollständigeren und prädiktiveren Modell durchgeführt werden. Tatsächlich besteht das oben beschriebene In-vivo-Modell 14 aus der Transplantation eines 3D-Glioblastom-Tumors in das Hirnparenchym einer Maus (Abbildung 4). Die Injektionsstelle des Tumors wird durch eine vernetzte Dextran-Gel-Hemi-Perle verstopft, um die physiologischen biophysikalischen Einschränkungen während des Tumorwachstums zu rekapitulieren. Obwohl in Referenz14 beschrieben, sollte noch einmal betont werden, dass es von entscheidender Bedeutung ist, dass die Dextran-Halbperle präzise auf die Dura mater geklebt wird. Andernfalls kann der Tumor durch die offene Dura entweichen und das Gehirn vollständig bedecken, was die Bildgebung unmöglich macht. Für jede chronische Bildgebung stellt das Einwachsen von Gewebe, das bei der Heilung des Schädelfensters stattfindet, ein ernsthaftes Hindernis dar, da das neue Gewebe nicht transparent ist und Bilder neblig oder unbrauchbar macht. Daher müssen nach dem Einsetzen und Verkleben der Halbkugel die Seitenwände des geöffneten Schädelfensters mit einer dünnen Schicht Sekundenkleber versiegelt werden, die sorgfältig um die Hohlraumwand herum platziert wird, ohne dass der Sekundenkleber verrutscht oder auf die Dura fließt. Wenn die flexible Sonde auf der Tumorinjektionsstelle platziert wird, können aus zwei Gründen keine Blasen unter der Sonde verbleiben. Erstens kann die Bildgebung nicht fortgesetzt werden, wenn Blasen vorhanden sind. Zweitens dienen Blasen als Isolatoren und verändern so die elektrischen Stimulationseigenschaften. Nach den oben beschriebenen Vorsichtsmaßnahmen wird die Kraniotomie mit einem Glasfenster versiegelt, das am Schädel zementiert ist, um eine chronische Bildgebung über Wochen zu ermöglichen. Da der Tumor aus GCaMP- oder DsRed-exprimierenden Zellen besteht, kann die Injektion mit einem Fluoreszenzmikroskop bestätigt werden. Die elektrochemische Impedanz der Elektroden muss gemessen werden, um die Leistung nach der Implantation zu validieren. Im Vergleich zur Impedanz in Kochsalzlösung wird in vivo eine Erhöhung der Impedanz bei Frequenzen über 100 Hz aufgrund des Vorhandenseins einer biologischen Umgebung erwartet (Abbildung 5). Vaskularisiertes neurales Parenchym und Tumorinfiltration können durch das transparente Substrat über Wochen mittels Zwei-Photonen-Mikroskopie beobachtet und charakterisiert werden (Abbildung 6). Die Verwendung von transgenen Tieren, die fluoreszierende Proteine in interessierenden Zellen (Immunzellen und Neuronen) exprimieren, kann beispielsweise den Nachweis des minimalen Entzündungsprozesses ermöglichen, der allein durch Elektrodenimplantation induziert wird (Abbildung 6A) oder das Vorhandensein von Mikroglia und Monozyten 26 Tage nach der Implantation einer PEF-stimulierten Elektrode, die auf einen wachsenden GBM-Tumor implantiert wurde, zeigen (Abbildung 6B1 ). Im letzteren Fall wurden sowohl periphere Monozyten-abgeleitete Zellen als auch hirnresidente Mikrogliazellen um und innerhalb des Tumors gefunden (Abbildung 6B2). Am Tag der PEF-Lieferung können Kontaktpads der flexiblen Elektroden direkt unter dem Zwei-Photonen-Mikroskop an den Impulsgenerator angeschlossen werden. Insgesamt kann dieses Modell verwendet werden, um die Wirkung bioelektrischer Behandlungen über die Zeit mit verschiedenen Arten von Zellen, die an der Entwicklung von Hirntumoren beteiligt sind, bis zu einer Tiefe von etwa 500 μm zu untersuchen.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63527/63527fig01.jpg"> Abbildung 1: Mikrofabrikation flexibler Elektroden . (A) Goldelektrodenstrukturierung und Parylene-C-Substrat. (B) Umriss der Öffnung. (C) PEDOT:PSS-Beschichtung. (D) Anschlüsse und Verpackung. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63527/63527fig01large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63527/63527fig02.jpg"> Abbildung 2: Elektrochemische Impedanzspektroskopie von flexiblen Goldelektroden und PEDOT:PSS-beschichteten Kaltelektroden in einer Salzlösung. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63527/63527fig02large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63527/63527fig03.jpg"> Abbildung 3: Das In-ovo-Modell des Glioblastoms. ED 0: Sphäroid, beobachtet mit einem Hellfeldmikroskop. ED 3: Schalenlose Kultur eines Wachtelembryos 3 Tage nach dem Öffnen. ED 6: In die CAM implantierter Tumor, beobachtet mit einem Hellfeldmikroskop. ED 9: Flexibles Gerät, das auf dem vaskularisierten Tumor platziert wird (Tumor in grün und Blutgefäße in rot). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63527/63527fig03large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63527/63527fig04.jpg"> Abbildung 4: Die In-vivo-Anwendung. (A) Schema für In-vivo-Experimente. (B) Platzierung der Sonde vor dem Auftragen von Deckglas und Acrylharz. (C) Abgeschlossene Sondenimplantation. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63527/63527fig04large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63527/63527fig05.jpg"> Abbildung 5: Elektrochemische Impedanzspektroskopie von flexiblen Goldelektroden in einer Salzlösung im Vergleich zu einer implantierten Sonde. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63527/63527fig05large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63527/63527fig06.jpg"> Abbildung 6: Intravitale multispektrale Zwei-Photonen-Bildgebung durch Elektroden . (A) Kachelbild der gesunden Gehirnoberfläche in einer Kontroll-Multifluoreszenz-AMU-Neuroinflam-Maus 3 Tage nach der Elektrodenimplantation. Cyan zeigt die dendritische Arborisierung von Schicht-5-Pyramidenneuronen, Grün zeigt rekrutierte Granulozyten und Monozyten und Gelb zeigt aktivierte Mikroglia und dendritische Zellen. Pink zeigt Infrarotdiffusion aufgrund von Wärmestau. (B1) Ähnliches Bild wie in A , aber 26 Tage nach der Tumor-Sphäroid-Implantation 200 μm tief im Kortex unmittelbar gefolgt von der Elektrodenimplantation. Beachten Sie die Anhäufung von grünen und gelben Immunzellen. (B2) Ähnliches Bild wie in B1 , jedoch 100 μm unter der Oberfläche der Elektroden. Beachten Sie das Vorhandensein einer blauen neuronalen dendritischen Arborisierung in der Peripherie der roten Tumormasse selbst, die von gelben Mikroglia und dendritischen Zellen infiltriert wird. Tiefblau zeigt ein zweites harmonisches Signal aus dem peritumoralen Kollagen. (B3) Vergrößerte Ansicht von B2 , die das Vorhandensein von Interneuron-Somas (durch Pfeile gekennzeichnet) in der Nähe des Tumors zeigt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63527/63527fig06large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>

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Flexible Organic Electronic Devices for Pulsed Electric Field Therapy of Glioblastoma

Diese Arbeit beschreibt die Entwicklung flexibler interdigitalisierter Elektroden für die Implementierung in 3D-Hirntumormodellen, nämlich In-vitro-Kultur, In-ovo-Modell und In-vivo-Mausmodell. Die vorgeschlagene Methode kann verwendet werden, um die Wirkungen von gepulsten elektrischen Feldern auf Tumore unterschiedlicher Komplexität zu bewerten.

Flexible organische elektronische Bauelemente für die gepulste elektrische Feldtherapie des Glioblastoms

Glioblastoma is difficult to eradicate with standard oncology therapies due to its high degree of invasiveness. Bioelectric treatments based on pulsed ...

Dieses Protokoll ermöglicht die Abgabe von elektrischen Pulsfeldern durch flexible Elektronik, um ihre therapeutischen Wirkungen auf das Glioblastom zu untersuchen. Wir tun dies, indem wir die Tumormikroumgebung in vivo mit Bildgebung visualisieren. Die Bioelektronik integriert sich in dieses Protokoll mit verschiedenen Modellen zunehmender Komplexität, um die Wirkung pulsierender Felder auf Krebs zu untersuchen.Die in dieser Arbeit vorgestellten Mikrofabrikationstechniken können auch als Mittel zur Behandlung anderer Krebsarten, einschließlich patienteneigener Xenotransplantate, getestet werden. Dies bewegt sich in Richtung der Idee einer Präzisionsmedizin, die auf jeden einzelnen Patienten zugeschnitten ist. Diese Sonden werden mit Standard-Mikrofabrikationstechniken hergestellt, so dass die Herstellung unkompliziert ist und jeder mit einem Reinraum sie herstellen kann.Für die Goldelektrodenstrukturierung wird eine drei Mikrometer dicke Schicht Parylene C mit einem Parylene-Abscheidungssystem abgeschieden, indem die sauberen Glasobjektträger in die Abscheidungskammer gelegt werden. Wiegen Sie sechs Gramm Parylene C in einem Aluminiumboot, legen Sie es in den Ofen, evakuieren Sie die Maschine und starten Sie die Abscheidung mit den im Manuskript beschriebenen Parametern. Wenn die Abscheidung beendet ist und die Temperatur des Verdampfers unter 40 Grad Celsius liegt, schalten Sie den Kühler, den Verdampfer und den Ofen aus.Entlüften Sie die Maschine und sammeln Sie die Proben. Schleudern Sie die mit Plasma behandelten Proben 40 Sekunden lang mit einem negativen Fotolack bei 1.000 Mal G. Belichten Sie den Fotolack durch eine Maske, die das Design der interdigitalisierten Elektrode aufweist.Tauchen Sie die Proben dann drei Minuten lang in einen metallionenfreien Entwickler, um den nicht belichteten Fotolack zu entfernen. Um eine 20-Nanometer-Adhäsionsschicht aus Chrom und eine 300-Nanometer-Schicht aus Gold mit einem thermischen Verdampfer abzuscheiden, entlüften Sie die Verdampfermaschine und befestigen Sie die Proben mit Metallschrauben an der oberen runden Platte. Füllen Sie die dafür vorgesehenen Tiegel jeweils mit Chrom und Gold.Versiegeln und evakuieren Sie die Maschine und starten Sie die Drehung des Probenhalters. Wählen Sie den Tiegel mit Chrom und erhöhen Sie den Strom langsam, bis die Abscheidungsrate 0,2 Angström pro Sekunde erreicht. Öffnen Sie den Verschluss, warten Sie, bis 20 Nanometer Chrom abgelagert sind, schließen Sie den Verschluss und drosseln Sie den Strom langsam auf null Milliampere.Wählen Sie den goldhaltigen Tiegel und erhöhen Sie den Strom langsam bis zu einer Abscheidungsrate von 0,2 Angström pro Sekunde. Öffnen Sie den Verschluss, um das Gold zu verdampfen, warten Sie bis zur Abscheidung von 10 Nanometern Gold und erhöhen Sie dann die Abscheidungsrate auf 1,5 Angström pro Sekunde, bis etwa 300 Nanometer abgelagert sind. Schließen Sie den Verschluss und senken Sie den Strom langsam auf null Milliampere.Tauchen Sie die Proben in ein Becherglas mit Aceton. Spülen Sie dann die Proben mit Isopropanol ab und trocknen Sie sie mit einer Luftpistole. Beschichten Sie vier Schichten PEDOT:PSS-Lösung 35 Sekunden lang mit dem 150-fachen G.Entfernen Sie die Opferschicht Parylene C, indem Sie die Proben in Wasser tauchen. Tauchen Sie die Proben 30 Minuten lang in deionisiertes Wasser, um die verbleibende Seife und niedermolekulare Verbindungen in der PEDOT:PSS-Folie zu entfernen, und lösen Sie die Proben vom Glassubstrat. Geben Sie vorsichtig 75 Mikroliter geschmolzene 1%ige Agaroselösung in jede Vertiefung der 96-Well-Platte und lassen Sie sie 15 Minuten bei Raumtemperatur erstarren.Trennen Sie die transduzierten Glioblastomzellen, die während der stabilen Zellliniengenerierung erhalten wurden. Fügen Sie 10.000 Glioblastomzellen pro Vertiefung hinzu und bilden Sie das Gesamtvolumen auf 150 Mikroliter pro Vertiefung mit DMEM, das ein Gramm pro Liter Glukose, L-Glutamin, Natriumpyruvat und Natriumbicarbonat, 10% fötales Rinderserum, 100 Einheiten pro Mikroliter Penicillin und 100 Mikrogramm pro Mikroliter Streptomycin enthält. Ersetzen Sie die Hälfte des Mediums bis zu weiteren Experimenten alle zwei Tage durch frisches Medium, während Sie die Pipettenspitze im oberen Teil der Vertiefung belassen, um eine Beschädigung der Agarose oder des Sphäroids selbst zu vermeiden.Legen Sie die befruchteten Eier der japanischen Wachtel, Coturnix japonica, in einen Brutkasten auf Tabletts mit einem automatischen Rotator, der die Eier alle zwei Stunden wendet. Dieser Tag gilt als embryonaler Tag Null. Öffnen Sie die Eier am dritten Tag vorsichtig mit einer Pinzette mit dünnen Spitzen, die mit 70% Ethanol vorgewaschen sind.Gießen Sie den Embryo in ein Plastikwaagen, bedecken Sie ihn mit einem anderen Wiegeboot und legen Sie ihn drei Tage lang bei 37 Grad Celsius in einen befeuchteten Standardinkubator. Machen Sie am sechsten Tag des Embryos mit einer 23-Gauge-Nadel einen kleinen Einschnitt in die Chorioallantoismembran. Legen Sie ein Sieben-Tage-Sphäroid mit einer Pipette auf den Einschnitt und geben Sie den Embryo bis zu weiteren Experimenten drei Tage lang in den Inkubator zurück.Geben Sie einen Tropfen DPBS, um die Kraniotomie zu bedecken. Legen Sie die flexible Elektrode auf den Tropfen des DPBS und legen Sie die Rückseite der Sonde vorsichtig mit den Kontaktpads auf den Rücken der Maus. Absorbieren Sie den DPBS-Tropfen mit einem kleinen Stück Papier, bis die Sonde flach auf der Dura liegen kann, und folgen Sie der Krümmung des Gehirns, um sicherzustellen, dass die kleine Kochsalzschicht unter den Elektroden verbleibt, um als Barriere gegen das Überlaufen von Klebstoff zu wirken.Geben Sie einen kleinen Tropfen Silikonkleber auf die Sonde und decken Sie sie mit einem fünf Millimeter großen runden Deckglas ab. Drücken Sie das Deckglas nach unten, bis das Silikon gleichmäßig verteilt ist und der Abstand zwischen dem Deckglas und der Sonde minimal ist. Warten Sie dann 30 Sekunden, bis sich das Silikon verfestigt hat.Um das Deckglas zu befestigen, tragen Sie schnell Sekundenkleber auf die Seiten auf und drücken Sie ihn nach unten, bis der Kleber fest wird. Tragen Sie Sekundenkleber mit einem Zahnstocher auf den Hals der Sonde auf und achten Sie darauf, dass der Sekundenkleber unter den Hals gezogen wird, um eine stabile Unterstützung zu gewährleisten. Decken Sie den Schädel mit Zahnzement ab, um eine chronische Kappe zu bilden, und achten Sie besonders darauf, nur die Ränder des Deckglases zu bedecken.Heben Sie die Rückseite der Sonde an und tragen Sie Zement unter den Sondenhals auf. Rest der Sonde auf dem Zement, bevor er aushärtet. Drücken Sie den Hals der Sonde vorsichtig nach unten, um ihre Oberfläche während des Experiments auf gleicher Höhe mit dem Deckglas und nicht im Weg des Mikroskopobjektivs zu platzieren.Decken Sie die Oberseite des Sondenhalses mit nicht mehr als 1,5 Millimetern Zahnzementschicht ab, um einen festen Halt auf der Sonde zu erreichen. Bauen Sie einen Zementbrunnen mit einem 1,5-Millimeter-Grat von ein bis zwei Millimetern um das Deckglas, um ein Becken für die Immersionsflüssigkeit für die Zwei-Photonen-Bildgebung zu schaffen. Verabreichen Sie nach dem Aushärten des Zements eine postoperative Analgesie und halten Sie das Tier bis zur Genesung warm, indem Sie es in ein Papiertuch wickeln und in die Nähe einer Infrarotlampe legen.Die PEDOT:PSS-beschichteten Elektroden zeigen die typischen kapazitiven und resistiv dominierten Bereiche, die durch eine Grenzfrequenz getrennt sind, während die unbeschichteten Elektroden nur kapazitives Verhalten zeigen. Das mit einem Hellfeldmikroskop beobachtete Wachstum der Sphäroide zeigte, dass je nach Zelllinie und Anzahl der ausgesäten Zellen mindestens zwei oder drei Tage benötigt werden, um sphärische und dichte Sphäroide zu erhalten. Im In-ovo-Modell kann das Transplantat von Sphäroioiden in der Chorioallantoismembran durch Fluoreszenzmikroskopie beurteilt werden, da lebende Zellen intrazelluläres Kalzium aufweisen und die Vaskularisierung des Tumors durch Injektion eines Fluoreszenzfarbstoffs in die Blutgefäße beurteilt werden kann.Verglichen mit der Impedanz in Kochsalzlösung wird in vivo eine Erhöhung der Impedanz bei Frequenzen über 100 Hertz aufgrund des Vorhandenseins einer biologischen Umgebung erwartet. Das vaskularisierte Neuralparenchym und die Tumorinfiltration können durch das transparente Substrat über Wochen hinweg durch Zwei-Photonen-Mikroskopie beobachtet und charakterisiert werden. Die Verwendung von transgenen Tieren, die fluoreszierende Proteine in interessierenden Zellen exprimieren, kann den minimalen Entzündungsprozess zeigen, der allein durch die Elektrodenimplantation induziert wird.Es kann das Vorhandensein von Mikroglia und Monozyten 26 Tage nach der Implantation von gepulsten elektrischen Feldern stimulierender Elektrode zeigen. Sowohl periphere Monozyten als auch hirnresonante Mikrogliazellen wurden um und innerhalb des Tumors gefunden. Der entscheidende Punkt für den Erfolg des Implantatverfahrens besteht darin, die Abdichtung und die Ebenheit des Schädelfensters sicherzustellen und die Qualität des Kontakts mit der Sonde zu optimieren.Zusätzlich zur intravitalen Bildgebung könnte es in Betracht gezogen werden, unser Protokoll mit anderen Maßnahmen und Techniken wie den Probenahmen und Messungen von Blutuntersuchungen auf Zytokine, dem Immunstatus durch Durchflusszytometrie oder sogar der Verhaltensanalyse zu kombinieren. Diese Arbeit ebnet den Weg für den Einsatz flexibler implantierbarer Geräte bei Krebs und eröffnet neue Perspektiven für den Einsatz der bioelektronischen Medizin bei dieser chronischen Krankheit.

Research

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