Name: flexible organic electronic devices for pulsed electric field therapy of glioblastoma
Uploaded: 2022-08-09T13:00:00
Duration: 11 min 2 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Flexible Organic Electronic Devices for Pulsed Electric Field Therapy of Glioblastoma at JoVE.com

העבודה המדווחת כאן נתמכה על ידי סוכנות המחקר הלאומית הצרפתית (ANR-18-CE19-0029). המחברים מודים בחום ל- S.M. Bardet על תרומתה ליצירת קו תאים יציב GCaMP6f ו- D. O'Connor על עזרתה במודל in ovo .

<ol>
	<li>Koshy, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+survival+time+trends+for+glioblastoma+using+the+SEER+17+population-based+registries.">Improved survival time trends for glioblastoma using the SEER 17 population-based registries.</a> Journal of Neuro-Oncology. 107 (1), 207-212 (2012).</li><li>Davis, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glioblastoma:+Overview+of+disease+and+treatment.">Glioblastoma: Overview of disease and treatment.</a> Clinical Journal of Oncology Nursing. 20, 2-8 (2016).</li><li>Edd, J. F., Horowitz, L., Davalos, R. V., Mir, L. M., Rubinsky, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+results+of+a+new+focal+tissue+ablation+technique:+irreversible+electroporation.">In vivo results of a new focal tissue ablation technique: irreversible electroporation.</a> IEEE transactions on Bio-Medical Engineering. 53 (7), 1409-1415 (2006).</li><li>Breton, M., Mir, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microsecond+and+nanosecond+electric+pulses+in+cancer+treatments.">Microsecond and nanosecond electric pulses in cancer treatments.</a> Bioelectromagnetics. 33 (2), 106-123 (2012).</li><li>Frandsen, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+therapeutic+applications+of+calcium+electroporation+to+effectively+induce+tumor+necrosis.">Direct therapeutic applications of calcium electroporation to effectively induce tumor necrosis.</a> Cancer Research. 72 (6), 1336-1341 (2012).</li><li>Lee, J. H., Kim, H., Kim, J. H., Lee, S. -. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Soft+implantable+microelectrodes+for+future+medicine:+prosthetics,+neural+signal+recording+and+neuromodulation.">Soft implantable microelectrodes for future medicine: prosthetics, neural signal recording and neuromodulation.</a> Lab on a Chip. 16 (6), 959-976 (2016).</li><li>Lee, H., Bellamkonda, R. V., Sun, W., Levenston, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomechanical+analysis+of+silicon+microelectrode-induced+strain+in+the+brain.">Biomechanical analysis of silicon microelectrode-induced strain in the brain.</a> Journal of Neural Engineering. 2 (4), 81-89 (2005).</li><li>Fattahi, P., Yang, G., Kim, G., Abidian, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+review+of+organic+and+inorganic+biomaterials+for+neural+interfaces.">A review of organic and inorganic biomaterials for neural interfaces.</a> Advanced Materials. 26 (12), 1846-1885 (2014).</li><li>Lecomte, A., Degache, A., Descamps, E., Dahan, L., Bergaud, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+and+in+vivo+biostability+assessment+of+chronically-implanted+Parylene+C+neural+sensors.">In vitro and in vivo biostability assessment of chronically-implanted Parylene C neural sensors.</a> Sensors and Actuators B: Chemical. 251, 1001-1008 (2017).</li><li>Dijk, G., Ruigrok, H. J., O'Connor, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PEDOT:PSS-coated+stimulation+electrodes+attenuate+irreversible+electrochemical+events+and+reduce+cell+electropermeabilization.">PEDOT:PSS-coated stimulation electrodes attenuate irreversible electrochemical events and reduce cell electropermeabilization.</a> Advanced Materials Interfaces. 8 (19), 2100214 (2021).</li><li>Chen, T. -. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultra-sensitive+fluorescent+proteins+for+imaging+neuronal+activity.">Ultra-sensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity.</a> Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).</li><li>Ribatti, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+5+Chick+embryo+chorioallantoic+membrane+as+a+useful+tool+to+study+angiogenesis.">Chapter 5 Chick embryo chorioallantoic membrane as a useful tool to study angiogenesis.</a> International Review of Cell and Molecular Biology. 270, 181-224 (2008).</li><li>Valdes, T. I., Kreutzer, D., Moussy, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chick+chorioallantoic+membrane+as+a+novel+in+vivo+model+for+the+testing+of+biomaterials.">The chick chorioallantoic membrane as a novel in vivo model for the testing of biomaterials.</a> Journal of Biomedical Materials Research. 62 (2), 273-282 (2002).</li><li>Ricard, C., Stanchi, F., Rougon, G., Debarbieux, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+orthotopic+glioblastoma+mouse+model+maintaining+brain+parenchymal+physical+constraints+and+suitable+for+intravital+two-photon+microscopy.">An orthotopic glioblastoma mouse model maintaining brain parenchymal physical constraints and suitable for intravital two-photon microscopy.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (86), e51108 (2014).</li><li>Lefevre, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrating+flexible+electronics+for+pulsed+electric+field+delivery+in+a+vascularized+3D+glioblastoma+model.">Integrating flexible electronics for pulsed electric field delivery in a vascularized 3D glioblastoma model.</a> npj Flexible Electronics. 5, 19 (2021).</li><li>Perry, J. L., Ramachandran, N. K., Utama, B., Hyser, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+genetically-encoded+calcium+indicators+for+live+cell+calcium+imaging+and+localization+in+virus-infected+cells.">Use of genetically-encoded calcium indicators for live cell calcium imaging and localization in virus-infected cells.</a> Methods. 90, 28-38 (2015).</li><li>Bl&#246;mer, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+and+sustained+gene+transfer+in+adult+neurons+with+a+lentivirus+vector.">Highly efficient and sustained gene transfer in adult neurons with a lentivirus vector.</a> Journal of Virology. 71 (9), 6641-6649 (1997).</li><li>Lenting, K., Verhaak, R., ter Laan, M., Wesseling, P., Leenders, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glioma:+experimental+models+and+reality.">Glioma: experimental models and reality.</a> Acta Neuropathologica. 133 (2), 263-282 (2017).</li><li>Hickman, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+models+of+cancer+for+pharmacology+and+cancer+cell+biology:+Capturing+tumor+complexity+in+vitro/ex+vivo.">Three-dimensional models of cancer for pharmacology and cancer cell biology: Capturing tumor complexity in vitro/ex vivo.</a> Biotechnology Journal. 9 (9), 1115-1128 (2014).</li><li>Tay, S. L. M., Heng, P. W. S., Chan, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+CAM-LDPI+method:+a+novel+platform+for+the+assessment+of+drug+absorption.">The CAM-LDPI method: a novel platform for the assessment of drug absorption.</a> Journal of Pharmacy and Pharmacology. 64 (4), 517-529 (2012).</li><li>Kundekov&#225;, B., M&#225;&#269;ajov&#225;, M., Meta, M., &#268;avarga, I., Bil&#269;&#237;k, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chorioallantoic+Membrane+Models+of+Various+Avian+Species:+Differences+and+Applications.">Chorioallantoic Membrane Models of Various Avian Species: Differences and Applications.</a> Biology. 10 (4), 301 (2021).</li><li>Ricard, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+dynamics+of+microglial+and+monocyte-derived+cells+in+glioblastoma-bearing+mice.">Phenotypic dynamics of microglial and monocyte-derived cells in glioblastoma-bearing mice.</a> Scientific Reports. 6 (1), 26381 (2016).</li></ol>

המחברים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

הגישה המתוארת בעבודה זו מאפשרת מודלים של גידולי מוח עם מערכת העברת PEF משולבת לחקור את ההשפעה של PEFs ברמות שונות של ארגון ביולוגי. פרוטוקול המיקרו-פבריקציה מורכב מתהליכים סטנדרטיים של סרט דק, המספקים מידה רבה של חופש בתכנון אלקטרודות שניתן להתאים ליישום הספציפי. לפעמים, שלב חישול תרמי נוסף יכול להיות שימושי בסוף הייצור, כדי להפחית את כיפוף האלקטרודות שהתרחש במהלך הייצור.
השימוש בקו תאי גליובלסטומה יציב המבטא אינדיקטור סידן פלואורסצנטי מונע את כל הסיבוכים הקשורים להעברת צבע ושמירתו, במיוחד בגידולים תלת ממדיים צפופים מאוד16. ואכן, רמת ביטוי גבוהה נצפתה לאורך תקופה ארוכה בהשוואה למדדי סידן פלואורסצנטיים כימיים סטנדרטיים17. פרוטוקול זה יכול להיות מיושם על קווי תאים שונים, כפי שהוא משמש בדרך כלל עבור דימות פעילות עצבית11. כאן נעשה שימוש בקווי תאים אנושיים ומורין (U87 ו-Gl261 להשתלה בעכברים מדוכאי חיסון או מדוכאי חיסון, בהתאמה). ואכן, מחקרים אחרונים הראו כי קו התאים U87 שונה מזה של התאים המקוריים, שכן מוטציות רבות נרכשו במשך שנים של תרבית תאים, והשפיעו על שחזור ניסיוני18. השיטה המשמשת להכנת גידולים תלת ממדיים היא תפוקה גבוהה, ניתנת לשחזור, ומאפשרת יצירת ספרואידים בגודל מסוים בהתאם לקו התא, מספר התאים בעת הזריעה וזמן הצמיחה19. עם זאת, ספרואידים אלה צפופים, אשר מציג חסרון בעת הדמיה בליבת הגידול.
מודל in ovo שימושי כגישה ראשונה לחקר ההשפעה של PEF על גידולים תלת-ממדיים וכלי הדם שלהם, ללא אינטראקציות עם סוגי תאים אחרים הנמצאים במוח. מודל זה זול, מהיר, בעל תפוקה גבוהה ומעלה פחות סוגיות אתיות מאשר מודלים של בעלי חיים. חשוב לשמור על שלמות העובר לאורך כל הניסוי, שכן הדבר עלול להשפיע על הישרדותו ועל איכות ההדמיה. יש לנקוט בזהירות מיוחדת בעת פתיחת ביצת השליו, כדי למנוע נזקים לקרום העוברי. השתל ומיקום האלקטרודות הגמישות חייבים להתבצע גם הם בזהירות, כדי למנוע דימום שעלול להרוג את העובר. הזרקת צבע פלואורסצנטי בכלי הדם מאפשרת הדמיה בו זמנית של תאי הגידול וכלי הדם במיקרוסקופ פלואורסצנטי. ההזרקה התוך עינית חייבת להתבצע בזהירות כדי למנוע דליפת צבע לנוזל העוברי, מה שעלול לגרום לפלואורסצנטיות שיורית ברקע הפוגעת באיכות ההדמיה. מודל זה יכול לשמש גם למעקב אחר ספיגת סמים, שכן הוא מאפשר גישה למערכת הדם. עם זאת, הניסויים מוגבלים על ידי זמן ההישרדות של 12 ימים של העובר, ובכך מאפשרים 7 ימי תצפית, שהוא קצר משמעותית ממודל in vivo 21.
מודל גידול המוח in vivo יכול להיות מנוטר במשך 4 עד 5 שבועות לפני שבעלי חיים מגיעים לנקודת סיום ניסויית אתית שנקבעת על ידי ירידה פתאומית של 20% במשקל. זה נסבל היטב ונשאר במקום אם זנב החיבור של האלקטרודה אינו ארוך מדי. אחרת, בעלי חיים נוטים לשרוט את המחבר המתהפך, אשר עלול בסופו של דבר להיקרע, ובכך למנוע חיבור לאחר מכן למגרה. תקופה זו של 4 שבועות היא בכל זאת בעלת ערך כדי לכסות את השלבים השונים של התפתחות גליובלסטומה. כאשר משווים את צפיפות תאי הגידול באותו נפח של עניין במרווחי זמן שונים, ניתן לראות את האבולוציה של קינטיקה צמיחת הגידול. בפרט, צמיחה מוגברת של הגידול נצפתה בזמן המתג החיסוני22. מחקר דומה בנוכחות אלקטרודה מעוררת יידע על ההשפעה של PEF על קצב התפשטות הגידול ורגישות הגידול לסילוק מערכת החיסון. בהשוואה למודל in ovo , ניתן לראות את מודל in vivo כמודל פרה-קליני רב ערך לחקר ההשפעה של תאי מערכת החיסון על התקדמות הגידול ותרומתם להשפעה הטיפולית של PEF. פרוטוקול זה מותאם ממאמר קודם עם תוספת של מכשיר אלקטרודה גמיש על הגידול לפני הנחת חלון גולגולת14. הן הטיפולים הביואלקטריים החריפים והן הכרוניים של גידולים יכולים להיות מאופיינים בתצפיות ישירות ועוקבות במיקרוסקופ של שני פוטונים, בהתחשב בכך שהגירוי הראשוני צפוי לגרום למוות תאי ולעורר דיסרגולציה מתמשכת של התגובה החיסונית.
החיבורים של הגשושית הגמישה נגישים בקלות תחת מיקרוסקופ שני פוטונים. לפיכך, ניתן להתאים פרמטרים של גירוי חשמלי בזמן אמת בהתבסס על ההשפעה הנצפית על הרקמה העצבית ו / או תאי המטרה, בדומה לאופן שבו רופא היה מבצע הליכים התערבותיים תוך צפייה בתמונות MRI או CT של המטופל שלו. שיקול אחרון הוא החשיבות של איטום זהיר של האלקטרודה במוח עם דבק-על ודבק סיליקון כדי למנוע צמיחה מחודשת של רקמות.
לסיכום, הפרוטוקול המתואר כאן מייצג מודל חדשני לחקר ההשפעה של טיפול PEF עם אלקטרודות פולימר אורגני גמישות עבור מודלים של גידולי גליובלסטומה. שני המודלים מציגים רמות שונות של מורכבות, כך שניתן להפריד בין השפעות תאיות, וסקולריות או חיסוניות להבנה טובה יותר של מנגנוני הפעולה. אלקטרודות קונפורמיות ושטחיות מפחיתות את הנזק היאטרוגני תוך שהן מאפשרות שיבוש של המיקרו-סביבה של הגידול, מה שגורם להתכווצות כלי דם או חוסר ויסות של סידןתוך-תאי 15.

גליובלסטומה מולטיפורמה (GBM) הוא גידול פולשני ביותר ולכן קשה למגר אותו באמצעות טיפולים סטנדרטיים כגון כריתה, הקרנות וכימותרפיה. למרות טיפולים רב-מודאליים, הפרוגנוזה נותרה גרועה מאוד ורוב החולים חווים התקדמות מחלה תוך שנה מהאבחנה 1,2. לאחרונה, פיתוח טיפולים ביואלקטריים הראה פוטנציאל גדול לשיפור הטיפולים הקיימים. טיפולים אלה משתמשים בהעברת פולסים חשמליים (PEF), בדרך כלל בפגישת טיפול אחת, כדי לשבש את שלמות קרום התא ואת המיקרו-סביבה של גידולים. הפרעה זו בקרום התא, הידועה גם בשם אלקטרופורציה, יכולה להיות הפיכה או בלתי הפיכה בהתאם לעוצמת השדה החשמלי ומספר הפולסים. אלקטרופורציה בלתי הפיכה (IRE) מיושמת כטכניקת אבלציה לא תרמית של רקמות שבה פולסים חשמליים גורמים נזק קטלני לקרומי התאים המוביל למוות תאי3. אלקטרופורציה הפיכה מיושמת באלקטרוכימותרפיה (ECT), טכניקה מבוססת הכוללת מתן PEFs בשילוב עם תרופות כימותרפיות כדי לשפר את ספיגת התרופות בתאים סרטניים4. יתר על כן, מחקרים אחרונים הדגימו אלקטרופורציה של סידן כחלופה לנזעי חשמל עם יעילות גבוהה לטיפול בסרטן, שהיא גם זולה וגורמת לפחות תופעות לוואי5. למרות ההתקדמות המבטיחה הזו, PEFs מיושמים בדרך כלל באמצעות אלקטרודות מתכתיות קשיחות אשר ידועות כגורמות נזק לרקמות רכות6. המוח רגיש במיוחד למכשירים פולשניים כאלה שבהם חוסר ההתאמה המכנית גורם לדלקת ולהצטלקות אסטרוגליאלית7.
בהקשר זה, מוצגת מערכת אספקת PEF גמישה בשילוב עם מודלים תלת ממדיים של גידולי גליובלסטומה, החל ממיקרו-פבריקציה ועד מודל מורין. אלקטרודות קונפורמיות מיוצרות בתהליכי מיקרו-ייצור סטנדרטיים של סרט דק, כולל שימוש בחומרים רכים ובעלי תאימות ביולוגית כגון parylene-C, זהב ו-PEDOT:PSS 8,9. עיצוב אלקטרודה בין-ספרתית משמש לכיסוי שטח פנים גדול תוך שמירה על שקיפות נאותה להדמיה בין אצבעות האלקטרודה10. עבור מודל הגידול, ספרואידים תלת-ממדיים של תאי גליובלסטומה המבטאים כתב פלואורסצנטי מקודד גנטית מיוצרים באמצעות וריאציה של שיטת צלחת 96 בארות כיסוי נוזלי11. הספרואידים מושתלים בקרום הכוריאואלנטואי של עובר שליו, וכתוצאה מכך מודל in ovo שנעשה בו שימוש נרחב לחקר אנגיוגנזה או טוקסיקולוגיה של תרופות12,13. גידולים יכולים להיות מושתלים וכלי דם על ידי כלי הדם של העובר בהיעדר מערכת חיסונית בשלב זה של התפתחות העובר12. אלקטרודות גמישות ממוקמות לאחר מכן על גבי הגידול הווסקולרי כדי לחקור את ההשפעה של העברת PEF על הספרואיד וכלי הדם שלו. לבסוף, השפעות אלה נחקרות על אורגניזם חי שלם, כולל מיקרו-סביבה של הגידול ומערכת החיסון, על ידי השתלת ספרואידים מהונדסים בפרנכימת המוח של מודלים מורינים14. אלקטרודות גמישות מונחות על גבי אתר ההחדרה והקרניוטומיה אטומה באמצעות חלון זכוכית, המאפשר הדמיה חוזרת ונשנית של שני פוטונים במשך מספר שבועות.
שיטות אלה יהיו שימושיות עבור אנשים המעוניינים בתחומים שונים, החל הנדסת מיקרואלקטרוניקה ליישומים אונקולוגיים. ניתן להשתמש בפרוטוקול המיקרו-פבריקציה ולהתאים אותו לכל יישום הדורש אלקטרודות מתכת דקות מצופות PEDOT:PSS. יתר על כן, המודלים הביולוגיים שפותחו להערכת טיפולים חשמליים נגד גידולים יהיו בעלי עניין כללי לחקר ההתמיינות של תגובה תאית, וסקולרית וחיסונית לחומרים מושתלים.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>(3-Glycidyloxypropyl)trimethoxysilane</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>440167</td>
			<td>GOPS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.25% Trypsin-EDTA (1X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25200-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-Dodecylbenzenesulfonic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>44198</td>
			<td>DBSA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plate</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Technic</td>
			<td>530</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrylic resin</td>
			<td>Fischer scientific</td>
			<td>NC1455685</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>agarose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9539</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>autoclave</td>
			<td>Tuttnauer</td>
			<td>3150 EL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AZ 10XT</td>
			<td>Microchemicals</td>
			<td></td>
			<td>Positive photoresist</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AZ 826 MIF Developer</td>
			<td>Merck</td>
			<td>10056124960</td>
			<td>Metal-ion-free developer for the negative photoresist</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AZ Developer</td>
			<td>Merck</td>
			<td>10054224960</td>
			<td>Metal-ion-free developer for the positive photoresist</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AZ nLof 2070</td>
			<td>Microchemicals</td>
			<td></td>
			<td>Negative photoresist</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buprenorphine</td>
			<td>Axience</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carprofen</td>
			<td>Rimadyl</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge Sorvall Legend X1R</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>75004260</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CMOS camera Prime 95B</td>
			<td>Photometrics</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 incubator HERAcell 150i</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAC board</td>
			<td>National Instruments</td>
			<td>USB 6259</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D&#233;co spray P&#233;b&#233;o</td>
			<td>Cultura</td>
			<td>3167860937307</td>
			<td>Black acrylic paint</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextran Texas Red 70.000</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>D1830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Die bonding paste &#34;Epinal&#34;</td>
			<td>Hitachi</td>
			<td>EN-4900GC</td>
			<td>Silver paste</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D2438</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispensing machine</td>
			<td>Tianhao</td>
			<td>TH-2004C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Modified Eagle&#8217;s Medium + GlutaMAX&#8482;-I</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10567-014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D6429</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Egg incubator COUVAD&#39;OR 160</td>
			<td>lafermedemanon.com</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylene glycol</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>6881.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fertilized eggs of Japanese quail</td>
			<td>Japocaille</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>VWR</td>
			<td>S181BH</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flask</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>658170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence macroscope</td>
			<td>Leica MZFLIII</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gl261</td>
			<td>DSMZ</td>
			<td>ACC 802</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gold pellets - Dia 3 mm x 6 mm th</td>
			<td>Neyco</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Handheld automated cell counter</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>PHCC00000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating and drying oven</td>
			<td>Memmert</td>
			<td>UF110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hexadimethrine Bromide Sequa-brene</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S2667</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hot plate Delta 6 HP 350</td>
			<td>S&#252;ss Microtec</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Illumination system pE-4000</td>
			<td>CoolLed</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Infrared tunable femtosecond laser (Ma&#239;-Ta&#239;)</td>
			<td>Spectra Physics (USA)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ionomycin calcium salt</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I3909</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kapton tape SCOTCH 92 33x19</td>
			<td>3M</td>
			<td></td>
			<td>Polyimide protection tape</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lab made pulse generator</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Labcoter 2 Parylene Deposition system PDS 2010</td>
			<td>SCS</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lenti-X 293 T cell line</td>
			<td>Takara Bio</td>
			<td>63218</td>
			<td>HEK 293T-derived cell line optimized for lentivirus production</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lenti-X GoStix Plus</td>
			<td>Takara Bio</td>
			<td>631280</td>
			<td>Quantitative lentiviral titer test</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mask aligner MJB4</td>
			<td>S&#252;ss Microtec</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro-90 Concentrated cleaning solution</td>
			<td>International Products</td>
			<td>M9050-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slides 76 x 52 x 1 mm</td>
			<td>Marienfeld</td>
			<td>1100420</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needles 30G</td>
			<td>BD Microlance 3</td>
			<td>304000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PalmSens4 potentiostat</td>
			<td>PalmSens</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>parylene-c : dichloro-p-cyclophane</td>
			<td>SCS</td>
			<td>300073</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCB Processing Tanks</td>
			<td>Mega Electronics</td>
			<td>PA104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEDOT:PSS Clevios PH 1000</td>
			<td>Heraeus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>penicillin / streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>351029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pGP-CMV-GCaMP6f</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>40755</td>
			<td>plasmid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffer Saline solution</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>D8537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasma treatment system PE-100</td>
			<td>Plasma Etch</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PlasmaLab 80 Reactive Ion Etcher</td>
			<td>Oxford Instruments</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic mask</td>
			<td>Selba</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic weigh boat 64 x 51 x 19 mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10770-454</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-dimethylsiloxane: SYLGARD 184 Silicone Elastomer Kit</td>
			<td>Dow chemicals</td>
			<td>1673921</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyimide copper film 60 &#181;m (Kapton)</td>
			<td>Goodfellow</td>
			<td>IM301522</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propan-2-ol</td>
			<td>Technic</td>
			<td>574</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protolaser S</td>
			<td>LPKF</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>puromycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A11103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Round cover glass 5 mm diameter</td>
			<td>Fischer scientific</td>
			<td>50-949-439</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scepter Sensors - 60 &#181;m</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>PHCC60050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone adhesive Kwik-Sil</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>spin coater</td>
			<td>S&#252;ss Microtec</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spin Coater</td>
			<td>Laurell</td>
			<td>WS-650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Super glue</td>
			<td>Office depot</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tetracycline-free f&#339;tal bovine Serum</td>
			<td>Takara Bio</td>
			<td>631105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermal evaporator Auto 500</td>
			<td>Boc Edwards</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Two-photon microscope</td>
			<td>Zeiss LSM 7MP</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>U87-MG</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>HTB-14</td>
			<td>Human glioblastoma cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonic cleaner</td>
			<td>VWR</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex VTX-3000L</td>
			<td>LMS</td>
			<td>VTX100323410</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xfect single shots reagent</td>
			<td>Takara Bio</td>
			<td>631447</td>
			<td>Transfection reagent</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

flexible organic electronic devices for pulsed electric field therapy of glioblastoma

גליובלסטומה קשה למיגור עם טיפולים אונקולוגיים סטנדרטיים בשל רמת הפולשנות הגבוהה שלה. טיפולים ביואלקטריים המבוססים על פולסים חשמליים (PEFs) מבטיחים לשיפור יעילות הטיפול. עם זאת, הם מסתמכים על אלקטרודות קשיחות הגורמות נזק חריף וכרוני, במיוחד ברקמות רכות כגון המוח. בעבודה זו, נעשה שימוש באלקטרוניקה גמישה כדי להעביר PEFs לגידולים והתגובה הביולוגית הוערכה במיקרוסקופ פלואורסצנטי. אלקטרודות זהב משולבות על מצע פרילן-C דק ושקוף צופו בפולימר המוליך PEDOT:PSS, והתוצאה הייתה התקן תואם ותואם ביולוגית. ההשפעות של PEFs על גידולים ועל המיקרו-סביבה שלהם נבדקו באמצעות מודלים ביולוגיים שונים. ראשית, מונושכבות של תאי גליובלסטומה גודלו בתרבית על גבי האלקטרודות כדי לחקור תופעות במבחנה. כשלב ביניים, פותח מודל in ovo שבו הושתלו ספרואידים גידוליים מהונדסים בקרום העוברי של שליו. בשל היעדר מערכת חיסונית, זה הוביל לגידולים מאוד וסקולריים. בשלב מוקדם זה של ההתפתחות, לעוברים אין מערכת חיסונית, וגידולים אינם מוכרים כגופים זרים. לכן, הם יכולים להתפתח במהירות תוך פיתוח כלי הדם שלהם ממערכת כלי הדם העוברית הקיימת, המייצגת מודל סרטן תלת ממדי בעל ערך. לבסוף, אספקת אלקטרודות גמישה של PEFs הוערכה באורגניזם שלם עם מערכת חיסון פונקציונלית, באמצעות מודל עכבר סינגני, אורתוגרפט (תוך גולגולתי). ספרואידים סרטניים הושתלו במוחם של עכברים רב-פלואורסצנטיים טרנסגניים לפני השתלת מכשירי אלקטרודות אורגניים גמישים. חלון גולגולתי אטום איפשר הדמיה מולטיפוטונית של הגידול והמיקרו-סביבה שלו במהלך הטיפול ב-PEFs במשך תקופה של מספר שבועות.

פרוטוקול זה מאפשר יישום לשני מודלים של גליובלסטומה בהם משולבת מערכת אספקת PEF גמישה. לאחר שלבי מיקרו-ייצור ואריזה, אלקטרודות גמישות מאופיינות בתמיסת מלח על ידי ספקטרוסקופיית עכבה אלקטרוכימית (EIS) כדי להעריך ולאמת את ביצועיהן. האלקטרודות מצופות PEDOT:PSS מראות את האזורים הנשלטים הקיבוליים וההתנגדותיים האופייניים המופרדים על-ידי תדר חיתוך, בעוד שהאלקטרודות הלא מצופות מציגות התנהגות קיבולית בלבד (איור 2).
וריאציה של שיטת צלחת 96 בארות כיסוי נוזלי משמשת לגידול גידולים תלת-ממדיים העשויים מתאי גליובלסטומה נגועים המבטאים ביציבות כתב סידן תוך תאי פלואורסצנטי. ניתן לצפות בצמיחת הספרואידים באמצעות מיקרוסקופ בעל שדה בהיר (איור 3; אד 0). לפחות 2 או 3 ימים נדרשים כדי לקבל spheroids כדורי צפוף, בהתאם לקו התא ואת מספר התאים זרע.
במודל in ovo , ספרואידים מושתלים בקרום הכוריאואלנטואי של עובר שליו (איור 3; אד 6). את הצלחת השתל ניתן להעריך באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי כמה ימים לאחר מכן, מאחר שבתאים חיים יש סידן תוך-תאי, ולכן הם פלואורסצנטיים (איור 3; אד 9). ניתן לצפות בכלי הדם של הגידול תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי על-ידי הזרקת צבע פלואורסצנטי לכלי הדם (איור 3; ED9). עם זאת, לא תמיד ניתן לדמיין את כלי הדם בתוך הגידול מכיוון שהספרואיד צפוף מאוד. האלקטרודות הבין-ספרתיות הגמישות ממוקמות על גבי הגידול הווסקולרי (איור 3; ED 9) ומחובר למחולל פולסים. הבדיקה חייבת להיות ממוקמת בעדינות כדי למנוע דימום של העובר; אחרת, הצבע הפלואורסצנטי יכול להתפשט, מה שחוסם כל תצפית על ידי הדמיה. ניתן לאמת העברה נכונה של הדופק לסביבה הביולוגית על ידי מדידת הזרם העובר במעגל. הדמיה של אלה במודלים של אובו מאפשרת ניטור בזמן אמת של השפעת PEFs על הסידן התוך-תאי בגידול גליובלסטומה תלת-ממדי, כמו גם את התכווצות כלי הדם הנגרמת על כלי הדם של הגידול, תוך הימנעות מכל השפעה של סוגי תאים אחרים כולל מערכת החיסון15.
המחקר של השפעת PEF על גליובלסטומה יכול להתבצע גם במודל מלא יותר ומנבא. ואכן, מודל in vivo שתואר לעיל14 מורכב מהשתלת גידול גליובלסטומה תלת-ממדי בפרנכימת המוח של עכבר (איור 4). אתר ההזרקה של הגידול מחובר על ידי חרוז ג'ל דקסטרן צולב, כדי לשחזר את האילוצים הביופיזיים הפיזיולוגיים במהלך צמיחת הגידול. למרות המתואר בהערה14, ראוי להדגיש שוב כי חשוב באופן קריטי כי חרוז חצי הדקסטרן יהיה מודבק במדויק לדורה מאטר; אחרת, הגידול יכול לברוח דרך הדורה הפתוחה ולכסות לחלוטין את המוח, מה שהופך את ההדמיה לבלתי אפשרית. עבור כל הדמיה כרונית, צמיחת רקמות המתרחשת כאשר חלון הגולגולת מחלים מהווה מחסום רציני, שכן הרקמה החדשה אינה שקופה והופכת את התמונות למעורפלות או לא שמישות. לכן, לאחר החדרה והדבקה של חצי החרוז, יש לאטום את דפנות חלון הגולגולת הפתוח בשכבה דקה של דבק-על המונחת בקפידה סביב קיר החלל, מבלי לתת לדבק-העל להחליק או לזרום על הדורה. כאשר הבדיקה הגמישה ממוקמת על גבי אתר הזרקת הגידול, שום בועות לא יכולות להישאר מתחת לבדיקה, משתי סיבות. ראשית, הדמיה אינה יכולה להתקדם כאשר קיימות בועות. שנית, בועות משמשות כמבודדות, ובכך משנות את תכונות הגירוי החשמלי. לאחר נקיטת אמצעי הזהירות המתוארים לעיל, הקרניוטומיה נאטמת באמצעות חלון זכוכית המוצמד לגולגולת כדי לאפשר הדמיה כרונית במשך שבועות. מכיוון שהגידול מורכב מתאים המבטאים GCaMP או DsRed, ניתן לאשר את ההזרקה באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי. יש למדוד את העכבה האלקטרוכימית של האלקטרודות כדי לאמת את הביצועים לאחר ההשתלה. בהשוואה לעכבה בתמיסת מלח, צפויה עלייה של העכבה in vivo בתדרים מעל 100 הרץ עקב נוכחות של סביבה ביולוגית (איור 5). ניתן לצפות ולהתאפיין בפרנכימה עצבית וסקולרית ובהסננה של הגידול דרך המצע השקוף במשך שבועות באמצעות מיקרוסקופ של שני פוטונים (איור 6). השימוש בחיות טרנסגניות המבטאות חלבונים פלואורסצנטיים בתאים מעניינים (תאי חיסון ונוירונים) יכול, למשל, לאפשר הדגמה של התהליך הדלקתי המינימלי המושרה על-ידי השתלת אלקטרודות בלבד (איור 6A) או להראות נוכחות של מיקרוגליה ומונוציטים 26 יום לאחר ההשתלה של אלקטרודה מגורה PEF שהושתלה על גבי גידול גדל של GBM (איור 6B1 ). במקרה האחרון, גם תאים היקפיים-מונוציטים וגם תאי מיקרוגליאה שוכני מוח נמצאו סביב הגידול ובתוכו (איור 6B2). ביום מסירת PEF ניתן לחבר רפידות מגע של האלקטרודות הגמישות למחולל הדופק, ישירות תחת מיקרוסקופ שני פוטונים. בסך הכל, מודל זה יכול לשמש לחקר ההשפעה של טיפולים ביואלקטריים לאורך זמן באמצעות סוגים שונים של תאים המעורבים בהתפתחות גידולי מוח, עד לעומק של כ -500 מיקרומטר.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63527/63527fig01.jpg"> איור 1: מיקרו-ייצור של אלקטרודות גמישות . (A) תבנית אלקטרודות זהב ומצע פארילן C. (ב) פתיחת מתאר. (C) PEDOT:ציפוי PSS. (ד) חיבורים ואריזה. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63527/63527fig01large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63527/63527fig02.jpg"> איור 2: ספקטרוסקופיית עכבה אלקטרוכימית של אלקטרודות זהב גמישות ואלקטרודות קרות מצופות PEDOT:PSS בתמיסת מלח. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63527/63527fig02large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63527/63527fig03.jpg"> איור 3: מודל in ovo של גליובלסטומה. ED 0: ספרואיד שנצפה במיקרוסקופ שדה בהיר. ED 3: תרבית פחות קליפה של עובר שליו 3 ימים לאחר הפתיחה. ED 6: גידול שהושתל ב- CAM שנצפה במיקרוסקופ שדה בהיר. ED 9: מכשיר גמיש המונח על הגידול הווסקולרי (גידול בירוק וכלי דם באדום). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63527/63527fig03large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63527/63527fig04.jpg"> איור 4: היישום in vivo. (A) תוכנית לניסויים in vivo. (ב) יש לבצע בדיקה לפני מריחת זכוכית כיסוי ושרף אקרילי. (ג) השתלת בדיקה שהושלמה. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63527/63527fig04large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63527/63527fig05.jpg"> איור 5: ספקטרוסקופיית עכבה אלקטרוכימית של אלקטרודות זהב גמישות בתמיסת מלח בהשוואה לגשושית מושתלת. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63527/63527fig05large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63527/63527fig06.jpg"> איור 6: הדמיה תוך-ספקטרלית מולטיספקטרלית של שני פוטונים באמצעות אלקטרודות . (A) תמונה מרוצפת של פני השטח הבריאים של המוח בעכבר AMU-Neuroinflam רב-פלואורסצנטי 3 ימים לאחר השתלת האלקטרודה. ציאן מראה ארבוריזציה דנדריטית של נוירונים פירמידליים בשכבה 5, ירוק מראה גרנולוציטים ומונוציטים מגויסים, וצהוב מראה תאי מיקרוגליה ודנדריטים פעילים. ורוד מראה דיפוזיה אינפרא אדום עקב הצטברות חום. (ב1) תמונה דומה כמו ב-A אך 26 ימים לאחר השתלת ספרואיד הגידול 200 מיקרומטר עמוק בתוך קליפת המוח מיד לאחר מכן השתלת אלקטרודות. שימו לב להצטברות של תאי חיסון ירוקים וצהובים. (ב2) תמונה דומה לזו של B1 אך 100 מיקרומטר מתחת לפני השטח של האלקטרודות. שימו לב לנוכחות של ארבוריזציה דנדריטית עצבית כחולה בפריפריה של מסת הגידול האדומה עצמה שחדרה על ידי מיקרוגליה צהובה ותאים דנדריטיים. כחול עמוק מראה אות הרמוני שני מהקולגן הפריטומורלי. (ב3) תצוגה מוגדלת של B2 המראה נוכחות של סומות בין נוירונים (מסומנות על ידי חצים) בקרבת הגידול. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63527/63527fig06large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Flexible Organic Electronic Devices for Pulsed Electric Field Therapy of Glioblastoma at JoVE.com

Flexible Organic Electronic Devices for Pulsed Electric Field Therapy of Glioblastoma

עבודה זו מתארת את הפיתוח של אלקטרודות בין-ספרתיות גמישות ליישום במודלים תלת-ממדיים של גידולי מוח, כלומר בתרבית חוץ גופית , במודל ovo ובמודל in vivo murine. השיטה המוצעת יכולה לשמש להערכת ההשפעות של פולסים חשמליים על גידולים ברמות שונות של מורכבות.

מכשירים אלקטרוניים אורגניים גמישים לטיפול בשדה חשמלי פועם של גליובלסטומה

Glioblastoma is difficult to eradicate with standard oncology therapies due to its high degree of invasiveness. Bioelectric treatments based on pulsed ...

פרוטוקול זה מאפשר העברת שדות חשמליים דופקים על ידי אלקטרוניקה גמישה כדי לחקור את ההשפעות הטיפוליות שלהם על גליובלסטומה. אנו עושים זאת על ידי הדמיה של מיקרו-סביבת הגידול in vivo באמצעות הדמיה. הביואלקטרוניקה משתלבת בפרוטוקול זה באמצעות מספר מודלים שונים של מורכבות הולכת וגוברת על מנת לחקור את ההשפעה של שדות פועמים על סרטן.טכניקות המיקרו-פבריקציה המוצגות בעבודה זו יכולות להיבדק גם כאמצעי לטיפול בסוגים אחרים של סרטן, כולל xenografts שמקורם בחולה. זה נע לקראת הרעיון של רפואה מדויקת המותאמת לכל מטופל בנפרד. בדיקות אלה מיוצרות בטכניקות מיקרו-פבריקציה סטנדרטיות, כך שהייצור פשוט וכל מי שיש לו חדר נקי יכול לייצר אותן.עבור דפוס אלקטרודות זהב, הפקידו שכבה של שלושה מיקרומטר של פארילן C עם מערכת שיקוע פארילן על ידי הצבת שקופיות הזכוכית הנקייה בתא התצהיר. שוקלים שישה גרם של פארילן C בסירת אלומיניום, מניחים אותו בכבשן, מפנים את המכונה ומתחילים את התצהיר עם הפרמטרים המתוארים בכתב היד. כאשר התצהיר הסתיים וטמפרטורת הוופורייזר נמוכה מ -40 מעלות צלזיוס, כבה את הצ'ילר, הוופורייזר, הכבשן.אווררו את המכונה ואספו את הדגימות. סובב לצפות את הדגימות שטופלו פלזמה עם photoresist שלילי ב 1, 000 פעמים G במשך 40 שניות. חשוף את photoresist דרך מסיכה הכוללת את עיצוב האלקטרודה הבין-ספרתית.לאחר מכן טבלו דגימות במפתח ללא יוני מתכת למשך שלוש דקות כדי להסיר את התנגדות האור שאינה חשופה. כדי להפקיד שכבת הדבקה של כרום בגודל 20 ננומטר ושכבת זהב של 300 ננומטר עם מאייד תרמי, אווררו את מכונת המאייד והדביקו את הדגימות על הצלחת העגולה העליונה באמצעות ברגי מתכת. מלאו את כורי ההיתוך הייעודיים בהתאמה בכרום ובזהב.אטמו ופנו את המכונה והתחילו בסיבוב של מחזיק הדגימה. בחר את כור ההיתוך המכיל כרום והגדל לאט את הזרם עד שקצב השקיעה מגיע ל -0.2 אנגסטרום לשנייה. פתחו את התריס, המתינו עד לשקיעה של 20 ננומטר כרום, סגרו את התריס והורידו לאט לאט את הזרם עד אפס מיליאמפר.בחר את הזהב המכיל כור היתוך והגדל לאט את הזרם עד לקצב שיקוע של 0.2 אנגסטרום לשנייה. פתחו את התריס כדי לאדות את הזהב, המתינו עד לשקיעה של 10 ננומטר זהב, ואז הגדילו את קצב השקיעה ל-1.5 אנגסטרומים לשנייה עד לכ-300 ננומטר. סגרו את התריס והגבירו באיטיות את הזרם לאפס מיליאמפר.לטבול את הדגימות בתוך המכילה אצטון. לאחר מכן לשטוף את הדגימות עם isopropanol ולייבש אותם עם אקדח אוויר. יש לסובב ארבע שכבות של תמיסת PEDOT:PSS במהירות של 150 פעמים G למשך 35 שניות.הסר את שכבת parylene C קורבן על ידי טבילת הדגימות במים. טבלו את הדגימות במים שעברו דה-יוניזציה למשך 30 דקות כדי להסיר את שאריות הסבון והתרכובות בעלות המשקל המולקולרי הנמוך בסרט PEDOT:PSS ולנתק את הדגימות ממצע הזכוכית. מוסיפים 75 מיקרוליטר של תמיסת אגרוז מותכת 1% בכל באר של צלחת 96 באר בזהירות ולתת לו להתמצק במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר.נתק את תאי הגליובלסטומה המומרים שהתקבלו במהלך יצירת קו התא היציב. הוסף 10, 000 תאי גליובלסטומה לבאר והשלם את הנפח הכולל ל -150 מיקרוליטר לבאר באמצעות DMEM המכיל גרם אחד לליטר גלוקוז, L-גלוטמין, נתרן פירובט ונתרן ביקרבונט, 10% נסיוב בקר עוברי, 100 יחידות למיקרוליטר פניצילין, ו -100 מיקרוגרם למיקרוליטר סטרפטומיצין. החליפו מחצית מהמדיה במדיה טרייה כל יומיים עד לניסויים נוספים תוך שמירה על קצה הפיפטה בחלק העליון של הבאר כדי למנוע נזק לאגרוז או לספרואיד עצמו.מניחים את הביצים המופרות של שליו יפני, Coturnix japonica, באינקובטור על מגשים עם מסובב אוטומטי שהופך ביצים כל שעתיים. יום זה נחשב ליום אפס עוברי. ביום השלישי העוברי, פתחו בעדינות את הביציות באמצעות פינצטה עם קצוות דקים שטופים מראש עם 70% אתנול.יוצקים את העובר לסירת שקילה מפלסטיק, מכסים אותו בסירת שקילה נוספת ומניחים אותו באינקובטור לח סטנדרטי בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך שלושה ימים. ביום העובר השישי, לעשות חתך קטן בקרום chorioallantoic עם מחט 23 מד. מניחים ספרואיד של שבעה ימים על החתך באמצעות פיפטה ומחזירים את העובר לאינקובטור למשך שלושה ימים עד לניסויים נוספים.מניחים טיפה של DPBS כדי לכסות את craniotomy. הנח את האלקטרודה הגמישה על טיפת DPBS והנח בעדינות את החלק האחורי של הגשושית עם רפידות המגע על גב העכבר. לספוג את טיפת DPBS עם פיסת נייר קטנה עד שהגשושית יכולה לשכב שטוחה על הדורה ולעקוב אחר העקמומיות של המוח, להבטיח שהשכבה הקטנה של מי מלח תישאר מתחת לאלקטרודות כדי לשמש מחסום מפני זליגת דבק.הניחו טיפה קטנה של דבק סיליקון על הגשושית וכסו אותה בזכוכית כיסוי עגולה בקוטר חמישה מ"מ. דחפו את זכוכית הכיסוי כלפי מטה עד שהסיליקון מפוזר באופן שווה והמרחק בין זכוכית הכיסוי לבדיקה הוא מינימלי. לאחר מכן המתינו 30 שניות עד שהסיליקון יתמצק.כדי לאבטח את זכוכית הכיסוי, מרחו במהירות דבק-על על צדדיו ודחפו אותו כלפי מטה עד שהדבק יתמצק. מרחו דבק-על על צוואר הגשושית באמצעות קיסם, ודאגו שדבק העל יישאב מתחת לצוואר כדי לספק תמיכה יציבה. כסו את הגולגולת במלט דנטלי לבניית כובע כרוני והקפידו במיוחד לכסות את שולי זכוכית הכיסוי בלבד.הרימו את החלק האחורי של הגשושית ומרחו מלט מתחת לצוואר הבדיקה. שאר הבדיקה על המלט לפני שהוא נרפא. דחפו מטה את צוואר הגשושית בעדינות כדי למקם את פני השטח שלה באותה רמה כמו זכוכית הכיסוי ולא בדרך של מטרת המיקרוסקופ במהלך הניסוי.כסו את החלק העליון של צוואר הבדיקה בלא יותר מ -1.5 מילימטרים של שכבת מלט דנטלי כדי להשיג אחיזה איתנה בבדיקה. בנו באר צמנט המציגה רכס של 1.5 מילימטר במילימטר עד שני מילימטרים סביב זכוכית הכיסוי כדי ליצור אגן לנוזל הטבילה עבור שני הדמיית הפוטון. לאחר שהמלט נרפא, יש לבצע שיכוך כאבים לאחר הניתוח ולשמור על חום החיה עד להחלמה על ידי עטיפתה במגבת נייר והצבתה קרוב לנורת אינפרא אדום.האלקטרודות מצופות PEDOT:PSS מציגות את האזורים הנשלטים הקיבוליים וההתנגדותיים האופייניים המופרדים בתדר חיתוך, בעוד שהאלקטרודות הלא מצופות מציגות התנהגות קיבולית בלבד. צמיחת הספרואידים שנצפתה במיקרוסקופ שדה בהיר גילתה כי נדרשים לפחות יומיים או שלושה כדי להשיג ספרואידים כדוריים וצפופים בהתאם לקו התא ומספר התאים שנזרעו. במודל in ovo, ניתן להעריך את השתל של ספרואידים בקרום הכוריאואלנטואי על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי מכיוון שבתאים חיים יש סידן תוך תאי וניתן להעריך את כלי הדם של הגידול על ידי הזרקת צבע פלואורסצנטי לכלי הדם.בהשוואה לעכבה בתמיסת מלח, צפויה עלייה של העכבה in vivo בתדרים מעל 100 הרץ עקב נוכחות של סביבה ביולוגית. ניתן לצפות ולאפיין את הפרנכימה העצבית של כלי הדם ואת חדירת הגידול דרך המצע השקוף במשך שבועות על ידי שני מיקרוסקופ פוטונים. השימוש בבעלי חיים טרנסגניים המבטאים חלבונים פלואורסצנטיים בתאים בעלי עניין יכול להדגים את התהליך הדלקתי המינימלי המושרה על ידי השתלת אלקטרודות בלבד.זה יכול להראות נוכחות של מיקרוגליה ומונוציטים 26 ימים לאחר ההשתלה פולסים שדות חשמליים אלקטרודה מגורה. הן מונוציטים היקפיים שמקורם והן תאי מיקרוגליאה בעלי תהודה מוחית נמצאו סביב הגידול ובתוכו. הנקודה הקריטית להצלחה בהליך ההשתלה היא הבטחת האיטום והשטיחות של חלון הגולגולת ואופטימיזציה של איכות המגע עם הבדיקה.בנוסף להדמיה התוך-חיונית, מה יכול לשקול לשלב את הפרוטוקול שלנו עם מדדים וטכניקות אחרות כמו דגימות ומדדים של עבודת דם עבור ציטוקינים, מצב חיסוני על ידי ציטומטריה זרימה, או אפילו ניתוח התנהגותי. עבודה זו סוללת את הדרך לשימוש במכשירים מושתלים גמישים לסרטן ופותחת אפשרויות חדשות לשימוש ברפואה ביואלקטרונית למחלה כרונית זו.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Coculture Assays to Study Macrophage and Microglia Stimulation of Glioblastoma Invasion

מבחני Coculture ללמוד מקרופאג Microglia גירוי של גליובלסטומה הפלישה

Glioblastoma multiforme (grade IV glioma) is a very aggressive human cancer with a median survival of 1 year post diagnosis. Despite the increased ...

Moving Upwards: A Simple and Flexible In Vitro Three-dimensional Invasion Assay Protocol

Moving Upwards: A Simple and Flexible In Vitro Three-dimensional Invasion Assay Protocol

נעים כלפי מעלה: פשוט וגמיש במבחנה הפלישה תלת מימדי Assay פרוטוקול

Although 3D invasion assays have been developed, the challenge remains to study cells without affecting the integrity of their microenvironment. ...

Fluorescence Molecular Tomography for In Vivo Imaging of Glioblastoma Xenografts

Fluorescence Molecular Tomography for In Vivo Imaging of Glioblastoma Xenografts

קרינה פלואורסצנטית טומוגרפיה מולקולרית עבור הדמיה In Vivo של גליובלסטומה Xenografts

Tumorigenicity is the capability of cancer cells to form a tumor mass. A widely used approach to determine if the cells are tumorigenic is by injecting ...

Live-Cell Imaging Assays to Study Glioblastoma Brain Tumor Stem Cell Migration and Invasion

מבחני הדמיה לחיות תאים מחקר המוח גליובלסטומה גידול תאי גזע ההעברה, הפלישה

Glioblastoma (GBM) is an aggressive brain tumor that is poorly controlled with the currently available treatment options. Key features of GBMs include ...

The Clinical Application of Tumor Treating Fields Therapy in Glioblastoma

היישום הקליני של הגידול לטיפול שדות טיפול ב גליובלסטומה

Glioblastoma is the most common and lethal form of brain cancer, with a median survival of 15 months after diagnosis and a 5 year survival rate of only 5% ...

A 3D Spheroid Model for Glioblastoma

מודל ספרואיד תלת-ממדי לגלינובלסטומה

Two-dimensional (2D) cell cultures do not mimic in vivo tumor growth satisfactorily. Therefore, three-dimensional (3D) culture spheroid models were ...

Co-culture of Glioblastoma Stem-like Cells on Patterned Neurons to Study Migration and Cellular Interactions

תרבות משותפת של תאים דמויי גזע גליובלסטומה על נוירונים בדוגמת ללמוד הגירה ואינטראקציות הסלולר

Glioblastomas (GBMs), grade IV malignant gliomas, are one of the deadliest types of human cancer because of their aggressive characteristics. Despite ...

Positron Emission Tomography-based Dose Painting Radiation Therapy in a Glioblastoma Rat Model using the Small Animal Radiation Research Platform

פוזיטרונים פליטת טומוגרפיה מבוסס מינון ציור הקרנות טיפול במודל חולדת Glioblastoma באמצעות פלטפורמת מחקר קרינה בבעלי חיים קטנים

A rat glioblastoma model to mimic chemo-radiation treatment of human glioblastoma in the clinic was previously established. Similar to the clinical ...

Application of Hemostatic Devices in Laparoscopic Hepatectomy

יישום של מכשירים המוסטטיים בכריתת כבד לפרוסקופית

Laparoscopic hepatectomy is considered a conventional method for treating benign and malignant liver diseases because it is a minimally invasive method. ...

Translational Orthotopic Models of Glioblastoma Multiforme

מודלים אורתוטופיים תרגומיים של גליובלסטומה מולטיפורמה

Genetically engineered mouse (GEM) models for human glioblastoma multiforme (GBM) are critical to understanding the development and progression of brain ...