Name: flexible organic electronic devices for pulsed electric field therapy of glioblastoma
Uploaded: 2022-08-09T13:00:00
Duration: 11 min 2 s
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ここで報告された研究は、フランス国立研究機関(ANR-18-CE19-0029)の支援を受けました。著者らは、安定したGCaMP6f細胞株の生成に貢献したS.M.バルデと、 inovo モデルに協力してくれたD.オコナーに心から感謝します。

<ol>
	<li>Koshy, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+survival+time+trends+for+glioblastoma+using+the+SEER+17+population-based+registries.">Improved survival time trends for glioblastoma using the SEER 17 population-based registries.</a> Journal of Neuro-Oncology. 107 (1), 207-212 (2012).</li><li>Davis, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glioblastoma:+Overview+of+disease+and+treatment.">Glioblastoma: Overview of disease and treatment.</a> Clinical Journal of Oncology Nursing. 20, 2-8 (2016).</li><li>Edd, J. F., Horowitz, L., Davalos, R. V., Mir, L. M., Rubinsky, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+results+of+a+new+focal+tissue+ablation+technique:+irreversible+electroporation.">In vivo results of a new focal tissue ablation technique: irreversible electroporation.</a> IEEE transactions on Bio-Medical Engineering. 53 (7), 1409-1415 (2006).</li><li>Breton, M., Mir, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microsecond+and+nanosecond+electric+pulses+in+cancer+treatments.">Microsecond and nanosecond electric pulses in cancer treatments.</a> Bioelectromagnetics. 33 (2), 106-123 (2012).</li><li>Frandsen, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+therapeutic+applications+of+calcium+electroporation+to+effectively+induce+tumor+necrosis.">Direct therapeutic applications of calcium electroporation to effectively induce tumor necrosis.</a> Cancer Research. 72 (6), 1336-1341 (2012).</li><li>Lee, J. H., Kim, H., Kim, J. H., Lee, S. -. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Soft+implantable+microelectrodes+for+future+medicine:+prosthetics,+neural+signal+recording+and+neuromodulation.">Soft implantable microelectrodes for future medicine: prosthetics, neural signal recording and neuromodulation.</a> Lab on a Chip. 16 (6), 959-976 (2016).</li><li>Lee, H., Bellamkonda, R. V., Sun, W., Levenston, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomechanical+analysis+of+silicon+microelectrode-induced+strain+in+the+brain.">Biomechanical analysis of silicon microelectrode-induced strain in the brain.</a> Journal of Neural Engineering. 2 (4), 81-89 (2005).</li><li>Fattahi, P., Yang, G., Kim, G., Abidian, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+review+of+organic+and+inorganic+biomaterials+for+neural+interfaces.">A review of organic and inorganic biomaterials for neural interfaces.</a> Advanced Materials. 26 (12), 1846-1885 (2014).</li><li>Lecomte, A., Degache, A., Descamps, E., Dahan, L., Bergaud, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+and+in+vivo+biostability+assessment+of+chronically-implanted+Parylene+C+neural+sensors.">In vitro and in vivo biostability assessment of chronically-implanted Parylene C neural sensors.</a> Sensors and Actuators B: Chemical. 251, 1001-1008 (2017).</li><li>Dijk, G., Ruigrok, H. J., O'Connor, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PEDOT:PSS-coated+stimulation+electrodes+attenuate+irreversible+electrochemical+events+and+reduce+cell+electropermeabilization.">PEDOT:PSS-coated stimulation electrodes attenuate irreversible electrochemical events and reduce cell electropermeabilization.</a> Advanced Materials Interfaces. 8 (19), 2100214 (2021).</li><li>Chen, T. -. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultra-sensitive+fluorescent+proteins+for+imaging+neuronal+activity.">Ultra-sensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity.</a> Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).</li><li>Ribatti, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+5+Chick+embryo+chorioallantoic+membrane+as+a+useful+tool+to+study+angiogenesis.">Chapter 5 Chick embryo chorioallantoic membrane as a useful tool to study angiogenesis.</a> International Review of Cell and Molecular Biology. 270, 181-224 (2008).</li><li>Valdes, T. I., Kreutzer, D., Moussy, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chick+chorioallantoic+membrane+as+a+novel+in+vivo+model+for+the+testing+of+biomaterials.">The chick chorioallantoic membrane as a novel in vivo model for the testing of biomaterials.</a> Journal of Biomedical Materials Research. 62 (2), 273-282 (2002).</li><li>Ricard, C., Stanchi, F., Rougon, G., Debarbieux, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+orthotopic+glioblastoma+mouse+model+maintaining+brain+parenchymal+physical+constraints+and+suitable+for+intravital+two-photon+microscopy.">An orthotopic glioblastoma mouse model maintaining brain parenchymal physical constraints and suitable for intravital two-photon microscopy.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (86), e51108 (2014).</li><li>Lefevre, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrating+flexible+electronics+for+pulsed+electric+field+delivery+in+a+vascularized+3D+glioblastoma+model.">Integrating flexible electronics for pulsed electric field delivery in a vascularized 3D glioblastoma model.</a> npj Flexible Electronics. 5, 19 (2021).</li><li>Perry, J. L., Ramachandran, N. K., Utama, B., Hyser, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+genetically-encoded+calcium+indicators+for+live+cell+calcium+imaging+and+localization+in+virus-infected+cells.">Use of genetically-encoded calcium indicators for live cell calcium imaging and localization in virus-infected cells.</a> Methods. 90, 28-38 (2015).</li><li>Bl&#246;mer, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+and+sustained+gene+transfer+in+adult+neurons+with+a+lentivirus+vector.">Highly efficient and sustained gene transfer in adult neurons with a lentivirus vector.</a> Journal of Virology. 71 (9), 6641-6649 (1997).</li><li>Lenting, K., Verhaak, R., ter Laan, M., Wesseling, P., Leenders, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glioma:+experimental+models+and+reality.">Glioma: experimental models and reality.</a> Acta Neuropathologica. 133 (2), 263-282 (2017).</li><li>Hickman, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+models+of+cancer+for+pharmacology+and+cancer+cell+biology:+Capturing+tumor+complexity+in+vitro/ex+vivo.">Three-dimensional models of cancer for pharmacology and cancer cell biology: Capturing tumor complexity in vitro/ex vivo.</a> Biotechnology Journal. 9 (9), 1115-1128 (2014).</li><li>Tay, S. L. M., Heng, P. W. S., Chan, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+CAM-LDPI+method:+a+novel+platform+for+the+assessment+of+drug+absorption.">The CAM-LDPI method: a novel platform for the assessment of drug absorption.</a> Journal of Pharmacy and Pharmacology. 64 (4), 517-529 (2012).</li><li>Kundekov&#225;, B., M&#225;&#269;ajov&#225;, M., Meta, M., &#268;avarga, I., Bil&#269;&#237;k, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chorioallantoic+Membrane+Models+of+Various+Avian+Species:+Differences+and+Applications.">Chorioallantoic Membrane Models of Various Avian Species: Differences and Applications.</a> Biology. 10 (4), 301 (2021).</li><li>Ricard, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+dynamics+of+microglial+and+monocyte-derived+cells+in+glioblastoma-bearing+mice.">Phenotypic dynamics of microglial and monocyte-derived cells in glioblastoma-bearing mice.</a> Scientific Reports. 6 (1), 26381 (2016).</li></ol>

著者は、競合する経済的利益はないと宣言しています。

この研究で説明されているアプローチにより、統合されたPEFデリバリーシステムを備えた脳腫瘍モデルは、生物学的組織のさまざまなレベルでのPEFの効果を研究することができます。微細加工プロトコルは、標準的な薄膜プロセスで構成されており、特定のアプリケーションに適応できる電極設計の自由度が高いです。場合によっては、製造中に発生した電極の曲げを減らすために、製造の最後に追加の熱アニーリングステップが役立つことがあります。
蛍光カルシウムインジケーターを発現する安定した膠芽腫細胞株を使用することで、特に非常に密度の高い3D腫瘍において、色素の送達と保持に関連するすべての合併症を回避できます16。実際に、標準的な化学蛍光カルシウム指示薬17と比較して長期間にわたって高い発現レベルが観察される。このプロトコルは、神経活動の画像化に一般的に使用されるように、様々な細胞株に適用することができる11。ここでは、ヒトおよびマウス細胞株を使用した(免疫不全マウスまたは免疫適格マウスへの移植にそれぞれU87およびGl261)。実際、最近の研究では、U87細胞株は、長年の細胞培養で多くの突然変異が獲得され、実験的再現性に影響を与えるため、元の細胞株とは異なることが示されました18。3D腫瘍の調製に使用される方法は、ハイスループットで再現性があり、細胞株、播種時の細胞数、および増殖時間に応じて特定のサイズのスフェロイドの生成を可能にします19。しかしながら、これらのスフェロイドは緻密であり、これは腫瘍の中心で画像化するときに不利を提示する。
in ovoモデルは、脳内に存在する他の細胞型との相互作用なしに、3D腫瘍とその血管系に対するPEFの効果を研究するための最初のアプローチとして有用です。このモデルは、動物モデルよりも安価で、高速で、高スループットであり、倫理的問題が少ないです。胚の生存と画像の品質に影響を与える可能性があるため、実験全体を通して胚の完全性を維持することが重要です。ウズラの卵を開くときは、胚膜への損傷を避けるために特別な注意を払う必要があります。移植片および可撓性電極の配置もまた、胚を殺す可能性のある出血を避けるために慎重に行われなければならない。血管への蛍光色素の注入により、腫瘍細胞の可視化と蛍光顕微鏡による血管新生を同時に行うことができます。眼内注射は、色素が胚液に漏れないように注意深く行う必要があり、バックグラウンドに残留蛍光が発生してイメージングの品質が低下する可能性があります。このモデルは、循環器系へのアクセスを可能にするため、薬物摂取の追跡にも使用できます。しかしながら、実験は胚の12日間の生存時間によって制限され、したがって7日間の観察を可能にし、これはin vivoモデル21よりも有意に短い。
in vivo脳腫瘍モデルは、動物が突然の20%の体重減少によって決定される倫理的実験エンドポイントに到達する前に、4〜5週間監視できます。それは忍容性が高く、電極の接続テールが長すぎない場合はその場に留まります。そうしないと、動物はフリッピングコネクタを傷つける傾向があり、最終的には引き裂かれ、その後の刺激装置への接続を妨げる可能性があります。それにもかかわらず、この4週間の期間は、膠芽腫の発症のさまざまな段階をカバーするために価値があります。異なる時間間隔で同じ体積の腫瘍細胞密度を比較すると、腫瘍増殖動態の進展が観察され得る。特に、免疫スイッチ22の時点で腫瘍増殖の亢進が認められた。刺激電極の存在下での同様の研究は、腫瘍増殖速度および免疫排除に対する腫瘍感受性に対するPEFの効果について情報を提供するであろう。in ovoモデルと比較して、in vivoモデルは、腫瘍の進行に対する免疫細胞の影響とPEFの治療効果への寄与を研究するための貴重な前臨床モデルと見なすことができます。このプロトコルは、頭蓋窓14を配置する前に腫瘍上に可撓性電極装置を追加した以前の記事から適応される。腫瘍の急性および慢性の生体電気治療は、初期刺激が細胞死を誘発し、免疫応答の持続的な調節不全を引き起こすことが予想されることを考えると、2光子顕微鏡による直接およびその後の観察によって特徴付けることができます。
フレキシブルプローブの接続は、2光子顕微鏡で簡単にアクセスできます。したがって、電気刺激パラメータは、医師が患者のMRIまたはCT画像を観察しながら介入手順を実行する方法と同様に、神経組織および/または標的細胞に対する観察された効果に基づいてリアルタイムで調整することができる。最後の考慮事項は、組織の再成長を防ぐために、スーパーグルーとシリコン接着剤で脳の電極を注意深く密閉することの重要性です。
結論として、ここに記載されているプロトコルは、膠芽腫腫瘍モデルに対する柔軟な有機ポリマー電極を用いたPEF療法の効果を研究するための革新的なモデルを表しています。2つのモデルは、細胞、血管、または免疫の影響を分離して作用機序をよりよく理解できるように、異なるレベルの複雑さを示します。コンフォーマルな表面電極は、医原性損傷を軽減しながら、腫瘍微小環境の破壊を可能にし、細胞内カルシウム15の血管収縮または調節不全を引き起こします。

多形性膠芽腫(GBM)は侵襲性の高い腫瘍であるため、切除、放射線療法、化学療法などの標準治療では根絶が困難です。マルチモーダル治療にもかかわらず、予後は非常に悪く、ほとんどの患者は診断から1年以内に疾患の進行を経験します1,2。最近、生体電気治療の開発は、既存の治療法を改善する大きな可能性を示しています。これらの治療法は、通常、1回の治療セッションでパルス電界(PEF)を送達して、細胞膜の完全性と腫瘍の微小環境を破壊します。エレクトロポレーションとしても知られるこの細胞膜破壊は、電界強度およびパルス数に応じて可逆的または不可逆的であり得る。不可逆エレクトロポレーション(IRE)は、電気パルスが細胞膜に致命的な損傷を引き起こし、細胞死を引き起こす非熱組織アブレーション技術として適用されます3。可逆的エレクトロポレーションは、がん細胞への薬物取り込みを促進するために化学療法薬と組み合わせてPEFを送達することからなる確立された技術である電気化学療法(ECT)に適用されます4。さらに、最近の研究では、カルシウムエレクトロポレーションが癌治療のための高効率でECTの代替として実証されており、これも安価で副作用が少ないことが実証されています5。これらの有望な進歩にもかかわらず、PEFは一般に、軟部組織に損傷を与えることが知られている剛性のある金属電極を使用して適用されます6。脳は、機械的ミスマッチが炎症と星状膠体瘢痕を誘発するような侵襲的な装置に特に敏感です7。
これに関連して、微細加工からマウスモデルまで、膠芽腫腫瘍の3Dモデルと組み合わせた柔軟なPEFデリバリーシステムが提示されます。コンフォーマル電極は、パリレン-C、金、PEDOT:PSS 8,9などの柔らかく生体適合性のある材料の使用を含む、標準的な薄膜微細加工プロセスで作られています。電極指10間の画像化のための十分な透明性を維持しながら、大きな表面積をカバーするために、桁間電極設計が使用される。腫瘍モデルの場合、遺伝的にコードされた蛍光レポーターを発現する膠芽腫細胞の3Dスフェロイドが、液体オーバーレイ96ウェルプレート法11のバリエーションを使用して作製される。スフェロイドはウズラ胚の絨毛尿膜に移植され、血管新生または薬物毒物学の研究に広く使用されているinovoモデルをもたらします12,13。腫瘍は、胚発生のこの段階で免疫系がない場合、胚の血管系によって移植および血管新生することができます12。次に、柔軟な電極を血管新生腫瘍の上に配置して、スフェロイドとその血管系に対するPEF送達の効果を調べます。最後に、これらの影響は、マウスモデルの脳実質に操作されたスフェロイドを移植することによって、腫瘍微小環境および免疫系を含む完全な生物に対して調査される14。柔軟な電極が挿入部位の上に配置され、開頭術はガラス窓で密閉されているため、数週間にわたって2光子イメージングを繰り返すことができます。
これらの方法は、マイクロエレクトロニクス工学から腫瘍学アプリケーションに至るまでのさまざまな分野に関心のある人々に役立ちます。微細加工プロトコルは、PEDOT:PSSでコーティングされた薄膜金属電極を必要とするあらゆるアプリケーションに使用および適合させることができます。さらに、抗腫瘍電気治療の評価のために開発された生物学的モデルは、移植された材料に対する細胞、血管、および免疫応答の分化の研究にとって一般的な関心事となるでしょう。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>(3-Glycidyloxypropyl)trimethoxysilane</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>440167</td>
			<td>GOPS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.25% Trypsin-EDTA (1X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25200-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-Dodecylbenzenesulfonic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>44198</td>
			<td>DBSA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plate</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Technic</td>
			<td>530</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrylic resin</td>
			<td>Fischer scientific</td>
			<td>NC1455685</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>agarose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9539</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>autoclave</td>
			<td>Tuttnauer</td>
			<td>3150 EL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AZ 10XT</td>
			<td>Microchemicals</td>
			<td></td>
			<td>Positive photoresist</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AZ 826 MIF Developer</td>
			<td>Merck</td>
			<td>10056124960</td>
			<td>Metal-ion-free developer for the negative photoresist</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AZ Developer</td>
			<td>Merck</td>
			<td>10054224960</td>
			<td>Metal-ion-free developer for the positive photoresist</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AZ nLof 2070</td>
			<td>Microchemicals</td>
			<td></td>
			<td>Negative photoresist</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buprenorphine</td>
			<td>Axience</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carprofen</td>
			<td>Rimadyl</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge Sorvall Legend X1R</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>75004260</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CMOS camera Prime 95B</td>
			<td>Photometrics</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 incubator HERAcell 150i</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAC board</td>
			<td>National Instruments</td>
			<td>USB 6259</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D&#233;co spray P&#233;b&#233;o</td>
			<td>Cultura</td>
			<td>3167860937307</td>
			<td>Black acrylic paint</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextran Texas Red 70.000</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>D1830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Die bonding paste &#34;Epinal&#34;</td>
			<td>Hitachi</td>
			<td>EN-4900GC</td>
			<td>Silver paste</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D2438</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispensing machine</td>
			<td>Tianhao</td>
			<td>TH-2004C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Modified Eagle&#8217;s Medium + GlutaMAX&#8482;-I</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10567-014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D6429</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Egg incubator COUVAD&#39;OR 160</td>
			<td>lafermedemanon.com</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylene glycol</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>6881.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fertilized eggs of Japanese quail</td>
			<td>Japocaille</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>VWR</td>
			<td>S181BH</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flask</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>658170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence macroscope</td>
			<td>Leica MZFLIII</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gl261</td>
			<td>DSMZ</td>
			<td>ACC 802</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gold pellets - Dia 3 mm x 6 mm th</td>
			<td>Neyco</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Handheld automated cell counter</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>PHCC00000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating and drying oven</td>
			<td>Memmert</td>
			<td>UF110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hexadimethrine Bromide Sequa-brene</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S2667</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hot plate Delta 6 HP 350</td>
			<td>S&#252;ss Microtec</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Illumination system pE-4000</td>
			<td>CoolLed</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Infrared tunable femtosecond laser (Ma&#239;-Ta&#239;)</td>
			<td>Spectra Physics (USA)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ionomycin calcium salt</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I3909</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kapton tape SCOTCH 92 33x19</td>
			<td>3M</td>
			<td></td>
			<td>Polyimide protection tape</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lab made pulse generator</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Labcoter 2 Parylene Deposition system PDS 2010</td>
			<td>SCS</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lenti-X 293 T cell line</td>
			<td>Takara Bio</td>
			<td>63218</td>
			<td>HEK 293T-derived cell line optimized for lentivirus production</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lenti-X GoStix Plus</td>
			<td>Takara Bio</td>
			<td>631280</td>
			<td>Quantitative lentiviral titer test</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mask aligner MJB4</td>
			<td>S&#252;ss Microtec</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro-90 Concentrated cleaning solution</td>
			<td>International Products</td>
			<td>M9050-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slides 76 x 52 x 1 mm</td>
			<td>Marienfeld</td>
			<td>1100420</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needles 30G</td>
			<td>BD Microlance 3</td>
			<td>304000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PalmSens4 potentiostat</td>
			<td>PalmSens</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>parylene-c : dichloro-p-cyclophane</td>
			<td>SCS</td>
			<td>300073</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCB Processing Tanks</td>
			<td>Mega Electronics</td>
			<td>PA104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEDOT:PSS Clevios PH 1000</td>
			<td>Heraeus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>penicillin / streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>351029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pGP-CMV-GCaMP6f</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>40755</td>
			<td>plasmid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffer Saline solution</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>D8537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasma treatment system PE-100</td>
			<td>Plasma Etch</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PlasmaLab 80 Reactive Ion Etcher</td>
			<td>Oxford Instruments</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic mask</td>
			<td>Selba</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic weigh boat 64 x 51 x 19 mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10770-454</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-dimethylsiloxane: SYLGARD 184 Silicone Elastomer Kit</td>
			<td>Dow chemicals</td>
			<td>1673921</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyimide copper film 60 &#181;m (Kapton)</td>
			<td>Goodfellow</td>
			<td>IM301522</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propan-2-ol</td>
			<td>Technic</td>
			<td>574</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protolaser S</td>
			<td>LPKF</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>puromycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A11103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Round cover glass 5 mm diameter</td>
			<td>Fischer scientific</td>
			<td>50-949-439</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scepter Sensors - 60 &#181;m</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>PHCC60050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone adhesive Kwik-Sil</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>spin coater</td>
			<td>S&#252;ss Microtec</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spin Coater</td>
			<td>Laurell</td>
			<td>WS-650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Super glue</td>
			<td>Office depot</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tetracycline-free f&#339;tal bovine Serum</td>
			<td>Takara Bio</td>
			<td>631105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermal evaporator Auto 500</td>
			<td>Boc Edwards</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Two-photon microscope</td>
			<td>Zeiss LSM 7MP</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>U87-MG</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>HTB-14</td>
			<td>Human glioblastoma cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonic cleaner</td>
			<td>VWR</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex VTX-3000L</td>
			<td>LMS</td>
			<td>VTX100323410</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xfect single shots reagent</td>
			<td>Takara Bio</td>
			<td>631447</td>
			<td>Transfection reagent</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

flexible organic electronic devices for pulsed electric field therapy of glioblastoma

膠芽腫は、その高度の侵襲性のために、標準的な腫瘍学療法で根絶することは困難です。パルス電界(PEF)に基づく生体電気処理は、処理効率の向上に有望です。しかし、それらは、特に脳などの軟部組織において、急性および慢性の損傷を引き起こす剛性電極に依存しています。この研究では、フレキシブルエレクトロニクスを使用してPEFを腫瘍に送達し、生物学的応答を蛍光顕微鏡で評価しました。薄く透明なパリレン-C基板上に桁間に配置された金電極を導電性ポリマーPEDOT:PSSでコーティングし、順応性のある生体適合性のあるデバイスを実現しました。腫瘍とその微小環境に対するPEFの影響を、さまざまな生物学的モデルを使用して調べました。まず、膠芽腫細胞の単層を電極上で培養し、 in vitroでの現象を調べた。中間ステップとして、操作された腫瘍スフェロイドをウズラの胚膜に移植する in ovo モデルが開発されました。免疫系がないため、これは高度に血管新生した腫瘍につながりました。発生のこの初期段階では、胚には免疫系がなく、腫瘍は異物として認識されません。したがって、彼らは貴重な3D癌モデルを表す既存の胚血管系から独自の血管を発達させながら速く発達することができます。最後に、PEFの柔軟な電極送達を、同世代のオルソグラフト(頭蓋内)マウスモデルを使用して、機能的な免疫系を備えた完全な生物で評価しました。腫瘍スフェロイドは、柔軟な有機電極デバイスの移植前に、トランスジェニック多蛍光マウスの脳に移植されました。密閉された頭蓋窓により、数週間にわたるPEFによる治療中の腫瘍とその微小環境の多光子イメージングが可能になりました。

このプロトコルは、柔軟なPEF送達システムが統合された2つの膠芽腫モデルへの適用を可能にする。微細加工およびパッケージングのステップに続いて、フレキシブル電極は、電気化学インピーダンス分光法(EIS)によって生理食塩水中で特性評価され、その性能を評価および検証されます。PEDOT:PSSコーティングされた電極は、カットオフ周波数によって分離された典型的な容量性および抵抗性が支配的な領域を示しますが、コーティングされていない電極は容量性挙動のみを示します(図2)。
液体オーバーレイ96ウェルプレート法のバリエーションを使用して、蛍光細胞内カルシウムレポーターを安定に発現するトランスフェクトされた膠芽腫細胞からなる3D腫瘍を増殖させます。スフェロイドの成長は明視野顕微鏡で観察できます(図3;ED 0)。球状および高密度のスフェロイドを得るには、細胞株および播種された細胞数に応じて、少なくとも2〜3日が必要である。
in ovoモデルでは、スフェロイドはウズラの胚の絨毛尿膜に移植されます(図3;エド6)。移植片の成功は、生細胞が細胞内カルシウムを有し、したがって蛍光性であるため、数日後に蛍光顕微鏡によって評価することができる(図3;エド9)。腫瘍の血管新生は、蛍光色素を血管に注入することにより、蛍光顕微鏡で観察することができます(図3;ED9)。ただし、スフェロイドは非常に密集しているため、腫瘍内の血管を常に視覚化できるとは限りません。柔軟なインターデジット電極は、血管新生腫瘍の上に配置されます(図3;ED9)とパルス発生器に接続した。プローブは、胚の出血を避けるために穏やかに配置する必要があります。そうしないと、蛍光色素が拡散する可能性があり、イメージングによる観察が妨げられます。生物学的環境へのパルスの正しい供給は、回路を流れる電流を測定することによって検証することができる。ovoモデルにおけるこれらのイメージングは、3D膠芽腫腫瘍における細胞内カルシウムに対するPEFの効果、ならびに腫瘍の血管系に誘導される血管収縮のリアルタイムモニタリングを可能にし、免疫系を含む他の細胞型の影響を回避することができる15。
膠芽腫に対するPEF効果の研究は、より完全で予測的なモデルでも行うことができます。実際に、上記14のin vivoモデルは、マウスの脳実質に3D膠芽腫腫瘍を移植することからなる(図4)。腫瘍の注射部位を架橋デキストランゲルヘミビーズによって塞ぎ、腫瘍の成長中の生理学的生物物理学的制約を再現する。参考文献14に記載されているが、デキストランヘミビーズが硬膜に正確に接着されることが非常に重要であることを再度強調する価値がある。そうしないと、腫瘍が開いた硬膜から逃げ出し、脳を完全に覆い、イメージングが不可能になります。慢性的なイメージングでは、頭蓋窓が治癒するときに発生する組織の内部成長は、新しい組織が不透明であり、画像が霧や使用できなくなるため、深刻な障壁をもたらします。したがって、ヘミビーズを挿入して接着した後、開いた頭蓋窓の側壁は、瞬間接着剤が滑ったり硬膜に流れたりすることなく、空洞壁全体に細心の注意を払って配置された瞬間接着剤の薄層で密閉する必要があります。フレキシブルプローブを腫瘍注入部位の上に配置した場合、2つの理由から、プローブの下に気泡が留まることはありません。まず、気泡が存在するとイメージングが進行しません。第二に、気泡は絶縁体として機能し、したがって電気刺激特性を変化させる。上記の予防措置を講じた後、開頭術は頭蓋骨に接着されたガラス窓で密閉され、数週間にわたる慢性的なイメージングが可能になります。腫瘍はGCaMPまたはDsRed発現細胞で構成されているため、注射は蛍光顕微鏡で確認できます。電極の電気化学インピーダンスは、移植後の性能を検証するために測定する必要があります。生理食塩水中のインピーダンスと比較して、生体内では生物学的環境の存在により100Hzを超える周波数でインピーダンスの増加が予想されます(図5)。血管新生神経実質および腫瘍浸潤は、2光子顕微鏡によって数週間にわたって透明な基質を通して観察および特徴付けることができます(図6)。目的の細胞(免疫細胞およびニューロン)において蛍光タンパク質を発現するトランスジェニック動物の使用は、例えば、電極移植のみによって誘導される最小炎症過程の実証を可能にし(図6A)、または増殖中のGBM腫瘍の上に移植されたPEF刺激電極の移植の26日後にミクログリアおよび単球の存在を示すことができる(図6B1).後者の場合、末梢単球由来細胞と脳常在性ミクログリア細胞の両方が腫瘍の周囲および内部に見られました(図6B2)。PEFの納入日には、フレキシブル電極のコンタクトパッドを2光子顕微鏡の真下でパルス発生器に接続することができます。全体として、このモデルは、脳腫瘍の発生に関与するさまざまな種類の細胞を使用して、約500μmの深さまでの経時的な生体電気治療の効果を調べるために使用できます。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63527/63527fig01.jpg"> 図1:フレキシブル電極の微細加工 。 (A)金電極パターニングとパリレンC基板。(B)アウトラインオープニング。(C)ペドット:PSSコーティング。(D)接続とパッケージング。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63527/63527fig01large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63527/63527fig02.jpg"> 図2:生理食塩水中のフレキシブル金電極およびPEDOT:PSSコーティングされた低温電極の電気化学インピーダンス分光法。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63527/63527fig02large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63527/63527fig03.jpg"> 図3:膠芽腫の inovo モデル。 ED0:明視野顕微鏡で観察したスフェロイド。ED3:開封後3日目のウズラ胚の殻なし培養。ED6:明視野顕微鏡で観察したCAMに移植した腫瘍。ED9:血管新生腫瘍(緑色の腫瘍と赤色の血管)に配置された柔軟なデバイス。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63527/63527fig03large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63527/63527fig04.jpg"> 図4: インビボ アプリケーション 。 (A) インビボ 実験のためのスキーム。(B)カバーガラスとアクリル樹脂を塗布する前のプローブ配置。(C)プローブの移植が完了しました。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63527/63527fig04large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63527/63527fig05.jpg"> 図5:生理食塩水中の柔軟な金電極の電気化学インピーダンス分光法と埋め込みプローブの比較。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63527/63527fig05large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63527/63527fig06.jpg"> 図6:電極を介した生体内マルチスペクトル2光子イメージング 。 (A)電極移植後3日目の対照多蛍光AMU-Neuroinflamマウスにおける健康な脳表面のタイル画像。シアンは第5層の錐体ニューロンの樹状樹状樹状化を示し、緑色は動員された顆粒球と単球を示し、黄色は活性化されたミクログリアと樹状細胞を示します。ピンクは蓄熱による赤外線拡散を示す。(B1) A と同様の画像であるが、腫瘍スフェロイド移植の26日後に皮質内部200μmの深さに電極移植を行った。緑と黄色の免疫細胞の蓄積に注意してください。(B2) B1 と同様の画像ですが、電極の表面から100μm下にあります。黄色ミクログリアおよび樹状細胞によって浸潤した赤色腫瘍塊自体の周辺における青色ニューロン樹状化の存在に留意されたい。濃い青色は、腫瘍周囲コラーゲンからの第2高調波信号を示す。(B3)腫瘍の近傍における介在ニューロン体の存在を示す B2 のズーム図(矢印で示す)。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63527/63527fig06large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>

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Flexible Organic Electronic Devices for Pulsed Electric Field Therapy of Glioblastoma

この研究では、3D脳腫瘍モデル、すなわち in vitro 培養、in ovo モデル、 およびin vivo マウスモデルに実装するための柔軟なインターデジット電極の開発について説明します。提案された方法は、さまざまなレベルの複雑さで腫瘍に対するパルス電界の影響を評価するために使用できます。

膠芽腫のパルス電界治療のための柔軟な有機電子デバイス

Glioblastoma is difficult to eradicate with standard oncology therapies due to its high degree of invasiveness. Bioelectric treatments based on pulsed ...

このプロトコルは、膠芽腫に対するそれらの治療効果を研究するために、フレキシブルエレクトロニクスによるパルス電界の送達を可能にする。これは、腫瘍の微小環境をin vivoでイメージングで視覚化することによって行われます。バイオエレクトロニクスは、癌に対する脈動場の影響を研究するために、複雑さを増すいくつかの異なるモデルを使用してこのプロトコルに統合されています。この研究で提示された微細加工技術は、患者由来の異種移植片を含む他のタイプの癌を治療する手段としてもテストできます。これは、個々の患者に合わせた精密医療のアイデアに向かっています。これらのプローブは標準的な微細加工技術で作られているため、製造は簡単で、クリーンルームがあれば誰でも作成できます。金電極のパターニングには、パリレン蒸着システムで3マイクロメートルのパリレンC層を蒸着チャンバー内にきれいなスライドガラスを配置して堆積させます。アルミボートで6グラムのパリレンCを計量し、それを炉に入れ、機械を排気し、原稿に記載されているパラメータで堆積を開始します。堆積が終了し、気化器の温度が摂氏40度を下回ったら、チラー、気化器、炉の電源を切ります。機械をベントし、サンプルを収集します。プラズマ処理したサンプルをネガ型フォトレジストで1, 000倍Gで40秒間スピンコートします。インターディジット電極設計を特徴とするマスクを通してフォトレジストを露光します。その後、サンプルを金属イオンフリー現像液に3分間浸漬し、未露光のフォトレジストを除去します。サーマルエバポレーターで20ナノメートルのクロム付着層と300ナノメートルの金層を堆積させるには、エバポレーターマシンをベントし、金属ネジで上部の丸いプレートにサンプルをクリップします。専用のるつぼにそれぞれクロムと金を入れます。機械を密閉して排気し、サンプルホルダーの回転を開始します。クロムを含むるつぼを選択し、堆積速度が毎秒0.2オングストロームに達するまでゆっくりと電流を増やします。シャッターを開き、20ナノメートルのクロムが堆積するまで待ち、シャッターを閉じて、ゼロミリアンペアまで電流をゆっくりと下げます。るつぼを含む金を選択し、毎秒0.2オングストロームの堆積速度になるまでゆっくりと電流を増やします。シャッターを開いて金を蒸発させ、10ナノメートルの金が堆積するまで待ってから、約1.5ナノメートルが堆積するまで堆積速度を毎秒300オングストロームに上げます。シャッターを閉じ、電流をゆっくりとゼロミリアンペアまで下げます。アセトンを含むビーカーにサンプルを浸します。次に、サンプルをイソプロパノールですすぎ、エアガンで乾燥させます。4層のPEDOT:PSS溶液を150倍Gで35秒間スピンコートします。試料を水に浸して犠牲パリレンC層を除去する。サンプルを脱イオン水に30分間浸して、PEDOT:PSSフィルムに残っている石鹸と低分子量化合物を除去し、サンプルをガラス基板から剥離します。96ウェルプレートの各ウェルに75マイクロリットルの溶融1%アガロース溶液を注意深く加え、室温で15分間固化させます。安定した細胞株作製中に得られた形質導入膠芽腫細胞を剥離する。1ウェルあたり10, 000個の膠芽腫細胞を追加し、1リットル当たり1グラムのグルコース、L-グルタミン、ピルビン酸ナトリウム、および重炭酸ナトリウム、10%ウシ胎児血清、ペニシリン1マイクロリットル当たり100単位、およびストレプトマイシン1マイクロリットル当たり100マイクログラムを含むDMEMを使用して、ウェル当たり150マイクロリットルに総容量を構成する。アガロースまたはスフェロイド自体への損傷を避けるために、ピペットチップをウェルの上部に保ちながら、さらなる実験まで2日ごとに培地の半分を新しい培地に交換します。ニホンウズラ、Coturnix japonicaの受精卵を、2時間ごとに卵を回転させる自動回転子を備えたトレイの上のインキュベーターに入れます。この日は胚のゼロ日目と見なされます。胚の3日目に、70%エタノールで事前に洗浄した細い先端のピンセットを使用して卵をそっと開きます。胚をプラスチック製の計量ボートに注ぎ、別の計量ボートで覆い、37°Cの標準的な加湿インキュベーターに3日間入れます。胚の6日目に、23ゲージの針で絨毛尿膜を小さく切開します。ピペットを使用して切開部に7日間のスフェロイドを置き、さらなる実験まで3日間胚をインキュベーターに戻します。開頭術を覆うためにDPBSを一滴置きます。フレキシブル電極をDPBSのドロップの上に置き、コンタクトパッド付きのプローブの背面をマウスの背面にそっと置きます。プローブが硬膜の上に平らに置かれ、脳の湾曲に追従できるようになるまで、DPBSドロップを小さな紙で吸収し、生理食塩水の小さな層が電極の下に残り、接着剤のスピルオーバーに対するバリアとして機能するようにします。プローブにシリコン接着剤を少量滴下し、5ミリメートルの丸いカバーガラスで覆います。シリコーンが均等に分散し、カバーガラスとプローブの間の距離が最小になるまで、カバーガラスを押し下げます。次に、シリコーンが固まるまで30秒待ちます。カバーガラスを固定するには、側面に瞬間接着剤をすばやく塗布し、接着剤が固まるまで押し下げます。つまようじを使用してプローブの首に瞬間接着剤を塗布し、瞬間接着剤が首の下に引かれるように注意して、安定したサポートを提供します。頭蓋骨を歯科用セメントで覆い、慢性キャップを作り、カバーガラスの端だけを覆うように特別な注意を払ってください。プローブの背面を持ち上げ、プローブのネックの下にセメントを塗布します。プローブが硬化する前に、プローブをセメントに残します。プローブのネックを軽く押し下げて、実験中に顕微鏡の対物レンズの邪魔にならないように、カバーガラスと同じ高さに表面を配置します。プローブネックの上部を1.5ミリメートル以下の歯科用セメント層で覆い、プローブをしっかりと保持します。カバーガラスの周囲1〜2ミリメートルに1.5ミリメートルの尾根を示すセメントウェルを構築し、2つの光子イメージング用の浸漬流体用の盆地を作成します。セメントが硬化したら、術後鎮痛を行い、ペーパータオルで包み、赤外線電球の近くに置いて、回復するまで動物を暖かく保ちます。PEDOT:PSSコーティングされた電極は、カットオフ周波数で区切られた典型的な容量性および抵抗性が支配的な領域を示しますが、コーティングされていない電極は容量性挙動のみを示します。明視野顕微鏡で観察されたスフェロイドの成長は、細胞株と播種された細胞数に応じて、球状で高密度のスフェロイドを得るのに少なくとも2〜3日が必要であることを明らかにしました。in ovoモデルでは、生細胞が細胞内カルシウムを持っているため、脈絡膜のスフェロイドの移植片を蛍光顕微鏡で評価でき、腫瘍の血管新生は蛍光色素を血管に注入することで評価できます。生理食塩水中のインピーダンスと比較して、生物学的環境の存在により、100ヘルツを超える周波数でin vivoでインピーダンスの増加が予想されます。血管新生神経実質および腫瘍浸潤は、2つの光子顕微鏡によって数週間にわたって透明な基質を通して観察および特徴付けることができる。目的の細胞で蛍光タンパク質を発現するトランスジェニック動物の使用は、電極移植のみによって誘発される最小限の炎症プロセスを実証することができます。パルス電界刺激電極の移植後26日目にミクログリアおよび単球の存在を示すことができる。末梢単球由来細胞と脳共鳴ミクログリア細胞の両方が腫瘍の周囲および内部に見られました。インプラント手術を成功させるための重要なポイントは、頭蓋窓のシーリングと平坦性を確保し、プローブとの接触の質を最適化することです。生体内イメージングに加えて、私たちのプロトコルを、サイトカインの血液検査のサンプリングや測定、フローサイトメトリーによる免疫状態、さらには行動分析などの他の測定や技術と組み合わせることを検討できます。この研究は、癌に対する柔軟な埋め込み型デバイスの使用への道を開き、この慢性疾患に対するバイオエレクトロニクス医学の使用の新しい展望を開きます。

Research

JoVE Journal

Cancer Research

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Moving Upwards: A Simple and Flexible In Vitro Three-dimensional Invasion Assay Protocol

Moving Upwards: A Simple and Flexible In Vitro Three-dimensional Invasion Assay Protocol

上に移動: シンプルかつ柔軟なIn Vitro三次元侵略試金のプロトコル

Although 3D invasion assays have been developed, the challenge remains to study cells without affecting the integrity of their microenvironment. ...

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膠芽腫の異種移植片の生体内イメージング用蛍光分子トモグラフィー

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A 3D Spheroid Model for Glioblastoma

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Co-culture of Glioblastoma Stem-like Cells on Patterned Neurons to Study Migration and Cellular Interactions

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